Summary
Hier wird ein System zur Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter , nicht lokalisierter Vibration berichtet. Dieses System ermöglicht es den Forschern, nicht lokalisierte Schwingungen mit gut kontrollierten Eigenschaften bei nanoskaliger Verschiebung hervorzurufen und Kalziumströme während der Reaktionen von C. elegans auf die Schwingungen zu quantifizieren.
Abstract
Nicht lokalisierte mechanische Kräfte wie Schwingungen und akustische Wellen beeinflussen eine Vielzahl biologischer Prozesse von der Entwicklung bis zur Homöostase. Tiere bewältigen diese Reize, indem sie ihr Verhalten ändern. Das Verständnis der Mechanismen, die einer solchen Verhaltensänderung zugrunde liegen, erfordert eine Quantifizierung der neuronalen Aktivität während des interessierenden Verhaltens. Hier berichten wir über eine Methode zur Kalziumbildgebung bei freiem Verhalten von Caenorhabditis elegans mit nicht lokalisierten Schwingungen spezifischer Frequenz, Verschiebung und Dauer. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingungen unter Verwendung eines akustischen Wandlers und die Quantifizierung evozierter Kalziumreaktionen bei Einzelzellauflösung. Als Beweis für das Prinzip wird die Calciumreaktion eines einzelnen Interneurons, AVA, während der Fluchtreaktion von C. elegans auf Vibration demonstriert. Dieses System wird das Verständnis neuronaler Mechanismen erleichtern, die Verhaltensreaktionen auf mechanische Reize zugrunde liegen.
Introduction
Tiere sind oft nicht lokalisierten mechanischen Reizen wie Vibrationen oder akustischen Wellenausgesetzt 1,2. Da diese Reize die Homöostase, Entwicklung und Fortpflanzung beeinflussen, müssen Tiere ihr Verhalten ändern, um mit ihnen fertig zu werden 3,4,5. Die neuronalen Schaltkreise und Mechanismen, die einer solchen Verhaltensänderung zugrunde liegen, sind jedoch kaum verstanden.
Mechanosensorisches Verhalten im Fadenwurz, Caenorhabditis elegans, ist ein einfaches Verhaltensparadigma, bei dem Würmer normalerweise ihr Verhalten von der Vorwärtsbewegung zu einer Rückwärtsfluchtreaktion ändern, wenn sie auf nichtlokalisierte Schwingungen stoßen6. Der neuronale Schaltkreis, der diesem Verhalten zugrunde liegt, besteht hauptsächlich aus fünf sensorischen Neuronen, vier Paaren von Interneuronen und mehreren Arten von Motoneuronen 7,8. Darüber hinaus gewöhnen sich Würmer an solche mechanischen Reize nach dem Training im Abstand mit wiederholter Stimulation 9,10,11. Daher stellt diese einfache Verhaltensreaktion ein ideales System dar, um neuronale Mechanismen zu untersuchen, die sowohl dem nicht lokalisierten Schwingungsverhalten als auch dem Gedächtnis zugrunde liegen. Ein Protokoll für die Kalziumbildgebung bei sich frei verhaltenden Würmern unter dem Einfluss von nicht lokalisierten Schwingungen wird veranschaulicht. Im Vergleich zu zuvor gemeldeten Systemen ist dieses System insofern einfach, als es keine zusätzliche Kamera für die Verfolgung benötigt. Es ermöglicht uns jedoch, die Frequenz, Verschiebung und Dauer der nicht lokalisierten Schwingung zu ändern. Da die Aktivierung der AVA-Interneuronen die Rückwärtsfluchtreaktion induziert, wurden Würmer, die GCaMP, einen Kalziumindikator, und TagRFP, ein calciuminsensitives fluoreszierendes Protein, unter der Kontrolle eines AVA-spezifischen Promotors mitexprimieren, als Beispiel verwendet (siehe Tabelle der Materialien für Details). Das Protokoll demonstriert die Aktivierung von AVA-Neuronen, wenn ein Wurm von der Vorwärts- zur Rückwärtsbewegung wechselt. Dieses Protokoll erleichtert das Verständnis des neuronalen Schaltkreismechanismus, der dem mechanosensorischen Verhalten zugrunde liegt.
