Summary
Hier gerapporteerd is een systeem voor calciumbeeldvorming bij vrij gedragende Caenorhabditis elegans met goed gecontroleerde, niet-gelokaliseerde trillingen. Dit systeem stelt onderzoekers in staat om niet-gelokaliseerde trillingen op te roepen met goed gecontroleerde eigenschappen op nanoschaalverplaatsing en om calciumstromen te kwantificeren tijdens reacties van C. elegans op de trillingen.
Abstract
Niet-gelokaliseerde mechanische krachten, zoals trillingen en akoestische golven, beïnvloeden een breed scala aan biologische processen van ontwikkeling tot homeostase. Dieren gaan met deze prikkels om door hun gedrag aan te passen. Het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan dergelijke gedragsmodificatie vereist kwantificering van neurale activiteit tijdens het gedrag van belang. Hier rapporteren we een methode voor calciumbeeldvorming bij vrij gedragende Caenorhabditis elegans met niet-gelokaliseerde trillingen van specifieke frequentie, verplaatsing en duur. Deze methode maakt de productie van goed gecontroleerde, niet-gelokaliseerde trillingen mogelijk met behulp van een akoestische transducer en kwantificering van opgeroepen calciumresponsen bij eencellige resolutie. Als bewijs van principe wordt de calciumrespons van een enkel interneuron, AVA, tijdens de ontsnappingsreactie van C. elegans op trillingen aangetoond. Dit systeem zal het begrip van neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan gedragsreacties op mechanische stimuli vergemakkelijken.
Introduction
Dieren worden vaak blootgesteld aan niet-gelokaliseerde mechanische stimuli zoals trillingen of akoestische golven 1,2. Omdat deze stimuli de homeostase, ontwikkeling en voortplanting beïnvloeden, moeten dieren hun gedrag aanpassen om ermee om te gaan 3,4,5. De neurale circuits en mechanismen die ten grondslag liggen aan dergelijke gedragsverandering zijn echter slecht begrepen.
Mechanosensorisch gedrag in de nematode, Caenorhabditis elegans, is een eenvoudig gedragsparadigma, waarin wormen meestal gedrag veranderen van voorwaartse beweging naar een achterwaartse ontsnappingsreactie wanneer ze niet-gelokaliseerde trillingen tegenkomen6. Het neurale circuit dat aan dit gedrag ten grondslag ligt, bestaat voornamelijk uit vijf sensorische neuronen, vier paar interneuronen en verschillende soorten motorneuronen 7,8. Bovendien wennen wormen aan dergelijke mechanische stimuli na gespreide training met herhaalde stimulatie 9,10,11. Daarom vormt deze eenvoudige gedragsrespons een ideaal systeem om neurale mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan zowel niet-gelokaliseerd trillingsgevoed gedrag als geheugen. Een protocol voor calciumbeeldvorming bij vrij gedragende wormen onder invloed van niet-gelokaliseerde trillingen wordt geïllustreerd. In vergelijking met eerder gerapporteerde systemen is dit systeem eenvoudig omdat het geen extra camera nodig heeft voor tracking; het stelt ons echter in staat om de frequentie, verplaatsing en duur van niet-gelokaliseerde trillingen te veranderen. Omdat activering van de AVA-interneuronen de achterwaartse ontsnappingsrespons induceert, werden wormen die GCaMP, een calciumindicator, co-expressie geven, en TagRFP, een calciumongevoelig fluorescerend eiwit, onder controle van een AVA-specifieke promotor als voorbeeld gebruikt (zie Tabel met materialen voor details). Het protocol demonstreert de activering van AVA-neuronen als een worm overschakelt van voorwaartse naar achterwaartse beweging. Dit protocol vergemakkelijkt het begrijpen van het neurale circuitmechanisme dat ten grondslag ligt aan mechanosensorisch gedrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Teelt van wormen tot calciumbeeldvorming
- Breng vier dagen voor een calciumbeeldvormingsexperiment twee volwassen ST12-wormen over naar een nieuwe nematodengroeimedium (NGM) -plaat (Table of Materials) waarop Escherichia coli OP50 in een vierkant patroon (ongeveer 4 mm x 4 mm) zijn gestreept met behulp van een celverspreider, zodat de worm het grootste deel van de tijd in de bacteriën doorbrengt tijdens calciumbeeldvorming12.
- Incubeer deze NGM-plaat gedurende 4 dagen bij 20 °C in een incubator (Table of Materials).
