Summary
여기서, 우리는 형광 화상 진찰에 의하여 혈관, 핵, 면역 세포, 뉴런 및 지질 물방울 외투 단백질을 시각화하기 위하여 마커의 조합을 사용하여 마우스와 인간 백색 지방 조직의 3D 구조를 해결하는 간단하고 저렴하고 빠른 청산 방법을 기술합니다.
Abstract
비만은 심장 혈관 질병, 타입-2 당뇨병 및 간 질병을 개발하는 리스크를 증가시키는 중요한 세계적인 공중 위생 문제점입니다. 비만은 지방 조직 (AT) 대두 증식 및 비대성으로 인해 질량의 증가를 특징으로하며, 3 차원 구조의 심오한 리모델링으로 이어진다. 실제로, 비만 도중 확장하는 AT의 최대 용량은 비만 관련 병학의 발달에 중추적인 입니다. 이 AT 확장은 에너지 섭취량의 과잉에 적응을 가능하게하고 다른 신진 대사 기관에 해로운 지질 유출을 피하기 위해 중요한 정향적 메커니즘입니다, 근육과 간 등. 따라서 AT 확장의 실패로 이어지는 구조적 리모델링을 이해하는 것은 높은 임상 적용성을 가진 근본적인 질문입니다. 이 기사에서는 형광 이미징에 의한 마우스 및 인간 백색 지방 조직의 형태를 탐구하기 위해 실험실에서 일상적으로 사용되는 간단하고 빠른 클리어링 방법을 설명합니다. 이 최적화된 AT 클리어링 방법은 화학 후드, 온도 제어 궤도 셰이커 및 형광 현미경을 갖춘 모든 표준 실험실에서 쉽게 수행됩니다. 또한 사용되는 화학 화합물을 쉽게 사용할 수 있습니다. 중요한 것은, 이 방법은 다양한 마커를 염색하여 3D AT 구조를 구체적으로 시각화하여, 신경 및 혈관 네트워크, 그리고 선천적이고 적응적인 면역 세포 분포를 확인할 수 있게 한다.
Introduction
비만은 지방 조직 질량에 있는 증가를 특징으로 하고 비만을 가진 사람들이 심장 혈관 질병, 타입-2 당뇨병, 간 질병 및 몇몇 암을 개발의 리스크를 증가했다는 것을 감안할 때, 중요한 세계적인 공중 위생 문제점이 되었습니다.
지방 조직의 근본적인 생리적 기능은 전신 포도당과 지질 항상성1,,2를조절하는 것입니다. 먹이 주기 동안, 지방 조직의 주요 세포(즉, 지방 조직의 주요 세포)는 식사에서 제공하는 포도당과 지질의 과잉을 트리글리세라이드로 저장합니다. 금식 하는 동안, 지방 세포는 신체의 에너지 수요를 유지 하기 위해 비 에스테르 지방산 과 글리세롤으로 트리 글리세라이드를 분해. 비만의 발달 도중, 지방 조직은 그들의 저장 용량을 증가시키기 위하여 adipocytes의크기 (비대성) 및/또는 수 (hyperhyperasia)를 증가시킴으로써 확장합니다. 지방 조직의 팽창이 한계에 도달하면, 환자 들 사이에서 일정한 높게 변수, 나머지 지질은 근육과 간3을포함하여 다른 신진 대사 기관에 축적3,4,그들의 기능 적 실패와 비만 관련 심장 대사 합병증을개시1,,5. 따라서, 지방 조직 확장을 지배하는 메커니즘을 식별하는 것은 중요한 임상 과제입니다.
비만 도중 지방 조직 안에 문서화된 형태학적 수정은 그것의 병리학적인 역기능에 연결됩니다. 여러 염색 절차는 액틴6,혈관 마커7,지질-물방울 마커8,및 특정 면역 세포 마커9,,10을포함하는 지방 조직의 조직 조직을 설명하기 위해 사용되어 왔다. 그러나, 대지세포(50~200 μm)의 막대한 직경11때문에, 비만 시 관찰된 극적인 구조적 AT 변화를 정확하게 분석하기 위해서는 전체 조직의 상당 부분을 3차원으로 분석하는 것이 필수적이다. 그러나, 빛이 불투명한 조직을 관통하지 않기 때문에, 형광 현미경검사를 이용한 대형 조직 샘플 내에서 3D로 이미징하는 것은 불가능합니다. 그(것)들을 투명하게 하기 위하여 조직 청산의 방법은 문헌에서 보고되었습니다 (검토를 위해,12참조) 조직을 지우고 심층적인, 전체 조직 형광 현미경 검사를 능력을 발휘할 수 있도록 합니다. 이 방법은 건강하고 병들게 한 조직에서 3D 세포 조직을 평가하는 전례없는 기회를 제공합니다. 각 기재 방법에는 장점과 단점이 있으므로 연구된 조직에 따라 신중하게 선택해야 합니다(검토를 위해13참조). 실제로, 일부 접근법은,14,,15,,16,17,18,,19를얻기 어렵거나, 독성이 있거나, 고가의 물질 또는화합물의사용 및/또는 사용이 필요하다. 베르너 Spalteholz에 의해 세기 전에 사용 된 첫 번째 화합물 중 하나를 활용20,우리는 매우 잘 화학 후드, 온도 제어 궤도 셰이커와 공초점 현미경을 포함한 전형적인 장비와 실험실에서 모든 마우스와 인간의 지방 조직 창고의 청산에 적응 사용자 친화적이고 저렴한 프로토콜을 설정합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 프로토콜은 테스트되었으며 모든 마우스 및 인간 흰색 지방 조직 창고에 대해 검증되었습니다. 인간과 마우스 조직 조직은 유럽 법률에 따라 수집및 프랑스와 스웨덴 윤리위원회에 의해 승인되었다.