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Protocol
1. Kultivierung von Würmern bis zur Kalziumbildgebung
- Übertragen Sie vier Tage vor einem Calcium-Imaging-Experiment zwei erwachsene ST12-Würmer auf eine neue Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) -Platte (Table of Materials), auf der Escherichia coli OP50 in einem quadratischen Muster (ca. 4 mm x 4 mm) mit einem Zellstreuer gestreift sind, so dass der Wurm während der Kalziumbildgebung die meiste Zeit in den Bakterien verbringt12.
- Inkubieren Sie diese NGM-Platte für 4 Tage bei 20 °C in einem Inkubator (Table of Materials).
2. Hardware-Setup
- Bereiten Sie ein Mikroskop vor, das mit einem piezoelektrischen Gerät zur Stimulation13, einem 2-fachen Objektiv, einer Hochgeschwindigkeits-sCMOS-Kamera, einer Bildaufteilungsoptik, einem motorisierten X-Y-Tisch, einer LED-Lichtquelle für die Anregung und einem Computer ausgestattet ist (Abbildung 1). Zu den wesentlichen Spezifikationen der sCMOS-Kamera gehören 2560 x 2160 aktive Pixel, 6,5 μm groß, mit einer 10-Tap-Kameraverbindung als Schnittstellenoption. Zu den wichtigsten Spezifikationen der motorisierten X-Y-Stufe gehören ein Verfahrbereich von 110 mm x 75 mm, eine maximale Geschwindigkeit von 250 mm/s, eine maximale Beschleunigung von 2.000 mm/sund eine unidirektionale Wiederholbarkeit von 0,25 μm.
- Schalten Sie den Computer und den motorisierten X-Y-Stagecontroller ein.
- Schalten Sie den Verstärker ein und stellen Sie den Lautstärkeregler auf 10 und den Bass- und Höhenregler auf 8.
- Um GCaMP und TagRFP anzuregen, schalten Sie die 488 nm und 560 nm Lichter der LED-Lichtquelle ein. Stellen Sie die Messgeräte von 470 nm und 550 nm der Steuerkapsel in der Lichtquelle auf 5% ein, damit die Intensität des LED-Lichts für die Bildgebung geeignet ist.
HINWEIS: Bei dieser LED-Intensität findet während der Aufnahme kein Photobleaching der GCaMP- und TagRFP-Fluoreszenz statt.
3. Software-Setup für die Kalziumbildgebung
- Laden Sie drei Softwarepakete in Windows herunter und installieren Sie sie: Mausmakrosoftware, Software zur Steuerung der Schwingungseigenschaft, Software zum Ausführen von Tracking-Software und Software zur Datenanalyse (Table of Materials).
- Doppelklicken Sie auf die Tracking-Softwaredatei.
- Drücken Sie die Taste Ausführen , und warten Sie 5 Minuten, bis die Software stabilisiert ist (Abbildung 2A).
- Geben Sie die Informationen zur Belichtungszeit und zum Binning an. 0,033 s Belichtungszeit mit 2 x 2 Binning sorgen für eine flüssige Bildaufnahme (Abbildung 2B).
HINWEIS: Es wird nur jedes 10. aufgenommene Bild angezeigt, um die Speicherlast zureduzieren. - Geben Sie die Informationen für die Bildaufnahme an (Abbildung 2C). Wenn beispielsweise 500 Bilder zweimal mit einem Intervall von 10 s aufgezeichnet werden, geben Sie 1.000 in das Feld Bilder insgesamt, 500 in das Feld Bilder und 10 in das Feld Intervall (s) ein.
- Aktivieren Sie die Schaltfläche "Erfassung" (Abbildung 2D).
- Teilen Sie das Fluoreszenzbild mithilfe der Bildaufteilungsoptik und die beiden Bilder auf (GCaMP-Kanal, 500-525 nm (Abbildung 2E); TagRFP-Kanäle, 584-676 nm (Abbildung 2F)) werden auf zwei Hälften der sCMOS-Kamera projiziert. Kalibrieren Sie die Koordinaten der GCaMP- und TagRFP-Kanäle (Abbildung 2G). Speichern Sie die Softwareeinstellungen.
- Legen Sie das Verzeichnis fest, um die Datendatei auszugeben (Abbildung 2H).
- Deaktivieren Sie die Schaltfläche "Erfassung" (Abbildung 2D).
