Summary
Her beskriver vi en enkel, billig og rask clearing metode for å løse 3D-strukturen av både mus og humant hvitt fettvev ved hjelp av en kombinasjon av markører for å visualisere vaskulatur, kjerner, immunceller, nevroner og lipid-dråpefrakkproteiner ved fluorescerende bildebehandling.
Abstract
Fedme er et stort verdensomspennende folkehelseproblem som øker risikoen for å utvikle hjerte-og karsykdommer, type-2 diabetes og leversykdommer. Fedme er preget av en økning i fettvev (AT) masse på grunn av adipocytt hyperplasi og / eller hypertrophia, noe som fører til dyp ombygging av sin tredimensjonale struktur. Faktisk er den maksimale kapasiteten til AT å utvide under fedme avgjørende for utviklingen av fedmerelaterte patologier. Denne AT-utvidelsen er en viktig homeostatisk mekanisme for å muliggjøre tilpasning til et overskudd av energiinntak og for å unngå skadelig lipidsøl til andre metabolske organer, som muskel og lever. Derfor er det et grunnleggende spørsmål med høy klinisk anvendelighet å forstå den strukturelle ombyggingen som fører til svikt i AT-utvidelse. I denne artikkelen beskriver vi en enkel og rask clearing metode som rutinemessig brukes i vårt laboratorium for å utforske morfologien til mus og menneskelig hvitt fettvev ved fluorescerende bildebehandling. Denne optimaliserte AT-ryddemetoden utføres enkelt i ethvert standardlaboratorium utstyrt med en kjemisk hette, en temperaturkontrollert orbital shaker og et fluorescerende mikroskop. Videre er de kjemiske forbindelsene som brukes lett tilgjengelige. Viktigere, denne metoden gjør det mulig å løse 3D AT-strukturen ved å farge ulike markører for å spesifikt visualisere adipocytter, de nevronale og vaskulære nettverkene, og den medfødte og adaptive immunceller distribusjon.
Introduction
Fedme er preget av en økning i fettvevsmasse og har blitt et stort verdensomspennende folkehelseproblem, gitt at personer med fedme har økt risiko for å utvikle kardiovaskulær sykdom, type-2 diabetes, leversykdommer og noen kreftformer.
En grunnleggende fysiologisk funksjon av fettvev er å modulere helkroppsglukose og lipid homeostase1,2. I fôringsperioden lagrer adipocytter (det vil si hovedcellene i fettvevet) overskuddet av glukose og lipider levert av et måltid i triglyserider. Under fasting bryter adipocytter ned triglyserider i ikke-forestret fettsyrer og glyserol for å opprettholde energibehovet i kroppen. Under utviklingen av fedme, fettvev utvide ved å øke størrelsen (hypertrophia) og / eller antall (hyperplasi) av adipocytter1, for å øke lagringskapasiteten. Når utvidelsen av fettvev når sin grense, en konstant svært variabel blant pasienter, de resterende lipider akkumuleres i andre metabolske organer, inkludert muskler og lever3,4, fører til deres funksjonelle svikt og initiere fedme-relaterte kardio-metabolske komplikasjoner1,5. Derfor er identifisering av mekanismene som styrer fettvevsutvidelse en viktig klinisk utfordring.
De morfologiske endringene dokumentert i fettvev under fedme er knyttet til sin patologiske dysfunksjon. Flere fargingsprosedyrer har blitt brukt til å beskrive vevsorganisering av fettvevet, inkludert actin6, vaskulære markører7,lipiddråpemarkører8og spesifikke immuncellemarkører9,10. Men på grunn av den enorme diameteren av adipocytter (50 til 200 μm)11, er det viktig å analysere en stor del av hele vevet i tre dimensjoner for å nøyaktig analysere de dramatiske strukturelle AT-endringene observert under fedme. Men fordi lyset ikke trenger inn i et ugjennomsiktig vev, er det ikke mulig å avbildning i 3D i en stor vevsprøve ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Metoder for vevrydding for å gjøre dem gjennomsiktige har blitt rapportert i litteraturen (for en gjennomgang,se 12) slik at man kan fjerne vev og utføre dyptgående, hele vev fluorescens mikroskopi. Disse metodene gir enestående muligheter til å vurdere 3D cellulær organisasjon i sunt og sykt vev. Hver av de beskrevne metodene har fordeler og ulemper, og må derfor nøye velges avhengig av det studerte vevet (for en gjennomgang, se13). Faktisk krever noen tilnærminger en lang inkubasjonsperiode og / eller bruk av materialer eller forbindelser som enten er dyre, giftige eller vanskelige å få14,15,16,17,18,19. Ved å dra nytte av en av de første forbindelsene som ble brukt for hundre år siden av Werner Spalteholz for å fjernevev 20,satte vi opp en brukervennlig og billig protokoll som er veldig godt tilpasset for rydding av alle mus- og menneskelige fettvevsdepoter i ethvert laboratorium med typisk utstyr, inkludert en kjemisk hette, en temperaturkontrollert orbital shaker og et konfokalt mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble testet og er validert for alle mus og menneskelige hvite fettvev depoter. Menneske- og mus fettvev ble samlet inn i henhold til europeiske lover og godkjent av franske og svenske etiske komiteer.