1. 마우스와 인간의 흰색 지방 조직의 고정
- 수확한 마우스 또는 인간의 백색 지방 조직을 15mL 플라스틱 튜브에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 함유한 PBS의 최소 10mL에 담급니다.
- 1 시간 동안 압연 접시에 실온에서 플라스틱 튜브를 흔들어.
- 플라스틱 튜브를 하룻밤 동안 롤링 플레이트에 4°C로 두고 고정을 완료합니다.
참고: 본 프로토콜은 마우스로부터 얻은 전체 부피지방 패드와 같은 대형 지방 조직 샘플에 적응되어 정상적인 식단을 공급합니다(≈250 mg - ≈0.6 cm3). 쥐로부터 얻은 고지방 지방 패드(≈1.5g-≈4cm3)또는 인간 지방 조직 샘플을 공급한 고지방 지방 패드와 같은 더 큰 시료의 경우, 클리어링 프로토콜은 전체 샘플(PFA 및 항체 혼합물을 스케일업하여)에 완벽하게 작동해야 하지만, 일반적으로, 1g(≈2.5cm3)주위의 조직 조각을 절단하여 추가 적인 시료를 예비합니다. PFA (단계 1.1.)의 경우 조직의 약 10 배 의 부피를 사용하는 것이 좋습니다. 항체 혼합물의 경우(3.1단계 및 3.4.) 부피를 증가시키고, 조직이 1.5mL 플라스틱 마이크로튜브에 너무 큰 경우 15mL 플라스틱 튜브(재료표참조)를 사용한다(재료표참조).
2. 마우스와 인간의 백색 지방 조직의 투과 및 포화
- PFA의 모든 흔적을 제거하기 위해 실온에서 5 분 동안 PBS의 10 mL에서 고정 된 흰색 지방 조직을 헹구는다.
- 0.3% 글리신(재료표참조)으로 보충된 15mL 의 PBS 플라스틱 튜브에 조직을 침수하고 분당 100회전(rpm)에서 1시간 동안 궤도 셰이커에서 실온에서 튜브를 흔들어 나머지 자유 알데히드 군을 담급니다.
- 0.2% 트리톤 X-100(재료표 참조)으로 보충된 15mL 의 PBS를 함유한 15mL 플라스틱 튜브에 조직을 침수하고 100rpm에서 2시간 동안 온도 조절 궤도 셰이커에서 37°C에서 튜브를 흔들어 줍니다. Table of Materials
- 0.2% 트리톤 X-100 및 20% DMSO(재료표참조)로 보충된 15mL 의 PBS를 함유한 15mL 플라스틱 튜브에 조직을 침수하고 밤새 100rpm의 온도 조절 궤도 셰이커에서 37°C에서 튜브를 흔들어 줍니다.
- 0.1% Tween-20(재료표 참조), 0.1% 트리톤 X-100, 0.1% 데옥시콜레이트(재료표 참조) 및 20% DMSO(재료표 참조) 및 20%의 DMSO에서 튜브를 흔들어 온도 조절식 암울 의 경우 10mL의 PBS가 함유된 15mL 플라스틱 튜브에 침수하고, 20%의 DMSO에서 튜브를 흔들어 온도 조절식 궤도 흔들림 을 20시에 20°C로 흔들었다. Table of Materials Table of Materials
- 0.2% Triton X-100으로 보충된 PBS의 10mL를 포함하는 15mL 플라스틱 튜브에서 조직을 헹구고 100 rpm에서 궤도 셰이커에서 실온에서 튜브를 흔들어 1 h.
- 0.2% 트리톤 X-100, 10% DMSO 및 3% BSA(재료표 참조)로 보충된 15mL 의 Table of MaterialsPBS 를 함유한 15mL 플라스틱 튜브에 조직을 침수하고 12시간 동안 100rpm의 온도 조절 궤도 셰이커에서 튜브를 37°C로 흔들어, 특별히 비항체를 사용할 수 있는 부위를 포화시한다.
참고: 2.7 단계에서, BSA는 사용되는 이차 항체의 종의 혈액 혈청에 의해 대체될 수 있다.
