Preparación e inyección de embriones de mosquitos Culex para generar mutaciones nulas utilizando CRISPR/Cas9
Summary
CRISPR/Cas9 se utiliza cada vez más para caracterizar la función génica en organismos no modelo. Este protocolo describe cómo generar líneas eliminatorias de Culex pipiens,desde la preparación de mezclas de inyección, hasta la obtención e inyección de embriones de mosquitos, así como la forma de criar, cruzar y detectar mosquitos inyectados y su progenie para detectar mutaciones deseadas.
Abstract
Los mosquitos Culex son los principales vectores de varias enfermedades que afectan negativamente la salud humana y animal, incluido el virus del Nilo Occidental y las enfermedades causadas por nematodos filariales como el gusano del corazón canino y la elefantiasis. Recientemente, la edición del genoma CRISPR /Cas9 se ha utilizado para inducir mutaciones dirigidas al sitio mediante la inyección de una proteína Cas9 que ha sido complejada con un ARN guía (ARNg) en embriones recién puestos de varias especies de insectos, incluidos los mosquitos que pertenecen a los géneros Anopheles y Aedes. Manipular e inyectar mosquitos Culex es un poco más difícil ya que estos mosquitos ponen sus huevos en posición vertical en balsas en lugar de individualmente como otras especies de mosquitos. Aquí describimos cómo diseñar gRNAs, complejarlos con proteína Cas9, inducir a mosquitos hembra de Culex pipiens a poner huevos, y cómo preparar e inyectar embriones recién puestos para microinyección con Cas9/gRNA. También describimos cómo criar y detectar mosquitos inyectados para detectar la mutación deseada. Los resultados representativos demuestran que esta técnica se puede utilizar para inducir mutaciones dirigidas al sitio en el genoma de los mosquitos Culex y, con ligeras modificaciones, también se puede utilizar para generar mutantes nulos en otras especies de mosquitos.
Introduction
Los mosquitos Culex se distribuyen por las regiones templadas y tropicales del mundo y transmiten varios virus mortales, incluidos el virus del Nilo Occidental1,la encefalitis de San Luis2, así como los nematodos filariales que causan el gusano del corazón canino3 y la elefantiasis4. Los miembros del complejo Culex pipiens, que incluye Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens y Cx. pipiens molestus, muestran variaciones sorprendentes en muchos aspectos de su biología. Por ejemplo, mientras que Cx. quinquefasciatus y Cx. pipiens molestus son incapaces de entrar en una latencia invernante5,6, Cx. pipiens pipiens muestran respuestas estacionales robustas y entran en diapausa en respuesta a días cortos7,8. Además, Cx. pipiens molestus tienden a ser más antropófilos, mientras que Cx. pipiens y Cx. quinquefasciatus son más zoofílicos6. Sin embargo, en los Estados Unidos y en muchos otros lugares del mundo, estas especies se cruzan, lo que tiene fuertes implicaciones para la transmisión de enfermedades, ya que los híbridos de Cx. pipiens pipiens y Cx. pipiens molestus son alimentadores oportunistas y morderán tanto a aves como a humanos9,sirviendo así como vectores puente para el virus del Nilo Occidental. El estudio de estos y otros aspectos fascinantes de la biología de los mosquitos Culex se ha visto obstaculizado, en parte, porque los mosquitos Culex son un poco más difíciles de criar en el laboratorio que los mosquitos Aedes, que producen huevos inactivos y resistentes a la desecación10 y porque las herramientas moleculares funcionales no están tan bien desarrolladas para las especies de Culex.
La edición del genoma CRISPR/Cas9 es una poderosa tecnología que se ha utilizado para evaluar la biología de varias especies importantes de mosquitos11,12,13,incluido el mosquito doméstico del sur, Culex quinquefasciatus14,15,16. Esta tecnología, desarrollada por Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier, explota una defensa bacteriana natural contra los virus mediante endonucleasas asociadas a CRISPR derivadas de bacterias (proteínas Cas; ver revisión de Van der Oost et al.17). Cuando se inyectan en embriones animales, las proteínas Cas9 en combinación con un ARN guía apropiado pueden producir roturas de doble cadena dentro del genoma. Esto se hace con mayor frecuencia mediante el uso de la proteína Cas9 que se compleja con ARN guía, que dirige la actividad de la endonucleasa a una región específica del genoma. Después de que la proteína Cas9 ha creado una rotura de doble cadena específica del sitio, la maquinaria celular intenta reparar la ruptura utilizando uno de dos mecanismos. El primero implica ligar los dos extremos juntos a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ), que es propensa a errores y a menudo produce inserciones y deleciones fuera de marco en el genoma que pueden resultar en proteínas no funcionales, generando así una mutación knock-out. Alternativamente, la maquinaria celular podría usar la reparación dirigida por homología (HDR) encontrando secuencias similares para reparar correctamente la rotura. La secuencia similar puede ser proporcionada por el segundo cromosoma dentro del organismo (ver revisión18). Sin embargo, si la secuencia reparada coincide exactamente con la secuencia original, la proteína Cas9 podrá volver a cortar el ADN. Alternativamente, los investigadores también pueden incluir un plásmido donante que contenga secuencias homólogas a cada lado del sitio de corte de la secuencia objetivo con una secuencia de reparación alternativa, a menudo una proteína marcador fluorescente, una versión modificada del gen original u otra modificación, que se puede copiar e insertar en el genoma, o “knocked-in”.
