Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إعداد وحقن أجنة البعوض Culex لتوليد الطفرات فارغة باستخدام CRISPR / Cas9

Published: September 10, 2020 doi: 10.3791/61651
Automatic Translation
1, 2
1Department of Entomology, The Ohio State University, 2Insect Transformation Facility, Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

Summary

يستخدم CRISPR/Cas9 بشكل متزايد لتوصيف وظيفة الجينات في الكائنات غير النموذجية. يصف هذا البروتوكول كيفية توليد خطوط خروج المغلوب من Culex pipiens، من إعداد خلطات الحقن ، إلى الحصول على أجنة البعوض وحقنها ، وكذلك كيفية تربية البعوض المحقون وعبوره وفحصه وذريه للطفرات المطلوبة.

Abstract

البعوض Culex هي النواقل الرئيسية للعديد من الأمراض التي تؤثر سلبا على صحة الإنسان والحيوان بما في ذلك فيروس غرب النيل والأمراض الناجمة عن الديدان الخيطية مثل دودة القلب الناب وداء الفيلة. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام تحرير الجينوم CRISPR /Cas9 للحث على الطفرات الموجهة إلى الموقع عن طريق حقن بروتين Cas9 الذي تم تعقيده مع الحمض النووي الريبي (gRNA) في الأجنة الطازجة من عدة أنواع من الحشرات ، بما في ذلك البعوض الذي ينتمي إلى جنس Anopheles و Aedes. إن التلاعب بعوض Culex وحقنه أكثر صعوبة قليلا لأن هذه البعوض تضع بيضها منتصبا في الطوافات بدلا من وضعها بشكل فردي مثل الأنواع الأخرى من البعوض. هنا نصف كيفية تصميم الحمض النووي الريبي ، وتعقيدها مع بروتين Cas9 ، وحمل البعوض الأنثوي من Culex pipiens على وضع البيض ، وكيفية إعداد وحقن الأجنة الموضوعة حديثا للتشخيص الدقيق مع Cas9 / gRNA. كما نقوم بوصف كيفية إعادة فحص البعوض المحقون وفحصه للكشف عن الطفرة المرغوبة. وتبين النتائج التمثيلية أن هذه التقنية يمكن استخدامها للحث على حدوث طفرات موجهة نحو الموقع في جينوم بعوض كوليكس، ويمكن استخدامها، مع تعديلات طفيفة، لتوليد طفرات فارغة في أنواع البعوض الأخرى أيضا.

Introduction

يتم توزيع البعوض Culex في جميع أنحاء المناطق المعتدلة والاستوائية في العالم وينقل العديد من الفيروسات القاتلة بما في ذلك فيروس غرب النيل1، التهاب الدماغ سانت لويس2 وكذلك الديدان الخيطية التي تسبب دودة القلب ال3 وداءالفيلة 4. أعضاء مجمع Culex pipiens ، الذي يتضمن Cx. quinquefasciatus، Cx. pipiens pipiens و Cx. pipiens molestus، يظهرون اختلافات مذهلة في العديد من جوانب بيولوجيتهم. على سبيل المثال، في حين Cx. quinquefasciatus وCx. pipiens molestus غير قادرين على دخول نائمة overwintering5،6، Cx. pipiens pipiens عرض استجابات موسمية قوية وأدخل diapause ردا على أيام قصيرة7،8. بالإضافة إلى ذلك ، Cx. pipiens molestus تميل إلى أن تكون أكثر أنثروبوفيليا في حين Cx. pipiens و Cx. quinquefasciatus هي أكثرzoophilic 6. ومع ذلك ، في الولايات المتحدة وفي جميع أنحاء العديد من الأماكن الأخرى في العالم ، تهجين هذه الأنواع ، مما له آثار قوية على انتقال المرض كهجينات من Cx. pipiens pipiens و Cx. pipiens molestus هي مغذيات انتهازية وستعض كل من الطيور والبشر9، وبالتالي تعمل كناقلات جسر لفيروس غرب النيل. وقد تعرقلت دراسة هذه الجوانب وغيرها من الجوانب الرائعة لبيولوجيا البعوض Culex ، ويرجع ذلك جزئيا ، لأن البعوض Culex هي أكثر صعوبة قليلا لتربية في المختبر من البعوض الزاعجة ، والتي تنتج البيض هادئة ومقاومة للجفاف10 ولأن الأدوات الجزيئية الوظيفية ليست متطورة بشكل جيد لأنواع Culex.

CRISPR/Cas9 تحرير الجينوم هو التكنولوجيا القوية التي تم استخدامها لتقييم بيولوجيا العديد من أنواع البعوض الهامة11،12،13، بما في ذلك البعوض البيت الجنوبي ، Culex quinquefasciatus14،15،16. هذه التكنولوجيا، التي وضعتها جنيفر دودنا وإيمانويل شاربنتييه، يستغل الدفاع البكتيري الطبيعي ضد الفيروسات عن طريق المشتقة من البكتيريا، وEDONUCLEASES كريسبر المرتبطة (بروتينات كاس؛ انظر الاستعراض من قبل فان دير أوستوآخرون. 17). عند حقنها في الأجنة الحيوانية، يمكن للبروتينات Cas9 بالاشتراك مع الحمض النووي الريبي دليل مناسب تنتج فواصل مزدوجة تقطعت بهم السبل داخل الجينوم. ويتم ذلك في أغلب الأحيان باستخدام بروتين Cas9 المعقد مع الرناس الإرشادي ، الذي يوجه نشاط الإندونوكليا إلى منطقة محددة من الجينوم. بعد أن خلق البروتين Cas9 كسر مزدوجة تقطعت بهم السبل موقع محدد، والآلات الخلوية محاولات لإصلاح كسر باستخدام واحدة من آليتين. الأول ينطوي على ربط الطرفين معا من خلال الانضمام إلى نهاية غير متجانسة (NHEJ) ، وهو عرضة للخطأ وغالبا ما تنتج عمليات الإدراج والحذف خارج الإطار في الجينوم التي يمكن أن تؤدي إلى بروتينات غير وظيفية ، وبالتالي توليد طفرة خروج المغلوب. بدلا من ذلك، قد تستخدم الآلات الخلوية إصلاح موجهة بالأوهام (HDR) عن طريق العثور على تسلسل مماثل لإصلاح الفاصل بشكل صحيح. ويمكن توفير تسلسل مماثل من الكروموسوم الثاني داخل الكائن الحي (انظر الاستعراض18). ومع ذلك ، إذا كان التسلسل الذي تم إصلاحه يطابق التسلسل الأصلي تماما ، فسيتمكن بروتين Cas9 من قطع الحمض النووي مرة أخرى. وبدلا من ذلك، يمكن للباحثين أيضا تضمين بلازميد متبرع يحتوي على تسلسلات متجانسة على جانبي موقع القطع للتسلسل المستهدف مع تسلسل إصلاح بديل - غالبا ما يكون بروتين علامة فلورية، أو نسخة معدلة من الجين الأصلي، أو أي تعديل آخر - يمكن نسخه وإدخاله في الجينوم، أو "طرقه".