1. Fiksering av mus og humant hvitt fettvev
- Dypp den høstede musen eller humant hvitt fettvev i minst 10 ml PBS som inneholder 4% paraformaldehyd (PFA) i et 15 ml plastrør.
- Rist plastrøret ved romtemperatur på en rulleplate i 1 time.
- La plastrøret stå ved 4 °C på en rullende plate over natten for å fullføre fikseringen.
MERK: Denne protokollen er tilpasset store fettvevsprøver, for eksempel hele epididymale fettputer hentet fra mus matet et normalt kosthold (≈250 mg - ≈0,6 cm3). For større prøver som epididymale fettputer hentet fra mus matet et fettrikt kosthold (≈ 1,5 g - ≈4 cm3) eller humane fettvevsprøver, selv om clearing protokollen skal fungere perfekt for hele prøven (ved å skalere opp PFA og antistoffblandinger), generelt, vi kuttet vev stykker rundt 1 g (≈2,5 cm3) for å reservere de resterende prøvene enten for ekstra farging eller applikasjoner. For PFA (trinn 1.1.) anbefaler vi å bruke omtrent 10 ganger volumet av vevet. For antistoffblandingene (trinn 3.1. og 3.4.), øk volumet for å fullstendig senke vevet helt, og bruk et 15 ml plastrør (se Materialtabell) hvis vevet er for stort for et mikrorør i plast på 1,5 ml (se Materialtabell).
2. Permeabilisering og metning av mus og humant hvitt fettvev
- Skyll det faste hvite fettvevet i 10 ml PBS i 5 min ved romtemperatur for å fjerne alle spor av PFA.
- Dypp vevet i et 15 ml plastrør som inneholder 10 ml PBS supplert med 0,3% glycin (se Materialtabell) og rist røret ved romtemperatur i en orbital shaker i 1 t ved 100 omdreininger per minutt (rpm) for å slukke de gjenværende frie aldehydgruppene.
- Dypp vevet i et 15 ml plastrør som inneholder 10 ml PBS supplert med 0,2 % Triton X-100 (se Materialtabell)og rist røret ved 37 °C i en temperaturkontrollert orbital shaker i 2 timer ved 100 o/min.
- Dypp vevet i et 15 ml plastrør som inneholder 10 ml PBS supplert med 0,2 % Triton X-100 og 20 % DMSO (se Materialtabellen) og rist røret ved 37 °C i en temperaturkontrollert orbital shaker ved 100 o/min over natten.
- Dypp vevet i et 15 ml plastrør som inneholder 10 ml PBS supplert med 0,1 % Tween-20 (se Materialtabell),0,1 % Triton X-100, 0,1 % deoksykollat (se Materialtabell)og 20 % DMSO og rist røret ved 37 °C i en temperaturkontrollert orbital shaker ved 100 o/min i minst 24 timer.
- Skyll vevet i et 15 ml plastrør som inneholder 10 ml PBS supplert med 0,2% Triton X-100 og rist røret ved romtemperatur i en orbital shaker ved 100 rpm i 1 time.
- Dypp vevet i et 15 ml plastrør som inneholder 10 ml PBS supplert med 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA (se Materialsekk)og rist røret ved 37 ° C i en temperaturkontrollert orbital shaker ved 100 rpm i 12 h, for å mette noen steder som ikke spesifikt kan binde antistoffer.
MERK: I trinn 2.7 kan BSA erstattes av blodserum av arten av det sekundære antistoffet som brukes.
