Summary
CRISPR/Cas9越来越多地用于非模型生物体的基因功能特征。该协议描述了如何产生 Culex皮皮恩斯的淘汰线，从准备注射混合，获得和注射蚊子胚胎，以及如何后方，交叉和屏幕注射蚊子及其后代所需的突变。
Abstract
Culex 蚊子是多种疾病的主要传播媒介，这些疾病对人类和动物健康产生了负面影响，包括西尼罗河病毒和由犬心虫和象虫病等纤维线虫引起的疾病。最近，CRISPR/Cas9基因组编辑被用来诱导现场定向突变，通过注射一种Cas9蛋白，该蛋白质已经与导引RNA（gRNA）复合成几个昆虫物种的新鲜胚胎，包括属于 阿诺菲勒斯 家族和 伊蚊的蚊子。操纵和注射 Culex 蚊子稍微困难一些，因为这些蚊子将卵子直立在木筏上，而不是像其他种类的蚊子那样单独。在这里，我们描述如何设计gRNA，用Cas9蛋白复合它们，诱导 Culex皮皮恩斯 雌性蚊子产卵，以及如何准备和注射新铺设的胚胎与Cas9/gRNA进行微注射。我们还描述了如何饲养和筛选注射蚊子的所需突变。具有代表性的结果表明，该技术可用于诱导 Culex 蚊子基因组中的部位定向突变，并稍作修改，也可用于在其他蚊子物种中产生空突变体。
Introduction
Culex蚊子分布在世界各地的温带和热带地区，传播几种致命的病毒，包括西尼罗河病毒1，圣路易斯脑炎2，以及引起犬心虫3和象虫病4的线虫。库莱克斯皮皮恩斯综合体的成员，其中包括Cx.五角星，Cx.皮皮恩斯皮皮恩斯和Cx.皮皮恩斯摩尔斯，显示其生物学的许多方面惊人的变化。例如，虽然Cx.五角星和Cx.皮皮恩斯骚扰者不能进入过冬的休眠5，6，Cx.皮皮恩斯皮皮恩斯显示强大的季节性反应，并进入糖尿病，以回应短天7，8。此外，Cx.皮皮恩斯的骚扰往往更人为的，而Cx.皮皮恩斯和Cx.五角星更动物性6。然而，在美国和世界许多其他地方，这些物种杂交，这对疾病传播有很强的影响，因为Cx.pipiens皮皮恩斯和Cx.皮皮恩斯的杂交是机会型的喂食者，将咬鸟和人类9，从而成为西尼罗河病毒的桥梁载体。研究Culex蚊子生物学的这些和其他迷人的方面受到了阻碍，部分原因是Culex蚊子在实验室中饲养比伊蚊稍微困难一些，伊蚊产生静止和耐干燥的鸡蛋10，而且功能分子工具不如Culex物种开发得那么好。
CRISPR/Cas9基因组编辑是一项强大的技术，已用于评估几个重要的蚊子物种11，12，13的生物学，包括南方房子蚊子，Culex五角星14，15，16。这项技术由詹妮弗·杜德纳和埃马努埃尔·夏彭蒂埃开发，利用细菌衍生的CRISPR相关内核糖（Cas蛋白：见范德奥斯特等人的评论）对病毒进行天然细菌防御。当注射到动物胚胎中时，Cas9蛋白质与适当的引导RNA结合，可以在基因组内产生双链断裂。这是最常通过使用Cas9蛋白质，这是复杂的指南RNA，引导内分泌酶活性到基因组的特定区域。在Cas9蛋白创造了一个特定于部位的双链断裂后，细胞机械试图使用两种机制之一来修复断裂。第一种需要通过非同源端连接（NHEJ）将两端连结在一起，这种连接容易出错，并且经常在基因组中产生框架外插入和缺失，从而产生非功能性蛋白质，从而产生淘汰突变。或者，蜂窝机械可能使用同源定向修复 （HDR）， 通过查找类似的序列来正确修复中断。类似的序列可能由生物体内的第二条染色体提供（见审查18）。但是，如果修复的序列与原始序列完全匹配，Cas9 蛋白质将能够再次切割 DNA。或者，研究人员还可以包括一个供体质粒，该质粒包含目标序列切口两侧的同源序列，该序列通常带有荧光标记蛋白、原始基因的修改版本或其他可复制并插入基因组的修饰序列，或"敲击"。
注射胚胎时，时机至关重要，在使用CRISPR/Cas9基因组编辑在昆虫中产生突变时尤其如此。这是因为Cas9蛋白质和gRNA只有在胚胎处于同步状态、细胞膜形成之前以及胚胎内可获得多个细胞核时，才具有产生突变的最大能力。对于蚊子，核在卵泡后2-4小时到达外围，取决于温度19，因此必须在此时之前成功进行微喷射。此外，Cas9蛋白质将切断任何核DNA，它可以访问，这样，从注射产生的个体将包含细胞的马赛克，有些有所需的突变，而另一些没有。为了成功遗传这些突变，Cas9蛋白质必须切割存在于生殖系中的DNA，从而产生未来的卵子和精子。为了确保在生殖系中产生突变，最好将所有材料注射到靠近胚胎中极细胞位置的位置的地方，而胚胎是昆虫生殖系的祖细胞。极细胞位于 Culex 胚胎20的后端附近。除了注射胚胎外，还必须制定一个仔细的交叉和筛选后代的计划，以便检测所需的突变。
该协议描述了如何生成gRNA，并将其与Cas9蛋白复合，以准备注射混合物，以及如何诱导 Culex皮皮恩斯 雌性蚊子产卵，以及如何准备和注射这些卵子为CRISPR/Cas9介导的基因组编辑。此外，我们描述如何后方，交叉和屏幕注射胚胎及其后代，以确认所需的突变已经获得。使用这个协议，我们产生了一个感兴趣的基因， 周期，在 Culex皮皮恩斯的巴克耶菌株的空突变。这种菌株最初于2013年从俄亥俄州哥伦布市的野外采集蚊子中建立，由Meuti实验室维持。该协议可用于其他研究，要求CRISPR/Cas9基因组编辑在 Culex 蚊子，以及其他蚊子物种，更笼统地，是相关的使用CRISPR/Cas9基因组编辑到任何昆虫物种。
