CRISPR/Cas9 se utiliza cada vez más para caracterizar la función génica en organismos no modelo. Este protocolo describe cómo generar líneas eliminatorias de Culex pipiens,desde la preparación de mezclas de inyección, hasta la obtención e inyección de embriones de mosquitos, así como la forma de criar, cruzar y detectar mosquitos inyectados y su progenie para detectar mutaciones deseadas.
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Artículo de método
Preparación e inyección de embriones de mosquitos Culex para generar mutaciones nulas utilizando CRISPR/Cas9
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Resumen
Resumen
Los mosquitos Culex son los principales vectores de varias enfermedades que afectan negativamente la salud humana y animal, incluido el virus del Nilo Occidental y las enfermedades causadas por nematodos filariales como el gusano del corazón canino y la elefantiasis. Recientemente, la edición del genoma CRISPR /Cas9 se ha utilizado para inducir mutaciones dirigidas al sitio mediante la inyección de una proteína Cas9 que ha sido complejada con un ARN guía (ARNg) en embriones recién puestos de varias especies de insectos, incluidos los mosquitos que pertenecen a los géneros Anopheles y Aedes. Manipular e inyectar mosquitos Culex es un poco más difícil ya que estos mosquitos ponen sus huevos en posición vertical en balsas en lugar de individualmente como otras especies de mosquitos. Aquí describimos cómo diseñar gRNAs, complejarlos con proteína Cas9, inducir a mosquitos hembra de Culex pipiens a poner huevos, y cómo preparar e inyectar embriones recién puestos para microinyección con Cas9/gRNA. También describimos cómo criar y detectar mosquitos inyectados para detectar la mutación deseada. Los resultados representativos demuestran que esta técnica se puede utilizar para inducir mutaciones dirigidas al sitio en el genoma de los mosquitos Culex y, con ligeras modificaciones, también se puede utilizar para generar mutantes nulos en otras especies de mosquitos.
Introducción
Los mosquitos Culex se distribuyen por las regiones templadas y tropicales del mundo y transmiten varios virus mortales, incluidos el virus del Nilo Occidental1,la encefalitis de San Luis2, así como los nematodos filariales que causan el gusano del corazón canino3 y la elefantiasis4. Los miembros del complejo Culex pipiens, que incluye Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens y Cx. pipiens molestus, muestran variaciones sorprendentes en muchos aspectos de su biología. Por ejemplo, mientras que Cx. quinquefasciatus <....
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Protocolo
En la mayoría de las instituciones de investigación, debe estar en vigor un Protocolo de Bioseguridad aprobado antes de que se generen o mantengan insectos transgénicos para garantizar que los organismos genéticamente modificados no escapen o sean retirados de las instalaciones del laboratorio. También podrían aplicarse regulaciones gubernamentales adicionales. Antes de comenzar un proyecto de esta naturaleza, verifique todas las políticas y procedimientos institucionales para determinar qué documentos y aprobaciones se requieren.
1. Diseño de gRNAs y preparación de mezclas inyectables
- Diseñe 2-5 gRNAs para cada g....
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Resultados
Utilizando el protocolo descrito, pudimos inyectar con éxito embriones de Cx. pipiens,y observamos una alta tasa de supervivencia entre los embriones inyectados (~55%, Figura 1). Los ensayos anteriores tuvieron un porcentaje más bajo de supervivencia, probablemente porque la parte anterior del folículo del óvulo estaba unida a la tira de apósito médico, evitando que las larvas de mosquitos escaparan del corion y nadaran con éxito en el agua. Asegurar que el extremo anterior se extie.......
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Discusión
Este protocolo presenta métodos para introducir mutaciones específicas en el genoma de los mosquitos Culex y también se puede utilizar para editar el genoma de otros mosquitos. El protocolo es significativo porque proporciona detalles específicos no solo de cómo preparar los materiales de inyección, sino también una descripción detallada en video de cómo inducir a los mosquitos a poner huevos, así como cómo preparar e inyectar esos huevos. También resumimos cómo aprovechar la biología de la hembra Cx. pipien.......