3. Farging prosedyre for mus og menneskelig hvitt fettvev
- Overfør vevet i et 1,5 ml mikrorør i plast som inneholder 300 μL PBS supplert med 0,2 % Triton X-100, 10 % DMSO, 3 % BSA og de primære antistoffene (10x mer konsentrert enn for kryoseksjonsfarging, men optimal antistoffkonsentrasjon bør evalueres for hvert antistoff). Beskytt røret mot lys ved å dekke med aluminiumsfolie og rist røret ved 37 °C i en temperaturkontrollert orbital shaker ved 100 o/min i minst to dager (se notatet i trinn 1.1 og trinn 3.7.1).
- Skyll vevet i et 15 ml plastrør som inneholder 10 ml PBS supplert med 0,2 % Triton X-100, 10 % DMSO og 3 % BSA og rist røret beskyttet mot lys ved 37 °C i en temperaturkontrollert orbital shaker ved 100 o/min i 5 timer. Utfør dette trinnet to ganger.
- Skyll vevet i et 15 ml plastrør som inneholder 10 ml PBS supplert med 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA og rist røret, beskyttet mot lys, ved 37 ° C i en temperaturkontrollert orbital shaker ved 100 rpm i en natt til to dager.
- Overfør vevet til et 1,5 ml plastmikrorør som inneholder 300 μL PBS supplert med 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA og sekundære antistoffer (10x mer konsentrert enn for kryoseksjonfarging). Beskytt røret mot lys ved å dekke med aluminiumsfolie og rist røret ved 37 °C i en temperaturkontrollert orbital shaker ved 100 o/min i minst to dager (se notatet i trinn 1.1 og trinn 3.7.1).
- Skyll vevet i et 15 ml plastrør som inneholder 10 ml PBS supplert med 0,2 % Triton X-100, 10 % DMSO og 3 % BSA og rist røret, beskyttet mot lys, ved 37 °C i en temperaturkontrollert orbital shaker ved 100 o/min i 5 timer. Utfør dette trinnet to ganger.
- Skyll vevet i et 15 ml plastrør som inneholder 10 ml PBS supplert med 0,2 % Triton X-100, 10 % DMSO og 3 % BSA og rist røret, beskyttet mot lys, ved 37 °C i en temperaturkontrollert orbital shaker ved 100 o/min i én natt til to dager.
- Skyll vevet i et 15 ml plastrør som inneholder 10 ml PBS og rist røret, beskyttet mot lys, ved 37 °C i en temperaturkontrollert orbital shaker ved 100 o/min i 2 timer.
MERK: For merking av spesifikke strukturer som kjerner eller actin, tilsett 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI eller tilsvarende) og/eller fluorescerende merket-falloidin må legges til i trinn 3.1. når bare fluorescerende merkede primære antistoffer brukes, eller i trinn 3.4. når sekundære antistoffer brukes.
MERK: For fargingsprosedyren kan primære antistoffer som allerede er konjugert med fluorokromer (som de som brukes til strømningscytometri) brukes, og vi anbefaler det for inntak av tid og spesifisitet. Faktisk, selv om musen primære antistoffer kan brukes etterfulgt av sekundære anti-mus antistoffer, som vi demonstrerte det her, har vi ofte observert ikke-spesifikk farging av blodkar på grunn av sirkulerende immunoglobulin. Derfor, for å unngå dette problemet, primære antistoffer som allerede er merket anbefales sterkt, og her gir vi bevis for at antistoffene som brukes i flytcytometri er kompatible med vår prosedyre. Men i det spesifikke tilfellet av et antigen som uttrykkes på lave nivåer, er et signalforsterkningstrinn via sekundære antistoffer obligatorisk; når det eneste tilgjengelige primære antistoffet er laget i musen, kan en hjerteperfusjon av musene med PBS i minst 5 min ved offeret fjerne en stor andel sirkulerende immunglobulin og dermed den ikke-spesifikke fargingen.
4. Ryddeprosedyre for mus og humant hvitt fettvev
- Dypp vevet i et 15 ml plastrør som inneholder 10 ml 50% etanol og rist røret, beskyttet mot lys, ved romtemperatur i en orbital shaker ved 100 rpm i 2 timer.
- Dypp vevet i et 15 ml plastrør som inneholder 10 ml 70% etanol og rist røret, beskyttet mot lys, ved romtemperatur i en orbital shaker ved 100 rpm i 2 timer.
- Dypp vevet i et 15 ml plastrør som inneholder 10 ml 95% etanol og rist røret, beskyttet mot lys, ved romtemperatur i en orbital shaker ved 100 rpm i 2 timer.
