Summary
CRISPR/Cas9 brukes i økende grad til å karakterisere genfunksjonen i ikke-modellorganismer. Denne protokollen beskriver hvordan du genererer knock-out linjer av Culex pipiens, fra å forberede injeksjonsblandinger, til å skaffe og injisere myggembryoer, samt hvordan du kan bake, krysse og skjerminnsprøyte mygg og deres avkom for ønskede mutasjoner.
Abstract
Culex mygg er de viktigste vektorene av flere sykdommer som negativt påvirker menneskers og dyrs helse, inkludert West Nile-virus og sykdommer forårsaket av filariale nematoder som hundehjerteorm og elefantase. Nylig har CRISPR / Cas9 genomredigering blitt brukt til å indusere stedsstyrte mutasjoner ved å injisere et Cas9-protein som har blitt kompleks med en guide RNA (gRNA) i nylagde embryoer av flere insektarter, inkludert mygg som tilhører slekten Anopheles og Aedes. Manipulere og injisere Culex mygg er litt vanskeligere da disse myggene legger eggene sine oppreist i flåter i stedet for individuelt som andre myggarter. Her beskriver vi hvordan man designer gRNAer, komplekserer dem med Cas9-protein, induserer kvinnelige mygg av Culex pipiens til å legge egg, og hvordan du forbereder og injiserer nylagde embryoer for mikroinjeksjon med Cas9 / gRNA. Vi beskriver også hvordan du skal bake og skjerm injisere mygg for ønsket mutasjon. De representative resultatene viser at denne teknikken kan brukes til å indusere stedsstyrte mutasjoner i genomet til Culex mygg, og med små modifikasjoner kan den også brukes til å generere nullmutanter i andre myggarter.
Introduction
Culex mygg distribueres over de tempererte og tropiske områdene i verden og overfører flere dødelige virus, inkludert West Nile virus1, St. Louis encefalitt2 samt filariale nematoder som forårsaker hundehjerteorm3 og elephantiasis4. Medlemmer av Culex pipiens-komplekset, som inkluderer Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens og Cx. pipiens molestus, viser slående variasjoner i mange aspekter av deres biologi. For eksempel, mens Cx. quinquefasciatus og Cx. pipiens molestus ikke er i stand til å gå inn i en overvintrende dormancy5,6, viser Cx. pipiens pipiens robuste sesongresponser og går inn i diapause som svar på korte dager7,8. I tillegg har Cx. pipiens molestus en tendens til å være mer antropofil mens Cx. pipiens og Cx. quinquefasciatus er mer zoofile6. Men i USA og over mange andre steder i verden interbreed disse artene, som har sterke implikasjoner for sykdomsoverføring som hybrider av Cx. pipiens pipiens og Cx. pipiens molestus er opportunistiske matere og vil bite både fugler og mennesker9, og dermed tjene som brovektorer for West Nile virus. Å studere disse og andre fascinerende aspekter av biologien til Culex mygg har blitt hemmet, delvis fordi Culex mygg er litt vanskeligere å bake i laboratoriet enn Aedes mygg, som produserer passiviserings- og uttørkingsbestandige egg10 og fordi funksjonelle molekylære verktøy ikke er like godt utviklet for Culex-arter.
CRISPR / Cas9 genomredigering er en kraftig teknologi som har blitt brukt til å evaluere biologien til flere viktige myggarter11,12,13, inkludert det sørlige huset mygg, Culex quinquefasciatus14,15,16. Denne teknologien, utviklet av Jennifer Doudna og Emmanuelle Charpentier, utnytter et naturlig bakteriell forsvar mot virus ved bakteriell avledede, CRISPR-assosierte endonucleases (Cas proteiner; se gjennomgang av Van der Oost et al.17). Når de injiseres i animalske embryoer, kan Cas9-proteinene i kombinasjon med en passende guide RNA produsere dobbeltstrengede pauser i genomet. Dette gjøres oftest ved å bruke Cas9-proteinet som er kompleks med guide RNAer, som leder endonukleaseaktivitet til en bestemt region av genomet. Etter at Cas9-proteinet har skapt en stedsspesifikk dobbeltstrenget pause, forsøker mobilmaskineriet å reparere pausen ved hjelp av en av to mekanismer. Den første innebærer ligating de to ender sammen gjennom ikke-homolog slutt sammenføyning (NHEJ), som er feilutsatt og ofte produserer out-frame innsettinger og slettinger i genomet som kan resultere i ikke-funksjonelle proteiner, og dermed generere en knock-out mutasjon. Alternativt kan mobilmaskineriet bruke homologi-rettet reparasjon (HDR) ved å finne lignende sekvenser for å reparere pausen riktig. Den lignende sekvensen kan gis av det andre kromosomet i organismen (se gjennomgang18). Men hvis den reparerte sekvensen samsvarer nøyaktig med den opprinnelige sekvensen, vil Cas9-proteinet igjen kunne kutte DNA-et. Alternativt kan forskere også inkludere en donorplasmid som inneholder homologe sekvenser på hver side av målsekvensens kuttested med en alternativ reparasjonssekvens – ofte et fluorescerende markørprotein, modifisert versjon av det opprinnelige genet eller annen modifikasjon – som kan kopieres og settes inn i genomet, eller «bankes inn».
Timing er kritisk ved injeksjon av embryoer, og dette er spesielt tilfelle når du bruker CRISPR / Cas9 genomredigering for å skape mutasjoner i insekter. Dette er fordi Cas9-proteinet og gRNAene har størst kapasitet til å generere mutasjoner bare når embryoet er i synytial tilstand, før cellulære membraner har dannet seg og når flere kjerner er tilgjengelige i embryoet. For mygg når kjerner periferien ~ 2-4 timer etter oviposisjon, avhengig av temperatur19, og derfor må vellykket mikroinjeksjon oppstå før denne tiden. I tillegg vil Cas9-proteinet kutte ethvert kjernefysisk DNA som det kan få tilgang til, slik at personen som følge av injeksjonen vil inneholde en mosaikk av celler, noen har ønsket mutasjon, og andre ikke. For at disse mutasjonene skal kunne arves, må Cas9-proteinet kutte DNA som ligger i bakterien som vil gi opphav til fremtidige egg og sædceller. For å sikre at mutasjoner genereres i bakterien, er det best å injisere alle materialer nær plasseringen av polcellene i embryoet, som er forfedrene til insektets bakterie. Polcellene ligger nær den bakre enden av Culex embryoer20. I tillegg til å injisere embryoer, er det viktig å utvikle en nøye plan for kryssing og screening av avkom for å oppdage ønsket mutasjon.