التوقيت أمر بالغ الأهمية عند حقن الأجنة ، وهذا هو الحال بشكل خاص عند استخدام تحرير الجينوم CRISPR / Cas9 لإنشاء طفرات في الحشرات. وذلك لأن بروتين Cas9 وgRNAs لديهما القدرة الأكبر على توليد الطفرات فقط عندما يكون الجنين في حالته المتزامنة ، قبل أن تتشكل الأغشية الخلوية وعندما يمكن الوصول إلى نواة متعددة داخل الجنين. للبعوض ، تصل النوى إلى المحيط بعد ~ 2-4 ساعات من التكاثر ، اعتمادا على درجة الحرارة19، وبالتالي يجب أن يحدث تحري دقيق ناجح قبل هذا الوقت. بالإضافة إلى ذلك، فإن البروتين Cas9 قطع أي الحمض النووي التي يمكن الوصول إليها، بحيث الفرد الناتج عن الحقن سوف تحتوي على فسيفساء من الخلايا، وبعضها لديه الطفرة المطلوبة، والبعض الآخر لا. من أجل أن تكون هذه الطفرات موروثة بنجاح، يجب على بروتين Cas9 قطع الحمض النووي الذي يوجد في الجرثومة التي من شأنها أن تؤدي إلى البويضات والحيوانات المنوية في المستقبل. لضمان أن يتم إنشاء الطفرات في الجرثومة فمن الأفضل لحقن جميع المواد القريبة من موقع خلايا القطب داخل الجنين ، والتي هي السلف من الجرثومة الحشرية. وتقع خلايا القطب بالقرب من النهاية الخلفية للأجنة Culex 20. بالإضافة إلى حقن الأجنة، من الضروري وضع خطة دقيقة لعبور وفحص النسل من أجل الكشف عن الطفرة المرجوة.

يصف هذا البروتوكول كيفية توليد gRNAs وتعقيدها مع بروتين Cas9 لإعداد خلطات الحقن ، وكذلك كيفية حث البعوض الأنثوي من Culex pipiens على وضع البيض وكيفية إعداد وحقن تلك البيض لتحرير الجينوم بوساطة CRISPR/Cas9. بالإضافة إلى ذلك، نقوم بوصف كيفية تربية الأجنة المحقونة وذرية الصليب وفحصها لتأكيد أنه تم الحصول على الطفرة المطلوبة. باستخدام هذا البروتوكول، قمنا بتوليد الطفرات فارغة لجين من الاهتمام، دورة،في سلالة باكاي من Culex pipiens. تأسست هذه السلالة في الأصل في عام 2013 من البعوض الذي تم جمعه ميدانيا في كولومبوس، أوهايو، ويحتفظ بها مختبر ميوتي. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء دراسات إضافية تتطلب تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 في بعوض Culex ، وكذلك أنواع البعوض الأخرى ، وبشكل أعم ، وثيق الصلة بتوظيف تحرير الجينوم CRISPR /Cas9 لأي نوع من أنواع الحشرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وفي معظم مؤسسات البحوث، يجب وضع بروتوكول معتمد للسلامة الأحيائية قبل توليد الحشرات المعدلة وراثيا أو صيانتها لضمان عدم هروب الكائنات المحورة وراثيا أو إزالتها من مرفق المختبر. وقد تطبق أيضا لوائح حكومية إضافية. قبل البدء في مشروع من هذا النوع، تحقق من جميع السياسات والإجراءات المؤسسية لتحديد الوثائق والموافقات المطلوبة.

1. تصميم gRNAs وإعداد يمزج الحقن

  1. تصميم 2-5 gRNAs لكل جين مستهدف حيث تعمل بعض gRNAs بشكل أفضل من غيرها. يمكن استخدام gRNAs التي تستهدف جين الاهتمام إما يدويا أو برامج مجانية ، مثل Chop-Chop.
  2. تصميم وطلب التمهيديات التي من شأنها تضخيم شظايا 100-200 نقطة أساس حول كل gRNA. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون موقع القطع موجودا تقريبا في الثلث الأوسط إلى النصف من منتج PCR. لاحظ كم نقطة أساس على كل موقع من مواقع القطع سيتم إنتاجها.
  3. الحصول على gRNAs.
    1. شراء gRNAs من الشركات التجارية مثل تقنيات الحمض النووي المتكاملة، فيشر العلمية، Genescript وغيرها. هذا هو الخيار الأسهل.
    2. بدلا من ذلك، إنشاء gRNAs في المختبر باستخدام تضخيم PCR لإنشاء قوالب توليف isothermal اللاحقة. انظر البروتوكول الذي وصفه بورت وآخرون21 وكيستلر وآخرون22.
    3. توفير gRNAs عن طريق البلازميد الذي يتم حقنه في الأجنة. في هذه الحالة، يجب أن يكون الدافع وراء gRNA من قبل الترويجي U6 (انظر 23،24 للحصول على تفاصيل).
  4. الحصول على البروتين Cas9.
    1. طلب Cas9 تجاريا من عدة شركات بما في ذلك فيشر العلمية. هذا هو الخيار الأسهل.
    2. جعل Cas9 البروتين وتنقية في المختبر وفقا لباسو وآخرون.25 وكيستلروآخرون.
    3. حقن Cas9 ميرنا في الأجنة، حيث سيتم ترجمتها في وقت لاحق إلى بروتين Cas9 النشطة. يمكن تصنيع Cas9 mRNA إما في المختبر باستخدام النسخ في المختبر22 أو شراؤها من بائعين مثل Sigma.
      ملاحظة: يجب أن يحتوي بروتين Cas9 المترجم على إشارة توطين نووية (NLS) على C-terminus ، وبالتالي يجب أن تكون NLS موجودة أيضا في Cas9 mRNA المحقون.
    4. التعبير عن البروتين Cas9 في الجسم الحي من خلال التعبير القائم على البلازميد. في هذه الحالة ، من الأفضل أن يكون التعبير عن Cas9 على البلازميد مدفوعا بمروج جنيني تم تميزه بشكل جيد في الأنواع المستهدفة.
      ملاحظة: حتى الآن ، لم يكن المروجون الجنينيين مميزين بشكل جيد في بعوض Culex ، وبالتالي يوصى بحقن البروتين النقي أو Cas9 mRNA.
  5. مجمع gRNAs مع البروتين Cas9، مقتبس من كيستلروآخرون.
    1. إذا حقن بروتين Cas9 مع gRNA معا (مستحسن)، تأكد من أن التركيزات النهائية للبروتين Cas9 هو 300 نانوغرام / ميكرولتر والتركيز النهائي من الحمض النووي الريبي واحد هو 80 ميكروغرام / ميكرولتر.
    2. حضانة لمدة 20 دقيقة على الجليد.
  6. اختبار gRNAs مع المقايسة في المختبر (على سبيل المثال، دليل-it sgRNA فحص كيت).
    1. تضخيم شظايا حول موقع قطع لكل gRNA باستخدام PCR.
    2. تشغيل منتجات PCR على هلام للتأكد من أنها هي الحجم الصحيح. ثم قم بتنقية منتجات PCR وتسلسلها لضمان أنها تستهدف منطقة الجينات الصحيحة.
    3. مزيج 200 نانوغرام من بقايا المنتج PCR المنقى مع 1 ميكرولتر من العازلة رد فعل Cas9، 1 ميكرولتر من BSA، 1.5 ميكرولتر من Cas9:gRNA المعقدة وبذلك إجمالي حجم التفاعل إلى 15 ميكرولتر. احتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.
    4. تشغيل المنتج على هلام مرة أخرى. إذا نجح بروتين Cas9 في قطع منتج PCR ، فيجب أن يبدو النطاق الأساسي أكثر إغماءا ويجب أن تكون العصابات الأصغر إضافية موجودة. لاحظ انخفاض حجم المنتج الأصلي PCR، وإذا رغبت في ذلك، حساب الانخفاض في كثافة النطاق لتقريب كفاءة القطع.
  7. إعداد مزيج الحقن النهائي
    1. لكل gRNA التي نجحت في خفض المنتج المستهدف PCR، مزيج كميات من كل Cas9 وgRNA في أنبوب 0.5 مل بحيث يبقى الحجم النهائي 300 نانوغرام / ميكرولتر من بروتين Cas9 و 80 نانوغرام / ميكرولتر من كل gRNA.
    2. تخزين Cas9 معقدة وgRNAs في -80 درجة مئوية حتى تكون هناك حاجة للحقن.