- Dypp vevet i et 15 ml plastrør som inneholder 10 ml 100% etanol og rist røret, beskyttet mot lys, ved romtemperatur i en orbital shaker ved 100 rpm i 2 timer.
- Dypp vevet i et 15 ml plastrør som inneholder 10 ml 100% etanol og rist røret, beskyttet mot lys, ved romtemperatur i en orbital shaker ved 100 rpm over natten.
- Dypp vevet i en 20 ml glassflaske med en plasthette (se materialbord) som inneholder 5 ml metylsallisylat (se Materialtabell) under en kjemisk hette og rist glassbeholderen, beskyttet mot lys, ved romtemperatur i en orbital shaker ved 100 o/min i minst 2 timer.
MERK: Avregningsprosedyren kan akselereres betydelig (om nødvendig) ved å unngå trinn 4.3. og 4.5., selv om den endelige clearing kvaliteten ville bli litt redusert.
5.3D-confocal avbildning av ryddet hvitt fettvev
- Overfør vevet til et metallisk bildekammer utstyrt med en glassbunn (se Materials bord) under en kjemisk hette og fyll kammeret med fersk metylsalylat.
MERK: For å sikre vevet på plass, og dermed for å hindre at det flyter eller beveger seg sidelengs i kammeret, påfør flere 18 mm runde glassdeksler (se Materialtabell) på toppen av vevet når du monterer det inn i kammeret. - Plasser bildekammeret på et omvendt konfokalmikroskop.
- Bilde vevet ved hjelp av et lavt forstørrelsesmål (f.eks. 4x mål) for å generere noen cm3D-kart over hele fettvevet eller av den menneskelige vevsprøven.
- Velg flere områder for vevsprøvetaking ved høyere forstørrelse. Bruk vanligvis et 20x langdistanseluftmål som gir et godt forhold mellom oppløsning og dybde. Vi kjøper store mosaikkbilder med z-stabler mellom 600 og 2000 μm dybde.
MERK: Bruk et mål om langdistanse for å bilde dypere inn i vevet.
6. Ekstraksjon av kvantitative resultater fra 3D-fettvevsbildene
MERK: Segmenteringen av de forskjellige strukturene og den påfølgende ekstraksjonen av den kvantitative informasjonen fra 3D-bildestakken som genereres i punkt 5, kan utføres ved hjelp av noen av de mange eksisterende bildeanalyseprogramvarealternativene, enten kommersielle eller freeware. I de følgende punktene beskriver vi en strategi som rutinemessig brukes i vårt laboratorium for å trekke ut kvantitativ informasjon fra 3D-fettvevsbilder ved hjelp av kommersiell programvare (se Materials tabell).
- Konverter 3D-stablene til programvareformatet for å frigjøre minneplass.
- Segmenter cellene.
- Åpne Celle-modulen i programvaren.
- Endre innstillingen for celledeteksjon til plasmamembranfarging.
- Velg den fluorescerende kanalen til markøren som brukes til å avgrense celleperipherien (fallosid som merker kortikal actin- eller plasmamembranmarkører som F4/80 for makrofag, TCR-β for T-celler eller klynge av differensierings-CD-proteiner som er spesifikke for immuncelleundertyper).
- Definer terskler og angi en rekke forventede cellestørrelser (det vil si 1 til 200 μm for cellegjenkjenning).
- Kjør segmenteringen. Et volum som tilsvarer z-stakken vil bli generert med de segmenterte cellene fargekodet med en annen farge for hver av nabocellene.
- Påfør statistiske filtre (størrelse, rundhet, sirkularitet, etc.) i statistikkfanen for å utelukke segmenteringsartefakter og/eller for å avgrense segmenterte celler til cellen av interesse basert på deres størrelse (det vil si 20-200 μm for adipocytter; 5-25 μm for makrofager; 1-3 μm for lymfocytter).
- Trekk ut målinger og kvantitative data (volum, antall, størrelse, diameter, etc.) fra statistikkfanen.
- Segment cellulære komponenter (kjerner, vesikler, etc.) eller fartøy som en struktur.
MERK: Selv om filtreringssegmenteringen er svært nyttig for å studere fartøyets tilkobling, bruker vi overflatemodulsegmenteringen til å trekke ut data om fartøyets størrelse, volum og diameter. Faktisk går kvantifiseringen av fartøyenes størrelser tapt ved bruk av filamentmodulen.- Åpne Surface-modulen for programvaren.
- Velg den fluorescerende kanalen til markøren som brukes til å merke den subcellulære komponenten spesifikt for å rekonstruere den i 3D.