Denne protokollen beskriver hvordan du genererer gRNAer og komplekserer dem med Cas9-protein for å forberede injeksjonsblandinger, samt hvordan man induserer kvinnelige mygg av Culex pipiens til å legge egg og hvordan du forbereder og injiserer disse eggene for CRISPR / Cas9-mediert genomredigering. I tillegg beskriver vi hvordan du kan bake, krysse og skjerm injisere embryoer og deres avkom for å bekrefte at ønsket mutasjon er oppnådd. Ved hjelp av denne protokollen genererte vi nullmutasjoner for et gen av interesse, syklus, i Buckeye-stammen av Culex pipiens. Denne stammen ble opprinnelig etablert i 2013 fra feltsamlede mygg i Columbus, Ohio og vedlikeholdes av Meuti-laboratoriet. Denne protokollen kan brukes til ytterligere studier som krever CRISPR / Cas9 genomredigering i Culex mygg, så vel som andre myggarter, og mer generelt er relevant for å bruke CRISPR / Cas9 genomredigering til alle insektarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I de fleste forskningsinstitusjoner må en godkjent Biosafety Protocol være på plass før transgene insekter genereres eller vedlikeholdes for å sikre at genmodifiserte organismer ikke vil unnslippe eller bli fjernet fra laboratorieanlegget. Ytterligere statlige forskrifter kan også gjelde. Før du begynner på et prosjekt av denne art, må du kontrollere alle institusjonelle retningslinjer og prosedyrer for å finne ut hvilke dokumenter og godkjenninger som kreves.
1. Design av gRNAer og tilberedning av injeksjonsblandinger
- Design 2-5 gRNAer for hvert målgen ettersom noen gRNAer fungerer bedre enn andre. gRNAer som retter seg mot et gen av interesse, kan enten utformes manuelt eller gratis programmer, for eksempel Chop-Chop, kan brukes.
- Design og bestill primere som vil forsterke 100-200 bp fragmenter rundt hver gRNA. Ideelt sett bør kuttestedet være plassert omtrent i midten tredje til halvparten av PCR-produktet. Legg merke til hvor mange bp på hvert sted av kuttet som skal produseres.
- Få tak i gRNAer.
- Kjøp gRNAer fra kommersielle selskaper som Integrated DNA Technologies, Fisher Scientific, Genescript og andre. Dette er det enkleste alternativet.
- Alternativt kan du opprette gRNAer i laboratoriet ved hjelp av PCR-forsterkning for å generere malene for etterfølgende isotermisk syntese. Se protokollen beskrevet av Port et al.21 og Kistler et al.22.
- Gi gRNAer via plasmid som injiseres i embryoer. I dette tilfellet bør gRNA drives av U6 promotor (se 23,24 for detaljer).
- Få tak i Cas9-proteinet.
- Bestill Cas9 kommersielt fra flere selskaper, inkludert Fisher Scientific. Dette er det enkleste alternativet.
- Lag Cas9 protein og rens i laboratoriet i henhold til Basu et al.25 og Kistler et al.22.
- Injiser Cas9 mRNA i embryoer, hvor det senere vil bli oversatt til aktivt Cas9-protein. Cas9 mRNA kan enten syntetiseres i laboratoriet ved hjelp av in vitro transkripsjon22 eller kjøpt fra leverandører som Sigma.
MERK: Det oversatte Cas9-proteinet må inneholde et kjernefysisk lokaliseringssignal (NLS) på C-terminus, og derfor må NLS også være til stede i den injiserte Cas9 mRNA. - Express Cas9 protein in vivo gjennom plasmidbasert uttrykk. I dette tilfellet er det best å ha uttrykket cas9 på plasmid drevet av en embryonal promotor som har vært godt preget av målartene.
MERK: Til dags dato har embryonale promotorer ikke vært godt karakterisert i Culex mygg, og derfor anbefales det å injisere renset protein eller Cas9 mRNA.
- Kompleks gRNAene med Cas9-proteinet, tilpasset fra Kistler et al.22.
- Hvis du injiserer Cas9-protein med gRNA sammen (anbefales), må du sørge for at de endelige konsentrasjonene av Cas9-protein er 300 ng/μL og den endelige konsentrasjonen av en enkelt gRNA er 80 μg/μL. Bland proteinet og en individuell gRNA i et 0,2 ml PCR-rør.
- Inkuber i 20 min på is.
- Teste gRNAer med en in vitro-analyse (f.eks.
- Forsterk fragmentene rundt kuttestedet for hver gRNA ved hjelp av PCR.
- Kjør PCR-produktene på en gel for å sikre at de har riktig størrelse. Deretter renser du PCR-produkter og sekvenserer dem for å sikre at de er rettet mot riktig genregion.
- Bland 200 ng av det resterende rensede PCR-produktet med 1 μL Cas9 reaksjonsbuffer, 1 μL BSA, 1,5 μL kompleks Cas9:gRNA og ta det totale reaksjonsvolumet til 15 μL. Inkuber i 5 minutter ved 37 °C.
- Kjør produktet på en gel igjen. Hvis Cas9-proteinet lykkes med å kutte PCR-produktet, skal primærbåndet se ut til å være mer svakt og flere mindre bånd skal være til stede. Legg merke til reduksjonen i størrelsen på det opprinnelige PCR-produktet, og beregn om ønskelig reduksjonen i båndintensiteten for å tilnærme skjæreeffektiviteten.
- Klargjøring av den endelige injeksjonsblandingen
- For hver gRNA som vellykket kutter sitt målrettede PCR-produkt, bland volumer av hvert Cas9 og gRNA i et 0,5 ml rør slik at det endelige volumet forblir 300 ng / μL cas9 protein og 80 ng / μL av hver gRNA.
- Oppbevar de komplekse Cas9- og gRNAene ved -80 °C til de er nødvendige for injeksjon.
2. Trekke og skrånende nåler
MERK: Vellykkede injeksjoner og overlevelse av embryoer krever skarpe nåler (Figur 1).
- Bruk enten 1 mm ytre diameter borosilikat eller kvarts glass mikrokapsler. Siliser mikrokapslingene i en kjemisk avtrekkshette før de trekkes.
- Kort sagt, plasser 3 ml Sigmacote i et glassbeger og vakuum trekk inn i et annet beger som inneholder glassmikrokapillærene i minst 4 timer, slik at silikonløsningen kan fordampe og bosette seg på alle overflater av mikrokapillærene.
- La deretter vakuumkammeret utjevne seg til omgivelsestrykk ved å gradvis åpne stoppekranventilen og la luften komme tilbake i kammeret. Nålene er da klare til å bli trukket.
- Les alltid bruksanvisningen for nåletrekkere før bruk.
MERK: Instruksjonene nedenfor beskriver hvordan du bruker en P-2000 lasernåltrekker til å trekke glassnåler. Det er viktig å merke seg at alle nåletrekkere selv av samme merke ikke er kalibrert for å trekke nøyaktig samme nål over forskjellige enheter. Nøkkelen til å få gode nåler er å starte på et gitt sett med parametere og deretter trekke nåler ved hjelp av parametere som er over og under disse verdiene. Test nålene ved hver av disse parametrene ved å evaluere hvor godt nålen pierces embryoer og hvor godt injeksjonsblandingen strømmer fra nålen. Finpuss parametrene til en nål oppnås som er lett å åpne eller skråstille, som pierces embryoer jevnt og som leverer injeksjonsblanding enkelt.
- Trekke nåler ved hjelp av P-2000 lasernåltrekker
- Slå på lasernåltrekkeren og la laseren varmes opp i 15 minutter før første trekk.