2. سحب و شطب الإبر

ملاحظة: الحقن الناجحة وبقاء الأجنة يتطلب إبر حادة (الشكل 1).

  1. استخدام إما 1 مم القطر الخارجي borosilicate أو الكوارتز الزجاج microcapillaries. سيليكون الكبسولات الدقيقة في غطاء الدخان الكيميائي قبل أن يتم سحبها.
    1. باختصار، ضع 3 مل من Sigmacote في كوب زجاجي وفراغ رسم في كوب الثاني الذي يحتوي على microcapillaries الزجاج لمدة 4 ساعة على الأقل، مما يسمح للحل السيليكون لتبخير والاستقرار على جميع أسطح microcapillaries.
    2. بعد ذلك، تسمح ببطء غرفة فراغ لتحقيق التعادل مع الضغط المحيط عن طريق فتح صمام stopcock تدريجيا والسماح للهواء للعودة إلى الغرفة. الإبر ثم على استعداد لسحبها.
    3. اقرأ دائما دليل التعليمات الخاص بشد الإبر قبل الاستخدام.
      ملاحظة: الإرشادات أدناه بالتفصيل كيفية استخدام P-2000 ليزر إبرة بولر لسحب الإبر الزجاجية. من المهم ملاحظة أن جميع سحب الإبر حتى من نفس العلامة التجارية لا يتم معايرة لسحب بالضبط نفس الإبرة عبر وحدات مختلفة. المفتاح للحصول على الإبر جيدة هو أن تبدأ في مجموعة معينة من المعلمات ثم سحب الإبر باستخدام المعلمات التي هي فوق وتحت هذه القيم. اختبار الإبر في كل من هذه المعلمات عن طريق تقييم مدى الإبرة يخترق الأجنة ومدى تدفق مزيج الحقن من الإبرة. صقل المعلمات حتى يتم الحصول على إبرة التي من السهل فتح أو شطبة، التي تخترق الأجنة بسلاسة، وأنه يسلم مزيج الحقن بسهولة.
  2. سحب الإبر باستخدام P-2000 ليزر إبرة سحب
    1. قم بتشغيل جهاز سحب إبرة الليزر واترك الليزر يسخن لمدة 15 دقيقة قبل السحب الأول.
    2. برمجة الجهاز لنوع من الزجاج أنبوب الشعيرات الدموية الدقيقة (تذكر أي معلمات سحب إبرة هي نقطة انطلاق منذ لم يتم معايرة سحب إبرة لإنتاج نفس الإبرة عبر جميع سحب):
      كوارتز: حرارة = 730; = 4; = 40؛ ديل = 122؛ نبض = 156
    3. بعد برمجة سحب الإبرة ، قم بتحميل رأسمالي صغير ومشبكه في مكانه ، مع الحرص على لمس نهاية الأنبوب الصغير فقط وليس المنطقة التي سيتم تسخينها بالليزر.
    4. بعد لقط الشعيرات الدموية الصغيرة، ضع الإبهام والسبابة على قضبان الإصبع ثم أطلق قضبان السحب عن طريق الضغط على إصدارات الربيع واحدة في كل مرة.
    5. ضغط الإبهام والسبابة لسحب القضبان معا تماما.
    6. وضع الجانب الآخر من الأنبوب الصغير في المشبك بحيث جزء صغير من الأنبوب يمتد من كلا الجانبين. تشديد المشابك التأكد من أن كلا المشابك هي إصبع ضيق وأنها تحمل "سحب القضبان" بحزم في مكان.
    7. أغلق الكفن الواقي على المسحب.
    8. اضغط على زر السحب وسيبدأ الليزر في تسخين الزجاج، ويشار إلى ذلك بضوء "الليزر على" الأحمر الموجود تحت الكفن. يتم الانتهاء من سحب عندما يتم فصل تماما أشرطة سحب، يرافقه هزة معدنية.
    9. تأكد من عدم إضاءة ضوء "الليزر على" قبل رفع الكفن.
    10. عقد نهاية صغيرة من الأنبوب الصغير الذي يمتد إلى ما وراء المشبك مع الإبهام والسبابة وتخفيف المشبك. ثم ارفع الأنبوب الصغير من المشبك.
    11. استخدام ملقط لوضع بعناية أنبوب صغير في طبق بيتري مربع اصطف مع الشريط على الوجهين. تأكد عند وضع الإبرة في صندوق الاحتفاظ من أن الطرف الخلفي من الإبرة يلمس أولا ويتم خفض الإبرة بلطف في مكانها بحيث لا تتلف طرف حاد.
  3. سحب الإبر باستخدام جهاز الكمبيوتر-10/PC-100 إبرة سحب
    1. إعداد جهاز سحب PC-10 باستخدام 4 الأوزان وتعيين درجة الحرارة ل50.4 درجة مئوية لسحب خطوة واحدة.
    2. وضع الزجاج البوروسيليكات الميكروبيلي في المشبك العلوي. ثم رفع المشبك السفلي المرجح في الموقف والمشبك الجزء السفلي من الشعيرات الدموية الصغيرة، والتأكد من أن الشعيرات الدموية في وضع يمكنها من سحب اثنين من الإبر جيدة. هذا هو دورة سحب طويلة نوعا ما، لكنه ينتج الإبر جيدة لل شطب.
  4. إبر مشطوفة.
    ملاحظة: هذه الطريقة من شطب الرطب يعطي ردود الفعل في الوقت الحقيقي على حجم فتح النسبية من الإبرة.
    1. تجميع لوحة جلخ والاحتفاظ حلقة من مشطوف إبرة. تأكد من توجيه الجانب الرمادي من اللوحة الكاشطة إلى الأعلى بين حلقة الاحتفاظ العلوية والسفلية. تشديد مسامير على حلقة الاحتفاظ، بالتناوب من المسمار إلى المسمار لضمان أن يتم تشديد كل المسمار بالتساوي. لوحة جلخ والاحتفاظ حلقات سوف يشار إليها فيما بعد باسم التجميع طحن.
    2. ضع 13 قطرة (~ 520 ميكرولتر) من زيت السند على السطح المسطح البصري ، ثم ضع تجميع الطحن فوق اللوحة. ضع التجميع تحت مجهر تشريح، ثم قم بتشغيل المجسم. يتم استخدام القليل من الزيت الإضافي مقارنة بتوصية سوتر ، لأن هذا يحافظ على دوران اللوحة الكاشطة لفترة أطول عند استخدامها بالتزامن مع طريقة ال شطب الرطب هذه.
    3. أضف 1٪ من محلول Photo-Flo إلى سطح الطحن ونقل الفتيل إلى موضعه بحيث يتم غمره في محلول Photo-Flo.
    4. تشغيل الهواء في المصدر الرئيسي. ثم ضع إبرة بوروسيليكاتي سحبت في حامل وتشديد حلقة الاحتفاظ. تشغيل الهواء في المنظم وزيادة حتى يصل الضغط إلى 26 PSI.
    5. يراقب من الجانب، وانخفاض الإبرة باستخدام مقبض التكيف الخشنة حتى يمس تقريبا سطح السائل الصورة فلو.
    6. ضبط المجهر لتحديد موقع الإبرة في مجال الرؤية. تبدأ في أدنى التكبير وزيادة التكبير. ضبط بعناية موقف الإبرة باستخدام مقبض التكيف الخشنة حتى يمس فقط سطح السائل الصورة فلو.
    7. باستخدام مقبض التكيف الخشن والاستمرار في النظر تحت المجهر ، خفض الإبرة حتى تكون قريبة من السطح الكاشط ولكن لا تلمسه.
    8. باستخدام مقبض التكيف الدقيق، بعناية وببطء خفض الإبرة، مع إيلاء اهتمام وثيق الإبرة والظل الذي يترك على سطح جلخ من مشطوف. عندما الإبرة وظلها تبدو وكأنها على وشك لمس سطح جلخ، والاستمرار في خفض الإبرة ببطء وبعناية أكبر.
    9. بالتناوب بين السماح الإبرة "شطبة" عن طريق خفضه على السطح جلخ، ومن ثم رفعه. قبل رفع الإبرة، لاحظ بسرعة الإعداد على ميكرومتر على مقبض التكيف غرامة بحيث يمكن خفض الإبرة إلى نفس الموقف أو، إذا لزم الأمر، إلى موقف أقل قليلا. تذكر أن تبقي الإبرة تحت طبقة السائل الصورة فلو. مرة واحدة وقد أثيرت الإبرة فوق سطح جلخ، ووقف بسرعة وإعادة تشغيل دوران مشطوف للتحقق من وجود فقاعات. إذا كانت الإبرة قد شطبت بشكل كاف، يجب أن تتدفق فقاعات الهواء من الإبرة إلى Photo-Flo. إذا لم يتم إيقاف اللوحة، فمن المرجح أن الفقاعات لن تصبح مرئية حتى يكون فتحة الإبرة كبيرة جدا.
    10. إذا لم تظهر فقاعات عندما يتم رفع الإبرة فوق سطح جلخ وتوقف مشطوف، كرر الإجراء شطب، وخفض الإبرة إلى موقف أقل قليلا على ميكرومتر تقع على مقبض التكيف غرامة، ورفع الإبرة، ووقف لوحة مشطوف والتحقق من وجود فقاعات الهواء. كرر حتى يظهر تيار صغير ولكن ثابت من الفقاعات.
    11. بمجرد وجود فقاعات الهواء ، تحقق من حجم الفتح النسبي عن طريق إيقاف اللوحة الكاشطة وخفض ضغط الهواء ، مع الإشارة إلى PSI التي يتوقف عندها تشكيل الفقاعة ، لأن هذا مؤشر نسبي على حجم فتح الإبر المفلحة. كلما انخفض الضغط الذي يتوقف فيه الهواء عن الهروب من طرف الإبرة ، كلما كان فتح الإبرة أكبر. الإبر مشطوف إلى النقطة التي فقاعات التوقف عن الهروب من الإبرة في 18-20 PSI يشير إلى أن الإبرة لديها فتحة صغيرة نسبيا، وينبغي أن يسبب الحد الأدنى من الضرر للجنين عند استخدامها للتشخيص الدقيق.
    12. بعد فحص فتحة الإبرة، قم بزيادة ضغط الهواء إلى 26 PSI لمنع السائل من دخول الإبرة. ثم رفع الإبرة صعودا والخروج من طبقة الصور فلو باستخدام مقبض التكيف الخشنة. من المهم ملاحظة أنه طالما أن الهواء يتدفق من الإبرة ، فإن Photo-Flo لا يدخل الإبرة ، وبالتالي فإن داخل الإبرة محمي من التلوث.
    13. بمجرد أن تخرج الإبرة من Photo-Flo، قم بإيقاف تشغيل الهواء وإزالة الإبرة من حامل الإبرة.
    14. باستخدام ملقط، ضع الإبرة مشطوف حديثا في طبق بيتري التي لديها إما الشريط على الوجهين أو الطين النمذجة للحفاظ عليه في مكانه. كرر العملية حتى يتم إنتاج 10-20 إبرة مشطوفة.