- Sett opp terskler og gi en rekke forventet diameter størrelse på strukturen (det vil vil, 0,5-5 μm for kjerner; 0-100 μm for fartøy; etc.).
- Kjør segmenteringen. Et volum med den segmenterte mobilstrukturen genereres. Målinger og kvantitative data (volum, antall, størrelse, diameter, etc.) kan trekkes ut fra statistikkfanen.
- Segmenter fartøyene som et rørformet kontinuum.
MERK: Selv om filtreringssegmenteringen er svært nyttig for å studere fartøyets tilkobling, bruker vi overflatemodulsegmenteringen til å trekke ut data om fartøyets størrelse, volum og diameter. Faktisk går kvantifiseringen av fartøyenes størrelser tapt ved bruk av filamentmodulen.- Åpne Filaments-modulen for programvaren.
- Velg den fluorescerende kanalen som tilsvarer fartøyets flekker.
- Definer terskler for fluorescensintensiteten, og velg riktig antall forventede tilkoblingsnoder.
- Kjør segmenteringen. Filamenter som representerer fartøysnettet vil bli generert i 3D. Målinger kan utvinnes fra statistikkfanen, slik at de kan innhente kvantitative data, inkludert fartøylengde, antall fartøygrenming, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren som er beskrevet her og oppsummert i figur 1,var vi i stand til å flekke og optisk klart menneske- og mushvitt fettvev som presentert i henholdsvis figur 2A og figur 2B. Det klarerte vevet ble overført til det metalliske bildekammeret for å utføre konfokal avbildning (figur 3A). Ryddingen forbedret dybden av vevsbildene som vi var i stand til å skaffe (figur 3B og figur 3C). Hele fettvevet kan kjøpes i 3D ved lav forstørrelse ved hjelp av et 4x mål (se Supplerende Movie 1), for å generere et 3D-kart, slik at du kan velge de forskjellige områdene som skal kjøpes ved høy forstørrelse ved hjelp av et 20x mål (figur 3D). De høye forstørrelsesbildene er anskaffet i 3D med en dybde på 2 mm (figur 3E).
Denne prosedyren gjør det mulig å merke mange generelle cellemarkører, inkludert kjerner ved hjelp av DAPI og actin ved hjelp av fluorescerende merket Phalloidin. Spesifikk farging av lipiddråper og adipocytter kan oppnås ved hjelp av perilipinantistoff (se tabell over materialer; Figur 4A) og anti-Glut4 antistoff (se tabell over materialer; Figur 4B) Henholdsvis. Blodkar kan oppdages ved hjelp av enten CD31-antistoffet (se materialtabell; Figur 4C) eller ved en intravenøs injeksjon av lectin-DyLight649 kort tid før museoffer (se tabell over materialer; Figur 4D). Makrofager og T-celler kan visualiseres ved hjelp av anti-CD301-PhycoErythrin antistoff (se tabell over materialer; Figur 4D) og anti-TCR-β-Pacific Bleu antistoff (se tabell over materialer; Figur 4E). Det perifere nervenettverket kan oppdages ved hjelp av antityrosinhydroksylaseantistoffet (TH) (se materialtabellen; Figur 4F-G). I tillegg tillater denne protokollen rydding av mus epididymal fettvev (Figur 4A-B, E), mus subkutan fettvev (Figur 4D, G),mus brun fettvev (Figur 4F), og menneskelig fettvev (figur 4C). Ved hjelp av en kombinasjon av disse merking og en kommersiell programvare (se tabell over materialer) for å segmentere disse markørene, kan vi bestemme innenfor fettvev i) adipocytter gjennomsnittlig størrelse og størrelsesfordeling (Figur 5A-B) og ii) blodkarnettverkstetthet (figur 5C).
