Preparazione e iniezione di embrioni di zanzare Culex per generare mutazioni nulle utilizzando CRISPR / Cas9
Summary
CRISPR/Cas9 è sempre più utilizzato per caratterizzare la funzione genica in organismi non modello. Questo protocollo descrive come generare linee knock-out di Culex pipiens, dalla preparazione di miscele di iniezione, all’ottenimento e all’iniezione di embrioni di zanzara, nonché come allevare, incrociare e schermare le zanzare iniettate e la loro progenie per le mutazioni desiderate.
Abstract
Le zanzare Culex sono i principali vettori di diverse malattie che hanno un impatto negativo sulla salute umana e animale, tra cui il virus del Nilo occidentale e le malattie causate da nematodi filariali come la filaria canina e l’elefantiasi. Recentemente, l’editing del genoma CRISPR / Cas9 è stato utilizzato per indurre mutazioni dirette al sito iniettando una proteina Cas9 che è stata complessata con un RNA guida (gRNA) in embrioni appena deposti di diverse specie di insetti, comprese le zanzare che appartengono ai generi Anopheles e Aedes. Manipolare e iniettare zanzare Culex è leggermente più difficile in quanto queste zanzare depongono le uova in posizione verticale in zattere piuttosto che individualmente come altre specie di zanzare. Qui descriviamo come progettare gRNA, complessarli con la proteina Cas9, indurre le zanzare femmine di Culex pipiens a depostare le uova e come preparare e iniettare embrioni appena deposti per la microiniezione con Cas9 / gRNA. Descriviamo anche come allevare e schermare le zanzare iniettate per la mutazione desiderata. I risultati rappresentativi dimostrano che questa tecnica può essere utilizzata per indurre mutazioni site-directed nel genoma delle zanzare Culex e, con lievi modifiche, può essere utilizzata per generare mutanti nulli anche in altre specie di zanzare.
Introduction
Le zanzare Culex sono distribuite in tutte le regioni temperate e tropicali del mondo e trasmettono diversi virus mortali tra cui il virus del Nilo occidentale1, l’encefalitedi St. Louis2 e i nematodi filariali che causano la filaria canina3 e l’elefantiasi4. I membri del complesso Culex pipiens, che comprende Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens e Cx. pipiens molestus, mostrano variazioni sorprendenti in molti aspetti della loro biologia. Ad esempio, mentre Cx. quinquefasciatus e Cx. pipiens molestus non sono in grado di entrare in una dormienza svernante5,6, Cx. pipiens pipiens mostrano robuste risposte stagionali ed entrano in diapausa in risposta ai giorni brevi7,8. Inoltre, Cx. pipiens molestus tendono ad essere più antropofili mentre Cx. pipiens e Cx. quinquefasciatus sono più zoofili6. Tuttavia, negli Stati Uniti e in molti altri luoghi del mondo, queste specie si incrociano, il che ha forti implicazioni per la trasmissione della malattia come ibridi di Cx. pipiens pipiens e Cx. pipiens molestus sono alimentatori opportunistici e morderanno sia gli uccelli che gliesseriumani 9 , fungendo così da vettori ponte per il virus del Nilo occidentale. Lo studio di questi e altri aspetti affascinanti della biologia delle zanzare Culex è stato ostacolato, in parte, perché le zanzare Culex sono leggermente più difficili da allevare in laboratorio rispetto alle zanzare Aedes, che producono uova quiescenti e resistenti all’essiccazione10 e perché gli strumenti molecolari funzionali non sono così ben sviluppati per le specie Culex.
L’editing del genoma CRISPR/Cas9 è una potente tecnologia che è stata utilizzata per valutare la biologia di diverse importanti specie di zanzare11,12,13,tra cui la zanzara della casa meridionale, Culex quinquefasciatus14,15,16. Questa tecnologia, sviluppata da Jennifer Doudna ed Emmanuelle Charpentier, sfrutta una difesa batterica naturale contro i virus da parte di endonucleasi associate a CRISPR di derivazione batterica (proteine Cas; vedi recensione di Van der Oost et al.17). Quando iniettate in embrioni animali, le proteine Cas9 in combinazione con un RNA guida appropriato possono produrre rotture a doppio filamento all’interno del genoma. Questo viene fatto più frequentemente utilizzando la proteina Cas9 che è complessata con RNA guida, che dirige l’attività dell’endonucleasi in una regione specifica del genoma. Dopo che la proteina Cas9 ha creato una rottura a doppio filamento site-specific, il macchinario cellulare tenta di riparare la rottura utilizzando uno dei due meccanismi. Il primo comporta la legatura delle due estremità insieme attraverso l’unione finale non omologa (NHEJ), che è soggetta a errori e spesso produce inserzioni e delezioni out-frame nel genoma che possono portare a proteine non funzionali, generando così una mutazione knock-out. In alternativa, il macchinario cellulare potrebbe utilizzare la riparazione diretta dall’omologia (HDR) trovando sequenze simili per riparare correttamente la rottura. La sequenza simile può essere fornita dal secondo cromosoma all’interno dell’organismo (vedi revisione18). Tuttavia, se la sequenza riparata corrisponde esattamente alla sequenza originale, la proteina Cas9 sarà in grado di tagliare nuovamente il DNA. In alternativa, i ricercatori possono anche includere un plasmide donatore che contiene sequenze omologhe su entrambi i lati del sito di taglio della sequenza target con una sequenza di riparazione alternativa – spesso una proteina marcatore fluorescente, una versione modificata del gene originale o altre modifiche – che possono essere copiate e inserite nel genoma o “knocked-in”.