El tiempo es crítico cuando se inyectan embriones, y este es especialmente el caso cuando se utiliza la edición del genoma CRISPR / Cas9 para crear mutaciones en insectos. Esto se debe a que la proteína Cas9 y los gRNAs tienen la mayor capacidad de generar mutaciones solo cuando el embrión está en su estado sincitial, antes de que se hayan formado las membranas celulares y cuando múltiples núcleos son accesibles dentro del embrión. Para los mosquitos, los núcleos alcanzan la periferia ~ 2-4 horas después de la oviposición, dependiendo de la temperatura19,y por lo tanto la microinyección exitosa debe ocurrir antes de este tiempo. Además, la proteína Cas9 cortará cualquier ADN nuclear al que pueda acceder, de modo que el individuo resultante de la inyección contendrá un mosaico de células, algunas con la mutación deseada y otras no. Para que estas mutaciones se hereden con éxito, la proteína Cas9 debe cortar el ADN que reside en la línea germinal que dará lugar a los futuros óvulos y espermatozoides. Para garantizar que se generen mutaciones en la línea germinal, es mejor inyectar todos los materiales cercanos a la ubicación de las células polares dentro del embrión, que son los progenitores de la línea germinal del insecto. Las células polares se encuentran cerca del extremo posterior de los embriones de Culex 20. Además de inyectar embriones, es imperativo desarrollar un plan cuidadoso para cruzar y examinar a la descendencia con el fin de detectar la mutación deseada.
Este protocolo describe cómo generar gRNAs y complejarlos con proteína Cas9 para preparar mezclas de inyección, así como cómo inducir a los mosquitos hembra de Culex pipiens a poner huevos y cómo preparar e inyectar esos huevos para la edición del genoma mediada por CRISPR / Cas9. Además, describimos cómo criar, cruzar y examinar embriones inyectados y su progenie para confirmar que se ha obtenido la mutación deseada. Utilizando este protocolo, generamos mutaciones nulas para un gen de interés, ciclo,en la cepa Buckeye de Culex pipiens. Esta cepa se estableció originalmente en 2013 a partir de mosquitos recolectados en el campo en Columbus, Ohio y es mantenida por el laboratorio Meuti. Este protocolo se puede utilizar para estudios adicionales que requieren la edición del genoma CRISPR / Cas9 en mosquitos Culex, así como otras especies de mosquitos, y, más en general, es relevante para emplear la edición del genoma CRISPR / Cas9 para cualquier especie de insecto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo presenta métodos para introducir mutaciones específicas en el genoma de los mosquitos Culex y también se puede utilizar para editar el genoma de otros mosquitos. El protocolo es significativo porque proporciona detalles específicos no solo de cómo preparar los materiales de inyección, sino también una descripción detallada en video de cómo inducir a los mosquitos a poner huevos, así como cómo preparar e inyectar esos huevos. También resumimos cómo aprovechar la biología de la hembra …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. David O’Brochta y a todos los miembros de la Red de Investigación de Coordinación de Tecnologías Genéticas de Insectos por la ayuda y capacitación que nos brindan a nosotros y a otros sobre la implementación de tecnologías genéticas. Agradecemos especialmente a Channa Aluvihare por optimizar el protocolo de micromanipulación para permitir que los embriones de Culex se inyecten y eclosionen. También agradecemos a Devante Simmons y Joseph Urso, estudiantes de pregrado que trabajan en el laboratorio Meuti, por su asistencia en el cuidado y la detección de mosquitos transgénicos, y a Zora Elmkami de la ITF por su ayuda en la cría y preparación de mosquitos para inyección. Este trabajo fue apoyado por una subvención de Semillas Interdisciplinarias del Instituto de Enfermedades Infecciosas de OSU proporcionada al MEM.
Materials
| Artificial Membrane Feeder | Hemotek | SP5W1-3 | Company location: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Company location: Carlsbad, CA, USA |
| Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | World Precision Instruments | 1B100-6 | Company Location: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Needle Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Whatman Circular filter paper (12.5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Conical tube (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Fisherbrand course filter paper with fast flow rate | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Cover glass (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Dental dam | Henry Schein Inc | 1010171 | Company Location: Melville, NY USA |
| Scotch double-sided tape | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| FemtoJet 4i microinjector | Eppendorf | 5252000021 | Company Location: Hamburg, Germany |
| Glass vial (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Halocarbon oil | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Needle Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| PC-100 Weighted Needle Puller | Narishige | PC-100 | This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | Company Location: Cornwall, UK |
| Guide-it™ sgRNA Screening Kit | Takara, Bio USA | 632639 | This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Small petri dishes (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Sodium citrate chicken blood | Lampire biologicals | 7201406 | Company Location: Everett, PA, USA |
| Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Company Location: Melville, NY USA |
| Tropical fish food | Tetramin | N/A | |
| Whatman filter paper | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Whatman filter paper, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
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