Summary
Rapportert her er et system for kalsiumavbildning i fritt oppføre Caenorhabditis elegans med godt kontrollert, ikke-lokalisert vibrasjon. Dette systemet gjør det mulig for forskere å fremkalle ikke-lokaliserte vibrasjoner med godt kontrollerte egenskaper ved nanoskala forskyvning og å kvantifisere kalsiumstrømmer under respons av C. elegans til vibrasjonene.
Abstract
Ikke-lokaliserte mekaniske krefter, som vibrasjoner og akustiske bølger, påvirker et bredt spekter av biologiske prosesser fra utvikling til homeostase. Dyr takler disse stimuliene ved å endre deres oppførsel. Å forstå mekanismene som ligger til grunn for en slik atferdsendring krever kvantifisering av nevral aktivitet under oppførselen av interesse. Her rapporterer vi en metode for kalsiumavbildning i fritt oppførende Caenorhabditis elegans med ikke-lokalisert vibrasjon av spesifikk frekvens, forskyvning og varighet. Denne metoden tillater produksjon av godt kontrollert, ikke-lokalisert vibrasjon ved hjelp av en akustisk svinger og kvantifisering av fremkalte kalsiumresponser ved encellet oppløsning. Som et prinsippbevis demonstreres kalsiumresponsen til en enkelt internuron, AVA, under Rømmingsresponsen fra C. elegans til vibrasjon. Dette systemet vil lette forståelsen av nevrale mekanismer som ligger til grunn for atferdsresponser på mekaniske stimuli.
Introduction
Dyr blir ofte utsatt for ikke-lokaliserte mekaniske stimuli som vibrasjoner eller akustiske bølger 1,2. Fordi disse stimuliene påvirker homeostase, utvikling og reproduksjon, må dyr endre sin oppførsel for å takle dem 3,4,5. Imidlertid er nevrale kretser og mekanismer som ligger til grunn for slik atferdsendring dårlig forstått.
Mekanosensorisk oppførsel i nematoden, Caenorhabditis elegans, er et enkelt atferdsparadigme, der ormer vanligvis endrer oppførsel fra fremoverbevegelse til en bakoverfluktrespons når de støter på ikke-lokalisert vibrasjon6. Den nevrale kretsen som ligger til grunn for denne oppførselen består hovedsakelig av fem sensoriske nevroner, fire par internuroner og flere typer motoriske nevroner 7,8. I tillegg vaner ormer seg til slike mekaniske stimuli etter spredt trening som involverer gjentatt stimulering 9,10,11. Derfor utgjør denne enkle atferdsresponsen et ideelt system for å undersøke nevrale mekanismer som ligger til grunn for både ikke-lokalisert vibrasjons-fremkalt oppførsel og minne. En protokoll for kalsiumavbildning i fritt oppførende ormer under påvirkning av ikke-lokaliserte vibrasjoner er illustrert. Sammenlignet med tidligere rapporterte systemer, er dette systemet enkelt ved at det ikke krever et ekstra kamera for sporing; Det lar oss imidlertid endre frekvensen, forskyvningen og varigheten av ikke-lokalisert vibrasjon. Fordi aktivering av AVA-internuronene induserer fluktresponsen bakover, ble ormer som samtidig uttrykker GCaMP, en kalsiumindikator og TagRFP, et kalsium ufølsomt fluorescerende protein, under kontroll av en AVA-spesifikk promotor, brukt som et eksempel (se Tabell over materialer for detaljer). Protokollen demonstrerer aktivering av AVA-nevroner når en orm bytter fra fremover til bakover bevegelse. Denne protokollen letter forståelsen av den nevrale kretsmekanismen som ligger til grunn for mekanosensorisk oppførsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dyrking av ormer til kalsiumavbildning
- Fire dager før et kalsiumavbildningseksperiment, overfør to voksne ST12 ormer til en ny nematodevekstmediumplate (NGM) (Materialbord) som Escherichia coli OP50 er strødd i et firkantet mønster (ca. 4 mm x 4 mm) ved hjelp av en cellespreder slik at ormen tilbringer mesteparten av tiden i bakteriene under kalsiumavbildning12.
- Inkuber denne NGM-platen i 4 dager ved 20 °C i en inkubator (Materialbord).