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Protocol
在大多数研究机构中，在产生或维持转基因昆虫之前，必须制定经批准的《生物安全议定书》，以确保转基因生物不会逃逸或被从实验室设施中移走。政府的其他法规也可能适用。在开始这种性质的项目之前，检查所有机构政策和程序，以确定需要哪些文件和批准。
1. 设计 gRNA 和准备注射混合物
- 为每个目标基因设计 2-5 gRNA，因为某些 gRNA 比其他基因工作得更好。针对感兴趣基因的 gRNA 可以手动设计，也可以使用免费程序（如斩波）。
- 设计和订购引物，将放大每个 gRNA 周围的 100-200 bp 片段。理想情况下，切割站点应位于 PCR 产品的中间三分之一到一半。请注意，切割的每个站点将产生多少 bp。
- 获取 gRNA。
- 从综合DNA技术、费舍尔科学、基因记录等商业公司购买 gRNA。这是最简单的选择。
- 或者，使用 PCR 放大在实验室中创建 gRNA，以生成后续等热合成的模板。请参阅波特等人描述的21 号和基斯特勒等人22号议定书。
- 通过注入胚胎的质粒提供 gRNA。在这种情况下，gRNA 应由 U6 促销器驱动（详情请参阅 23、24）。
- 获取Cas9蛋白。
- 从包括费舍尔科学公司在内的几家公司订购Cas9。这是最简单的选择。
- 根据巴苏等人25和基斯特勒等人的说法，在实验室中制造Cas9蛋白质并净化。
- 将 Cas9 mRNA注射到胚胎中，然后转化为活性Cas9蛋白。 Cas9 mRNA 可以在实验室中使用体外转录22 进行合成，也可以从西格玛等供应商处购买。
注：翻译后的Cas9蛋白必须在C-总站上包含核定位信号（NLS），因此NLS也必须存在于注入的 Cas9 mRNA中。 - 通过质粒表达在体内表达Cas9蛋白。在这种情况下，最好在胚胎促进剂的推动下，在目标物种中具有良好特征的质粒上表达Cas9。
注：迄今为止，胚胎促进剂在 Culex 蚊子中尚未得到很好的描述，因此建议注射纯化蛋白或Cas9 mRNA。
- 将gRNA与Cas9蛋白复杂化，该蛋白由基斯特勒等人22号改编而成。
- 如果将Cas9蛋白与gRNA一起注射（推荐），确保Cas9蛋白质的最终浓度为300 ng/μL，单GRNA的最终浓度为80微克/微升。
- 在冰上孵育20分钟。
- 使用体外检测（例如，指南-它 sgRNA 筛查套件）测试 gRNA。
- 使用 PCR 放大每个 gRNA 切口位点周围的碎片。
- 在凝胶上运行 PCR 产品，以确保其尺寸正确。然后，净化PCR产品并进行排序，以确保它们针对正确的基因区域。
- 将剩余纯化 PCR 产品 200 ng 与 1 μL 的 Cas9 反应缓冲、1 μL 的 BSA、1.5 μL 的复合 Cas9：gRNA 混合，使总反应体积达到 15 μL。 在 37°C 下孵育 5 分钟。
- 再次在凝胶上运行产品。如果Cas9蛋白成功切割PCR产品，主频段应显得更微弱，并应存在额外的较小频段。请注意原始 PCR 产品的尺寸减少，如果需要，请计算频段强度的降低，以接近切割效率。
- 准备最后的注射组合
- 对于成功切割其目标 PCR 产品的每种 GRNA，将每个 Cas9 和 gRNA 的体积混合到 0.5 mL 管中，以便最终体积保持 300 ng/μL 的 Cas9 蛋白质和 80 ng/μL 的每个 gRNA。
- 将复合的 Cas9 和 gRNA 存储在 -80 °C 下，直到需要注射为止。
2. 拉针和斜针
注：成功的注射和胚胎的存活需要锋利的针头（图1）。
- 使用 1 毫米外径的博罗硅酸盐或石英玻璃微胶囊。在拉扯之前，先将化学烟罩中的微资本硅化。
- 简言之，将 3 毫升的 Sigmacote 放入玻璃烧杯中，真空抽入包含玻璃微资本的第二个烧杯中至少 4 小时，使硅化溶液蒸发并沉淀在微资本的所有表面上。
- 之后，通过逐渐打开气门并让空气返回腔室，慢慢让真空室与环境压力相等。然后，针头准备被拔下。
- 使用前请务必阅读针拔器说明书。
注：下面的说明详细说明了如何使用P-2000激光针拔拔器拉玻璃针。请务必注意，即使是同一品牌的所有针头拉拔器也不会校准，无法跨不同单元拉出完全相同的针头。获得良好针头的关键是从给定的参数开始，然后使用高于和低于这些值的参数拉针。通过评估针头刺穿胚胎的程度以及注射混合物从针头流出的程度，测试每个参数的针头。完善参数，直到获得针，很容易打开或斜面，刺穿胚胎顺利，并提供注射混合容易。
- 使用 P-2000 激光针拔拔器拉针
- 打开激光针拔器，让激光在第一次拉动前预热 15 分钟。
- 为玻璃微资本管类型对机器进行编程（请记住，任何针拔器参数都是一个起点，因为针拔器没有校准，无法在所有拉拔器中产生相同的针头）：
石英：热 + 730;菲尔 = 4;维尔 = 40;德尔 = 122;脉冲 = 156 - 编程针拔器后，加载微资本并将其夹紧到位，注意只触摸微资本管的末端，而不是激光加热的区域。