3. تغذية الدم جيل الوالدين من البعوض

  1. اليرقات الخلفية للبعوض Cx. pipiens في ظل ظروف يوم طويل لا لبس فيها (>13 ساعة من الضوء / اليوم) في 25-27 درجة مئوية لضمان عدم دخول البعوض في سبات أو diapause.
  2. بعد سبعة إلى عشرة أيام من ذروة ظهور الكبار، قم بإعداد نظام تغذية غشاء Hemotek عن طريق توصيل وحدات التدفئة بمصدر الطاقة. ضبط درجة حرارة كل وحدة إلى 37 درجة مئوية (درجة حرارة الجسم الداخلية للإنسان) أو 41 درجة مئوية (درجة حرارة الجسم الداخلية الدجاج) باستخدام المسمار التكيف على الجزء العلوي من الوحدة. تأكد من أن درجة الحرارة الصحيحة قد تم الوصول إليها باستخدام ميزان الحرارة الكهربائي.
  3. إعداد خزان وجبات الدم للتغذية.
    1. قطع مربع واحد من البارافيلم لكل اسطوانة تغذية الدم، وفرك البارافيلم ضد القدمين العارية. وهذا يوفر الروائح التي هي جذابة للبعوض.
    2. تمتد البارافيلم رقيقة قدر الإمكان، والتفاف حواف بإحكام حول خزان وجبة. إذا رغبت في ذلك، آمنة في مكان مع المطاط O-حلقة.
    3. إضافة ما يقرب من 200 ميكرولتر من محلول ATP 0.1 M إلى 15 مل من دم الدجاج الطازج أو المذاب الكامل المعالج بالسيترات الصوديوم. يساعد ATP على تحفيز تغذية الدم، ويمنع سترات الصوديوم الدم من التخثر.
    4. عقد الخزان بحيث الجانب parafilm تواجه أسفل، واستخدام بعناية ماصة المتاح لملء الخزان. كل خزان يحمل ~ 3 مل من الدم. ختم منافذ التعبئة مع المقابس البلاستيكية.
    5. المسمار خزانات وجبة في وحدات التدفئة ووضعها على رأس قفص البعوض بحيث الجانب parafilm تواجه أسفل والبعوض يمكن أن تتغذى من خلال شبكة.
  4. تغطية الأقفاص مع أكياس القمامة السوداء لمحاكاة الغسق وضربة بقوة في كل قفص كمازيادة تركيز ثاني أكسيد الكربون يحفز تغذية الدم.
  5. حافظ على وحدة التغذية على القفص لمدة 2-8 ساعة لزيادة تغذية الدم. تحقق بشكل دوري ولاحظ نسبة الإناث التي تناولت وجبة دم (واضحة من بطنها الحمراء والمنتفخة).

4. حث البيض زرع في البعوض الكبار

  1. بعد أربعة إلى خمسة أيام من تغذية الدم، قم بإعداد أنبوب مخروطي سعة 50 مل لوضع البعوض.
    1. إنشاء ثقب ~ 20 ملم بالقرب من الجزء السفلي من أنبوب مخروطي.
    2. تغطية الحفرة مع اثنين من المربعات (35 ملم2)من المطاط سد الأسنان، واحدة مع شق أفقي وآخر مع شق عمودي. استخدام الشريط لإرفاق مربعات سد الأسنان إلى أنبوب مخروطي.
    3. ضع قطعة من ورق الفلتر مقاس 4.25 سم على طبق بيتري مقاس 35 مم × 10 مم ومبلل ورق الفلتر بماء مقطر 750 ميكرولتر.
    4. عكس أنبوب مخروطي على ورقة تصفية وتطور ذهابا وإيابا عدة مرات لضمان أنها آمنة.
  2. استخدام الطامح الفم لإزالة بعناية ~ 10 الإناث من Cx. pipiens من قفصهم ونقلها إلى أنبوب مخروطي المعدة.
  3. ضع أسطوانة مبهمة فوق الأنبوب المخروطي لتوفير الظلام للبعوض لأن هذا يحفز وضع البيض ، وانتظر 20-25 دقيقة.