2. Maskinvareoppsett
- Forbered et mikroskop utstyrt med en piezoelektrisk enhet for stimulering13, et 2x objektiv objektiv, et høyhastighets sCMOS-kamera, bildedelingsoptikk, et x-y motorisert stadium, en LED-lyskilde for eksitasjon og en datamaskin (figur 1). Viktige spesifikasjoner for sCMOS-kameraet inkluderer 2560 x 2160 aktive piksler, 6,5 μm i størrelse, med en kamerakobling med 10 trykk som et grensesnittalternativ. Viktige spesifikasjoner for X-Y motorisert stadium inkluderer 110 mm x 75 mm reiseområde, 250 mm / s maksimal hastighet, 2000 mm / s2 maks akselerasjon og 0,25 μm enveis repeterbarhet.
- Slå på datamaskinen og den motoriserte trinnkontrolleren x-y.
- Slå på forsterkeren og sett volumjusteringen til 10 og bass- og diskantjusteringene til 8.
- For å begeistre GCaMP og TagRFP, slå på lysdioden på 488 nm og 560 nm i LED-lyskilden. Sett målerne på 470 nm og 550 nm av kontrollsensoren i lyskilden til 5% slik at intensiteten på LED-lyset er egnet for avbildning.
MERK: Ved denne LED-intensiteten oppstår ikke fotobleaching av GCaMP- og TagRFP-fluorescens under opptak.
3. Programvareoppsett for kalsiumavbildning
- Last ned og installer tre programvarepakker i Windows: musemakroprogramvare, programvare for å kontrollere vibrasjonsegenskap, programvare for kjøring av sporingsprogramvare og programvare for dataanalyse (Tabell over materialer).
- Dobbeltklikk på sporingsprogramvarefilen.
- Trykk på Kjør-knappen og vent i 5 minutter for å stabilisere programvaren (figur 2A).
- Oppgi informasjon om eksponeringstid og binning. 0,033 s eksponeringstid med 2 x 2 binning sikrer jevn bildeanskaffelse (figur 2B).
MERK: Bare hverttiende bilde som er anskaffet, vises for å redusere minnebelastningen. - Oppgi informasjonen for bildeanskaffelse (figur 2C). Når for eksempel 500 bilder tas opp to ganger med et intervall på 10 s, skriver du inn 1 000 i boksen Totalt antall bilder , 500 i Bilder-boksen og 10 i Intervall(er)- boksen.
- Slå på Anskaffelse-knappen (figur 2D).
- Del fluorescensbildet ved hjelp av bildedelingsoptikk, og de to bildene (GCaMP-kanal, 500-525 nm (figur 2E); TagRFP-kanalen, 584-676 nm (figur 2F)) projiseres på to halvdeler av sCMOS-kameraet. Kalibrer koordinatene til GCaMP- og TagRFP-kanalene (figur 2G). Lagre programvareinnstillingene.
- Angi at mappen skal sende datafilen (figur 2H).
- Slå av Anskaffelse-knappen (figur 2D).
- Dobbeltklikk på programvaren for musemakrosystemet (figur 3A) og angi vibrasjonsegenskapene (figur 3B). Les analysen .txt fil med musemakrosystemet slik at musepekeren styres basert på koordinatene og tidsplanen i filen (figur 3A). Angi koordinatene til musepekeren (magenta firkanter i figur 3A) og vent til stimulering etter at du har startet opptaket (magenta i figur 3A). Still inn frekvensen og amplitudeverdiene i programvaren for vibrasjonskontroll (figur 3B).
4. Fremstilling av ormer for kalsiumavbildning
- Overfør en enkelt orm som uttrykker både GCaMP og TagRFP fra den inkuberte platen til en ny fersk NGM-plate som E. coli OP50 har blitt strødd på.
- Fest NGM-platen til den piezoelektriske akustiske svingeren ved hjelp av gjennomsiktig tape (figur 4). Ikke trykk platen på aktuatoren fordi dette endrer vibrasjonsfrekvensen.
5. Kalsiumavbildning under kontroll av spesifikke vibrasjonsegenskaper
- Slå på Anskaffelse-knappen (figur 2D).
- Finn ormen under sterkt lys og eksitasjonslys (488 nm og 560 nm).
- Sett zoomverdien for mikroskopi til 2,5x. Synsfeltet er 1,1 mm x 1,1 mm med en oppløsning på 2,6 μm/piksel.