- Doppelklicken Sie auf die Mausmakro-Systemsoftware (Abbildung 3A) und stellen Sie die Schwingungseigenschaften ein (Abbildung 3B). Lesen Sie die Assay.txt Datei mit dem Mausmakrosystem, sodass der Mauszeiger basierend auf den Koordinaten und dem Zeitplan in dieser Datei gesteuert wird (Abbildung 3A). Legen Sie die Koordinaten des Mauszeigers fest (Magenta-Quadrate in Abbildung 3A) und warten Sie nach dem Start der Aufzeichnung bis zur Stimulation (Magenta in Abbildung 3A). Stellen Sie die Frequenz- und Amplitudenwerte in der Software zur Schwingungsdämpfung ein (Abbildung 3B).
4. Vorbereitung von Würmern für die Kalziumbildgebung
- Übertragen Sie einen einzelnen Wurm, der sowohl GCaMP als auch TagRFP ausdrückt, von der inkubierten Platte auf eine neue frische NGM-Platte, auf der E. coli OP50 gestreift wurde.
- Befestigen Sie die NGM-Platte mit transparentem Klebeband am piezoelektrischen akustischen Wandler (Abbildung 4). Drücken Sie die Platte nicht auf den Aktuator, da dies die Schwingungsfrequenz verändert.
5. Calcium-Bildgebung unter Kontrolle spezifischer Schwingungseigenschaften
- Aktivieren Sie die Schaltfläche "Erfassung" (Abbildung 2D).
- Finden Sie den Wurm unter hellem Licht und Anregungslicht (488 nm und 560 nm).
- Stellen Sie den Zoomwert der Mikroskopie auf 2,5x ein. Das Sichtfeld beträgt 1,1 mm x 1,1 mm bei einer Auflösung von 2,6 μm/Pixel.
- Schalten Sie das helle Licht aus und dann die Homing-Taste (Abbildung 2I), um den fluoreszierenden Fleck eines Wurms zu verfolgen. Diese Homing-Taste startet die Bewegung der X-Y-Stufe, um den maximalen Intensitätsbereich des Wurms in der Mitte des Sichtfeldes im TagRFP-Bild zu halten.
HINWEIS: In Bezug auf den flp-18-Promotor ist die Fluoreszenzintensität der AVA-Neuronen am stärksten und die von anderen Neuronen sind schwach oder werden nicht erkannt. Daher ist das niedrige Vergrößerungssystem für die Verfolgung nicht erforderlich und die Bühne bewegt sich während der gesamten Aufnahme. - Stellen Sie sicher, dass die Werte der Intensitätsbalken in Abbildung 2E und 2F ungefähr 1.000 betragen. Wenn dies nicht der Fall ist, stimmen Sie die Messgeräte 470 nm und 550 nm des Steuerpods in der Lichtquelle ab.
- Drücken Sie die Taste Ausführen im Mausmakrosystem, um die Steuerung des Mauszeigers gemäß einem in Abbildung 3A beschriebenen Zeitplan zuzulassen. Dies beginnt mit der Tracking-Software aufzuzeichnen und stimuliert durch Wellen-Gen-Software, während der Wurm verfolgt wird.
- Überprüfen Sie, ob die BMP-Ausgabedatei ordnungsgemäß erstellt wurde.
6. Datenanalyse
- Erstellen Sie einen Ordner auf dem Desktop und nennen Sie ihn CalciumImaging.
- Erstellen Sie einen Ordner im CalciumImaging-Ordner und nennen Sie ihn CIResult für die Ausgabeergebnisdateien.
- Doppelklicken Sie auf die Datei DualViewImaging.nb , die in der Datenanalysesoftware für Windows geschrieben wurde.
- Fügen Sie den Dateipfad in den CIResult-Ordner ein (z. B. DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (Abbildung 5).
- Fügen Sie den Dateipfad in den Ordner ein, der die BMP-Datei enthält (z. B. SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (Abbildung 5), wobei XXX den Ordnernamen einschließlich der BMP-Dateien bezeichnet.
- Drücken Sie gleichzeitig die Umschalttaste und die Eingabetaste , um eine automatische Analyse zu starten. Diese Analyse verwendet den Wert eines maximalen Intensitätsbereichs des Sichtfelds im TagRFP-Bild (siehe die Legende von Abbildung 6 für ein detailliertes Berechnungsverfahren im Programm).