5. مايكرو التلاعب الطازجة وضعت Culex البيض

  1. إعداد الشريحة لربط أجنة البعوض للميكروينيكشن.
    1. إرفاق قطعة من الشريط على الوجهين لعرض غطاء الزجاج.
    2. إرفاق شريط رقيقة من الملابس الطبية شفافة (على سبيل المثال، Tegaderm، 2-3 مم واسعة) إلى الشريط على الوجهين بحيث يعمل بالتوازي مع نهاية قصيرة من الزجاج الغطاء ويتم وضعه حوالي 5 ملم من نهاية الزجاج الغطاء.
    3. إزالة الشريط الزائد على الوجهين مع شفرة حلاقة حادة، وإزالة 2-3 مم من خلع الملابس الطبية وشريط على الوجهين من كل نهاية الزجاج الغطاء. وهذا يسمح لطبقة من الزيت بالبقاء على الشريحة بعد تركيب البيض على زجاج الغطاء.
    4. باستخدام قلم رصاص الشمع، رسم شكل "D" حول الشريط على الوجهين وشريط من خلع الملابس الطبية. وهذا سيكون بمثابة حاجز لعقد المياه حول البيض بعد الحقن.
  2. بعد إعداد الشريحة و انقضاء 20-25 دقيقة ، قم بإزالة الأنبوب المبهم وتحديد ما إذا كان البعوض قد وضع أي بيض أم لا.
    1. إذا لم يكن كذلك، وتغطيتها لمدة 5-10 دقائق أخرى.
    2. إذا كان البعوض قد وضع البيض ، بعناية ولكن بسرعة رفع أنبوب مخروطي وتغطية مع غطاء. ضع البعوض في قفص منفصل ، وسجل الوقت الذي تم فيه جمع البيض على جدول بيانات. ثم أضف 50-100 ميكرولتر من ماء DI إلى ورقة التصفية التي تحتوي على طوافات البيض.
  3. تحت المجهر تشريح خط البيض.
    1. ضع قطعة من ورق التصفية (مستطيلات مقاس 10 مم × 30 مم مقطوعة من ورق فلتر خشن بمعدل تدفق سريع) تحت زجاج غطاء 24 مم × 40 مم بحيث يغطي زجاج الغطاء 50-60٪ من الجانب الأيسر من ورقة التصفية.
    2. قم بتبليل ورق الفلتر بماء DI 50 ميكرولتر. سوف تنتشر المياه تحت غطاء الزجاج ببطء، وخلق خزان للحفاظ على ورقة التصفية والبيض الرطب خلال micromanipulation. سوف يتشكل الغضروف المفصلي بين زجاج الغطاء وورق التصفية عند تطبيق الكمية الصحيحة من الماء.
    3. فصل البيض من أطواف البيض باستخدام فرشاة الطلاء غرامة، والموقف بحيث ضيقة، نهاية الخلفي للجنين هو لمس الزجاج الغطاء (اليسار) وأوسع، نهاية الأمامي هو إلى اليمين.
    4. محاذاة البيض لمدة 20 دقيقة، ومراقبة بعناية تغيير لونها من أبيض حليبي إلى رمادي فاتح جدا. فحص بشكل روتيني فيلم المياه تحت غطاء الزجاج للتأكد من أن هناك كمية كافية من الماء. إذا بدا أن البيض يجف، أضف كمية صغيرة من ماء DI (20-30 ميكرولتر) إلى ورقة التصفية.
    5. بعد 20 دقيقة، تجاهل جميع البيض المتبقي.
  4. نقل البيض إلى الشريحة microinjection.
    1. استخدم قطعة صغيرة (10 مم × 30 مم) من ورق التصفية الخشن للفتيل الماء من جانب ورقة التصفية المشبعة، وإزالة ورق فلتر الفتل مع ملقط. كرر 2-3 مرات للتأكد من أن ورقة التصفية مع البيض جافة قدر الإمكان.
    2. وضع مستطيل جديد وجاف من ورق التصفية والاحتفاظ بها في مكانها مع زوج من ملقط. سحب بعناية بعيدا الزجاج الغطاء إلى اليسار، بعيدا عن البيض الانحياز.
    3. جفف الماء الزائد على المسرح دون إزعاج ورقة التصفية الصغيرة التي تحتوي على البيض المنحاز. استمر في تجفيف ورق الفلتر الرطب بالبيض عدة مرات أخرى، والضغط على المستطيلات الصغيرة من ورق التصفية مع الإبهام و/أو ملقط، لضمان جفاف البيض قدر الإمكان قبل نقله إلى شريحة الحقن.
    4. باستخدام ملقط، قم بإزالة الورقة التي تتراجع عن شريط الضمادات الطبية من الشريحة المتصاعدة.
    5. عقد الشريحة المتصاعدة مع الإبهام والإصبع الأوسط والملابس الطبية المكشوفة التي تواجه أسفل، وانخفاض بزاوية 45 درجة على خط البيض المنحازة. ضع الشريحة بحيث تتدلى النهاية الأمامية الأوسع للبيض (يسار) قليلا من نهاية الضمادة الطبية ، لأن هذا يعزز قدرة يرقات Culex على الفقس بنجاح من البيض المركب.
    6. اضغط على السبابة إلى الجانب السفلي من زجاج الغطاء، مع الاستمرار في حمل زجاج الغطاء بين الإبهام والإصبع الأوسط، لضمان أن جميع البيض المنحاز ملتصق بقوة بخلع الملابس الطبية.
    7. عكس الزجاج الغطاء على الفور بحيث تواجه البيض، وتطبيق طبقة رقيقة من زيت الهالوكربون النفط (2-3 قطرات؛ ~ 20 ميكرولتر) على البيض. وهذا يمنع البيض من الجفاف أثناء الميكرويكشن. إزالة أي بيض غير مرفقة بخلع الملابس الطبية أو غير مغطاة بالزيت.