2. Hardware instellen
- Bereid een microscoop voor die is uitgerust met een piëzo-elektrisch apparaat voor stimulatie13, een 2x objectieflens, een snelle sCMOS-camera, beeldsplitsingsoptiek, een x-y gemotoriseerd podium, een LED-lichtbron voor excitatie en een computer (figuur 1). Essentiële specificaties van de sCMOS-camera omvatten 2560 x 2160 actieve pixels, 6,5 μm groot, met een 10-tap cameralink als interface-optie. Belangrijke specificaties van de X-Y gemotoriseerde trap zijn 110 mm x 75 mm rijbereik, 250 mm/s maximale snelheid, 2.000 mm/s2 maximale versnelling en 0,25 μm unidirectionele herhaalbaarheid.
- Schakel de computer en de x-y gemotoriseerde stage controller in.
- Zet de versterker aan en stel de volumeregelaar in op 10 en de bas- en treble-instellingen op 8.
- Om GCaMP en TagRFP te prikkelen, schakelt u de 488 nm- en 560 nm-lampjes van de LED-lichtbron in. Stel de meters van 470 nm en 550 nm van de regeleenheid in de lichtbron in op 5%, zodat de intensiteit van het LED-licht geschikt is voor beeldvorming.
OPMERKING: Bij deze LED-intensiteit treedt tijdens de opname geen fotobleaching van GCaMP- en TagRFP-fluorescentie op.
3. Software-installatie voor calciumbeeldvorming
- Download en installeer drie softwarepakketten in Windows: muismacrosoftware, software voor het regelen van trillingseigenschappen, software voor het uitvoeren van trackingsoftware en software voor gegevensanalyse (Tabel met materialen).
- Dubbelklik op het trackingsoftwarebestand.
- Druk op de knop Uitvoeren en wacht 5 minuten om de software te stabiliseren (afbeelding 2A).
- Geef de informatie over blootstellingstijd en binning. 0,033 s belichtingstijd met 2 x 2 binning zorgt voor een vloeiende beeldacquisitie (figuur 2B).
OPMERKING: Alleen elke10e verkregen afbeelding wordt weergegeven om de geheugenbelasting te verminderen. - Geef de informatie voor beeldacquisitie (figuur 2C). Wanneer bijvoorbeeld twee keer 500 afbeeldingen worden opgenomen met een interval van 10 s, voert u 1.000 in het vak Afbeeldingen totaal, 500 in het vak Afbeeldingen en 10 in het vak Interval (s).
- Schakel de acquisitieknop in (afbeelding 2D).
- Splits het fluorescentiebeeld met behulp van beeldsplitsingsoptiek en de twee afbeeldingen (GCaMP-kanaal, 500-525 nm (figuur 2E); TagRFP-kanaal, 584-676 nm (figuur 2F)) worden geprojecteerd op twee helften van de sCMOS-camera. Kalibreer de coördinaten van de GCaMP- en TagRFP-kanalen (figuur 2G). Sla de software-instellingen op.
- Stel de map in om het gegevensbestand uit te voeren (afbeelding 2H).
- Schakel de acquisitieknop uit (afbeelding 2D).
- Dubbelklik op de muis macrosysteemsoftware (figuur 3A) en stel de trillingseigenschappen in (figuur 3B). Lees het assay.txt bestand met het muismacrosysteem, zodat de muiscursor wordt bestuurd op basis van de coördinaten en het schema in dat bestand (figuur 3A). Stel de coördinaten van de muiscursor in (magenta-vierkanten in figuur 3A) en wacht tot de stimulatie na het starten van de opname (magenta in figuur 3A). Stel de frequentie en de amplitudewaarden in de software in voor trillingsregeling (figuur 3B).
4. Voorbereiding van wormen voor calciumbeeldvorming
- Breng een enkele worm die zowel GCaMP als TagRFP tot expressie brengt over van de geïncubeerde plaat naar een nieuwe verse NGM-plaat waarop E. coli OP50 is gestreept.
- Bevestig de NGM-plaat met transparant plakband aan de piëzo-elektrische akoestische transducer (figuur 4). Druk de plaat niet op de actuator omdat dit de trillingsfrequentie verandert.
5. Calciumbeeldvorming onder controle van specifieke trillingseigenschappen
- Schakel de acquisitieknop in (afbeelding 2D).
- Zoek de worm onder fel licht en excitatielicht (488 nm en 560 nm).
- Stel de zoomwaarde van microscopie in op 2,5x. Het gezichtsveld is 1,1 mm x 1,1 mm met een resolutie van 2,6 μm/pixel.
- Schakel het felle licht uit en schakel de Homing-knop in (figuur 2I) om de fluorescerende vlek van een worm te volgen. Deze homing-knop start de beweging van de X-Y-fase om het maximale intensiteitsgebied van de worm in het midden van het gezichtsveld in de TagRFP-afbeelding te houden.