Figur 1: Sammendrag av ryddingsprosedyren for hvitt fettvev. Mus eller humant hvitt fettvev er fast, gjennomsyret, mettet, farget og ryddet. Bilder blir deretter kjøpt i 3D og analysert ved hjelp av en kommersiell programvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fotografier av hvitt fettvev. (A)Fotografi av humant hvitt fettavstøtende fettvev før og etter ryddingsprosedyren. (B) Fotografi av mus epididymal hvit fettvev før og etter rydding prosedyren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Forbedret bildedybde med fettvevsrydding. (A) Montering av metallbildekammeret utstyrt med glassbunn. (B) Z-serien bilder av mus epididymal hvit fettvev farget med falloidin-Alexa488 (grønn) før og etter clearing. (C) XZ projeksjoner som tilsvarer de hvite stiplede linjene over panelet B z-stabel. (D) Z-projeksjon av 0,4 cm z-stabel med mus subkutant hvitt fettvev farget for actin ved hjelp av Falloidin-Alexa488 og ervervet ved lav forstørrelse med et 4x mål. De små bildene til høyre ble kjøpt på den valgte vevsposisjonen ved hjelp av et 20x mål. (E) Sidevisning av 3D-volumgjengivelse av bilde z-stack fra ryddet mus hvit fettvev farget med Falloidin-Alexa488 kjøpt på samme måte som 20x bilder fra (D). 3D-bildedybden oppnådd ved vår høye forstørrelsesprosedyre er demonstrert her og understreket av en z-dybdefargekoding (mørk blå for z = 0 mm til mørk rød for z = 2 mm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Mus og humant hvitt fettvev farget for flere markører. (A)Enkelt plan bilde av mus epididymal hvit fettvev farget for lipid dråper ved hjelp av anti-perilipin1 antistoff og anti-mus-alexa647-konjugert antistoff. (B)Mosaic enkelt plan bilde av mus epididymal hvit fettvev farget for kjerner og adipocytter ved hjelp av DAPI, anti-Glut4 antistoff og anti-mus-alexa647-konjugert antistoff. (C) Z-projeksjon av 600 μm z-stabel av humant hvitt fettindiponeringsvev farget for fartøy ved hjelp av CD31-alexa647-konjugert antistoff. (D) Z-projeksjon av 600 μm z-stabel med mus subkutant hvitt fettvev farget for fartøy og makrofager ved hjelp av lectin-DyLight649 intravenøse injeksjoner og anti-CD301-alexa555 antistoff. Innfeltet nederst til høyre er et zoomet bilde av den hvite stiplede boksen. (E) Enkelt plan bilde av mus epididymal hvit fettvev farget for actin og T-celler ved hjelp av falloidin-Alexa488 og anti-TCRβ-Pacific blå-konjugert. Innfeltet nederst til høyre er et zoomet bilde av den hvite stiplede boksen. (F) Z-projeksjon av 50 μm z-stabel med mus brun fettvev farget for kjerner og nevronale nettverk ved hjelp av DAPI, anti-TH antistoff og anti-kanin-alexa647-konjugert antistoff. (G) Z-projeksjon av 600 μm z-stabel med mus subkutant hvitt fettvev farget for kjerner og nevronale nettverk ved hjelp av DAPI, anti-TH antistoff og anti-kanin-alexa647-konjugert antistoff. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Analyse av 3D-bilder ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare (se materialtabell). (A) 3D volum gjengivelse av menneskelige adipocytter segmentert i 3D av kommersielt tilgjengelig programvare. Hver adipocyte har en annen farge til sin kontakt tilstøtende adipocytter. Fartøy er representert i rødt. (B)Størrelse kvantifisering og distribusjon av adipocytter fra 3D volum gjengivelse av panel A, som inneholder rundt 20.000 adipocytter. (C) 3D-volumgjengivelse av blodkar segmentert i 3D ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare og representert i rødt eller gult for henholdsvis store og små fartøy. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende film 1: 3D-volumgjengivelse av hele subkutant hvitt fettvev vist i figur 3D. Den hvite boksen representerer en 2 cm3 kube. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endringene som forekommer i fettvevet i løpet av patologisk progresjon, for eksempel fedme, er grunnleggende for forståelsen av mekanismene bak patologien. Banebrytende studier som avslørte slike mekanismer i fettvev har vært basert på globale tilnærminger som hele fettvev proteomics21, flyt cytometri22,,23,og transkripsjonsmikromikk24,25. I tillegg er det gjort forsøk på å utforske de strukturelle endringene som skjer i fettvev ved hjelp av histologiske analyser26,27,28,29. Analysen av 5-10 μm fettvevsseksjoner, på grunn av den begrensede størrelsen på seksjonen, begrenser imidlertid evnen til å sette pris på viktige strukturelle egenskaper. For det første er bare noen få adipocyttkjerner påviselig per seksjon, siden hver seksjon bare representerer en liten del av adipocytter (1/10th). For det andre er størrelsen på adipocytter anslått fra fettvevsseksjoner unøyaktig fordi de fleste adipocytter kuttes under eller bak ekvator, noe som fører til en partisk (under) måling av deres gjennomsnittlige størrelse. For det tredje går blodkaret og nervefiberkontinuumet tapt under fysisk snitting. For det fjerde er fordelingen av hver undertyper av immunceller i vevet vanskelig å fastslå fordi de tredimensjonale koordinatene går tapt. I denne sammenheng, metodikken vi foreslår her tillater enhver standard laboratorium å bilde menneskelig og mus hvitt fettvev i tre dimensjoner, på en enkel og rimelig måte.