- Slå av det sterke lyset og slå på Homing-knappen (figur 2I) for å spore det fluorescerende stedet for en orm. Denne homing-knappen starter bevegelsen av X-Y-fasen for å holde ormens maksimale intensitetsområde midt i synsfeltet i TagRFP-bildet.
MERK: Når det gjelder flp-18-promotoren , er den fluorescerende intensiteten til AVA-nevronene sterkest og de fra andre nevroner er svake eller ikke oppdaget. Derfor er det lave forstørrelsessystemet ikke nødvendig for sporing, og scenen beveger seg gjennom hele innspillingen. - Kontroller at verdiene for intensitetsstolpene i figur 2E og 2F er ca. 1 000. Hvis ikke, finjusterer du målerne på 470 nm og 550 nm på kontrollsensoren i lyskilden.
- Trykk Kjør-knappen i musemakrosystemet for å tillate musemarkørkontroll i henhold til en tidsplan som er beskrevet i figur 3A. Dette begynner å registrere ved hjelp av sporingsprogramvaren og stimulere ved bølgegenprogramvare mens du sporer ormen.
- Kontroller om utdata-BMP-filen er riktig opprettet.
6. Dataanalyse
- Opprett en mappe på skrivebordet og gi den navnet KalsiumImaging.
- Opprett en mappe i KalsiumImaging-mappen og gi den navnet CIResult, for utdataresultatfilene.
- Dobbeltklikk på DualViewImaging.nb-filen skrevet i dataanalyseprogramvare for Windows.
- Sett inn filbanen i CIResult-mappen (for eksempel Katalognavn[/Brukere/Sugi0911/Desktop/KalsiumImaging/CIResult/test.rtf]) (figur 5).
- Sett inn filbanen til mappen, inkludert BMP-filen (f.eks. SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (figur 5), der XXX angir mappenavnet inkludert BMP-filer.
- Trykk skift - og returtastene samtidig for å starte en automatisk analyse. Denne analysen bruker verdien for et område med maksimal intensitet i synsfeltet i TagRFP-bildet (se forklaringen til figur 6 for detaljert beregningsprosedyre i programmet).
- Kontroller om følgende utdatafiler er riktig opprettet i CIResult-mappen.
XXX-GCaMP.tif (bildefil som illustrerer spor av GCaMP-intensiteter for alle bilder)
XXX-GCaMP.xls (regnearkfil som viser GCaMP-intensiteter i alle bilder)
XXX-TagRFP.tif (bildefil som illustrerer spor av intensiteter i TagRFP for alle bilder)
XXX-TagRFP.xls (regnearkfil som viser TagRFP-intensiteter i alle bilder)
XXX-Ratio.tif (bildefil som illustrerer spor av forholdsverdien for alle bilder)
XXX-Ratio.xls (regnearkfil som viser forholdsverdien i alle bilder)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her brukes en orm som uttrykker både GCaMP og TagRFP under kontroll av AVA internuron-spesifikk promotor som et eksempel på kalsiumavbildning i fritt oppførende C. elegans. GCaMP- og TagRFP-kanaldata ble innhentet som en serie bilder, hvorav noen vises i figur 6 og som en film (Tilleggsfilm 1). Forskyvningen av Petri-platen indusert av vårt ikke-lokaliserte vibrasjonssystem (figur 7) ble også kvantifisert. Forskyvningen kan styres ved å stille inn amplitudeverdien i programvaren for vibrasjonskontroll (figur 3B) og volumjusteringen i forsterkeren (figur 4), mens frekvensen reguleres ved å angi frekvensverdien i programvaren (figur 4). I de vellykkede forsøkene ble det observert en forbigående kalsiumrespons av AVA-nevroner ved stimulering med vibrasjoner som hadde en frekvens på 630 Hz og en forskyvning på ca. 4,5 μm i 1 s, noe som indikerer at AVA-nevronen ble aktivert under en orms bakoverrespons på den ikke-lokaliserte stimuleringen (figur 6). Grunnlinjer for både GCaMP- og TagRFP-signaler viste også at nesten ingen fotobleaching skjedde under opptak.