    8. ضع الغطاء الزجاجي مع البيض المثبت داخل طبق بيتري مربع مع مربع كبير من ورق التصفية الرطب لنقله للتنقية الدقيقة.

6. حقن أجنة Culex

  1. إعادة ملء إبر الحقن بمزيج الحقن
    1. اختيار إبرة حشو أو هلام تحميل تلميح التي تناسب بسهولة في النهاية الخلفية لإبرة الحقن المختارة، وسيكون قليلا من الفضاء بين نهاية حشو إبرة وإبرة الحقن.
    2. ضع بعناية قطرة واحدة وصغيرة من مزيج الحقن (~ 0.5-1 ميكرولتر) في إبرة الحقن ، وذلك باستخدام حشو الإبرة لملء الإبرة مرة أخرى. ضع قطرة من مزيج الحقن بالقرب من حيث إبرة الحقن يبدأ تفتق.
  2. إرفاق إبرة الحقن إلى حاقن الصغرى.
  3. ضع الشريحة التي تحتوي على الأجنة على خشبة مسرح المجهر.
  4. فتح الإبرة
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم الإبر مشطوف، وهذا ليس ضروريا.
    1. استخدام ضغط حقن بدءا من ~ 30 PSI وضبط حسب الضرورة لتقديم حجم مناسب من مزيج الحقن.
    2. تحت مجهر تشريح، ضع الإبرة فوق الجنين، واستخدم المايكرومانيبولاتور بعناية لخفض الإبرة على الجنين. بمجرد أن تلمس الإبرة الجنين بالكاد ، تحرك الجنين بسرعة عموديا إلى المحور الطويل للابرة.
    3. لتحديد ما إذا كان قد تم فتح الإبرة بنجاح، اضغط على الزناد الحقن ومعرفة ما إذا كان أي فقاعات / حقن مزيج الهروب من الإبرة. إذا لم يكن الأمر كذلك، كرر تحريك الجنين ضد الإبرة حتى تفتح الإبرة ويهرب مزيج الحقن عند الضغط على الزناد.
  5. حقن الأجنة
    1. ضع الجنين الأول في الصف في مركز الرؤية في المجهر وتأكد من أنه في بؤرة التركيز.
    2. ضع الإبرة فوق البيضة الأولى ، أيضا داخل مركز مجال الرؤية داخل المجهر.
    3. زيادة تدريجية التكبير على المجهر، وخفض بعناية الإبرة لإبقائه فقط فوق الجنين الأول، تركزت وفي التركيز. المضي قدما حتى المجهر قد وصلت إلى أعلى التكبير وعلى حد سواء الجنين والإبرة هي في التركيز.
    4. تحرك بعناية الجنين على خشبة المسرح قليلا إلى اليسار وخفض الإبرة قليلا بحيث الإبرة والجنين هي الآن في نفس المستوى من العرض.
    5. باستخدام مرحلة المجهر لتحريك الجنين، المس الجنين بعناية وبلطف إلى طرف الإبرة. يجب أن تنحرف النهاية الضيقة والخلفية للجنين قليلا. ضبط ارتفاع الإبرة إذا كانت مرتفعة جدا أو منخفضة جدا.
    6. باستخدام مرحلة المجهر ، قم بتحريك النهاية الخلفية للجنين إلى الإبرة ولاحظ الإبرة التي تخترق وترية بيضة البعوض. يجب أن تخترق الإبرة الغشاء في الموقع التقريبي لخلايا القطب داخل أجنة Culex. بمجرد حدوث ذلك ، اسحب الزناد الحقن 1-3 مرات لاطلاق النار حقن مزيج في الجنين. تقديم كمية صغيرة من مزيج الحقن، فقط بما فيه الكفاية أن تطهير صغيرة في embryoplasm يمكن الكشف عنها.
    7. باستخدام المرحلة، نقل الجنين إلى اليمين، بعيدا وخارج غيض من الإبرة. إذا سارت الحقنة بشكل جيد، يجب أن يتسرب القليل من السوائل من الجنين.
    8. حرك المرحلة لأسفل بحيث يتم وضع الجنين التالي في الخط أمام الإبرة. ثم مرة أخرى، نقل المرحلة إلى اليسار، ووضع الجنين على إبرة الحقن وسحب الزناد الحقن.
    9. إذا كان مزيج الحقن لا يبدو أن الخروج و / أو إذا كان كمية كبيرة من السوائل يهرب من الجنين بعد إزالة الإبرة، واستبدال إبرة الحقن والبدء من جديد.
    10. تدمير أي بيض غير حقن أو التالفة.
  6. رعاية الأجنة بعد الحقن
    1. بعد حقن جميع الأجنة على الشريحة ، اغسل زيت الهالوكربون عن طريق تطبيق ماء التناضح العكسي بزجاجة بخ ، بحيث يتم توجيه تيار الماء إلى أعلى غطاء الزجاج فوق الأجنة المحقونة والسماح للماء بالتدفق إلى أسفل الغطاء وفوق الأجنة لشطف الزيت. تأكد من عدم توجيه مجرى المياه مباشرة إلى الأجنة لأن هذا قد يضر بها أو يفصلها عن الضمادات الطبية. هذه العملية يزيل معظم, ولكن ليس كل, من النفط Halocarbon.
    2. قم بتغطية الشريحة بماء DI 150 ميكرولتر.
    3. ضع الشريحة مع الأجنة المحقونة على ورق فلتر مبلل داخل طبق بيتري مربع.
    4. ضع طبق بيتري الذي يحتوي على الأجنة المحقونة في غرفة بيئية محددة إلى 25-27 درجة مئوية ، 70-80٪ RH مع جلسة تصوير طويلة اليوم (>13 ساعة ضوء / يوم).