- 夹住微资本后，将拇指和食指放在指条上，然后通过按弹簧一次释放一个来释放拉杆。
- 挤压拇指和食指，将棒子完全拉在一起。
- 将微资本管的另一侧放置在其夹子中，使小管的一小部分从两侧延伸。拧紧夹子，确保两个夹子都紧握手指，并牢固地固定"拉杆"。
- 关闭拉拔器上的保护罩。
- 按下 拉 按钮，激光将开始加热玻璃，由位于罩子下方的红色"激光开"灯表示。拉杆完全分离时，拉力完成，并伴有金属轰轰声。
- 在抬起护罩之前，确保"激光开启"灯不会亮起。
- 用拇指和食指将微资本管的小端握住，伸到夹子之外，并松开夹子。然后将微资本管从夹子中取出。
- 使用钳子小心地将微资本管放入方形的培养皿中，盘中内衬双面胶带。将针头放入握持箱时，确保针头的后端首先接触，并轻轻地将针头放入原位，以免尖尖损坏。
- 使用 PC-10/PC-100 拔针器拉针
- 使用 4 个重量设置 PC-10 拉拔器，并将单步拉力的温度设置为 50.4 °C。
- 将硅酸盐玻璃微资本放入顶部夹子中。然后将加权底部夹子提升到位置，夹住微资本的底部，确保毛细细处于拉两根好针的位置。这是一个相当长的拉力周期，但它产生良好的针斜。
- 斜针。
注：这种湿斜面方法可实时反馈针头的相对开口大小。- 组装磨料板和针斜面的保留环。确保磨料板的灰色侧朝上和下保留环之间向上方向。拧紧固定环上的螺丝，从螺丝交替拧到螺丝，以确保每个螺丝均匀拧紧。磨料板和固定环将在此后称为研磨组件。
- 将 13 滴（+ 520 μL）基座油放入光学平面上，然后将研磨组件放在板顶部。将装配件置于解剖显微镜下方，然后打开斜面器。与 Sutter 的建议相比，使用一点额外的油，因为当与这种湿斜面方法一起使用时，这会使磨料板旋转更长时间。
- 将 1% 光弗洛溶液添加到研磨表面，并将芯移入位置，使其浸入光伏溶液中。
- 打开主源处的空气。然后将拉的玻色酸盐针放入支架中，并拧紧固定环。打开调节器的空气，并增加，直到压力达到26 PSI。
- 从侧面观察，使用粗调整旋钮降低针头，直到它几乎触及Phoit-Flo液体表面。
- 调整显微镜，将针头定位在视场中。从最低放大率开始，增加放大倍数。使用粗调整旋钮小心地调整针头的位置，直到它只触及光弗洛液体的表面。
- 使用粗调整旋钮，继续在显微镜下观察，降低针头，直到它接近磨蚀表面，但不接触它。
- 使用微调旋钮，小心而缓慢地降低针头，密切注意针头及其在斜面磨料表面留下的阴影。当针头及其阴影看起来像是即将触摸磨蚀表面时，继续更缓慢和小心地降低针头。
- 交替让针头"斜面"，通过降低到磨蚀表面，然后提高它。在抬起针头之前，请快速注意微调旋钮上的微米设置，以便将针头降低到相同的位置，或在必要时降低到稍微低的位置。记得把针头放在照片弗洛液体层下面。一旦针头在磨料表面上方抬起来，请快速停止并重新启动斜面的旋转，以检查是否有气泡。如果针头已经足够斜面，气泡应该从针头流出，进入Pho3-Flo。如果不停止板，气泡很可能不会变得可见，直到针开太大。
- 如果针头在磨蚀表面上方凸起，并且斜面停止时没有气泡，则重复斜面程序，将针头降低到微调旋钮上的微米上稍低的位置，抬起针头，停止斜面板，并检查气泡。重复上述步骤，直到出现少量但稳定的气泡流。
- 出现气泡后，通过停止磨料板和降低气压来检查相对开口大小，并注意到气泡形成停止的 PSI，因为这是斜面针开口大小的相对指示。空气停止从针尖逸出的压力越低，针头开口越大。针头在 PSI 18-20 时停止从针头中逸出，这表明针头的开口相对较小，在用于微注射时对胚胎的损害应最小。
- 检查针头开口后，将气压增加到 26 PSI，以防止液体进入针头。然后使用粗调整旋钮将针头向上和从照片弗洛层中抬起来。需要注意的是，只要空气从针头流出，Photo-Flo就不会进入针头，因此针头内部可以防止污染。
- 一旦针头从 Photo-Flo 中取出，关闭空气并从针架上取下针头。
- 使用钳子，将新斜面针放入有双面胶带或建模粘土的培养皿中，使其保持原位。重复这个过程，直到10-20斜针已经产生。
3. 为父母代蚊子提供血液喂养
- Cx. pipiens蚊子的后幼虫在 25-27 °C 的明确长时间条件下（> 13 小时的光/天），以确保蚊子不会进入越冬的休眠或腹泻。
- 成人出现高峰期后七到十天，通过将加热装置插入电源来准备 Hemotek 膜进给系统。使用装置顶部的调整螺丝将每个单位的温度调整为 37 °C（人体内部体温）或 41 °C（鸡内部体温）。使用电温度计确保达到正确的温度。
- 准备血餐水库喂养。
- 为每个供血圆柱体切割一平方的准胶片，并赤脚摩擦护身膜。这提供了对蚊子有吸引力的气味。
- 尽可能薄地伸展副膜，并将边缘紧紧包裹在餐水库周围。如果需要，用橡胶 O 环固定到位。
- 将大约 200 μL 的 0.1 M ATP 溶液添加到 15 mL 的新鲜或解冻的全柠檬酸钠处理鸡血中。ATP 有助于刺激血液喂养，柠檬酸钠可防止血液凝固。