Figur 1: En skjematisk systemkonfigurasjon. En NGM-plate som en orm beveger seg fritt på, holdes på en akustisk svinger. Eksitasjonslys (488 nm og 560 nm) avgis fra en LED-lyskilde. GCaMP og TagRFP fluorescerende utslipp deles av bildesplittende optikk, slik at hvert fluorescerende utslipp projiseres på halvparten av et sCMOS-kamera. Sporingsprogramvare styrer x-y-motorisert stadium for å spore ormens fluorescerende sted. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjermbilde av programvaren for å spore et fluorescerende sted for en orm. (A) Kjør-knappen for å aktivere programvaren. (B) Bokser for innstilling av bildevisningssyklus, eksponeringstid(er) og binning i hver kanal. (C) Bokser for å gi informasjon om bildeanskaffelsessyklusen. (D) Anskaffelse-knappen for å starte direktesending. (E) GCaMP-bilde. (F) TagRFP-bilde. (G) Et panel for kalibreringskoordinater mellom GCaMP- og TagRFP-bilder. (H) Boks for angivelse av filbane. (I) Homing-knappen for å starte ormsporing. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bilde av musens makrosystem og programvare for å kontrollere vibrasjoner. (A) Den magentafargede firkanten angir koordinatene for musepekeren. Betydningen av hver skriptlinje forklares med magenta bokstaver. (B) GUI (grafisk brukergrensesnitt) av programvare for å kontrollere vibrasjon. Vibrasjonsfrekvens- og amplitudeverdier styres ved hjelp av dette GUI. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bilde av NGM-platen som holdes på den akustiske svingeren ved hjelp av gjennomsiktig tape. Bare en enkelt orm beveger seg på platen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bilde av dataanalyseprogramvaren. Magenta og blå understreking angir banene til CIResult-mappen og mappen, inkludert henholdsvis BMP-filer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Spor av intensitetene til GCaMP (A) og TagRFP (B) fluorescens, og forholdet endres (C,D). (A -C) De representative sporene for GCaMP-signal, TagRFP-signal og forholdsendringer av en enkelt orm. Forholdet endres ved hjelp av DualViewImaging.nb-filen, som følger. Koordinaten der intensiteten til TagRFP-fluorescens er maksimal etter at bakgrunnsdelsnitt er trukket ut for hvert bilde. Dette TagRFP-signalet tjener til å kompensere for fokusendringer forårsaket av dyrets bevegelse. Maksimal fluorescensintensitet for GCaMP i den ekstraherte koordinaten ±10 piksler beregnes som GCaMP-signalintensiteten for hvert bilde. For rasjonmetri beregnes ((IGCaMP − IGCaMP_BG) − (ITagRFP − ITagRFP_BG)) / (ITagRFP − ITagRFP_BG), der jegGCaMP og ITagRFP er henholdsvis GCaMP- og TagRFP-signalene fra AVA-nevronen, og jegGCaMP_BG og jegTagRFP_BG er bakgrunnssignalene. Denne beregningsprosessen ble brukt på alle bilder for å kvantifisere forholdsendringen i en tilbakeføringshendelse. Den vertikale linjen ved 5 s i alle spor indikerer stimuleringsperioden. (D) Gjennomsnittlig forholdstall endres for 15 ormer. Feilfeltet angir SEM. Klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Forholdet mellom parametere. (A) Erstatninger ble målt hver 100 Hz ved hjelp av en laser doppler vibrometer, der amplitudeverdien i programvaren og VOLUM-justeringsverdien i forsterkeren ble festet til henholdsvis 0 og 10. Resonansfrekvensen ble observert mellom 100-200 Hz, som lignet verdien beskrevet i spesifikasjonen av den akustiske svingeren. (B) Frekvenser og forskyvninger ble kontrollert av programvaren (område; 100 til 1000 Hz) og forsterkeren (område: 1-10), henholdsvis og målt ved hjelp av en laser doppler vibrometer. Amplitudeverdien som er valgt av programvaren, er angitt for hver frekvens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfilm 1: En representativ film for kalsiumtransienter i en AVA-internuron av en fritt oppførende orm som svar på en 630 Hz ikke-lokalisert vibrasjon. Stimulering ble fremkalt 5 s etter å ha startet innspillingen. GFP ble også uttrykt i tarmen av ormen som en co-injeksjonsmarkør for GCaMP. Denne GFP-fluorescensen påvirker ikke signalintensiteten til GCaMP. Skalalinjen er også angitt i det første bildet. Ormens retning vises øverst til høyre etter det første bildet. Windows-mediespilleren er egnet for å spille av AVI-filen, men den kan også spilles av ved hjelp av noen gratis nedlastede mediespillere, for eksempel VLC-mediespiller i Mac. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generelt krever kvantifisering av nevral aktivitet innføring av en sonde og / eller begrensninger på dyrekroppsbevegelse. Men for studier av mekanosensorisk oppførsel utgjør den invasive innføringen av en sonde og begrensninger seg selv mekaniske stimuli. C. elegans gir et system for å omgå disse problemene, fordi funksjonene er gjennomsiktige og fordi den har en enkel, kompakt nevral krets som bare består av 302 nevroner. Kombinere disse fordelene med den tidligere utviklede metoden for å fremkalle ikke-lokaliserte vibrasjoner av nanoskala forskyvning13, illustrert her er en metode for ikke-invasiv kalsiumavbildning av uhemmet C. elegans som reagerer på kontrollert vibrasjon.