3. 마우스와 인간의 흰색 지방 조직에 대한 염색 절차
- PBS의 300 μL을 함유한 1.5mL 플라스틱 마이크로튜브로 조직을 전송하여 0.2% 트리톤 X-100, 10% DMSO, 3% BSA 및 1차 항체(극저온분 염색에 대한 것보다 10배 더 농축되지만 최적의 항체 농도는 각 항체에 대해 평가되어야 한다). 알루미늄 호일로 덮어 로부터 튜브를 보호하고 적어도 이틀 동안 100 rpm에서 온도 제어 궤도 셰이커에서 37 °C에서 튜브를 흔들어 (단계 1.1 및 단계 3.7.1의 노트 참조).
- 15mL의 PBS를 함유한 15mL 플라스틱 튜브에서 조직을 헹구고 0.2% 트리톤 X-100, 10% DMSO 및 3% BSA로 보충하고 온도 조절 궤도 셰이커에서 37°C에서 빛으로부터 보호된 튜브를 5시간 동안 100rpm에 온도 조절 궤도 셰이커로 흔들어 줍니다. 이 단계를 두 번 수행합니다.
- 1박 2일 동안 1박 2일 동안 100rpm의 온도 조절 궤도 셰이커에서 37°C에서 빛으로부터 보호되는 0.2% Triton X-100, 10% DMSO 및 3% BSA로 보충된 PBS10mL의 15mL 플라스틱 튜브에서 조직을 헹구고, 빛으로부터 보호되는 튜브를 흔들어 1박 2일 동안 1박 2일 동안 1박 2일 동안 온도 조절 궤도 셰이커에서 37°C에서 진동을 조절한다.
- 조직을 PBS의 300 μL을 함유한 1.5mL 플라스틱 마이크로튜브로 옮기는 것은 0.2% 트리톤 X-100, 10% DMSO, 3% BSA 및 이차 항체(극저온염색보다 10배 더 농축)로 보충하였다. 알루미늄 호일로 덮어 로부터 튜브를 보호하고 적어도 이틀 동안 100 rpm에서 온도 제어 궤도 셰이커에서 37 °C에서 튜브를 흔들어 (단계 1.1 및 단계 3.7.1의 노트 참조).
- PBS의 10mL를 포함하는 15mL 플라스틱 튜브에서 조직을 헹구고 0.2% 트리톤 X-100, 10% DMSO 및 3% BSA로 보충되어 5h의 100rpm의 온도 조절 궤도 셰이커에서 37°C에서 빛으로부터 보호되는 튜브를 흔들어 줍니다. 이 단계를 두 번 수행합니다.
- 1박 2일 동안 1박 2일 동안 100rpm의 온도 조절 궤도 셰이커에서 37°C에서 빛으로부터 보호되는 0.2% Triton X-100, 10% DMSO 및 3% BSA로 보충된 PBS15mL 플라스틱 튜브에서 조직을 헹구십시오.
- 10mL의 PBS를 포함하는 15mL 플라스틱 튜브에서 조직을 헹구고, 2시간 동안 100rpm의 온도 조절 궤도 셰이커에서 37°C에서 빛으로부터 보호되는 튜브를 흔들어 줍니다.
참고: 핵 이나 액틴과 같은 특정 구조의 라벨링에 대 한, 추가 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI 또는 동등한) 및/또는 형광 표표-phalloidin 단계에서 추가 해야 3.1. 형광으로 만 표기 된 1 차적인 항체가 사용되는 경우, 또는 단계에서 3.4. 이차 항체가 사용될 때.
참고: 염색 절차의 경우, 이미 플루오로크롬(유동 세포측정에 사용되는 것과 같은)으로 컨쥬게이트된 1차 항체를 사용할 수 있으며 시간과 특이성을 얻기 위해 권장합니다. 실제로, 마우스 1차 항체가 이차 항마우스 항체에 의해 사용될 수 있더라도, 여기서 입증했듯이, 우리는 종종 순환면역글로불린으로 인한 혈관의 비특이적 염색을 관찰했다. 따라서, 이 문제점을 피하기 위하여는, 이미 표지된 1 차적인 항체는 높게 추천되고 여기에서 우리는 유동 세포측정에 사용된 항체가 우리의 절차와 호환된다는 것을 증거를 제공합니다. 그러나, 낮은 수준에서 발현되는 항원의 특정 한 경우, 이차 항체를 통한 신호 증폭 단계가 필수적이다. 유일한 유효한 1 차항체가 마우스에서 만들어지면, 희생시 적어도 5 분 동안 PBS를 가진 마우스의 심관류는 순환 면역 글로불린의 큰 비율을 제거하고 따라서 비 특이적 염색을 제거할 수 있다.
4. 마우스 및 인간 흰색 지방 조직에 대한 클리어링 절차
- 15mL 플라스틱 튜브에 50% 에탄올10mL이 들어있는 튜브를 침전하고 빛으로부터 보호되는 튜브를 흔들어 100rpm의 궤도 셰이커에서 실온에서 2시간 동안 흔들어 줍니다.