- Überprüfen Sie, ob die folgenden Ausgabedateien im CIResult-Ordner ordnungsgemäß erstellt wurden.
XXX-GCaMP.tif (Bilddatei mit Spuren von GCaMP-Intensitäten für alle Bilder)
XXX-GCaMP.xls (Tabellenkalkulationsdatei, die die GCaMP-Intensitäten in allen Bildern auflistet)
XXX-TagRFP.tif (Bilddatei, die Spuren der Intensitäten von TagRFP für alle Bilder veranschaulicht)
XXX-TagRFP.xls (Tabellenkalkulationsdatei, die TagRFP-Intensitäten in allen Bildern auflistet)
XXX-Ratio.tif (Bilddatei, die Spuren des Verhältniswerts für alle Bilder veranschaulicht)
XXX-Ratio.xls (Tabellenkalkulationsdatei, die den Verhältniswert in allen Bildern auflistet)
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Representative Results
Hier wird ein Wurm, der sowohl GCaMP als auch TagRFP unter Kontrolle des AVA-Interneuron-spezifischen Promotors exprimiert, als Beispiel für die Kalziumbildgebung bei freiem Verhalten von C. elegans verwendet. GCaMP- und TagRFP-Kanaldaten wurden als eine Reihe von Bildern, von denen einige in Abbildung 6 dargestellt sind, und als Film (Supplemental Movie 1) erhalten. Die Verschiebung der Petriplatte, die durch unser nicht lokalisiertes Schwingungssystem induziert wird (Abbildung 7), wurde ebenfalls quantifiziert. Die Verschiebung kann durch Einstellen des Amplitudenwertes in der Software zur Schwingungsregelung (Abbildung 3B) und des Lautstärkereglers im Verstärker (Abbildung 4) gesteuert werden, während die Frequenz durch Einstellen des Frequenzwertes in der Software geregelt wird (Abbildung 4). In den erfolgreichen Experimenten wurde bei Stimulation eine transiente Kalziumreaktion von AVA-Neuronen mit Vibrationen mit einer Frequenz von 630 Hz und einer Verschiebung von etwa 4,5 μm für 1 s beobachtet, was darauf hindeutet, dass das AVA-Neuron während der Rückwärtsreaktion eines Wurms auf die nicht lokalisierte Stimulation aktiviert wurde (Abbildung 6). Baselines von GCaMP- und TagRFP-Signalen zeigten auch, dass während der Aufnahme fast keine Photobleiche auftrat.
Abbildung 1: Eine schematische Systemkonfiguration. Eine NGM-Platte, auf der sich ein Wurm frei bewegt, wird auf einem akustischen Wandler gehalten. Anregungslicht (488 nm und 560 nm) wird von einer LED-Lichtquelle emittiert. GCaMP- und TagRFP-Fluoreszenzemissionen werden durch bildspaltende Optiken aufgeteilt, so dass jede Fluoreszenzemission auf die Hälfte einer sCMOS-Kamera projiziert wird. Tracking-Software steuert die motorisierte x-y-Stufe, um den fluoreszierenden Punkt des Wurms zu verfolgen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Screenshot der Software zur Verfolgung eines fluoreszierenden Flecks eines Wurms . (A) Die Schaltfläche Ausführen zum Aktivieren der Software. (B) Boxen zum Einstellen des Bildanzeigezyklus, der Belichtungszeit(en) und des Binning in jedem Kanal. (C) Kästchen zur Bereitstellung von Informationen über den Bilderfassungszyklus. (D) Die Schaltfläche "Erfassung" zum Initiieren des Live-Streamings. (E) GCaMP-Bild. (F) TagRFP-Bild. (G) Ein Panel zur Kalibrierung von Koordinaten zwischen GCaMP- und TagRFP-Bildern. (H) Box zum Festlegen des Dateipfads. (I) Die Homing-Taste , um das Wurm-Tracking zu starten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Foto des Mausmakrosystems und der Software zur Steuerung von Vibrationen. (A) Das Magenta-Quadrat gibt die Koordinaten für den Mauszeiger an. Die Bedeutung jeder Schriftzeile wird in magentafarbenen Buchstaben erklärt. (B) Die GUI (grafische Benutzeroberfläche) von Software zur Steuerung von Schwingungen. Schwingungsfrequenz- und Amplitudenwerte werden über diese GUI gesteuert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Foto der NGM-Platte, die mit transparentem Klebeband auf dem akustischen Wandler gehalten wird. Nur ein einziger Wurm bewegt sich auf dem Teller. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Foto der Datenanalysesoftware. Magenta und blaue Unterstreichungen zeigen die Pfade zum CIResult-Ordner bzw. zum Ordner mit BMP-Dateien an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Spuren der Intensitäten der GCaMP (A) und TagRFP (B) Fluoreszenz und der Verhältnisänderung (C,D). (A -C) Der Vertreter verfolgt das GCaMP-Signal, das TagRFP-Signal und die Verhältnisänderungen eines einzelnen Wurms. Die Verhältnisänderung wird mithilfe der Datei DualViewImaging.nb wie folgt berechnet. Die Koordinate, in der die Intensität der TagRFP-Fluoreszenz maximal ist, nachdem die Hintergrundsubtraktion für jedes Bild extrahiert wurde. Dieses TagRFP-Signal dient dazu, Fokusänderungen zu kompensieren, die durch die Bewegung des Tieres verursacht werden. Die maximale Fluoreszenzintensität von GCaMP innerhalb der extrahierten Koordinate ±10 Pixel wird als GCaMP-Signalintensität für jedes Bild berechnet. Für die Ratiometrie wird ((I GCaMP − I GCaMP_BG) − (I TagRFP − ITagRFP_BG)) / (I TagRFP − I TagRFP_BG) berechnet, wobei I GCaMP und I TagRFP dieGCaMP- bzw.TagRFP-Signale desAVA-Neurons sind und IGCaMP_BG und I TagRFP_BG die Hintergrundsignale sind. Dieser Berechnungsprozess wurde auf alle Bilder angewendet, um die Verhältnisänderung in einem Umkehrereignis zu quantifizieren. Die vertikale Linie bei 5 s in allen Spuren zeigt die Stimulationsdauer an. (D) Das durchschnittliche Verhältnis ändert sich für 15 Würmer. Der Fehlerbalken zeigt REM an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Beziehung zwischen Parametern. (A) Der Austausch wurde alle 100 Hz mit einem Laser-Doppler-Vibrometer gemessen, bei dem der Amplitudenwert in der Software und der VOLUME-Einstellwert im Verstärker auf 0 bzw. 10 festgelegt wurden. Die Resonanzfrequenz wurde zwischen 100-200 Hz beobachtet, was dem in der Spezifikation des akustischen Wandlers beschriebenen Wert ähnlich war. (B) Frequenzen und Verschiebungen wurden von der Software (Bereich; 100 bis 1000 Hz) bzw. dem Verstärker (Bereich: 1-10) gesteuert und mit einem Laser-Doppler-Vibrometer gemessen. Der von der Software gewählte Amplitudenwert wird für jede Frequenz angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzungsfilm 1: Ein repräsentativer Film für Calciumtransienten in einem AVA-Interneuron eines sich frei verhaltenden Wurms als Reaktion auf eine nicht lokalisierte 630 Hz-Vibration. Die Stimulation wurde 5 s nach Beginn der Aufnahme hervorgerufen. GFP wurde auch im Darm des Wurms als Co-Injektionsmarker für GCaMP exprimiert. Diese GFP-Fluoreszenz hat keinen Einfluss auf die Signalintensität von GCaMP. Die Maßstabsleiste ist auch im ersten Bild angezeigt. Die Richtung des Wurms wird oben rechts nach dem ersten Bild angezeigt. Der Windows Media Player eignet sich zum Abspielen der AVI-Datei, kann aber auch mit einigen kostenlos heruntergeladenen Mediaplayern wie dem VLC Media Player auf dem Mac abgespielt werden . Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Im Allgemeinen erfordert die Quantifizierung der neuronalen Aktivität die Einführung einer Sonde und / oder Einschränkungen der Körperbewegung von Tieren. Für Studien des mechanosensorischen Verhaltens stellen jedoch die invasive Einführung einer Sonde und der Fesseln selbst mechanische Reize dar. C. elegans bietet ein System, um diese Probleme zu umgehen, weil seine Eigenschaften transparent sind und weil es einen einfachen, kompakten neuronalen Schaltkreis hat, der nur 302 Neuronen umfasst. Durch die Kombination dieser Vorteile mit der zuvor entwickelten Methode zur Evokation nichtlokalisierter Schwingungen nanoskaliger Verschiebung13 wird hier eine Methode zur nichtinvasiven Kalziumbildgebung von hemmungslosen C. elegans veranschaulicht, die auf kontrollierte Vibrationen reagiert.