OPMERKING: In termen van de flp-18 promotor is de fluorescerende intensiteit van de AVA-neuronen het sterkst en die van andere neuronen zijn zwak of niet gedetecteerd. Daarom is het lage vergrotingssysteem niet vereist voor het volgen en beweegt het podium gedurende de opname. - Zorg ervoor dat de waarden van de intensiteitsbalken in figuur 2E en 2F ongeveer 1.000 zijn. Als dat niet het geval is, verfijn dan de 470 nm en 550 nm meters van de bedieningseenheid in de lichtbron.
- Druk op de knop Uitvoeren in het muismacrosysteem om muiscursorbesturing mogelijk te maken volgens een schema dat wordt beschreven in Figuur 3A. Dit begint te registreren met behulp van de trackingsoftware en wordt gestimuleerd door golfgensoftware tijdens het volgen van de worm.
- Controleer of het BMP-uitvoerbestand op de juiste manier is gemaakt.
6. Data-analyse
- Maak een map op het bureaublad en noem deze CalciumImaging.
- Maak een map in de map CalciumImaging en noem deze CIResult voor de uitvoerresultaatbestanden.
- Dubbelklik op het bestand DualViewImaging.nb geschreven in data-analysesoftware voor Windows.
- Voeg het bestandspad in de map CIResult in (bijv. DirectoryNaam[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (Afbeelding 5).
- Voeg het bestandspad naar de map in, inclusief het BMP-bestand (bijvoorbeeld SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (Afbeelding 5), waarin XXX de mapnaam aangeeft, inclusief BMP-bestanden.
- Druk tegelijkertijd op de Shift - en Return-toetsen om een automatische analyse te starten. Deze analyse gebruikt de waarde van een maximale intensiteitsgebied van het gezichtsveld in de TagRFP-afbeelding (zie de legenda van figuur 6 voor een gedetailleerde berekeningsprocedure in het programma).
- Controleer of de volgende uitvoerbestanden op de juiste manier zijn gemaakt in de map CIResult.
XXX-GCaMP.tif (afbeeldingsbestand dat sporen van GCaMP-intensiteiten voor alle afbeeldingen illustreert)
XXX-GCaMP.xls (spreadsheetbestand met GCaMP-intensiteiten in alle afbeeldingen)
XXX-TagRFP.tif (afbeeldingsbestand dat sporen van intensiteiten van TagRFP voor alle afbeeldingen illustreert)
XXX-TagRFP.xls (spreadsheetbestand met TagRFP-intensiteiten in alle afbeeldingen)
XXX-Ratio.tif (afbeeldingsbestand dat sporen van de verhoudingswaarde voor alle afbeeldingen illustreert)
XXX-Ratio.xls (spreadsheetbestand met de verhoudingswaarde in alle afbeeldingen)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier wordt een worm die zowel GCaMP als TagRFP tot expressie brengt onder controle van de AVA interneuron-specifieke promotor gebruikt als een voorbeeld van calciumbeeldvorming bij vrij gedragende C. elegans. GCaMP- en TagRFP-kanaalgegevens werden verkregen als een reeks afbeeldingen, waarvan sommige worden weergegeven in figuur 6 en als een film (aanvullende film 1). De verplaatsing van de petriplaat geïnduceerd door ons niet-gelokaliseerde trillingssysteem (figuur 7) werd ook gekwantificeerd. De verplaatsing kan worden geregeld door de amplitudewaarde in te stellen in de software voor trillingsregeling (figuur 3B) en de volumeregelaar in de versterker (figuur 4), terwijl de frequentie wordt geregeld door de frequentiewaarde in de software in te stellen (figuur 4). In de succesvolle experimenten werd een voorbijgaande calciumrespons van AVA-neuronen waargenomen bij stimulatie met trillingen met een frequentie van 630 Hz en een verplaatsing van ongeveer 4,5 μm gedurende 1 s, wat aangeeft dat het AVA-neuron werd geactiveerd tijdens de achterwaartse respons van een worm op de niet-gelokaliseerde stimulatie (figuur 6). Baselines van zowel GCaMP- als TagRFP-signalen toonden ook aan dat er bijna geen fotobleaching optrad tijdens de opname.