Denne metoden har noen begrensninger. For det første er tiden som kreves for å forberede vevet (fiksering, permeabilisering, farging, rydding) lang (mer enn en uke). Dette ville være vanskelig å redusere fordi mesteparten av denne tiden er nødvendig for å flekke vevet. Penetrasjon av antistoffer i slike store vevsprøver krever lange inkubasjonstider. Redusere inkubasjonstiden ville øke risikoen for å ha ikke-homogen antistoff penetrasjon, noe som ville føre til flekker artefakter. Derfor er det eneste mulige vinduet for å få tid og forkorte prosedyren tiden dedikert til å fjerne vevet, noe som tar rundt en dag når optimale resultater er nødvendig, men dette kan reduseres til en halv dag uten en dramatisk nedgang i kvalitet. Den andre begrensningen er den sannsynlige krympingen av vevet. Faktisk, i enhver protokoll som dehydrerer vev ved hjelp av løsemidler, er det sannsynlig at vevet krymper på grunn av vannfjerning. Estimering av denne krympingen er alltid utfordrende, og det er nesten umulig her fordi kanten av vevet blir gjennomsiktig når lipider begynner å bli ekstrahert under dehydreringsprosessen. Derfor må størrelsen estimeringer av det ryddet vev tolkes med forsiktighet. Men å sammenligne endringer i adipocyttstørrelser eller karlengde mellom vev avledet fra mus med forskjellige genotyper og / eller sendt til forskjellige miljøforhold forblir informativ11. Den siste begrensningen er knyttet til det store volumet av hele musen fettvev eller av en stor menneskelig fettvev kirurgisk prøve. Faktisk, selv om protokollen er perfekt tilpasset for å fjerne disse store prøvene, er det utfordrende å forestille seg et helt organ med et konfokalt mikroskop. Strategien for å overvinne dette problemet og utnytte hele organryddingsprosedyren, er å skaffe seg et 3D-kart over hele orgelet ved å bruke et 4x-mål, og å velge bestemte områder tilfeldig spredt i vevet der høyere forstørrelse 3D-bilder ved hjelp av et 20x langdistansemål kan anskaffes. Oppsettet "høy forstørrelse" gjør det mulig å forestille seg vevsvolumet på rundt 45 mm3 (4,7 x 4,7 x 2 mm). Selv om dette volumet er begrenset i forhold til volumet av hele orgelet (0,5 til mer enn 4 cm3),gjentar oppkjøpene i flere posisjoner i vevet tillater oss å få en god prøvetaking av vevet ved cellulær til sub-cellulær oppløsning. Vær oppmerksom på at avbildning av store vev vil generere en betydelig mengde bildedata som må lagres.
Prosedyren har betydelige forskjeller sammenlignet med metoder som tidligere har blitt beskrevet for å fjerne fettvev14,30. Først av alt, i motsetning til AdipoClear, som bruker metanol, diklormetan og dibenzylether14, metoden som presenteres her bruker etanol for dehydrering og metylsalylate for rydding. Derfor er prosedyren tryggere fordi den utnytter mindre giftige clearing løsemidler som ofte brukes av mat / drikke-behandling næringer (etanol og metylsalicylat), i forhold til den høye toksisiteten av diklormetan, metanol og dibenzylether. Videre er utarbeidelsen av vevet i henhold til protokollen to dager raskere enn AdipoClear-protokollen14. Mer nylig ble en annen metode foreslått av Li og kolleger for å fjerne fettvevsstykker ved å fordype dem i glyserol30. Denne protokollen er veldig enkel selv i forhold til denne prosedyren, og kvaliteten på bildene er god selv ved høy forstørrelse. Denne ryddeprotokollen fungerer imidlertid bare effektivt når du bruker 2 mm3 fettvevsbiter. Snittingen av vevet i disse små prøvene før avregningsprosedyren hindrer en fra å bilde vevsvolumer større enn 2 mm3 selv ved lav forstørrelse. Prosedyren som presenteres her gjør det mulig å kartlegge hele vevet i 3D ved lav forstørrelse og oppkjøp av 3D-stabler av bilder rundt 45 mm 3 ved flerekjente stillinger i hele det fjernede fettvevet ved høy forstørrelse.