- Programmer maskinen for typen glassmikrokapillær rør (Husk at eventuelle nåletrekkerparametere er et utgangspunkt siden nåletrekkere ikke er kalibrert for å produsere samme nål over alle trekkere):
Kvarts: Varme = 730; Fil = 4; Vel = 40; DEL = 122; = 156 - Etter programmering av nåletrekkeren, last en mikrokapillær og klem den på plass, pass på at du bare berører enden av mikrokapslerøret og ikke området som skal oppvarmes av laseren.
- Etter å ha klemt mikrokapillæren, plasser tommelen og pekefingeren på fingerstengene og slipp deretter trekkstengene ved å trykke på fjærutløser en om gangen.
- Klem tommelen og pekefingeren for å trekke stengene helt sammen.
- Plasser den andre siden av mikrokapselrøret i klemmen slik at en liten del av røret strekker seg fra begge sider. Stram klemmene og sørg for at begge klemmene er fingertette og at de holder "trekkstengene" godt på plass.
- Lukk beskyttelsesdekselet på trekktrekkeren.
- Trykk på Trekk-knappen og laseren vil begynne å varme opp glasset, indikert av det røde "laser på" -lyset som ligger under dekselet. Trekket fullføres når trekkstengene er helt separert, ledsaget av en metallisk thud.
- Pass på at "laser på"-lampen ikke lyser før du løfter dekselet.
- Hold den lille enden av mikrokapselrøret som strekker seg utover klemmen med tommel og pekefinger og løsne klemmen. Løft deretter mikrokapselrøret ut av klemmen.
- Bruk tang for å forsiktig plassere mikrokapillærrøret i en firkantet Petri-tallerken foret med dobbeltsidig tape. Pass på at når du plasserer nålen i oppbevaringsboksen, må du først berøre den bakre enden av nålen, og at nålen senkes forsiktig på plass slik at den skarpe spissen ikke blir skadet.
- Trekke nåler ved hjelp av en PC-10/PC-100 nåltrekker
- Sett opp PC-10-trekkeren med 4 vekter og sett tempen for 50,4 °C for et enkeltsteg.
- Plasser en mikrokapsel av borosilikatglass i toppklemmen. Løft deretter den vektede bunnklemmen på plass og klem den nederste delen av mikrokapselen, og sørg for at kapillæren er på plass for å trekke to gode nåler. Dette er en ganske lang trekksyklus, men den produserer gode nåler for beveling.
- Skråkant nåler.
MERK: Denne metoden for våt skråkant gir tilbakemelding i sanntid på den relative åpningsstørrelsen på nålen.- Monter slipeplaten og holderingen på nålebeveleren. Påse at den grå siden av slipeplaten er orientert oppover mellom øvre og nedre holdering. Stram skruene på holderringen, vekslende fra skrue til skrue for å sikre at hver skrue strammes jevnt. Slipeplaten og festeringene vil heretter bli referert til som slipeenheten.
- Plasser 13 dråper (~ 520 μL) sokkelolje på den optiske flate overflaten, og plasser deretter slipeenheten på toppen av platen. Plasser enheten under et dissekeringsmikroskop, og slå deretter på skråkanten. Litt ekstra olje sammenlignet med Sutters anbefaling brukes, da dette holder slipeplaten spinnende i en lengre periode når den brukes sammen med denne våte skråkantmetoden.
- Tilsett 1% Photo-Flo-løsning på slipeflaten og flytt veken på plass slik at den er nedsenket i Photo-Flo-løsningen.
- Slå på luften ved hovedkilden. Sett deretter en trukket borosilikatnål inn i holderen og stram holderringen. Slå på luften ved regulatoren og øk til trykket har nådd 26 PSI.
- Se fra siden, senk nålen ved hjelp av den grove justeringsknappen til den nesten berører Photo-Flo flytende overflate.
- Juster mikroskopet for å finne nålen i synsfeltet. Start med laveste forstørrelse, og øk forstørrelsen. Juster nålens posisjon forsiktig ved hjelp av den grove justeringsknappen til den bare berører overflaten på Photo-Flo-væsken.
- Bruk den grove justeringsknappen og fortsett å se under mikroskopet, senk nålen til den er nær slipeflaten, men ikke berøre den.
- Bruk finjusteringsknappen, senk nålen forsiktig og sakte, vær oppmerksom på nålen og skyggen den etterlater på slipeflaten på beveleren. Når nålen og skyggen ser ut som de er i ferd med å berøre slipeflaten, fortsett å senke nålen enda langsommere og forsiktig.
- Veksle mellom å la nålen "skråstille" ved å senke den på slipeflaten, og deretter heve den. Før du hever nålen, må du raskt notere innstillingen på mikrometeret på finjusteringsknappen slik at nålen kan senkes til samme posisjon eller om nødvendig til en litt lavere posisjon. Husk å holde nålen under Photo-Flo flytende lag. Når nålen er hevet over slipeflaten, må du raskt stoppe og starte rotasjonen av beveleren på nytt for å se etter bobler. Hvis nålen har blitt tilstrekkelig skråstilt, skal luftbobler strømme ut fra nålen og inn i Photo-Flo. Hvis platen ikke stoppes, vil bobler sannsynligvis ikke bli synlige før nåleåpningen er for stor.
- Hvis det ikke oppstår bobler når nålen heves over slipeflaten og beveleren har stoppet, gjentar du skråstillingsprosedyren, senker nålen til en litt lavere posisjon på mikrometeret som ligger på finjusteringsknappen, hever nålen, stopper skråkantplaten og ser etter luftbobler. Gjenta til en liten, men jevn strøm av bobler vises.
- Når luftbobler er til stede, kontroller den relative åpningsstørrelsen ved å stoppe slipeplaten og senke lufttrykket, og legg merke til PSI der bobleformasjonen stopper, da dette er en relativ indikasjon på størrelsen på åpningen av de skrå nålene. Jo lavere trykk luften slutter å unnslippe fra nålespissen, jo større nålåpning. Nåler skråstilt til det punktet hvor bobler slutter å unnslippe fra nålen ved 18-20 PSI indikerer at nålen har en relativt liten åpning og bør forårsake minimal skade på et embryo når den brukes til mikroinjeksjoner.
- Etter å ha sjekket nåleåpningen, øk lufttrykket til 26 PSI for å forhindre at væske kommer inn i nålen. Løft deretter nålen opp og ut av Photo-Flo-laget ved hjelp av den grove justeringsknappen. Det er viktig å merke seg at så lenge luft strømmer ut av nålen, kommer photo-flo ikke inn i nålen, og derfor er innsiden av nålen beskyttet mot forurensning.
- Når nålen er ute av Photo-Flo, slå av luften og fjern nålen fra nåleholderen.
- Bruk tang, plasser den nylig skrå nålen i en Petri-tallerken som enten har dobbeltsidig tape eller modellering av leire for å holde den på plass. Gjenta prosessen til 10-20 skrå nåler er produsert.