Figuur 1: Een schematische systeemconfiguratie. Een NGM-plaat waarop een worm vrij beweegt, wordt op een akoestische transducer gehouden. Excitatielicht (488 nm en 560 nm) wordt uitgestraald door een LED-lichtbron. GCaMP- en TagRFP-fluorescentie-emissies worden gesplitst door beeldsplitsende optica, zodat elke fluorescerende emissie wordt geprojecteerd op de helft van een sCMOS-camera. Trackingsoftware bestuurt de x-y gemotoriseerde fase om de fluorescerende plek van de worm te volgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Screenshot van de software voor het volgen van een fluorescerende plek van een worm. (A) De knop Uitvoeren voor het activeren van de software. (B) Vakken voor het instellen van de beeldweergavecyclus, belichtingstijd (en) en binning in elk kanaal. (C) Vakken voor het verstrekken van informatie over de beeldverwervingscyclus. (D) De acquisitieknop om livestreaming te starten. (E) GCaMP-afbeelding. (F) TagRFP-afbeelding. (G) Een paneel voor kalibratiecoördinaten tussen GCaMP- en TagRFP-afbeeldingen. (H) Vak voor het instellen van het bestandspad. (I) De Homing-knop om het volgen van wormen te starten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Foto van het muis macrosysteem en software voor het regelen van trillingen. (A) Het magenta-vierkant geeft de coördinaten voor de muiscursor aan. De betekenis van elke scriptregel wordt uitgelegd in magenta letters. (B) De GUI (grafische gebruikersinterface) van software voor het regelen van trillingen. Trillingsfrequentie en amplitudewaarden worden geregeld met behulp van deze GUI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Foto van de NGM-plaat die met transparant plakband op de akoestische transducer wordt gehouden. Slechts een enkele worm beweegt op de plaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Foto van de data-analysesoftware. Magenta en blauwe onderstrepingen geven respectievelijk de paden naar de map CIResult en de map inclusief BMP-bestanden aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Sporen van de intensiteiten van GCaMP (A) en TagRFP (B) fluorescentie, en de verhoudingsverandering (C,D). (Een -C) De representatieve sporen voor GCaMP-signaal, TagRFP-signaal en verhoudingsveranderingen van een enkele worm. De verhoudingswijziging wordt als volgt berekend met behulp van het bestand DualViewImaging.nb. De coördinaat waarin de intensiteit van TagRFP-fluorescentie maximaal is nadat achtergrondaftrek is geëxtraheerd voor elke afbeelding. Dit TagRFP-signaal dient om te compenseren voor focusveranderingen veroorzaakt door de beweging van het dier. De maximale fluorescentie-intensiteit van GCaMP binnen de geëxtraheerde ±10 pixels wordt berekend als de GCaMP-signaalintensiteit voor elk beeld. Voor ratiometrie wordt ((IGCaMP − IGCaMP_BG) − (ITagRFP − ITagRFP_BG)) / (ITagRFP − ITagRFP_BG) berekend, waarbij IGCaMP en ITagRFP respectievelijk de GCaMP- en TagRFP-signalen van het AVA-neuron zijn en ikGCaMP_BG en ikTagRFP_BG respectievelijk de achtergrondsignalen zijn. Dit berekeningsproces werd toegepast op alle afbeeldingen om de verhoudingsverandering in een omkeringsgebeurtenis te kwantificeren. De verticale lijn op 5 s in alle sporen geeft de stimulatieperiode aan. (D) De gemiddelde verhouding verandert voor 15 wormen. Foutbalk geeft SEM aan. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Relatie tussen parameters. (A) Vervangingen werden elke 100 Hz gemeten met behulp van een laser doppler vibrometer, waarbij de amplitudewaarde in de software en de VOLUME-regelwaarde in de versterker werden vastgesteld op respectievelijk 0 en 10. De resonantiefrequentie werd waargenomen tussen 100-200 Hz, wat vergelijkbaar was met de waarde beschreven in de specificatie van de akoestische transducer. (B) Frequenties en verplaatsingen werden geregeld door respectievelijk de software (bereik; 100 tot 1000 Hz) en de versterker (bereik: 1-10) en gemeten met behulp van een laser doppler vibrometer. De door de software geselecteerde amplitudewaarde wordt voor elke frequentie aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende film 1: Een representatieve film voor calciumtransiënten in een AVA-interneuron van een vrij gedragende worm als reactie op een 630 Hz niet-gelokaliseerde trilling. Stimulatie werd 5 s na het starten van de opname opgeroepen. GFP werd ook uitgedrukt in de darm van de worm als een co-injectiemarker voor GCaMP. Deze GFP-fluorescentie heeft geen invloed op de signaalintensiteit van GCaMP. De schaalbalk wordt ook aangegeven in de eerste afbeelding. De richting van de worm wordt rechtsboven na de eerste afbeelding aangegeven. De Windows-mediaspeler is geschikt voor het afspelen van het AVI-bestand, maar het kan ook worden afgespeeld met behulp van enkele gratis gedownloade mediaspelers, zoals VLC-mediaspeler op de Mac. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Over het algemeen vereist de kwantificering van neurale activiteit de introductie van een sonde en / of beperkingen op de beweging van het lichaam van dieren. Voor studies van mechanosensorisch gedrag vormen de invasieve introductie van een sonde en beperkingen zelf echter mechanische stimuli. C. elegans biedt een systeem om deze problemen te omzeilen, omdat de kenmerken ervan transparant zijn en omdat het een eenvoudig, compact neuraal circuit heeft dat slechts 302 neuronen omvat. Door deze voordelen te combineren met de eerder ontwikkelde methode voor het oproepen van niet-gelokaliseerde trillingen van verplaatsing op nanoschaal13, wordt hier geïllustreerd een methode voor niet-invasieve calciumbeeldvorming van ongeremde C. elegans die reageren op gecontroleerde trillingen.