7. تربية الأجنة المحقونة (F0)إلى مرحلة البلوغ وإعداد الصلبان

  1. فحص شرائح الأجنة المحقونة يوميا ، مع توقع ظهور يرقاتنجمة واحدة بعد 1.5 يوم من الحقن.
  2. عد عدد يرقاتنجمة سانت 1 ، وضع 100-200 يرقة في حاوية Tupperware بحجم صندوق الأحذية مع 450 مل من مياه DI ، و 50 ملغ من طعام الأسماك المطحونة. في هذا الوقت ، قم بإنشاء حاويات أكثر من مرة إلى 5 أضعاف تحتوي على يرقات من النوع البري أو غير المحقون سيتم استخدامها للعبور مع البعوض المحقون.
  3. إطعام اليرقات يوميا ، وزيادة طفيفة في كمية الطعام التي يتلقونها كل يوم حتى تصل إلى 300-500 ملغ في اليومالسادس من حياة اليرقات.
  4. بمجرد ظهور الخوادر ، استخدم ماصة نقل لوضع جرو واحد في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 2 مل مليئة بنسبة 50-75٪ مليئة بمياه DI. كرر لجميع الخوادر، سواء الخوادر التي تم حقنها كجنة وكذلك غير مخنوش، الخوادر البرية من نوع. اضغط بعناية على الأغطية بحيث تكونجارية قليلا ، مما يمنع البعوض من الهروب ولكنه لا يزال يسمح بكمية صغيرة من تبادل الغاز.
  5. بمجرد ظهور البعوض البالغ داخل أنابيب الطرد المركزي الدقيق ، أطلق البعوض الأنثوي المحقون في قفص يحتوي على بعوض ذكوري بكر من النوع البري ، محققا نسبة لا تقل عن ذكر واحد من النوع البري لكل أنثى يتم حقنها. وبالمثل، حقن إطلاق البعوض الذكور في قفص يحتوي على الإناث البرية البكر، وتحقيق نسبة من حوالي 5-10 الإناث البرية العذراء لكل ذكر عن طريق الحقن. يوصى بزيادة نسبة الإناث البرية إلى الذكور المحقونين حيث يمكن لكل بعوضة ذكر أن تتزاوج عدة مرات. لذلك ، فإن وجود أعداد أكبر من الإناث البرية التي تتزاوج مع الذكور المحقون يزيد من عدد ذرية F1 التي يمكن إنتاجها.