- 15mL 플라스틱 튜브에 70% 에탄올이 들어 있는 15mL 플라스틱 튜브에 침을 을 채우고, 2시간 동안 100rpm의 궤도 셰이커의 실온에서 빛으로부터 보호되는 튜브를 흔들어 보냅니다.
- 95%의 에탄올10mL를 함유한 15mL 플라스틱 튜브에 조직을 담그고, 2시간 동안 100rpm의 궤도 셰이커의 실온에서 빛으로부터 보호되는 튜브를 흔들어 보냅니다.
- 100% 에탄올10mL가 들어있는 15mL 플라스틱 튜브에 조직을 담그고 빛으로부터 보호되는 튜브를 2시간 동안 100rpm의 궤도 셰이커의 실온에서 흔들어 줍니다.
- 100% 에탄올10mL의 10mL를 포함하는 15mL 플라스틱 튜브에 조직을 침수하고 밤새 100 rpm의 궤도 셰이커의 실온에서 빛으로부터 보호되는 튜브를 흔들어 줍니다.
- 화학 후드 아래 메틸 살리실레이트 5mL(재료 표 참조)가 들어있는 플라스틱 캡(재료 표참조)이 있는 20mL 유리 병에 조직을 담그고 빛으로부터 보호된 유리 용기를 2시간 이상 100rpm의 궤도 셰이커에서 실온에서 흔들어 주세요.
참고: 4.3단계를 피함으로써 클리어링 절차가 크게 가속화될 수 있습니다(필요한 경우). 및 4.5., 최종 클리어링 품질은 약간 감소 될 것이지만.
5.3D 클리어 된 백색 지방 조직의 공초점 화상 진찰
- 화학 후드 아래 유리 바닥 (재료의 표참조)가 장착 된 금속 이미징 챔버로 조직을 전송하고 신선한 메틸 살리실레이트로 챔버를 채웁니다.
참고: 조직을 제자리에 고정시키고 챔버에서 옆으로 부동하거나 움직이지 않도록 하려면 챔버에 장착할 때 조직 위에 18mm 둥근 유리 커버립(재료 표참조)을 적용하십시오. - 반전된 공초점 현미경에 이미징 챔버를 놓습니다.
- 낮은 배율 목표(예를 들어, 4배 목표)를 사용하여 조직을 이미지화하여 전체 지방 조직 또는 인간 조직 샘플의 몇 cm3 3D 맵을 생성한다.
- 더 높은 배율에서 조직 샘플링을 위한 몇몇 지역을 선택합니다. 일반적으로 해상도와 깊이 사이의 좋은 비율을 제공하는 20배 의 장거리 공기 목표를 사용합니다. 600~2000μm 깊이 의 z-스택이 있는 대형 모자이크 이미지를 획득합니다.
참고: 장거리 목표를 사용하여 조직에 더 깊이 이미지를 적용합니다.
6. 3D 지방 조직 이미지에서 정량적 결과의 추출
참고: 5지점에서 생성된 3D 이미지 스택으로부터의 상이한 구조의 세분화 및 후속 추출은 상업적 또는 프리웨어 중 많은 기존 이미지 분석 소프트웨어 옵션을 사용하여 수행할 수 있다. 다음 지점에서는 상용 소프트웨어를 사용하여 3D 지방 조직 이미지에서 정량적 정보를 추출하는 데 일상적으로 사용되는 전략을 설명합니다(재료 표참조).
- 3D 스택을 소프트웨어 형식으로 변환하여 메모리 공간을 확보합니다.
- 셀을 분할합니다.
- 소프트웨어의 셀 모듈을 엽니다.
- 세포 검출 설정을 플라즈마 멤브레인 염색으로 변경합니다.
- 세포 주변을 묘사하는 데 사용되는 마커의 형광 채널을 선택하십시오(대식대식용 F4/80과 같은 피질 액틴 또는 플라즈마 멤브레인 마커를 라벨로 표시하는 phalloidin, T 세포를 위한 TCR-β 또는 면역 세포 특수형에 특이적인 분화 CD 단백질의 클러스터).
- 임계값을 설정하고 예상 셀 크기범위(즉, 세포 검출을 위한 1~200 μm)를 제공합니다.
- 분할을 실행합니다. z-스택에 대응하는 부피는 각 이웃 셀에 대해 다른 색상으로 색으로 구분된 분할된 셀로 생성됩니다.
- 통계 탭에 통계 필터(크기, 둥글림, 원형 등)를 적용하여 세분화 된 아티팩트를 제외하거나 세그먼트 된 세포를 크기에 따라 관심 있는 셀로 미세 조정합니다 (즉, 20-200 μm 대식세포용, 대식세포용 1-3 μm).
- 통계 탭에서 측정 및 정량 적 데이터(볼륨, 수, 크기, 직경 등)를 추출합니다.
- 세포 성분(핵, 소포 등) 또는 혈관을 구조로 분할한다.
참고: 필라멘트 분할은 선박의 연결을 연구하는 데 매우 유용하지만, 우리는 선박의 크기, 부피 및 직경에 대한 데이터를 추출하기 위해 표면 모듈 세분화를 사용합니다. 실제로 필라멘트 모듈을 사용할 때 선박의 크기가 정량화됩니다.- 소프트웨어의 Surface 모듈을 엽니다.