Egenskaper av mekaniske stimuli defineres av flere parametere, for eksempel frekvens, forskyvning og varighet. I det siste har biotremologi dukket opp som et nytt forskningsfelt1. Hovedformålet med slike studier er å forstå mekanismer som ligger til grunn for produksjon, spredning og mottak av mekaniske vibrasjoner av organismer, og påvirkning av disse vibrasjonene på atferd. Mange dyr, inkludert mennesker, bruker vibrasjoner og akustiske bølger for å overvåke omgivelsene. For eksempel oppdager skorpioner byttedyr gjennom substratbåren vibrasjon14. Derfor er vibrasjon et verktøy for kommunikasjon med omgivelsene. Metoden som er beskrevet her, kan brukes til å kontrollere inngangsparametere og kvantifisere nevrale responser på en-nevronnivå, noe som fører til en opprettelse av et fasediagram som beskriver inngangsutgangsforholdet. Basert på slike fasediagrammer kan vi få innsikt i hvilke parametere som påvirker spesifikke nevrale kretser, og av hvilke mekanismer dyr takler mekaniske vibrasjoner.
Siden 200715 har flere systemer blitt utviklet for enkelt-neuron kalsiumavbildning i fritt bevegelige C. elegans. Disse systemene har hovedsakelig fokusert på nevronale responser på temperatur15,16, luktstoffer16,17, og berøring stimuli17. Når det gjelder ikke-lokaliserte vibrasjoner, har metoden for å trykke på en Petri-plate lenge blitt brukt til å kvantifisere atferdsresponser. Å trykke på en Petri-plate på et motorisert x-y-stadium førte imidlertid til at det fluorescerende stedet gikk ut av synsfeltet, noe som førte til at man ikke klarte å spore en fritt oppførende orm. Derfor ble den piezoelektriske akustiske svingeren innebygd, noe som fremkaller ikke-lokalisert vibrasjon over z-aksen, i sporingssystemet. Denne metoden tillater utførelsen av reproduserbare eksperimenter for kvantifisering av nevronale responser på ikke-lokalisert vibrasjon.
De demonstrerte metodene gir også mulighet for ytterligere metodisk forlengelse. Siden den nåværende protokollen kan fange opp svar på bare en enkelt nevron i to dimensjoner, bør autofokussystemet være utstyrt i fremtiden for å forhindre tap av fokus. På den annen side, fordi flere volumetriske avbildningsmetoder nylig er utviklet ved hjelp av C. elegans 18,19,20,21, bør forlengelse av tilnærmingen til volumetrisk avbildning tillate ikke-invasiv kvantifisering av flere nevroner 22 eller til og med hele hjernen 18,19,20,21 , som svar på vibrasjoner som har kontrollerbare egenskaper. Et slikt system kan brukes på det nylig etablerte systemet for å undersøke mekanismer som ligger til grunn for kollektiv atferd23. Derfor vil ytterligere biologiske applikasjoner og utvidelser av metoden sannsynligvis gjøre oss i stand til å forstå nevrale mekanismer som ligger til grunn for mekanosensorisk oppførsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Caenorhabditis Genetics Center for å gi stammene som brukes i denne studien. Denne publikasjonen ble støttet av JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific research (B) (Grant No. JP18H02483), på Innovative områder "Science of Soft Robot" prosjekt (Grant No. JP18H05474), PRIME fra Japan Agency for Medical Research and Development (tilskuddsnummer 19gm6110022h001) og Shimadzu-stiftelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
- Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
- Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
- Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
- Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
- Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
- Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).
- Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
- Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
- Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
- Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
- Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
- Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
- Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
- Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