- 抓住储层，使护栏侧朝下，并小心地使用一次性移液器填充储层。每个储层都保存着3兆L的血液。用塑料塞密封灌装端口。
- 将餐水罐拧入加热装置，放在蚊笼顶部，使副膜侧朝下，蚊子可以通过网状物进食。
- 用黑色垃圾袋盖住笼子，模拟黄昏，并猛烈地吹进每个笼子，因为增加的CO2 浓度刺激血液喂养。
- 将喂食器放在笼子上2-8小时，以最大限度地增加血液喂养。定期检查并注意服用血餐的女性比例（其红色和腹部张张明显）。
4. 诱导成年蚊子产卵
- 血液喂养后四到五天，准备一个50mL圆锥管，用于蚊子的卵石。
- 在圆锥管底部附近创建一个 +20 mm 孔。
- 用两个正方形（35毫米2）的牙坝橡胶盖住洞，一个用水平缝，另一个用垂直缝。使用胶带将牙坝的正方形连接到锥形管上。
- 将 4.25 厘米的滤纸放在 35 mm x 10 mm Petri 盘上，然后用 750 μL 蒸馏水将滤纸弄湿。
- 将圆锥管倒置到滤纸上，来回扭动几次，以确保其安全。
- 使用口腔吸气器小心地将 10 名 Cx. pipiens 雌性从笼子中取出，并将其转移到准备好的圆锥管中。
- 在圆锥管上放置一个不透明的圆柱体，为蚊子提供黑暗，因为这会刺激产卵，等待20-25分钟。
5. 微操作新鲜产的 Culex 鸡蛋
- 准备幻灯片，将蚊子胚胎附着在微注射上。
- 将一块双面胶带连接到盖玻璃的宽度上。
- 将透明医用敷料的细条（例如 Tegaderm，2-3 毫米宽）连接到双面胶带上，使其与盖玻璃的短端平行运行，并且从盖玻璃末端定位约 5 mm。
- 用锋利的剃须刀刀片取下多余的双面胶带，从盖玻璃的两端取下 2-3 mm 的医用敷料和双面胶带。这样，鸡蛋被安装到盖玻璃上后，一层油可以留在滑梯上。
- 使用蜡笔，在双面胶带和医用敷料条周围绘制"D"形。这将作为注射后在鸡蛋周围保持水的屏障。
- 幻灯片准备完毕后，经过20-25分钟，取出不透明的管子，确定蚊子是否产卵。
- 如果没有，再盖5-10分钟。
- 如果蚊子已经产卵，小心但迅速抬起圆锥管，盖上盖子。将蚊子放在单独的笼子里，并记录鸡蛋收集在电子表格上的时间。然后在含有蛋筏的滤纸中加入 50-100 μL 的 DI 水。
- 在解剖显微镜下排列鸡蛋。
- 将一块滤纸（10 毫米 x 30 毫米矩形从粗滤纸中切割，流速快）放在 24 mm x 40 mm 盖玻璃下，使盖玻璃覆盖滤纸左侧的 50-60%。
- 用 50 μL 的 DI 水将滤纸弄湿。水会慢慢扩散到盖玻璃下，形成一个储层，在微观控制过程中保持滤纸和鸡蛋湿润。当应用正确的水量时，覆盖玻璃和滤纸之间将形成半月板。
- 用细漆刷将卵子从蛋筏上分离出来，并放置，使胚胎的窄后端接触盖玻璃（左），而更宽、前端在右侧。
- 对齐鸡蛋20分钟，仔细观察其颜色从乳白色到非常浅的灰色的变化。定期检查盖玻璃下的水膜，以确保有足够的水量。如果鸡蛋看起来干燥，在滤纸上加入少量的DI水（20-30微升）。
- 20分钟后，丢弃所有剩余的鸡蛋。
- 将鸡蛋转移到微注射幻灯片上。
- 使用一小块（10 毫米 x 30 毫米）粗滤纸从饱和滤纸的侧面吸水，并用钳子取出芯滤纸。重复 2-3 次，以确保鸡蛋的滤纸尽可能干燥。
- 放置一个新鲜、干燥的滤纸矩形，并用一对钳子将其保持到位。小心地将盖玻璃拉到左边，远离对齐的鸡蛋。
- 干燥舞台上多余的水，而不会干扰含有对齐鸡蛋的小滤纸。继续用鸡蛋再干燥几次湿滤纸，用拇指和/或钳子压在滤纸的小矩形上，确保鸡蛋在转移到注射滑梯之前尽可能干燥。
- 使用钳子，从安装滑梯上取下从医用敷料条上后退的纸张。
- 用拇指和中指将安装滑梯和暴露的医用敷料朝下，以 45° 角向下放在对齐的鸡蛋线上。放置滑梯，使卵子的较宽前端（左）稍微挂在医用敷料的末端，因为这增强了 Culex 幼虫从安装的卵子中成功孵化的能力。
- 将食指压在盖玻璃的下侧，同时继续将盖玻璃放在拇指和中指之间，以确保所有对齐的鸡蛋都牢固地连接到医用敷料上。
- 立即倒置盖玻璃，使鸡蛋朝上，并在鸡蛋上涂上一层薄薄的油卤油（2-3滴;+20 μL）。这可防止鸡蛋在微注射过程中干燥。取出任何未附着在医用敷料上或未涂上油的鸡蛋。
- 将玻璃盖与安装的鸡蛋对峙在方形 Petri 盘内，并放入一大方形湿滤纸，用于微喷射。
6. 注射 库莱克斯 胚胎
- 用注射混合物回填注射针
- 选择针头填充剂或凝胶加载尖端，轻松贴合到选定的注射针的后端，并在针头填充物末端和注射针之间留出一点空间。
- 小心地将一滴和一小滴注射混合（+0.5-1 μL）放入注射针中，使用针头填充剂回填针头。将注射混合滴放在注射针开始锥形的地方附近。
- 将注射针连接到微型喷油器上。
- 将包含胚胎的幻灯片放在显微镜的舞台上。
- 打开针头
注意：如果使用斜针，则没有必要使用斜针。- 使用 +30 PSI 的起始注射压力，并在必要时进行调整，以提供适当的注射混合物体积。
- 在解剖显微镜下，将针头放在胚胎上方，并小心地使用显微操纵器将针头降低到胚胎上。一旦针头几乎不能接触胚胎，迅速将胚胎垂直于针头的长轴。
- 要确定针头是否成功打开，请按下注射触发器，看看是否有气泡/注射混合物从针头中逸出。如果没有，重复移动胚胎对针头，直到针是打开的，注射混合逃脱时，按下扳机。