3. Blodfôring av foreldregenerasjonen av mygg
- Bakre larver av Cx. pipiens mygg under entydige lange dagforhold (>13 h lys / dag) ved 25-27 °C for å sikre at mygg ikke kommer inn i deres overvintrende dormancy eller diapause.
- Syv til ti dager etter topp voksen fremvekst, forberede Hemotek Membrane fôringssystem ved å koble varmeenhetene til strømforsyningen. Juster temperaturen på hver enhet til 37 °C (kroppstemperatur) eller 41 °C (kyllingens indre kroppstemperatur) ved hjelp av justeringsskruen på toppen av enheten. Påse at riktig temperatur er nådd ved hjelp av et elektrisk termometer.
- Forbered blodmelreservoaret for fôring.
- Klipp en firkant med parafilm for hver blodfôringssylinder, og gni parafilm mot bare føtter. Dette gir dufter som er attraktive for myggene.
- Strekk parafilmen så tynt som mulig, og vikle kantene tett rundt måltidsreservoaret. Fest eventuelt på plass med en gummi-O-ring.
- Tilsett ca. 200 μL 0,1 M ATP-oppløsning til 15 ml friskt eller tint hel, natriumsitratbehandlet kyllingblod. ATP bidrar til å stimulere blodfôring, og natriumsitrat forhindrer blodet i å koagulere.
- Hold reservoaret slik at parafilmsiden vender ned, og bruk forsiktig en engangspipette for å fylle reservoaret. Hvert reservoar har ~3 ml blod. Forsegle påfyllingsportene med plastplugger.
- Skru måltidsreservoarene inn i varmeenhetene og legg på toppen av myggburet slik at parafilmsiden vender ned og myggene kan mate gjennom nettet.
- Dekk burene med svarte søppelposer for å simulere skumring og blåse kraftig inn i hvert bur, da den økte CO2-konsentrasjonen stimulerer blodfôring.
- Hold materen på buret i 2-8 timer for å maksimere blodfôring. Sjekk regelmessig og legg merke til andelen kvinner som har tatt et blodmåltid (tydelig av deres røde og distended abdomens).
4. Indusere egglegging i voksne mygg
- Fire til fem dager etter blodfôring, lag et 50 ml konisk rør for myggoviposisjon.
- Lag et hull på ~ 20 mm nær bunnen av det koniske røret.
- Dekk hullet med to firkanter (35 mm2) tanndammegummi, en med horisontal spalte og en annen med vertikal spalte. Bruk tape til å feste rutene til tanndammen til det koniske røret.
- Legg et filterpapir på 4,25 cm på en Petri-tallerken på 35 mm x 10 mm og fukt filterpapiret med 750 μL destillert vann.
- Snu det koniske røret på filterpapiret og vri frem og tilbake et par ganger for å sikre at det sitter godt fast.
- Bruk en munnaspirator for å forsiktig fjerne ~ 10 kvinner av Cx. pipiens fra buret og overføre dem til det forberedte koniske røret.
- Plasser en ugjennomsiktig sylinder over det koniske røret for å gi mørke til myggene, da dette stimulerer egglegging, og vent 20-25 minutter.
5. Mikromanipulerende nylagde Culex-egg
- Forbered lysbildet for å feste myggembryoene for mikroinjeksjon.
- Fest et stykke dobbeltsidig tape til bredden på et dekkglass.
- Fest en tynn stripe med gjennomsiktig medisinsk dressing (f.eks. Tegaderm, 2-3 mm bred) til det dobbeltsidige båndet slik at det går parallelt med den korte enden av dekkglasset og er plassert ca. 5 mm fra enden av dekkglasset.
- Fjern overflødig dobbeltsidig tape med et skarpt barberblad, og fjern 2-3 mm medisinsk dressing og dobbeltsidig tape fra hver ende av dekkglasset. Dette gjør at et lag med olje forblir på lysbildet etter at eggene er montert på dekkglasset.
- Bruk en voksblyant til å tegne en D-form rundt det dobbeltsidige båndet og stripen av medisinsk dressing. Dette vil fungere som en barriere for å holde vannet rundt eggene etter injeksjon.
- Etter at lysbildet er forberedt og 20-25 minutter har gått, fjern det ugjennomsiktige røret og bestem om myggene har lagt egg eller ikke.
- Hvis ikke, dekk dem i ytterligere 5-10 minutter.
- Hvis myggene har lagt egg, løft forsiktig, men raskt det koniske røret og dekk med en hette. Plasser myggene i et eget bur, og registrer tiden eggene ble samlet på et regneark. Tilsett deretter 50-100 μL DI-vann til filterpapiret som inneholder eggflåtene.
- Under et dissekerende mikroskop stiller eggene opp.
- Plasser et stykke filterpapir (10 mm x 30 mm rektangler kuttet av grovt filterpapir med rask strømningshastighet) under et 24 mm x 40 mm dekselglass slik at dekkglasset dekker 50-60% av venstre side av filterpapiret.
- Fukt filterpapiret med 50 μL DI-vann. Vannet vil spre seg sakte under dekkglasset, og skape et reservoar for å holde filterpapiret og eggene våte under mikromanipulering. En menisk vil danne seg mellom dekkglasset og filterpapiret når riktig mengde vann påføres.
- Skill eggene fra eggflåtene ved hjelp av en fin pensel, og plasser slik at den smale, bakre enden av embryoet berører dekselglasset (venstre) og den bredere, fremre enden er til høyre.
- Juster egg i 20 min, nøye observere endringen av fargen fra en melkehvit til en veldig lysegrå. Kontroller vannfilmen under dekkglasset rutinemessig for å sikre at det er tilstrekkelig mengde vann. Hvis eggene ser ut til å tørke ut, tilsett en liten mengde DI-vann (20-30 μL) til filterpapiret.
- Etter 20 min, kast alle gjenværende egg.
- Overfør eggene til mikroinjeksjonssklien.
- Bruk et lite (10 mm x 30 mm) grovt filterpapir til å transportere vann fra siden av det mettede filterpapiret, og fjern det fukttransporterende filterpapiret med tang. Gjenta 2-3 ganger for å sikre at filterpapiret med eggene er så tørt som mulig.
- Legg et friskt, tørt rektangel av filterpapir og hold det på plass med et par tang. Trekk forsiktig bort dekkglasset til venstre, bort fra de justerte eggene.
- Tørk overflødig vann på scenen uten å forstyrre det lille filterpapiret som inneholder de justerte eggene. Fortsett å tørke det våte filterpapiret med eggene flere ganger, og trykk på de små rektanglene av filterpapir med tommelen og / eller tang, for å sikre at eggene er så tørre som mulig før du overfører dem til injeksjonssklie.
- Bruk tang til å fjerne papirstøtten fra stripen av medisinsk dressing fra monteringsskuffen.
- Hold monteringsskuffen med en tommel og langfinger og den eksponerte medisinske bandasjen vendt ned, og senk i en 45° vinkel på linjen med justerte egg. Plasser lysbildet slik at den bredere, fremre enden av eggene (venstre) henger litt utenfor enden av den medisinske dressingen, da dette forbedrer Culex larvers evne til å luke fra de monterte eggene.