Il tempismo è fondamentale quando si iniettano embrioni, e questo è particolarmente vero quando si utilizza l’editing del genoma CRISPR / Cas9 per creare mutazioni negli insetti. Questo perché la proteina Cas9 e i gRNA hanno la maggiore capacità di generare mutazioni solo quando l’embrione è nel suo stato sinciziale, prima che si siano formate membrane cellulari e quando più nuclei siano accessibili all’interno dell’embrione. Per le zanzare, i nuclei raggiungono la periferia ~ 2-4 ore dopo l’ovodeposizione, a seconda della temperatura19, e quindi la microiniezione di successo deve avvenire prima di questo momento. Inoltre, la proteina Cas9 taglierà qualsiasi DNA nucleare a cui può accedere, in modo tale che l’individuo risultante dall’iniezione conterrà un mosaico di cellule, alcune con la mutazione desiderata e altre no. Affinché queste mutazioni siano ereditate con successo, la proteina Cas9 deve tagliare il DNA che risiede nella linea germinale che darà origine alle future uova e spermatozoi. Per garantire che le mutazioni siano generate nella linea germinale è meglio iniettare tutti i materiali vicino alla posizione delle cellule polari all’interno dell’embrione, che sono i progenitori della linea germinale dell’insetto. Le cellule polari si trovano vicino all’estremità posteriore degli embrioni di Culex 20. Oltre a iniettare embrioni, è imperativo sviluppare un piano attento per l’incrocio e lo screening della prole al fine di rilevare la mutazione desiderata.
Questo protocollo descrive come generare gRNA e complessarli con la proteina Cas9 per preparare miscele di iniezione, nonché come indurre le zanzare femmine di Culex pipiens a depostare le uova e come preparare e iniettare quelle uova per l’editing del genoma mediato da CRISPR / Cas9. Inoltre, descriviamo come allevare, incrociare e schermare gli embrioni iniettati e la loro progenie per confermare che la mutazione desiderata è stata ottenuta. Usando questo protocollo, abbiamo generato mutazioni nulle per un gene di interesse, ciclo,nel ceppo Buckeye di Culex pipiens. Questo ceppo è stato originariamente istituito nel 2013 da zanzare raccolte sul campo a Columbus, Ohio ed è mantenuto dal laboratorio Meuti. Questo protocollo può essere utilizzato per ulteriori studi che richiedono l’editing del genoma CRISPR / Cas9 nelle zanzare Culex, così come in altre specie di zanzare e, più in generale, è rilevante per l’impiego dell’editing del genoma CRISPR / Cas9 a qualsiasi specie di insetti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo presenta metodi per introdurre mutazioni specifiche nel genoma delle zanzare Culex e può essere utilizzato anche per modificare il genoma di altre zanzare. Il protocollo è significativo in quanto fornisce dettagli specifici non solo su come preparare i materiali di iniezione, ma anche una panoramica video dettagliata su come indurre le zanzare a dedurre le uova, nonché su come preparare e iniettare quelle uova. Riassumiamo anche come sfruttare la biologia della femmina Cx. pipiens p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. David O’Brochta e tutti i membri della Rete di ricerca di coordinamento delle tecnologie genetiche degli insetti per l’aiuto e la formazione che forniscono a noi e ad altri sull’implementazione delle tecnologie genetiche. Ringraziamo in particolare Channa Aluvihare per aver ottimizzato il protocollo di micromanipolazione per consentire l’iniezione e la schiusa degli embrioni Culex. Ringraziamo anche Devante Simmons e Joseph Urso, studenti universitari che lavorano nel laboratorio Meuti, per la loro assistenza nella cura e nello screening delle zanzare transgeniche, e Zora Elmkami dell’ITF per l’assistenza all’allevamento e la preparazione delle zanzare per l’iniezione. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione interdisciplinare Seeds dell’Istituto di malattie infettive dell’OSU fornita a MEM.
Materials
| Artificial Membrane Feeder | Hemotek | SP5W1-3 | Company location: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Company location: Carlsbad, CA, USA |
| Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | World Precision Instruments | 1B100-6 | Company Location: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Needle Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Whatman Circular filter paper (12.5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Conical tube (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Fisherbrand course filter paper with fast flow rate | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Cover glass (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Dental dam | Henry Schein Inc | 1010171 | Company Location: Melville, NY USA |
| Scotch double-sided tape | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| FemtoJet 4i microinjector | Eppendorf | 5252000021 | Company Location: Hamburg, Germany |
| Glass vial (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Halocarbon oil | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Needle Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| PC-100 Weighted Needle Puller | Narishige | PC-100 | This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | Company Location: Cornwall, UK |
| Guide-it™ sgRNA Screening Kit | Takara, Bio USA | 632639 | This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Small petri dishes (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Sodium citrate chicken blood | Lampire biologicals | 7201406 | Company Location: Everett, PA, USA |
| Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Company Location: Melville, NY USA |
| Tropical fish food | Tetramin | N/A | |
| Whatman filter paper | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Whatman filter paper, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
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