- 注射胚胎
- 将第一个胚胎放在显微镜的视线中心，并确保它处于焦点位置。
- 将针头放在第一个鸡蛋上，也放在显微镜内的视野中心。
- 逐步增加显微镜上的放大倍数，小心地降低针头，使其在第一个胚胎上方，居中和聚焦。继续，直到显微镜达到其最高放大倍率，胚胎和针头都集中。
- 小心地将舞台上的胚胎稍微向左移动，将针头稍微放下，使针头和胚胎现在处于同一平面。
- 使用显微镜阶段移动胚胎，小心地轻轻地触摸胚胎到针尖。胚胎的窄后端应稍微偏转。如果针头过高或过低，则调整针头的高度。
- 使用显微镜阶段，将胚胎的后端移到针头上，观察针头穿透蚊子蛋的胆汁。针头应该只是穿透 膜在Culex 胚胎中的极细胞的近似位置。一旦发生这种情况，将注射触发器拉1-3次，将注射混合射入胚胎。提供少量的注射混合物，仅够检测到胚胎质中的一个小空液。
- 使用阶段，将胚胎移到右侧、远离和关闭针尖。如果注射进行得很顺利，胚胎中几乎不会有液体泄漏。
- 向下移动阶段，以便线中的下一个胚胎位于针头前面。然后再次将舞台向左移动，将胚胎定位到注射针上并扣动注射扳机。
- 如果注射混合似乎没有出来和/或者如果大量的液体从胚胎中逸出后，针头被取出，更换注射针，重新开始。
- 销毁任何未注射或损坏的鸡蛋。
- 注射后对胚胎的适应
- 在注射了幻灯片上的所有胚胎后，用喷瓶将反渗透水冲洗掉卤化油，使水流直接流到注入胚胎上方的玻璃盖唇顶部，让水顺着盖唇流下来，在胚胎上冲洗掉油。请确保不要将水流直接引向胚胎，因为这可能会损坏或将其从医用敷料中分离。此过程可去除大多数（但不是全部）卤化碳油。
- 用 150 μL 的 DI 水覆盖幻灯片。
- 将滑梯与注射的胚胎放在方形培养皿内的湿滤纸上。
- 将含有注射胚胎的培养皿放在环境室中，设置为 25-27 °C，70-80% RH，并配有长日光佩里奥（> 13 h 光/天）。
7. 将注射胚胎（F0）移植到成年并设置十字架
- 每天检查注射胚胎的幻灯片，预计注射后1.5天就会出现1个 星内幼虫。
- 计算1st 星幼虫的数量，并将100-200只幼虫放入一个鞋盒大小的Tupperware容器中，容器内装有450毫像的DI水和50毫克的地面鱼食。此时，创建1-5倍以上的容器，其中含有野生类型或未注射的幼虫，将用于与注射蚊子交叉。
- 每天喂幼虫，稍微增加它们每天收到的食物量，直到幼虫生命的第 6天达到300-500毫克。
- 一旦 pupae 出现，使用转移移液器将一个 pupae 放入充满 50-75% 充满 DI 水的 2 mL 微中心管中。重复所有幼崽，无论是作为胚胎注射的幼崽，以及未注射的野生型幼崽。小心地按压盖子，使其稍微开口，防止蚊子逃跑，但仍允许少量的气体交换。
- 一旦成年蚊子出现在它们的微中心管内，将注射的雌性蚊子释放到含有处女野生型雄性蚊子的笼子中，每注射雌性蚊子至少达到1只野生型雄性蚊子的比例。同样，将雄性蚊子放入含有处女野生型雌性蚊子的笼子中，每注射一只雄性蚊子的比例约为5-10。建议提高野生型雌性蚊子与注射雄性蚊子的比例，因为每只雄性蚊子可以交配多次。因此，与注射的雄配的野生型雌性数量增加可产生的 F1 后代数量。
8. 获取和饲养F1 蚊子并筛查其突变
- 成人出现后七至十天，为每个笼子中的女性提供血餐（第 3 步）。
- 喂血四天后，将卵水放入每个笼子。每个蛋筏代表一只雌性蚊子的后代，因此应在卵化后不久放入自己的塑料鞋盒大小的饲养容器中。给每个容器贴上唯一标识符的标签，并表明幼虫属于F1 代感兴趣的基因，无论是雄性还是雌性父母被注射，锅的建立日期，饲养条件和实验者的首字母缩写。
- 每天监测幼虫的锅。幼虫一在锅中孵化，就提供50毫克的地面鱼食。如上所述，每天增加食物6天（第7.3步）。
- 将单个 pupae 转移到 2 mL 微中心管中，其中含有 1-1.5 mL 的 DI 水，给每个管子贴上标签，并破解盖子。
- 一旦成年蚊子出现，小心地打开2毫升的微中心管，用食指盖住，用另一只手在微中心管的顶部放一个3dram玻璃瓶。蚊子的自然本能应该是飞起来，飞进玻璃瓶里。一旦发生这种情况，将手指滑过玻璃瓶的开口，并迅速倒置它，将一小团棉布稍微湿透，10% 蔗糖溶液进入小瓶顶部。这防止蚊子逃跑，并提供必要的食物和水源。
- 标记含有幼虫呼气的管子和含有成年蚊子的玻璃瓶，以指示其来源的幼虫锅、蚊子的性别以及该个体的独特标识符。前：II.C.M32，"II"表示注射了雄性父母，"C"表示个体起源的锅/蛋筏，"M32"表示是第32个 从幼虫饲养容器中产生的雄性。
- 将成年蚊子放在其单独的玻璃瓶内，放回环境室，每天在棉花中加入少量（+20 μL）10%蔗糖溶液。一定要不要过度喂养或饱和棉花，因为蚊子会卡在蔗糖溶液中而死亡。
- 筛查蚊子的所需突变
- 根据制造商的说明，使用 Phire 直接 PCR 套件从每个幼虫的卵筏/锅中提取 5-10 个幼虫的基因组 DNA，以及 1-2 个野生型个体，作为对照。