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Divulgaciones
RH trabaja para la Instalación de Transformación de Insectos, que brinda servicios de modificación genética de insectos.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. David O'Brochta y a todos los miembros de la Red de Investigación de Coordinación de Tecnologías Genéticas de Insectos por la ayuda y capacitación que nos brindan a nosotros y a otros sobre la implementación de tecnologías genéticas. Agradecemos especialmente a Channa Aluvihare por optimizar el protocolo de micromanipulación para permitir que los embriones de Culex se inyecten y eclosionen. También agradecemos a Devante Simmons y Joseph Urso, estudiantes de pregrado que trabajan en el laboratorio Meuti, por su asistencia en el cuidado y la detección de mosquitos transgénicos, y a Zora Elmkami de la ITF por su ayuda en la cría y preparación ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alimentador de membrana artificial | Hemotek | SP5W1-3 Ubicación de la | empresa: Blackburn, Reino Unido |
| ATP | Invitrogen 18330019 | Ubicación de la empresa: Carlsbad, CA, EE. UU | |
| Tubos mirocapilares de vidrio de borosilicato, diámetro exterior de 1 mm | World Precision Instruments | 1B100-6 | Ubicación de la empresa: Sarasota, FL, EE. UU |
| Bv10 Biseladora de aguja Sutter | Instruments | BV-10-B | Ubicación de la empresa: Nobato, CA, EE. UU |
| Papel de filtro circular Whatman (12,5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Ubicación de la empresa: St. Louis, MO, EE. UU |
| Tubo cónico (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Ubicación de la empresa: Waltham, MA, EE. UU. |
| Papel de filtro del curso Fisherbrand con caudal rápido | Thermo Fisher Scientific | 09-800 Ubicación de | la empresa: Waltham, MA, EE. UU. |
| Cubreobjetos (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 Ubicación de la | empresa: Waltham, MA, EE. UU. |
| Protector dental | Henry Schein Inc | 1010171 | empresa Ubicación: Melville, NY, EE. UU. |
| Cinta adhesiva escocesa de doble cara | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Company Ubicación: Waltham, MA, EE. UU. |
| Microinyector FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | Ubicación de la empresa: Hamburgo, Alemania |
| Frasco de vidrio (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Ubicación de la empresa: Waltham, MA, EE. UU. |
| Aceite de halocarbono | Sigma Aldrich | H8898-50ML Ubicación de | la empresa: St. Louis, MO, EE. UU. |
| P-2000 Tirador de aguja láser | Sutter Instruments | P-2000/G | Ubicación de la empresa: Nobato, CA, EE. UU |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Ubicación de la empresa: Waltham, MA, EE. UU |
| Tirador de aguja ponderado PC-100 | Narishige | PC-100 | Esto es compatible con el modelo PC-10 anterior, que ha sido descontinuado. Ubicación de la empresa: Amityville, NY, EE. UU. |
| Kit de PCR directo Phire | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Ubicación de la empresa: Waltham, MA, EE. UU |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 Ubicación de | la empresa: Waltham, MA, EE. UU. |
| Tubos mirocapilares de vidrio de cuarzo, diámetro exterior de 1 mm | Suministros de tubos capilares limitados | QGCT 1.0 | Ubicación de la empresa: Cornualles, Reino Unido |
| Guía-it&comercio; Kit de detección de sgRNA Takara | , Bio USA | 632639 | Este kit le permite determinar si los ARNg cortan las secuencias de ADN in vitro. Ubicación de la empresa: Mountain View, CA, EE. UU |
| Sigmacote Sigma | Aldrich | SL2-100ML | Ubicación de la empresa: St. Louis, MO, EE. UU |
| Placas de Petri pequeñas (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 Ubicación de | la empresa: Waltham, MA, EE. UU |
| Sangre de pollo con citrato de sodio | Lampire biológicos | 7201406 | Ubicación de la empresa: Everett, PA, EE. UU |
| Plato de Petri cuadrado Fisherbrand (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific FB0875711A | Company Ubicación: Waltham, MA, EE. UU | |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Ubicación de la empresa: Melville, NY, EE. UU. |
| Alimento para peces tropicales | Tetramin | N/A | |
| Papel de filtro Whatman | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 Ubicación de | la empresa: Waltham, MA, EE. UU |
| Papel de filtro Whatman, 4,25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 Ubicación de la | empresa: St. Louis, MO, EE. UU. |
Referencias
- Hamer, G. L., et al. Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).
- Bailey, C. L., et al. Isolation of St. Louis encephaliti....
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Reimpresiones y permisos