- Trykk pekefingeren til undersiden av dekkglasset, mens du fortsetter å holde dekkglasset mellom tommelen og langfingeren, for å sikre at alle de justerte eggene er godt festet til den medisinske dressingen.
- Umiddelbart inverter dekselglasset slik at eggene vender opp, og påfør et tynt lag olje Halocarbon olje (2-3 dråper; ~ 20 μL) på eggene. Dette forhindrer eggene i å desiccating under mikroinjeksjon. Fjern egg som ikke er festet til medisinsk dressing eller ikke er dekket av oljen.
- Plasser glassdekselet med de monterte eggene vendt opp på innsiden av en firkantet Petri-tallerken med et stort kvadrat vått filterpapir for transport for mikroinjeksjon.
6. Injisere Culex embryoer
- Tilbakefylling av injeksjonsnålene med injeksjonsblandingen
- Velg en nålefyller eller gellastespiss som lett passer inn i bakenden av den valgte injeksjonsnålen, og vil ha litt plass mellom enden av nålefylleren og injeksjonsnålen.
- Legg forsiktig en enkelt og liten dråpe injeksjonsblanding (~ 0,5-1 μL) i injeksjonsnålen ved hjelp av nålefylleren for å fylle nålen på baksiden. Plasser dråpen av injeksjonsblandingen i nærheten av der injeksjonsnålen begynner å avsmalne.
- Fest injeksjonsnålen til mikroinjektoren.
- Plasser lysbildet som inneholder embryoene på mikroskopets stadium.
- Åpne nålen
MERK: Hvis du bruker skrå kanyler, er dette ikke nødvendig.- Bruk et startinjeksjonstrykk på ~30 PSI og juster etter behov for å levere et passende injeksjonsvolum.
- Under et disseksjonsmikroskop plasserer du nålen over embryoet, og bruker forsiktig mikromanipulatoren til å senke nålen på embryoet. Når nålen knapt berører embryoet, flytt raskt embryoet vinkelrett på nålens lange akse.
- For å finne ut om kanylen ble åpnet, trykk på injeksjonsutløseren og se om noen bobler/injeksjonsblanding rømmer fra kanylen. Hvis ikke, gjenta å flytte embryoet mot nålen til nålen er åpen og injeksjonsblandingen slipper ut når avtrekkeren trykkes.
- Injisere embryoer
- Plasser det første embryoet i linje i midten av synet i mikroskopet og sørg for at det er i fokus.
- Plasser nålen over det første egget, også innenfor midten av synsfeltet i mikroskopet.
- Gradvis øke forstørrelsen på mikroskopet, forsiktig senke nålen for å holde den like over det første embryoet, sentrert og i fokus. Fortsett til mikroskopet har nådd sin høyeste forstørrelse og både embryoet og nålen er i fokus.
- Beveg embryoet forsiktig på scenen litt til venstre og senk nålen litt slik at nålen og embryoet nå er i samme synsplan.
- Bruk mikroskopstadiet til å flytte embryoet, forsiktig og forsiktig berøre embryoet til spissen av nålen. Den smale, bakre enden av embryoet skal avledes litt. Juster nålens høyde hvis den er for høy eller for lav.
- Bruk mikroskopstadiet til å flytte den bakre enden av embryoet på nålen og observere nålen som trer inn i myggeggets korion. Nålen skal bare trenge inn i membranen på omtrentlig plassering av stangcellene i Culex embryoer. Når dette skjer, trykk injeksjonsutløseren 1-3 ganger for å skyte injeksjonsblanding inn i embryoet. Lever en liten mengde injeksjonsblanding, akkurat nok til at en liten rydding i embryoplasma kan oppdages.
- Bruk scenen, flytt embryoet til høyre, bort og av spissen av nålen. Hvis injeksjonen gikk bra, bør lite eller ingen væske lekke fra embryoet.
- Flytt scenen ned slik at neste embryo i linjen er plassert foran nålen. Flytt deretter scenen til venstre, plasser embryoet på injeksjonsnålen og trekk injeksjonsutløseren.
- Hvis injeksjonsblandingen ikke ser ut til å komme ut og/eller hvis en stor mengde væske slipper ut fra embryoet etter at nålen er fjernet, bytt injeksjonsnålen og start på nytt.
- Ødelegg eventuelle ikke-injiserte eller skadede egg.
- Ta vare på embryoene etter injeksjon
- Etter at alle embryoer på lysbildet er injisert, vask av Halocarbon-oljen ved å påføre omvendt osmosevann med en spruteflaske, slik at strømmen av vann er rettet mot toppen av glassdekslene over de injiserte embryoene og la vannet strømme ned dekslene og over embryoene for å skylle oljen bort. Pass på at du ikke retter vannstrømmen direkte mot embryoene, da dette kan skade eller løsne dem fra den medisinske dressingen. Denne prosessen fjerner de fleste, men ikke alle, av Halocarbon-oljen.
- Dekk lysbildet med 150 μL DI-vann.
- Plasser lysbildet med de injiserte embryoene på vått filterpapir inne i en firkantet Petri-tallerken.
- Plasser Petri-retten som inneholder de injiserte embryoene i et miljøkammer satt til 25-27 °C, 70–80 % RELATIV med lang dag fotoperiod (>13 t lys/dag).
7. Oppdrett av injiserte embryoer (F0) til voksen alder og sette opp kryss
- Undersøk lysbildene av injiserte embryoer daglig, og forvent at 1m instar larver skal dukke opp 1,5 dager etter injeksjon.
- Tell antall 1m instar larver, og legg 100-200 larver i en skoeske-størrelse Tupperware beholder med 450 ml DI-vann og 50 mg malt fiskemat. På dette tidspunktet, lag 1-5 ganger flere beholdere som inneholder villtype eller ikke-injiserte larver som vil bli brukt til å krysse med de injiserte myggene.
- Fôr larvene daglig, noe som øker mengden mat de mottar hver dag til de når 300-500 mg på densjette dagen av larvlivet.
- Når pupper vises, bruk en overføringspipette for å plassere en pupae i et 2 ml mikrosenterrør fylt 50-75% fullt av DI-vann. Gjenta for alle pupper, både puppene som ble injisert som embryoer samt uinjisert, vill-type pupper. Trykk forsiktig på lokkene slik at de er litt ajar, slik at myggene ikke rømmer, men likevel tillater en liten mengde gassutveksling.
- Når de voksne myggene dukker opp inne i mikrocentrifugerørene, slipper du injiserte kvinnelige mygg i et bur som inneholder jomfruelige mannlige mygg, og oppnår et forhold på minst 1 villtype mann for hver injisert kvinne. På samme måte, slipp injiserte mannlige mygg i et bur som inneholder jomfruelige villtype kvinner, og oppnå et forhold på ca 5-10 jomfru villtype kvinner for hver injisert mann. Et høyere forhold mellom villtype kvinner og injiserte menn anbefales da hver mannlig mygg kan mate flere ganger. Derfor, å ha høyere antall vill-type kvinner som parrer seg med injiserte menn øker antall F1 avkom som kan produseres.