Denne prosedyren kan ha flere fremtidige programmer. Som med alle metodene, kan prosedyren som er beskrevet her forenklet og / eller ytterligere optimalisert. Et interessant fremskritt for prosedyren kan komme fra kombinasjonen av clearingprosessen, beskrev vi, med flere bildetilnærminger. Spesifikke bildeoppsett, for eksempel optical projection tomography (OPT), Total Internal Reflection Fluorescence microscopy (TIRF), Selective Plan Illumination Microscopy (SPIM) eller Stimulated Emission Depletion microscopy (STED) er i prinsippet kompatibel med prosedyren, selv om dette vil begrense anvendelsen for de laboratoriene som er utstyrt med disse systemene. Alternativt, ved hjelp av et mål med en høy numerisk blenderåpningsindeks og et oppkjøpssystem som er i stand til å skaffe hundrevis av bilder per sekund, som finnes i mange laboratorier, kan man utføre superoppløsningsanalyser ved hjelp av Super Resolution Radial Fluctuations (SRRF) etterbehandling bildeanalyse freeware31. Interessant, klassiske fluorokromer er tilpasset SRRF-analysen, som ville muliggjøre 3D-superoppløsningsanalyser av hele menneskelige og mus hvite fettvev.
Mange kritiske trinn i protokollen er relatert til vevsbehandling før selve ryddingen. Først av alt, og når det gjelder klassiske histologiske analyser, er fikseringstrinnet grunnleggende. Ved svak fiksering bevares ikke strukturelle egenskaper, mens utvidet fiksering fører til krysskobling og blokkering av spesifikke antigenområder og påfølgende ikke-homogen immun-farging. Et annet følsomt trinn er fargingen av vevet, som presenterer flere kritiske punkter som vi vil beskrive nedenfor. Først må antistoffene valideres ved å teste dem på kryostatseksjoner for å bekrefte at de er funksjonelle og for å bestemme deres optimale konsentrasjon. Den endelige konsentrasjonen som brukes til ryddingsprosedyren er ti ganger den optimale konsentrasjonen for kryostatseksjonene. For det andre er inkubasjonstiden også kritisk på grunn av vevets størrelse. En inkubasjonstid som er for kort, vil gi svak eller ikke-homogen immunstaining (f.eks. korrekt farging på periferien av vevet, men ingen intern farging). På samme måte vil vasketrinn som er for korte forhindre at ikke-spesifikt bundne antistoffer fjernes fra vevet som fører til ikke-spesifikk farging. Så vidt vi vet, svekker ikke utvidet inkubasjon av vevet med antistoffer fargingen. Derfor anbefaler vi på det sterkeste lange inkubasjons- og vaskeperioder. For det tredje må valget av fluorokrom tilpasses signalet av interesse. I vevsprøver generelt, og spesielt hvitt fettvev, er ikke-ubetydelig autofluorescens påviselig ved 488 nm og 555 nm. For høyt uttrykte proteiner er dette ikke et problem, og fargingen vil fungere bra i disse kanalene. Men for proteiner med lavt uttrykk anbefaler vi sterkt bruk av fjernrøde fluorokromer. For clearing er det ingen kritiske skritt siden metodikken er veldig enkel. Husk at metylsallisat ikke er kompatibel med plastmaterialer, derfor anbefaler vi glassflasker for ryddetrinnene og et metallisk kammer utstyrt med en glassbunn for å utføre bildet. Alternativer for denne monteringsprosedyren finnes ved hjelp av i) en vanlig glasssklie, tannharpiks og glassdekslerlip (for å generere et lite glasskammer), eller ii) en glass petriskål (for oppreist mikroskopoppsett).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av INSERM, Université Côte d'Azur, og ved tilskudd fra det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR) gjennom Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), programmet UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 "Systèmes Complexes" og Academy 4 "Complexité et diversité duvant vi", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), og Young Investigator Program til J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Vi takker også Imaging Core Facility of C3M finansiert av Conseil Départemental des Alpes-Maritimes og Région PACA, og som også støttes av IBISA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA). Vi takker Marion Dussot for teknisk hjelp i vevsforberedelse. Vi takker Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, for bevislesing av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes - Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes - Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software - IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
References
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
- Shields, K. J., Wu, C. Differential Adipose Tissue Proteomics. Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W. Adipose tissue changes in obesity. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 1049-1052 (2005).
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