Eigenschappen van mechanische stimuli worden gedefinieerd door verschillende parameters, zoals frequentie, verplaatsing en duur. Onlangs is biotremologie naar voren gekomen als een nieuw onderzoeksveld1. Het belangrijkste doel van dergelijke studies is om mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de productie, verspreiding en ontvangst van mechanische trillingen door organismen, en de invloed van die trillingen op gedrag. Veel dieren, waaronder mensen, gebruiken trillingen en akoestische golven om de omgeving te bewaken. Schorpioenen detecteren bijvoorbeeld prooien door middel van substraatgedragen trillingen14. Daarom is vibratie een communicatiemiddel met de omgeving. De hier beschreven methode kan worden gebruikt om invoerparameters te regelen en neurale responsen op het niveau van één neuron te kwantificeren, wat leidt tot een creatie van een fasediagram dat de input-outputrelatie beschrijft. Op basis van dergelijke fasediagrammen kunnen we inzicht krijgen in welke parameters specifieke neurale circuits beïnvloeden en door welke mechanismen dieren omgaan met mechanische trillingen.
Sinds 200715 zijn verschillende systemen ontwikkeld voor single-neuron calcium beeldvorming in vrij bewegende C. elegans. Deze systemen hebben zich voornamelijk gericht op neuronale reacties op temperatuur15,16, geurstoffen16,17 en aanraakprikkels17. Met betrekking tot niet-gelokaliseerde trillingen wordt de methode van het tikken op een petriplaat al lang toegepast voor het kwantificeren van gedragsreacties. Het tikken op een petriplaat op een gemotoriseerd x-y-podium zorgde er echter voor dat de fluorescerende plek het gezichtsveld verliet, wat leidde tot het niet volgen van een vrij gedragende worm. Daarom werd de piëzo-elektrische akoestische transducer, die niet-gelokaliseerde trillingen over de z-as oproept, in het volgsysteem ingebed. Deze methode maakt de uitvoering van reproduceerbare experimenten mogelijk voor het kwantificeren van neuronale reacties op niet-gelokaliseerde trillingen.
De gedemonstreerde methoden bieden ook de mogelijkheid tot verdere methodologische uitbreiding. Omdat het huidige protocol reacties van slechts één neuron in twee dimensies kan vastleggen, moet het autofocussysteem in de toekomst worden uitgerust om verlies van focus te voorkomen. Aan de andere kant, omdat er onlangs verschillende volumetrische beeldvormingsmethoden zijn ontwikkeld met behulp van C. elegans 18,19,20,21, zou uitbreiding van de benadering van volumetrische beeldvorming niet-invasieve kwantificering van meerdere neuronen22 of zelfs de hele hersenen 18,19,20,21 mogelijk moeten maken , als reactie op trillingen met controleerbare eigenschappen. Een dergelijk systeem kan worden toegepast op het onlangs opgerichte systeem om mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan collectief gedrag23. Daarom zullen verdere biologische toepassingen en uitbreidingen van de methode ons waarschijnlijk in staat stellen om neurale mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan mechanosensorisch gedrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
We danken het Caenorhabditis Genetics Center voor het leveren van de stammen die in deze studie worden gebruikt. Deze publicatie werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific research (B) (Grantnr. JP18H02483), over innovatieve gebieden "Science of Soft Robot" project (Grant nr. JP18H05474), de PRIME van het Japan Agency for Medical Research and Development (subsidienummer 19gm6110022h001) en de Shimadzu foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
- Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
- Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
- Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
- Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
- Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
- Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).
- Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
- Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
- Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
- Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
- Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
- Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
- Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
- Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