8. Oppnå og oppdra F1 mygg og screene dem for mutasjoner
- Syv til ti dager etter voksen fremvekst, tilby et blodmåltid til hunnene i hvert bur som beskrevet ovenfor (trinn 3).
- Fire dager etter blodfôring legger du oviposisjonsvann i hvert bur. Hver eggflåte representerer avkom av en enkelt kvinnelig mygg, og bør derfor plasseres i sin egen plast, skoboks-størrelse oppdrettsbeholder kort tid etter oviposisjon. Merk hver beholder med en unik identifikator, og angi også at larvene tilhører F1-generasjonen for genet av interesse, om den mannlige eller kvinnelige forelderen ble injisert, datoen pannen ble etablert, oppdrettsforhold og eksperimentets initialer.
- Overvåk larvernes panner daglig. Så snart larver klekker seg i pannene, gi 50 mg malt fiskemat. Øk maten daglig i 6 dager som beskrevet ovenfor (trinn 7.3).
- Overfør individuelle pupper til 2 ml mikrosenterfugerør som inneholder mellom 1-1,5 ml DI-vann, merk hvert rør og knekk dekslene.
- Når de voksne myggene dukker opp, åpner du forsiktig 2 ml mikrocentrifugerøret, dekker med en pekefinger, og bruker den andre hånden, plasser et 3 dram hetteglass over toppen av mikrocentrifugerøret. Myggens naturlige instinkt bør være å fly opp og inn i hetteglasset med glass. Når dette skjer, skyv en finger over åpningen av hetteglasset i glass, og snu det raskt, plasser en liten bomullskule som har blitt litt fuktet med 10% sukroseoppløsning i toppen av hetteglasset. Dette forhindrer myggen i å unnslippe og gir en nødvendig mat- og vannkilde.
- Merk både røret som inneholder pupal exuvia og glasshetteglasset som inneholder voksen mygg for å indikere larvalpannen som den stammer fra, myggens kjønn og den unike identifikatoren for den personen. Eksempel: II.C.M32, hvor "II" representerer at den mannlige forelderen ble injisert, representerer "C" pannen / eggflåten som personen stammer fra, og "M32" betegner at det var den 32.
- Plasser voksne mygg i deres individuelle glassflasker tilbake i miljøkammeret, og tilsett en liten mengde (~ 20 μL) av 10% sukroseløsning til bomullen daglig. Pass på at du ikke overfeeder eller metter bomullen, da myggene blir sittende fast i sukroseoppløsningen og dør.
- Screening mygg for ønsket mutasjon
- Trekk ut genomisk DNA fra 5-10 pupal exuvia fra hver eggflåte / panne av larver ved hjelp av Phire Direct PCR Kit i henhold til produsentens instruksjoner, samt 1-2 wild-type individer som vil tjene som en kontroll.
MERK: Ettersom avkomene fra hver flåte sannsynligvis er fulle søsken, vil screening av 5-10 larver fra hver panne avgjøre om mutasjonen har blitt overført til avkom. Hvis ingen av de screenede larver fra en panne har ønsket mutasjon, må du ikke screene flere voksne. Hvis noen av larvene har mutasjonen, bør hvert individ fra den pannen screenes. - Bruk de tidligere utformede PCR-primerne (trinn 1.2), forsterk fragmentet rundt den anslåtte plasseringen av mutasjonen din ved hjelp av Phire PCR-settet i både villtype og F1 avkom og kjør PCR-fragmenter på en 3-4% agarose gel for å avgjøre om det er synlige innsettinger eller slettinger (indels).
MERK: Alle individer som har ønsket mutasjon vil være heterozygote og skal vise 2 bånd, en vill type og en enten litt kortere eller lengre i ønsket posisjon. For å skille disse, sammenlign posisjonen og tykkelsen på båndene til de ville typene individer med de i båndene i F1-avkom. Ideelt sett vil to diskrete bånd være synlige, men hvis indel er veldig liten, kan bandet se ut til å være bredere og / eller uskarpt. - Rens PCR-produktet enten ved å utskille båndet som inneholder de antatte indels (anbefales) eller ved å rense det gjenværende PCR-produktet som ikke ble lastet inn i gelen. Send inn den rensede PCR-en for sekvensering for å finne ut om den ønskede mutasjonen er til stede.
- Trekk ut genomisk DNA fra 5-10 pupal exuvia fra hver eggflåte / panne av larver ved hjelp av Phire Direct PCR Kit i henhold til produsentens instruksjoner, samt 1-2 wild-type individer som vil tjene som en kontroll.
9. Oppnå og oppdrett F2 og F3 mygg og screening dem for mutasjoner
- Slipp alle F1 voksne mygg som ønsket mutasjon ble funnet ved å screene sin pupal exuvia fra deres individuelle glassflasker og inn i et bur som inneholder villtype, ikke-injiserte mygg av motsatt kjønn. Backcrossing for denne andre generasjonen bør fjerne alle skadelige effekter av injeksjon og innavl.
- Blod mate burene til mutant F1 mygg og deres wild-type kolleger som tidligere beskrevet. Fire til fem dager senere, samle de resulterende F2 egg flåter.
- Merk og bak F2 larver som beskrevet ovenfor, og plasser hver eggflåte i en separat, merket beholder. Ved pupering, igjen skille individuelle pupper i individuelle 2 ml mikrocentrifuge rør, og overføre hver voksen til separate glass hetteglass avkortet med sukrose-gjennomvåt bomull ved fremveksten. Deretter screen pupal exuvia av hver F2 individ ønsket mutasjon som tidligere beskrevet (trinn 8.5-8.8).
MERK: Her vil alle individer som har ønsket mutasjon være heterozygote, og derfor bør PCR-produktet ideelt produsere 2 forskjellige bånd når de kjøres på en 3-4% agarose gel. - Når mutante F2 larver er identifisert, plasser alle menn og kvinner som har mutasjonen i samme bur for å mate. Blodfôr 7-10 dager etter voksen fremvekst, og 4-5 dager senere samler F3 eggflåter.
- Legg hver F3 eggflåte i en separat larvoppdrettsbeholder, og merk og fôr som beskrevet ovenfor.
- Del F3-puppen inn i individuelle 2 ml mikrocentrifugerør. Når voksne dukker opp, overfør dem til individuelle hetteglass avkortet med 10% sukrose-gjennomvåt bomull. Screen pupal exuvia som tidligere beskrevet. Denne gangen bør ca 25% av avkomene i hver panne være homozygote for nullmutasjonen. Plasser disse personene i et enkelt bur, og bruk dem til å skape og vedlikeholde den nylig genererte mutantlinjen av mygg.
MERK: Hvis et lavt antall homozygote mygg er til stede, kan heterozygot f3 menn og kvinner krysses med hverandre for å generere ytterligere homozygote-null mygg i F4-generasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av den beskrevne protokollen var vi i stand til å injisere embryoer av Cx. pipiens, og observerte en høy overlevelse blant de injiserte embryoene (~ 55%, figur 1). Tidligere studier hadde en lavere prosentandel av overlevelse, sannsynligvis fordi fremre av eggsekken var festet til den medisinske dressingstripen, og forhindret mygg larver fra å unnslippe fra koreksjonen og vellykket svømme i vannet. Å sikre at den fremre enden strekker seg utover stripen av medisinsk dressing økte larvaloverlevelsen sterkt, og resulterer i avkom av høy kvalitet som er i stand til å utvikle seg til voksen alder og reprodusere (Figur 2B).