注：由于每个木筏的后代很可能是完整的兄弟姐妹，从每个木筏上筛选5-10只幼虫将确定突变是否已经传给后代。如果一个平底锅中筛选出的幼虫没有所需的突变，则不要筛选其他成人。如果一些幼虫有突变，那么每个来自该锅的人都应该接受筛查。 - 使用以前设计的 PCR 引物（第 1.2 步），使用野生类型和 F1 后代的 Phire PCR 套件放大突变预测位置周围的片段，并在 3-4% 的阿加罗斯凝胶上运行 PCR 片段，以确定是否有可见的插入或删除（indels）。
注：任何有所需突变的个体将是异质的，应该显示2个波段，一个野生类型，一个稍微短或更长在所需的位置。为了区分这些，比较野生类型个体的带的位置和厚度与那些在F1后代的乐队。理想情况下，2 个离散频段是可见的，但如果内德尔非常小，则带可能看起来更宽和/或更模糊。 - 通过清除含有可疑的 Indels（推荐）的带子或净化未加载到凝胶中的剩余 PCR 产品来净化 PCR 产品。提交纯化 PCR 进行测序，以确定是否存在所需的突变。
- 根据制造商的说明，使用 Phire 直接 PCR 套件从每个幼虫的卵筏/锅中提取 5-10 个幼虫的基因组 DNA，以及 1-2 个野生型个体，作为对照。
9. 获取和饲养F2 和F3 蚊子，并筛查它们的突变
- 释放所有F1 成年蚊子，通过从其单独的玻璃瓶中筛选出其幼虫外泄物，并放入含有野生型、未注射的异性蚊子的笼子中，发现其所需突变。第二代的背对应消除注射和近亲繁殖的所有有害影响。
- 血液喂养变异的F1 蚊子及其野生型蚊子的笼子，如前所述。四到五天后，收集由此产生的F2 蛋筏。
- 标记和后方的F2 幼虫如上所述，将每个蛋筏放入一个单独的，标记的容器。幼崽后，再次将单个幼崽分离成单独的2毫升微中心管，并在出现时将每个成人转移到用蔗糖浸泡棉盖住的单独玻璃瓶中。然后筛选每个 F2 个体的脓包外泄，如前所述所述（步骤 8.5-8.8）。
注：在这里，所有有所需突变的个体都是异质的，因此PCR产品最好在3-4%的玫瑰凝胶上运行时产生2个不同的波段。 - 一旦发现突变的F2 幼虫，将所有有突变的雄性及雌性放入同一笼子中交配。血液喂养7-10天后成人出现，4-5天后，收集F3 蛋筏。
- 将每个F3 蛋筏放入一个单独的幼虫饲养容器中，并按上文所述标记和喂养。
- 将 F3 pupae 分离成单独的 2 mL 微中心管。一旦成人出现，将它们转移到单独的玻璃瓶，用10%的蔗糖浸泡棉封顶。像以前描述的那样筛选脓包外泄。这一次，每个平底锅中大约25%的后代应该是空突变的同源体。将这些个体放入一个笼子中，并用它们来创建和维持新生成的蚊子突变线。
注：如果存在少量的同源蚊子，则F3 雄性蚊子和雌性蚊子可以相互交叉，在F4 代产生更多的同源蚊子。
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Representative Results
使用上述协议，我们成功地注射了Cx.pipiens的胚胎，并观察到注射胚胎的存活率很高（+55%，图1）。早期的试验存活率较低，可能是因为卵泡前部附着在医用敷料条上，防止蚊子幼虫从胆汁中逸出并成功游入水中。确保前端延伸到医疗敷料条外，大大提高了幼虫的存活率，并导致高质量的后代，能够发展到成年和繁殖（图2B）。
随后的实验和筛选表明，昼夜时钟基因周期（cyc：KM355981）进入注射胚胎的生殖系（图3）。鉴于我们的引物在切口附近放大了细胞基因的大片区域，因此很难观察到异种蚊子F1蚊子的两个单独的带。这表明设计引物的效用，这些引物将放大切口周围 100-200 bp 的片段，以及对所有疑似突变蚊子进行测序的重要性。测序显示，大约10%的被筛查的蚊子在我们设计的第一个导引RNA的Cas9切口附近显示有一个小的插入或删除（图3），这表明这是一个高效的GRNA，我们在微射中成功地瞄准了极细胞。F1个体成功地交配并产生了可行的后代（F2代），其中一些也含有突变。
图1：斜面硅酸盐针的示例。 这种针是由硅化玻色硅酸盐微资本管制成的，使用PC-10垂直针拔拔器拉，然后斜靠在BV-10贝弗勒上。针头的放大倍数为 +63 倍。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：F0一代在其发展中的生存。（A） 从3张含有注射胚胎的幻灯片中孵化出的1号星幼虫图像。（B） 图形表示每个生命阶段的人数。在注射的801个胚胎中，有441个1个星幼虫孵化，这149个个体达到幼崽，共导致121个成年人（73名男性和43名女性）。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：代表结果显示所需突变的传播。前两个序列表示库莱克斯五角星（Cx.quinq）中循环基因的序列：XP_001865023.1）和野生类型的女性的 Cx. pipiens （WT.F;KM355981）。下面的序列表示三个雄性F1后代（I.DM1：I.DM1：I.DM1）中的序列。II.JM4;II.K10M）。绿色盒子代表Cas9蛋白（CGG）识别的PAM序列，而绿色箭头代表Cas9蛋白质裂开基因组DNA的位置。