- 세포 전 성분을 3D로 재구성하기 위해 세포 전 성분에 특별히 레이블을 지정하는 데 사용되는 마커의 형광 채널을 선택합니다.
- 임계값을 설정하고 구조의 예상 직경 크기의 범위를 제공합니다 (즉, 핵에 대한 0.5-5 μm; 혈관에 대한 0-100 μm; 등).
- 분할을 실행합니다. 분할된 셀룰러 구조를 가진 부피가 생성됩니다. 측정 및 정량 적 데이터(볼륨, 수, 크기, 직경 등)는 통계 탭에서 추출할 수 있습니다.
- 혈관을 관 전위로 분류합니다.
참고: 필라멘트 분할은 선박의 연결을 연구하는 데 매우 유용하지만, 우리는 선박의 크기, 부피 및 직경에 대한 데이터를 추출하기 위해 표면 모듈 세분화를 사용합니다. 실제로 필라멘트 모듈을 사용할 때 선박의 크기가 정량화됩니다.- 소프트웨어의 필라멘트 모듈을 엽니다.
- 혈관 염색에 대응하는 형광 채널을 선택합니다.
- 형광 강도에 대한 임계값을 설정하고 예상되는 연결 노드수를 적절히 선택합니다.
- 분할을 실행합니다. 선박 네트워크를 나타내는 필라멘트는 3D로 생성됩니다. 측정은 통계 탭에서 추출하여 선박 길이, 선박 분기 수 등을 포함한 정량적 데이터를 얻을 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기에 기재된 절차를 이용하여 도 1에요약된, 우리는 도 2A 및 도 2B에각각 제시된 바와 같이 인간및 마우스 백색 지방 조직을 각각 얼룩지게 하고 광학적으로 맑은 조직할 수 있었다. 클리어된 조직은 공초점 이미징(도 3A)을 수행하기 위해 금속 이미징 챔버로옮겨졌다. 클리어링은 우리가 획득할 수 있었던 조직 이미지의 깊이를 크게향상(도 3B 및 도 3C). 전체 지방 조직은 4배 목표(보충 동영상 1 참조)를사용하여 낮은 배율에서 3D로 획득할 수 있으며, 3D 맵을 생성하여 20배 목표(도3D)를사용하여 높은 배율에서 획득할 다른 영역을 선택할 수 있다. 높은 배율 이미지는 깊이 2mm(도3E)로3D로 획득됩니다.
이 절차는 형광 표기 판로이드를 사용하여 DAPI 및 액틴을 사용하여 핵을 포함한 수많은 일반 세포 마커의 라벨링을 가능하게합니다. 지질 방울과 지방 세포의 특정 염색은 perilipin 항체를 사용하여 달성 될 수있다 (재료의 표 참조; 도 4A) 및 안티 글루트4 항체 (재료의 테이블 참조; 도 4B) 각각. 혈관은 CD31 항체를 사용하여 검출될 수 있다(재료의 표 참조; 도 4C) 또는 마우스 희생 직전에 렉틴-DyLight649의 정맥 주사에 의하여 (재료의 표 참조; 그림 4D). 대식세포 및 T 세포는 항 CD301-Phycoerythrin 항체를 사용하여 시각화될 수 있다(재료의 표 참조; 도 4D) 및 안티 TCR-β-태평양 블루 항체(재료 표 참조; 그림 4E). 말초 신경 망은 항 티로신 하이드록실라제(TH) 항체를 사용하여 검출될 수 있다(재료의 표 참조; 그림 4F-G). 또한, 본 프로토콜은 마우스 고환 지방조직(도 4A-B,E),마우스 피하 지방 조직(도 4D, G),마우스 갈색 지방 조직(도4F),및 인간 지방 조직(도Figure 44C)의청산을 허용한다. 이러한 라벨링과 상용 소프트웨어(재료의 표 참조)를 조합하여 이러한 마커를 분사하고, 우리는 지방 조직 i) 지방 조직 내에서 평균 크기 및 크기분포(도 5A-B)및 ii) 혈관 네트워크 밀도(도5C)를결정할 수 있다.