Eigenschaften mechanischer Reize werden durch mehrere Parameter wie Frequenz, Verschiebung und Dauer definiert. In jüngster Zeit hat sich die Biotremologie als neues Forschungsfeldherauskristallisiert 1. Der Hauptzweck solcher Studien besteht darin, die Mechanismen zu verstehen, die der Produktion, Ausbreitung und dem Empfang mechanischer Schwingungen durch Organismen und dem Einfluss dieser Schwingungen auf das Verhalten zugrunde liegen. Viele Tiere, einschließlich Menschen, verwenden Vibrationen und akustische Wellen, um die Umgebung zu überwachen. Zum Beispiel erkennen Skorpione Beute durch substratgetragene Vibration14. Daher ist Vibration ein Werkzeug der Kommunikation mit der Umgebung. Die hier beschriebene Methode kann verwendet werden, um Eingabeparameter zu steuern und neuronale Reaktionen auf Einzelneuronenebene zu quantifizieren, was zu einer Erstellung eines Phasendiagramms führt, das die Input-Output-Beziehung beschreibt. Basierend auf solchen Phasendiagrammen können wir Erkenntnisse darüber gewinnen, welche Parameter bestimmte neuronale Schaltkreise beeinflussen und durch welche Mechanismen Tiere mit mechanischen Schwingungen umgehen.
Seit 200715 wurden mehrere Systeme für die Einzelneuronen-Kalziumbildgebung in frei beweglichen C. elegans entwickelt. Diese Systeme haben sich hauptsächlich auf neuronale Reaktionen auf Temperatur15,16, Geruchsstoffe 16,17 und Berührungsreize 17 konzentriert. In Bezug auf nicht lokalisierte Schwingungen wird die Methode des Klopfens einer Petriplatte seit langem zur Quantifizierung von Verhaltensreaktionen angewendet. Das Tippen auf eine Petriplatte auf einer motorisierten x-y-Stufe führte jedoch dazu, dass der fluoreszierende Fleck das Sichtfeld verließ, was dazu führte, dass ein sich frei verhaltender Wurm nicht verfolgt werden konnte. Daher wurde der piezoelektrische akustische Wandler, der nicht lokalisierte Schwingungen über die z-Achse hervorruft, in das Nachführsystem eingebettet. Diese Methode ermöglicht die Durchführung reproduzierbarer Experimente zur Quantifizierung neuronaler Reaktionen auf nichtlokalisierte Schwingungen.
Die demonstrierten Methoden bieten auch die Möglichkeit einer weiteren methodischen Erweiterung. Da das aktuelle Protokoll Antworten nur eines einzelnen Neurons in zwei Dimensionen erfassen kann, sollte das Autofokussystem in Zukunft so ausgestattet sein, dass es einen Verlust des Fokus verhindert. Da andererseits in letzter Zeit mehrere volumetrische Bildgebungsverfahren mit C. elegans 18,19,20,21 entwickelt wurden, sollte die Erweiterung des Ansatzes der volumetrischen Bildgebung eine nichtinvasive Quantifizierung mehrerer Neuronen22 oder sogar des gesamten Gehirnsermöglichen 18,19,20,21 , als Reaktion auf Vibrationen mit kontrollierbaren Eigenschaften. Ein solches System könnte auf das kürzlich etablierte System angewendet werden, um Mechanismen zu untersuchen, die dem kollektiven Verhalten zugrunde liegen23. Daher werden weitere biologische Anwendungen und Erweiterungen der Methode es uns wahrscheinlich ermöglichen, neuronale Mechanismen zu verstehen, die mechanosensorischen Verhaltensweisen zugrunde liegen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken dem Caenorhabditis Genetics Center für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Stämme. Diese Veröffentlichung wurde unterstützt durch JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant Nr. JP18H02483), zu innovativen Bereichen des Projekts "Science of Soft Robot" (Förderkennzeichen JP18H05474), die PRIME der Japan Agency for Medical Research and Development (Fördernummer 19gm6110022h001) und die Shimadzu-Stiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
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