这些结果表明，F1雄性中遗传了2或4个核苷酸的短缺失。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该协议提出了将特定突变引入 Culex 蚊子基因组的方法，也可用于编辑其他蚊子的基因组。该协议意义重大，因为它不仅提供了如何准备注射材料的具体细节，而且还提供了如何诱导蚊子产卵以及如何准备和注射这些卵子的详细视频概述。我们还总结了如何利用雌性 Cx.pipiens 的生物学在单独的木筏上产卵，从而筛选出每个雌性子的较小比例的后代，以寻找所需的突变。这里提出的方法已经针对 Cx.pipiens 进行了优化，但可以通过小幅调整来编辑其他蚊子或昆虫的基因组。此外，这里描述的微操纵和微注射协议可以将几种不同的材料注射到昆虫胚胎中，包括转位子、dsRNA或其他内核糖核糖，如TALION或锌-手指核糖核酸酶。此外，斜面协议产生具有可变开口大小的微注射针，因此可创建可用于注射各种注射材料的针头。针头的开阔大小可以通过在针头倾斜后缓慢降低空气压力来推断，并注意到气泡停止从新打开的针头流出的压力。产生气泡所需的气压越小，则表明针头的开口尺寸较大，相反，较高的气压则表明针头的开口尺寸较小。开口尺寸较大的针头更适合注射更大的颗粒和更粘稠的材料，但可能会对胚胎造成更大的损害，从而降低存活率。
微射实验在许多方面是与时钟赛跑。首先，在卵化前2小时内注射单个胚胎，然后胆汁变硬和囊形成。因此，当蚊子第一次被放置在卵室时，必须注意操作卵子注射需要多长时间（我们建议不超过20-30分钟），以及注射所有胚胎需要多长时间。当筛选成年蚊子进行突变时，时间也有限，因为 Cx. pipiens 对周围环境相当敏感，蚊子通常只在单独的玻璃瓶中存活 3-5 天。因此，必须尽快筛查蚊虫的外泄。或者，人们也可以从单个蚊子腿14中提取基因组DNA。然而，为了做到这一点，蚊子应该首先在冰上麻醉。由于我们担心冷处理和四肢丧失会如何影响蚊子的生存及其交配和产卵的能力，我们决定改为筛选丢弃的幼崽外泄物以进行突变。外泄物中的gDNA水平可能低于蚊子腿部，这确实增加了额外的精力和时间来分离幼虫阶段的蚊子，但也确保了所有成年人在被释放到适当的笼子里时都不受伤害，这绝对至关重要。我们认为，结果是值得的，但鼓励其他人考虑，如果删除一条腿可能是一个更好的行动方针，以满足他们的实验需求。
加快突变筛查的最佳方法是注射含有遗传标记的质粒，如荧光蛋白，切口两侧均匀序列。使用同源定向修复 （HDR） 的内窥突变率通常低于非同源最终加入 （NHEJ），淘汰突变 （HDR=0.71%）;NHEJ=24.87%因此，插入标记的频率可能会低得多，但能够在荧光显微镜下快速筛选蚊子幼虫所节省的时间可能值得冒这个险，这取决于项目。此外，HDR和敲击突变的发生率提高时，人们还注射了含有Cas9蛋白质的遗传序列的质粒，由一个功能良好的胚胎促进运动驱动，和GRNA驱动的U6促进器24，26。这可能是因为在胚胎发育的早期，当细胞核迅速分裂（细胞周期的S相），容易出错但权宜之计的NHEJ机制似乎是修复双链断裂的首选方法（审查18）。然而，随着胚胎发育的进展，细胞机制准备使用更精确的HDR机制来修复双链断裂（后期S相和G2相）。在胚胎发育早期注射含有Cas9序列的质粒使Cas9蛋白能够到达大多数目标细胞，而胚胎仍处于同步状态，在细胞膜形成之前，但转录和翻译Cas9蛋白所需的轻微延迟似乎增加了内核细胞在发育中的胚胎更可能使用HDR准确修复基因组DNA中的双链断裂时活跃的可能性。例如，Lin等人发现，当与gRNA复合的Cas9蛋白被注射到细胞周期M阶段的人类细胞系中时，HDR的发病率被提高到+33%。在质粒上输送Cas9和gRNA的另一个好处是，它们粘度较低，因此在注射过程中堵塞针头的可能性较小（R.Harrell，个人观察）。然而，在Culex蚊子中具有胚胎促进剂并验证之前，我们建议注射Cas9蛋白或mRNA，如这里所述。
此外，鉴于人们必须投入多少时间来饲养和筛选蚊子，我们建议至少安排一名全职技术人员、学生或研究人员来完成这项任务。我们还建议从战略上考虑给定实验需要多少空突变体，以及空线内遗传多样性的重要性。虽然我们能够识别F1 和F2 代有突变的蚊子，但只有少数F2 蚊子存活到成年，异种变异蚊子未能产生可行的后代。我们认为，这与突变没有多大影响，更可能是由于我们筛选蚊子时，雄性蚊子和雌性蚊子被限制在玻璃管内。这种长时间的隔离很可能干扰了她们成功交配的能力，在女性的情况下，她们可以获得血餐并产下可行的卵子。单代交叉和/或已采用优化筛选技术应防止此问题在未来发生。因此，通过遵循这个协议，我们相信，研究人员将能够成功地产生 库莱克斯 蚊子的空线，并通过微小的调整，额外的昆虫。
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Disclosures
RH为昆虫转化设施工作，该设施提供昆虫基因改造服务。
Acknowledgments