그림 1: 백색 지방 조직에 대한 청산 절차의 요약. 마우스 또는 인간의 백색 지방 조직은 고정, 투과, 포화, 염색 및 지워집니다. 그런 다음 이미지를 3D로 획득하고 상용 소프트웨어를 사용하여 분석합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 흰색 지방 조직의 사진. (A)개간 절차 전후에 인간 백색 복부 골반 지방 조직의 사진. (B)마우스 부피성 백색 지방 조직의 사진은 청산 절차 전후에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 지방 조직 클리어링으로 향상된 이미징 깊이. (A)유리 바닥이 장착된 금속 이미징 챔버의 장착. (B)클리어링 전후의 phalloidin-Alexa488(녹색)으로 염색된 마우스 고환 백색 지방 조직의 Z 시리즈 이미지. (C)패널 B z 스택을 가로질러 흰색 점선에 대응하는 XZ 프로젝션. (D)Phalloidin-Alexa488을 사용하여 액틴을 위해 염색된 마우스 피하 백색 지방 조직의 0.4cm z-스택의 Z-프로젝션은 4배 의 목표와 낮은 배율로 획득하였다. 오른쪽의 작은 이미지는 20배 의 목표를 사용하여 선택한 조직 위치에서 획득되었다. (E)Phalloidin-Alexa488으로 염색된 클리어 마우스 백색 지방 조직에서 이미지 z-스택의 3D 볼륨 렌더링의 측면뷰(D)에서20x 이미지와 유사하게 획득하였다. 우리의 높은 배율 절차에 의해 달성 된 3D 이미징 깊이는 여기에서 입증되고 z 깊이 색상 코딩 (z = 0mm에 대한 진한 파란색에서 z = 2mm의 어두운 빨간색)에 의해 밑줄이 강조됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 마우스와 인간의 흰색 지방 조직 여러 마커에 대 한 염색. (A)항-페리핀1 항체 및 항 마우스-alexa647-공주 항체를 사용하여 지질 방울에 얼룩진 마우스 고환 백색 지방 조직의 단일 평면 이미지. (B)다피, 항글루4 항체 및 항마우스-alexa647-공주 항체를 사용하여 핵 및 지방 세포에 염색된 마우스 부피백색 지방 조직의 모자이크 단일 평면 이미지. (C)CD31-alexa647-공주 항체를 사용하여 혈관에 염색된 인간 백색 복부골반 지방 조직의 600 μm z-stack의 Z-프로젝션. (D)렉틴-DyLight649 정맥 주사 및 항 CD301-alexa555 항체를 사용하여 혈관 및 대식세포에 얼룩진 마우스 피하 백색 지방 조직의 600 μm z-스택의 Z-프로젝션. 오른쪽 아래 인셋은 흰색 점선 상자의 확대 이미지입니다. (E)phalloidin-Alexa488 및 항 TCRβ-태평양 청색-공주를 사용하여 액틴 및 T 세포를 위해 염색된 마우스 고환 백색 지방 조직의 단일 평면 이미지. 오른쪽 아래 인셋은 흰색 점선 상자의 확대 이미지입니다. (F)DAPI, 항체 및 항토끼-alexa647-공주 항체를 사용하여 핵 및 뉴런 네트워크를 위해 염색된 마우스 갈색 지방 조직의 50 μm z-stack의 Z-프로젝션. (G)DAPI, 안티-TH 항체 및 항래빗-alexa647-공주 항체를 사용하여 핵 및 뉴런 네트워크에 염색된 마우스 피하 백색 지방 조직의 600 μm z-stack의 Z-프로젝션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 시판되는 소프트웨어를 사용하여 3D 이미지 분석(재료 표 참조). (A)시판 가능한 소프트웨어에 의해 3D로 분할된 인간 분포세포의 3D 볼륨 렌더링. 모든 지방세포는 인접한 접대에 접촉하는 것에 다른 색상을 가지고 있습니다. 선박은 빨간색으로 표시됩니다. (B)약 20,000개의 선포세포가 포함된 패널 A의 3D 볼륨 렌더링으로부터 의 크기 정량화 및 분포. (C)3D로 분할된 혈관의 3D 부피 렌더링은 시판되는 소프트웨어를 사용하여 각각 크고 작은 혈관에 대해 빨간색 또는 노란색으로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 동영상 1: 도 3D에도시된 전체 피하 백색 지방 조직의 3D 부피 렌더링. 흰색 상자는 2cm3 큐브를 나타냅니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
비만과 같은 병리학적 진행 과정에서 지방 조직 내에서 발생하는 수정은 병리학 뒤에 있는 메커니즘의 이해에 기본입니다. 지방 조직에서 이러한 메커니즘을 밝힌 선구적인 연구는 전체 지방 조직프로테오믹스(21),유동 세포측정법(22,,23)및전사학(24,,25)과같은 글로벌 접근법에 기반을 두고 있다.22 또한, 조직학적 분석을 이용하여 지방 조직에서 발생하는 구조적 변화를 탐구하기 위한 노력이 이루어지고 있다26,,27,,28,,29. 그러나, 5-10 μm 지방 조직 단면의 분석은, 단면의 제한된 크기 때문에, 중요한 구조적 특징을 평가하는 기능을 제한한다. 첫째, 각 단면이 선포세포의 작은 부분만을 나타내기 때문에 단면도핵은 단면도(1/10th)만 검출된다.th 둘째, 대부분의 지방 조직 섹션에서 추정된 지방 조직 단면에서 추정된 지방 세포의 크기는 대부분의 적도 의 밑에 또는 뒤에 절단되기 때문에 정확하지 않습니다, 그들의 평균 크기의 편향된 (아래) 측정으로 이끌어 내는. 셋째, 혈관 및 신경 섬유 연속체는 물리적 단면 중에 손실됩니다. 넷째, 조직 내의 면역 세포의 각 아류형의 분포는 3차원 좌표가 손실되기 때문에 확립하기 어렵다. 이러한 맥락에서, 우리가 여기에서 제안하는 방법론은 모든 표준 실험실이 간단하고 저렴한 방식으로 인간과 마우스 흰색 지방 조직을 3 차원으로 이미지 할 수 있게합니다.