Påfølgende eksperimenter og screening indikerer at nullmutasjonen for døgnklokkens gensyklus (cyc; KM355981) kom seg inn i bakterien til de injiserte embryoene (Figur 3). Gitt at våre primere forsterket en stor region av cyc-genet nær cut-sites, var det vanskelig å observere to separate bånd i heterozygote, F1 mygg. Dette demonstrerer nytten av å designe primere som vil forsterke fragmenter som er ~ 100-200 bp rundt kuttstedet, og også viktigheten av sekvensering av alle mistenkte mutant mygg. Sekvensering viste at omtrent 10% av de screenede myggene viste en liten innsetting eller sletting nær Cas9-kuttestedet til den første guiden RNA som vi hadde designet (Figur 3), noe som tyder på at dette var en svært effektiv gRNA og at vi med hell målrettet polcellene under mikroinjeksjoner. F1 individer parret og produserte levedyktige avkom (F2 generasjon), hvorav noen også inneholdt mutasjonen.
Figur 1: Eksempel på en skrå borosilikatnål. Denne nålen ble fremstilt fra et silikonisert borosilikatmikrokapillært rør, trukket ved hjelp av en PC-10 vertikal nåletrekker, og deretter skråstilt på en BV-10 Beveller. Nålen er sett under ~ 63x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Overlevelse av F0-generasjonen på tvers av utviklingen. (A) Bilde av 1m instar larver som klekket ut fra 3 lysbilder som inneholder injiserte embryoer. (B) Grafisk fremstilling av antall individer på hvert livsstadium. Av de 801 embryoene som ble injisert, klekket 441 1st instar larver, og av disse nådde 149 personer pupering, noe som resulterte i totalt 121 voksne (73 menn og 43 kvinner). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative resultater som viser overføringen av ønsket mutasjon. De to øverste sekvensene representerer sekvensen av syklusgenet i Culex quinquefascaitus (Cx.quinq; XP_001865023.1) og i villtype kvinner av Cx. pipiens (WT. F; KM355981). Sekvensene nedenfor representerer sekvenser i tre mannlige F1 avkom (I.DM1; II.JM4; II.K10M). Den grønne boksen representerer PAM-sekvensen anerkjent av Cas9-proteinet (CGG), mens den grønne pilen representerer hvor Cas9-proteinet spaltet genomisk DNA. Disse resultatene viser at korte slettinger på 2 eller 4 nukleotider ble arvet hos F1 hannene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen presenterer metoder for å introdusere spesifikke mutasjoner i genomet til Culex mygg og kan også brukes til å redigere genomet til andre mygg. Protokollen er viktig ved at den gir spesifikke detaljer om ikke bare hvordan du forbereder injeksjonsmaterialene, men også en detaljert videooversikt over hvordan man kan indusere mygg til å legge egg, samt hvordan du forbereder og injiserer disse eggene. Vi oppsummerer også hvordan du kan dra nytte av biologien til kvinnelige Cx. pipiens å legge egg i individuelle flåter og dermed screene en mindre andel av avkom fra hver kvinne for ønskede mutasjoner. Metodene som presenteres her er optimalisert for Cx. pipiens, men kan tilpasses, med små justeringer, for å redigere genomene til andre mygg eller insekter. I tillegg er mikromanipulerings- og mikroinjeksjonsprotokollene beskrevet her egnet til å injisere flere forskjellige materialer i insektembryoer, inkludert transposoner, dsRNA eller andre endonucleases som TALENs eller Zinc-Finger nukleaser. Videre genererer skråkantprotokollen mikroinjeksjonsnåler med variable åpningsstørrelser, og skaper derfor nåler som kan brukes til å injisere et bredt utvalg av injeksjonsmaterialer. Nålens åpne størrelse kan utledes ved å sakte redusere lufttrykket etter at nålen er skråstilt, og merke trykket der luftbobler slutter å strømme fra spissen av den nyåpnede nålen. Jo mindre lufttrykk som trengs for å produsere bobler indikerer at nålen har en større åpningsstørrelse, og omvendt indikerer høyere lufttrykk at nålen har en mindre åpningsstørrelse. Nåler med større åpningsstørrelser er bedre for å injisere større partikler og mer viskøse materialer, men vil sannsynligvis forårsake større skade på embryoet og dermed redusere overlevelsen.
Mikroinjeksjonseksperimenter er på mange måter et kappløp mot klokken. For det første må man injisere individuelle embryoer innen de første 2 timene av oviposisjon, før koret herdes og blastodermdannelse oppstår. Derfor er det viktig å merke seg når myggene først ble plassert i oviposisjonskammeret, hvor lang tid det tar å manipulere eggene til injeksjon (vi anbefaler ikke mer enn 20-30 minutter), og hvor lang tid det tar å injisere alle embryoer. Tiden er også begrenset når screening av voksne mygg for mutasjoner som Cx. pipiens er ganske følsomme for sine omgivelser og mygg overlever vanligvis bare i 3-5 dager i individuelle glassflasker. Derfor er det viktig å screene mygg pupal exuvia så raskt som mulig. Alternativt kan man også trekke ut genomisk DNA fra et enkelt myggben14. For å gjøre det, bør myggene først bedøves på is. Da vi var trette av hvordan kald behandling og tap av lemmer kunne påvirke myggoverlevelse og deres evne til å mate og legge levedyktige egg, bestemte vi oss for i stedet å screene den kasserte pupal exuvia for mutasjoner. Nivået av gDNA i exuvia er sannsynligvis lavere enn inne i et myggben, og dette legger til ekstra innsats og tid til å skille mygg på puppetrinnet, men sikrer også at alle voksne er uovertruffen når de slippes ut i sine passende bur, noe som er helt avgjørende. Vi føler at resultatene er verdt det, men oppfordrer andre til å vurdere om fjerning av et ben kan være et bedre handlingsforløp for deres eksperimentelle behov.