我们感谢David O'Brochta博士和昆虫遗传技术协调研究网络的所有成员，感谢他们为我们和其他人提供的关于实施遗传技术的帮助和培训。我们特别感谢香娜·阿卢维哈雷优化了微操纵方案，允许 Culex 胚胎被注射和孵化。我们还要感谢在Meuti实验室工作的本科生德文特·西蒙斯和约瑟夫·乌尔索，感谢他们帮助照顾和筛查转基因蚊子，感谢ITF的佐拉·埃尔姆卡米协助饲养和准备蚊子注射。这项工作得到了奥苏传染病研究所向MEM提供的跨学科种子赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Membrane Feeder | Hemotek | SP5W1-3 | Company location: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Company location: Carlsbad, CA, USA |
| Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | World Precision Instruments | 1B100-6 | Company Location: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Needle Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Whatman Circular filter paper (12.5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Conical tube (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Fisherbrand course filter paper with fast flow rate | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Cover glass (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Dental dam | Henry Schein Inc | 1010171 | Company Location: Melville, NY USA |
| Scotch double-sided tape | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| FemtoJet 4i microinjector | Eppendorf | 5252000021 | Company Location: Hamburg, Germany |
| Glass vial (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Halocarbon oil | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Needle Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| PC-100 Weighted Needle Puller | Narishige | PC-100 | This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | Company Location: Cornwall, UK |
| Guide-it™ sgRNA Screening Kit | Takara, Bio USA | 632639 | This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Small petri dishes (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Sodium citrate chicken blood | Lampire biologicals | 7201406 | Company Location: Everett, PA, USA |
| Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Company Location: Melville, NY USA |
| Tropical fish food | Tetramin | N/A | |
| Whatman filter paper | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Whatman filter paper, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
References
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