이 메서드에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 조직을 준비하는 데 필요한 시간 (고정, 투과화, 염색, 청산)은 1 주일 이상 길다. 이 시간의 대부분은 조직을 얼룩해야하기 때문에 이 것을 감소시키기 어려울 것입니다. 이러한 큰 조직 샘플 내에서 항체의 침투는 긴 잠복 시간을 필요로한다. 잠복기를 줄이면 비균질성 항체 침투의 위험이 증가하여 유물을 염색할 수 있습니다. 따라서, 시간을 얻고 절차를 단축하는 유일한 가능한 창은 최적의 결과가 필요할 때 하루 정도 걸리는 조직을 지우기 위한 전용 시간이지만, 이는 극적인 품질 저하 없이 반나절로 감소될 수 있다. 두 번째 제한은 조직의 가능한 수축입니다. 실제로, 용매를 사용하여 조직을 탈수하는 어떤 프로토콜에서, 조직이 물 제거로 인해 축소 될 가능성이 높습니다. 이 수축을 추정하는 것은 항상 도전적이고, 지질이 탈수 과정에서 추출되기 시작할 때 조직의 가장자리가 투명해지기 때문에 여기에서 거의 불가능합니다. 따라서, 클리어 조직의 크기 추정은주의해서 해석될 필요가 있습니다. 그러나, 다른 유전자형을 가진 마우스에서 파생되거나 상이한 환경 조건에 제출된 조직 들 간의 지방분두체 크기 또는 혈관 길이의 변화를 비교하는 것은 유익한11남아있다. 마지막 한계는 전체 마우스 지방 조직 또는 큰 인간 지방 조직 수술 샘플의 큰 양에 연결됩니다. 실제로 프로토콜은 이 큰 견본을 지우기 위하여 완벽하게 적응되어 있더라도, 전체 기관을 화상 진찰하는 것은 공초점 현미경으로 도전적입니다. 이 문제를 극복하고 전체 장기 청산 절차의 잠재력을 최대한 활용하는 전략은 4배 목표를 사용하여 전체 기관의 3D 저배율 지도를 획득하고, 20배 이상의 장거리 목표를 사용하여 더 높은 배율 3D 이미지를 획득할 수 있는 조직 내에서 무작위로 분산된 특정 영역을 선택하는 것이다. "높은 배율" 설정은 약 45mm3 (4.7 x 4.7 x 2 mm)의 조직 볼륨을 이미징 할 수 있습니다. 이 부피는 전체 기관의 부피(0.5 ~ 4cm 이상3)에비해 제한되어 있지만, 조직 내의 여러 위치에서 획득을 반복하면 세포에서 세포에서 조직의 좋은 샘플링을 얻을 수 있다. 큰 조직을 이미징하면 상당한 양의 이미징 데이터가 생성됩니다.
절차는 이전에 지방조직(14,30)을지우기 위하여 기술된 방법에 비교될 때 유의한 다름이있습니다. 우선, 메탄올, 디클로로메탄 및 디벤질레터14를사용하는 AdipoClear와 달리, 여기에 제시된 방법은 디탈디온과 메틸 살리실레이트에 대한 에탄올을 사용하여 청산한다. 따라서, 이 절차는 디클로로메탄, 메탄올 및 디벤질레터의 높은 독성에 비해 식품/음료 가공 산업(에탄올 및 메틸살리실레이트)에서 자주 사용되는 독성이 적은 청산 용매를 활용하기 때문에 더 안전합니다. 더욱이, 프로토콜에 따른 조직의 제조는 AdipoClear프로토콜(14)보다2일 빠릅니다. 최근에는 Li와 동료들이글리세롤(30)에침지하여 지방 조직 조각을 지우는 또 다른 방법을 제안했다. 이 프로토콜은 이 절차에 비해 매우 간단하며 이미지의 품질은 높은 배율에서도 좋습니다. 그러나, 이 클리어링 프로토콜은 2mm3 지방 조직 조각을 사용할 때만 효율적으로 작동합니다. 청산 절차 전에 이 작은 견본으로 조직의 단면은 낮은 배율에서 조차 2 mm3 보다는 더 큰 화상 진찰 조직 볼륨에서 1개를 방지합니다. 여기에 제시 된 절차는 낮은 배율에서 3D 의 전체 조직의 매핑 및 높은 배율에서 전체 클리어 지방 조직 내에서 여러 알려진 위치에서 약 45 mm3 의 이미지 의 3D 스택의 수집을 허용합니다.