Den beste måten å fremskynde screening for mutasjoner er å injisere en plasmid som inneholder en genetisk markør, for eksempel et fluorescerende protein, flankert av homologe sekvenser på hver side av kuttestedet. Ratene av knock-in mutasjoner ved hjelp av homologi rettet-reparasjon (HDR) er generelt lavere enn ikke-homolog end-joining (NHEJ), knock-out mutasjoner (HDR = 0,71%; NHEJ=24,87 %; 22). Derfor vil innsetting av markøren sannsynligvis skje med en mye lavere frekvens, men tidsbesparelsene som tilbys ved å raskt kunne screene mygg larver under et fluorescerende mikroskop, kan være verdt risikoen, avhengig av prosjektet. I tillegg forbedres ratene av HDR og knock-in mutasjoner når man også injiserer en plasmid som inneholder den genetiske sekvensen av Cas9-proteinet, drevet av en godt karakterisert embryonal promotor, og gRNA drevet av U6 promotor24,26. Dette skyldes sannsynligvis tidlig i embryonal utvikling, når kjernene raskt deler seg (S-fase av cellesyklusen), ser den feilutsatte, men hensiktsmessige NHEJ-mekanismen ut til å være den foretrukne metoden for å reparere dobbeltstrengede pauser (gjennomgått18). Men etter hvert som embryogenesen utvikler seg, er mobilmaskineriet primet til å bruke den mer nøyaktige HDR-mekanismen for å reparere dobbeltstrengede pauser (sen S-fase og G2-fase). Injisering av en plasmid som inneholder Cas9-sekvensen tidlig i embryonal utvikling, gjør at Cas9-proteinet kan nå de fleste målceller mens embryoet fortsatt er i synkrontilstand og før cellulære membraner har dannet seg, men den lille forsinkelsen som kreves for å transkribere og oversette Cas9-proteinet ser ut til å øke sannsynligheten for at endonuclease vil være aktiv i en tid da det utviklende embryoet er mer sannsynlig å bruke HDR til å reparere dobbeltstrengede pauser nøyaktig. For eksempel oppdaget Lin et al.27 at hdr-ratene ble forbedret til ~ 33% da Cas9-proteinet som ble kompleks med gRNA ble injisert i menneskelige cellelinjer arrestert i M-fasen av cellesyklusen. En ekstra fordel med å levere Cas9 og gRNAer på plasmider er at de er mindre viskøse og derfor mindre sannsynlig å tette nålen under injeksjoner (R. Harrell, personlig observasjon). Men inntil emtoniske promotorer er karakterisert og validert i Culex mygg, anbefaler vi å injisere Cas9 protein eller mRNA som beskrevet her.
I tillegg, gitt hvor lang tid man må dedikere til oppdrett og screening av mygg, anbefaler vi å ha minst en heltidstekniker, student eller forsker viet til denne oppgaven. Vi anbefaler også strategisk å vurdere hvor mange nullmutanter man trenger for et gitt eksperiment og betydningen av genetisk mangfold innenfor nulllinjen. Mens vi var i stand til å identifisere mygg i F1 og F2 generasjoner som hadde mutasjonen, overlevde bare en håndfull F2 mygg til voksen alder de heterozygote mutante myggene klarte ikke å produsere levedyktige avkom. Vi tror at dette er mye mindre å gjøre med mutasjonen, og mer sannsynlig er et resultat av den lange perioden at både mannlige og kvinnelige mygg var begrenset til glassrør mens vi screenet dem. Denne langvarige isolasjonsperioden forstyrret mest sannsynlig deres evne til å mate og, når det gjelder kvinner, få et blodmåltid og legge levedyktige egg. Outcrossing for en enkelt generasjon og / eller å ha optimaliserte screeningteknikker på plass bør forhindre at dette problemet oppstår i fremtiden. Derfor, ved å følge denne protokollen, er vi sikre på at forskere vil kunne generere nulllinjer av Culex mygg og, med mindre justeringer, flere insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
RH jobber for Insect Transformation Facility, som leverer tjenester innen insektgenetiske modifikasjoner.
Acknowledgments
Vi takker Dr. David O'Brochta og alle medlemmer av Insect Genetic Technologies Coordination Research Network for hjelp og opplæring som de gir oss og andre om implementering av genetiske teknologier. Vi takker spesielt Channa Aluvihare for å optimalisere mikromanipuleringsprotokollen slik at Culex-embryoer kan injiseres og klekkes. Vi takker også Devante Simmons og Joseph Urso, studenter som jobber i Meuti-laboratoriet, for deres hjelp til å ta vare på og screene transgene mygg, og Zora Elmkami fra ITF for å få hjelp til å oppdra og klargjøre mygg til injeksjon. Dette arbeidet ble støttet av et tverrfaglig frøstipend fra Infectious Diseases Institute ved OSU gitt til MEM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Membrane Feeder | Hemotek | SP5W1-3 | Company location: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Company location: Carlsbad, CA, USA |
| Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | World Precision Instruments | 1B100-6 | Company Location: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Needle Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Whatman Circular filter paper (12.5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Conical tube (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Fisherbrand course filter paper with fast flow rate | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Cover glass (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Dental dam | Henry Schein Inc | 1010171 | Company Location: Melville, NY USA |
| Scotch double-sided tape | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| FemtoJet 4i microinjector | Eppendorf | 5252000021 | Company Location: Hamburg, Germany |
| Glass vial (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Halocarbon oil | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Needle Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| PC-100 Weighted Needle Puller | Narishige | PC-100 | This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | Company Location: Cornwall, UK |
| Guide-it™ sgRNA Screening Kit | Takara, Bio USA | 632639 | This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Small petri dishes (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Sodium citrate chicken blood | Lampire biologicals | 7201406 | Company Location: Everett, PA, USA |
| Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Company Location: Melville, NY USA |
| Tropical fish food | Tetramin | N/A | |
| Whatman filter paper | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Whatman filter paper, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
References
- Hamer, G. L., et al. Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).
- Bailey, C. L., et al. Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes. Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).
- Sabry, M. A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis. The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).
- Cancrini, G., et al. Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy. Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).
- Wilton, D. P., Smith, G. C. Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).
- Mattingly, P. F. The Culex pipiens complex. Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).
- Eldridge, B. F. The effect of temperature and photoperiod on blood-feeding and ovarian development in mosquitoes of the Culex pipiens complex. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17 (1), 133-140 (1968).
- Spielman, A., Wong, J. Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens. Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).
- Fritz, M. L., Walker, E. D., Miller, J. R., Severson, D. W., Dworkin, I. Divergent host preferences of above-and below-ground Culex pipiens mosquitoes and their hybrid offspring. Medical and Veterinary Entomology. 29 (2), 115-123 (2015).
- Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Annals of the Entomological Society of America. 57 (4), 468-472 (1964).
- Dong, S., Lin, J., Held, N. L., Clem, R. J., Passarelli, A. L., Franz, A. W. Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 10 (3), (2015).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Liu, T., et al. Construction of an efficient genomic editing system with CRISPR/Cas9 in the vector mosquito Aedes albopictus. Insect Science. 26 (6), 1045-1054 (2019).
- Itokawa, K., Komagata, O., Kasai, S., Ogawa, K., Tomita, T. Testing the causality between CYP9M10 and pyrethroid resistance using the TALEN and CRISPR/Cas9 technologies. Scientific Reports. 6, 24652 (2016).
- Li, M., Li, T., Liu, N., Raban, R. R., Wang, X., Akbari, O. S. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29, 214-220 (2019).
- Anderson, M. E., et al. CRISPR/Cas9 gene editing in the West Nile Virus vector, Culex quinquefasciatus Say. PloS one. 14 (11), (2019).
- Van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends in Biochemical Sciences. 34 (8), 401-407 (2009).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
- Monnerat, A. T., et al. Anopheles albitarsis embryogenesis: morphological identification of major events. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 97 (4), 589-596 (2002).
- Davis, C. W. C. A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae). Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).
- Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (29), 2967-2976 (2014).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