이 절차에는 여러 가지 향후 응용 프로그램이 있을 수 있습니다. 다른 방법과 마찬가지로 여기에 설명된 절차는 단순화 및/또는 추가로 최적화될 수 있습니다. 절차에 대한 흥미로운 사전은 추가 이미징 접근과 함께, 우리는 설명, 청산 과정의 조합에서 올 수 있습니다. 예를 들어, 광학 프로젝션 단층 촬영(OPT), 총 내부 반사 형광 현미경 검사법(TIRF), 선택적 계획 조명 현미경 검사법(SPIM) 또는 자극방출 방출 고갈 현미경검사법(STED)과 같은 특정 이미징 설정은 이러한 시스템이 장착된 실험실에 대한 적용 가능성을 제한하지만 절차와 원칙적으로 호환됩니다. 또는, 높은 수치 조리개 지수와 초당 수백 개의 이미지를 획득할 수 있는 획득 시스템을 갖춘 목표를 사용하여 많은 실험실에서 발견되는, 슈퍼 해상도 방사형 변동(SRRF) 후처리 이미지 분석프리웨어(31)를사용하여 초해상도 분석을 수행할 수 있다. 흥미롭게도, 고전 형광은 SRRF 분석에 적응되어 전체 인간 및 마우스 흰색 지방 조직의 3D 슈퍼 해상도 분석을 가능하게합니다.
프로토콜의 많은 중요한 단계는 청산 자체 이전에 조직 처리와 관련이 있습니다. 우선, 고전 조직학 분석에 관해서는 고정 단계가 기본입니다. 약한 고정의 경우 구조적 특징이 보존되지 않는 반면, 확장된 고정은 특정 항원 부위의 교차 연결 및 차단과 결과적으로 비균질적인 면역 염색으로 이어집니다. 또 다른 민감한 단계는 우리가 아래에 설명 할 몇 가지 중요한 점을 제시하는 조직의 염색입니다. 첫째, 항체는 극저온 섹션에서 그(것)들이 기능하고 있다는 것을 확인하고 그들의 최적 농도를 결정하기 위하여 그(것)들을 시험해서 검증될 필요가 있습니다. 클리어링 절차에 사용되는 최종 농도는 극저온 섹션에 대한 최적의 농도의 10배이다. 둘째, 인큐베이션의 시간 또한 조직의 크기 때문에 중요 하다. 너무 짧은 잠복기는 약하거나 비 균일한 면역 스테인링을 생성합니다 (예를 들어, 조직의 주변에 정확한 염색하지만 내부 염색은 없습니다). 유사하게, 너무 짧은 세척 단계는 비 특이적 얼룩으로 이끌어 내는 조직에서 제거되는 비 특이적 결합 항체를 방지할 것입니다. 우리의 지식에, 항체를 가진 조직의 확장된 잠복은 얼룩을 손상시키지 않습니다. 따라서, 우리는 강력하게 긴 인큐베이션과 세탁 기간을 권장합니다. 셋째, 플루오로크롬의 선택은 관심의 신호에 적응해야 한다. 조직 샘플에서 일반적으로, 특히 백색 지방 조직에서, 불무시할 수 없는 자동 형광은 488 nm 및 555 nm에서 검출됩니다. 고도로 발현 된 단백질에 대 한 이것은 문제가 되지 않습니다 그리고 얼룩이 채널에서 잘 작동 합니다. 그러나 발현이 낮은 단백질의 경우 극한형 형광을 사용하는 것이 좋습니다. 지우기의 경우 방법론이 매우 간단하기 때문에 중요한 단계가 없습니다. 메틸 살리실레이트는 플라스틱 재료와 호환되지 않으므로 클리어링 단계를 위한 유리 병과 이미징을 수행하기 위해 유리 바닥이 장착된 금속 챔버를 권장합니다. 이 장착 절차에 대한 대안은 정상적인 유리 슬라이드, 치과 수지 및 유리 커버 슬립 (작은 유리 챔버를 생성하기 위해) 또는 ii) 유리 페트리 접시 (직립 현미경 설정용)를 사용하여 존재합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 INSERM에 의해 지원되었다, 유니버시테 코트 다쥐르( Côte d'Azur)와 프랑스 국립연구청(ANR)의 보조금으로 퓨처 라벡스 시나라이프(ANR-11-LABX-0028-01), 아카데미 2 "시스테메스 컴플렉스" 및 아카데미 4 "비벤테"를 통해 프로그램 UCA JEDI(ANR-15-IDEX-01) 라 레체르체 메디칼(에키페 FRM DEQ20180839587)과 J.G.(ANR18-CE14-0035-01-길러론)에 대한 젊은 조사 프로그램 도 쏟아졌다. 또한 콘세일 데파르테멘탈 데 알프스-마리타임스와 레지온 PACA가 지원하는 C3M의 이미징 코어 시설에 감사드리며, IBISA 현미경 및 이미징 플랫폼 코트 다쥐르(MICA)가 지원합니다. 우리는 조직 준비에 기술적 인 도움을 매리언 두소트 감사합니다. 우리는 애비 컷트리스, UCA 국제 과학 가시성, 원고의 증거 읽기에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes - Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes - Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software - IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
References
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
- Shields, K. J., Wu, C.
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W.
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