8. الحصول على وتربية البعوض F1 وفحصها للكشف عن الطفرات

  1. بعد سبعة إلى عشرة أيام من ظهور الكبار ، قدم وجبة دم للإناث في كل قفص كما هو موضح أعلاه (الخطوة 3).
  2. بعد أربعة أيام من تغذية الدم، ضع الماء في كل قفص. تمثل كل طوافة بيض ذرية بعوضة أنثى واحدة ، وبالتالي يجب وضعها في حاوية تربية بلاستيكية بحجم صندوق الأحذية بعد وقت قصير من التراكب. قم بتسمية كل حاوية بمعرف فريد ، وتشير أيضا إلى أن اليرقات تنتمي إلى جيل F1 لجين الاهتمام ، سواء تم حقن الوالد الذكر أو الأنثى ، وتاريخ إنشاء المقلاة ، وظروف التربية ، والأحرف الأولى من اسم المجرب.
  3. راقب المقالي من اليرقات يوميا. بمجرد أن تفقس اليرقات في المقالي ، وفر 50 ملغ من طعام السمك المطحون. زيادة الطعام يوميا لمدة 6 أيام كما هو موضح أعلاه (الخطوة 7.3).
  4. نقل الخوادر الفردية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق 2 مل التي تحتوي على ما بين 1-1.5 مل من المياه DI، تسمية كل أنبوب، وكسر الأغطية.
  5. بمجرد ظهور البعوض البالغ ، افتح بعناية أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل ، الذي يغطي بإصبع السبابة ، وباستخدام اليد الأخرى ، ضع قارورة زجاجية 3 درام فوق الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق. يجب أن تكون غريزة البعوض الطبيعية هي الطيران إلى الأعلى وإلى القارورة الزجاجية. وبمجرد حدوث ذلك، قم بتمرير إصبع فوق فتحة القارورة الزجاجية، وعكسها بسرعة، ووضع كرة صغيرة من القطن تم ترطيبها قليلا بمحلول السكروز بنسبة 10٪ في الجزء العلوي من القارورة. وهذا يمنع البعوض من الهرب ويوفر مصدر الغذاء والماء اللازم.
  6. قم بتسمية الأنبوب الذي يحتوي على الإكسوفيا الخوادر والقارورة الزجاجية التي تحتوي على البعوض البالغ للإشارة إلى مقلاة اليرقات التي نشأت منها ، وجنس البعوض ، والمعرف الفريد لذلك الفرد. على سبيل المثال: II.C.M32، حيث يمثل "II" أن الوالد الذكر تم حقنه، يمثل "C" طوف المقلاة/البيض الذي نشأ منه الفرد، ويعين "M32" أنه الذكر الثاني والثلاثين الذي خرج من حاويةتربية اليرقات تلك.
  7. ضع البعوض البالغ داخل قوارير الزجاج الفردية الخاصة به مرة أخرى في الغرفة البيئية ، وأضف كمية صغيرة (~ 20 ميكرولتر) من محلول السكروز بنسبة 10٪ إلى القطن يوميا. تأكد من عدم الإفراط في تغذية أو تشبع القطن كما البعوض سوف تتعثر في محلول السكروز ويموت.
  8. فحص البعوض للكشف عن الطفرة المطلوبة
    1. استخراج الحمض النووي الجينومي من 5-10 التوفيا الجرو من كل طوف البيض / عموم من اليرقات باستخدام Phire المباشر PCR كيت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، فضلا عن 1-2 الأفراد البرية من النوع الذي سيكون بمثابة السيطرة.
      ملاحظة: بما أن النسل من كل طوافة من المرجح أن يكون أشقاء كاملين ، فإن فحص 5-10 يرقات من كل مقلاة سيحدد ما إذا كانت الطفرة قد انتقلت إلى النسل. إذا لم يكن لدى أي من اليرقات التي تم فحصها من مقلاة واحدة الطفرة المطلوبة ، فلا تقم بفحص البالغين الإضافيين. إذا كان لدى بعض اليرقات الطفرة ، فيجب فحص كل فرد من تلك المقلاة.
    2. باستخدام التمهيديات PCR المصممة سابقا (الخطوة 1.2) ، تضخيم جزء حول الموقع المتوقع للطفرة الخاصة بك باستخدام عدة Phire PCR في كل من البرية من نوع وF1 ذرية وتشغيل شظايا PCR على هلام agarose 3-4 ٪ لتحديد ما إذا كان هناك أي عمليات الإدراج أو الحذف مرئية (indels).
      ملاحظة: أي الأفراد الذين لديهم الطفرة المطلوبة سوف تكون heterozygous وينبغي عرض 2 العصابات، نوع واحد البرية واحد إما أقصر قليلا أو أطول في الموقف المطلوب. لتمييز هذه، قارن موقف وسماكة نطاقات من الأفراد نوع البرية مع تلك الموجودة في العصابات في ذرية F1. من الناحية المثالية 2 فرق منفصلة سوف تكون مرئية، ولكن إذا كان indel صغيرة جدا، قد يبدو الفرقة لتكون أوسع و / أو ضبابية.
    3. تنقية المنتج PCR إما عن طريق استئصال النطاق الذي يحتوي على indels المشتبه به (الموصى بها) أو عن طريق تنقية المنتج PCR المتبقية التي لم يتم تحميلها في هلام. تقديم PCR تنقية للتسلسل لتحديد ما إذا كانت الطفرة المطلوبة موجودة.

9. الحصول على وتربية البعوض F2 و F3 وفحصها للكشف عن الطفرات

  1. أطلق جميع البعوض البالغ F1 الذي تم العثور على الطفرة المرغوبة من خلال فحص التوفيا الجروية من قوارير الزجاج الفردية الخاصة بهم وإلى قفص يحتوي على البعوض البري من النوع غير المحقون من الجنس الآخر. يجب أن يزيل الكروسينج لهذا الجيل الثاني جميع الآثار الضارة للحقن والتربية الداخلية.
  2. الدم يغذي أقفاص البعوض F1 متحولة ونظرائهم البرية من نوع كما وصف سابقا. بعد أربعة إلى خمسة أيام، جمع الطوافات البيض F2 الناتجة.
  3. قم بتسمية وتربية يرقات F2 كما هو موضح أعلاه ، ووضع كل طوافة بيض في حاوية منفصلة تحمل علامة. عند pupation، فصل مرة أخرى الخوادر الفردية في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 2 مل الفردية، ونقل كل شخص بالغ في قوارير زجاجية منفصلة مغطاة القطن غارقة في السكروز عند ظهورها. ثم فحص التوافه pupal من كل فرد F2 الطفرة المطلوبة كما هو موضح سابقا (الخطوات 8.5-8.8).
    ملاحظة: هنا جميع الأفراد الذين لديهم الطفرة المطلوبة سوف تكون heterozygous، وبالتالي فإن المنتج PCR يجب أن تنتج بشكل مثالي 2 نطاقات متميزة عند تشغيلها على هلام agarose 3-4٪.
  4. بمجرد التعرف على يرقات F2 المتحولة ، ضع جميع الذكور والإناث الذين لديهم طفرة في نفس القفص للتزاوج. تغذية الدم 7-10 أيام بعد ظهور الكبار، وبعد 4-5 أيام، وجمع الطوافات البيض F3.
  5. ضع كل طوافة بيض F3 في حاوية منفصلة لتربية اليرقات ، وعلامة وتغذية كما هو موضح أعلاه.
  6. فصل الخوادر F3 إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق 2 مل الفردية. بمجرد ظهور البالغين، قم بنقلها إلى قوارير زجاجية فردية مغطاة بقطن منقوع بالسكتروز بنسبة 10٪. فحص الإكسوفيا الجرو كما هو موضح سابقا. هذه المرة، ينبغي أن يكون ما يقرب من 25٪ من النسل في كل مقلاة homozygous للطفرة فارغة. ضع هؤلاء الأفراد في قفص واحد ، واستخدمهم لإنشاء وصيانة خط البعوض المتحول الذي تم إنشاؤه حديثا.
    ملاحظة: إذا كان هناك عدد منخفض من البعوض المثلي موجود ، يمكن عبور الهتروزيغوس F3 الذكور والإناث مع بعضهم البعض لتوليد بعوض إضافي متجانس - لاغي في الجيل F4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام البروتوكول الموصوف ، تمكنا من حقن أجنة Cx. pipiensبنجاح ، ولاحظنا معدلا مرتفعا للبقاء على قيد الحياة بين الأجنة المحقونة (~ 55 ٪ ، الشكل 1). كانت نسبة البقاء على قيد الحياة في التجارب السابقة أقل، على الأرجح لأن الجزء الأمامي من بصيلات البيض كان متصلا بشريط التضميد الطبي، مما منع يرقات البعوض من الهروب من المشيمة والسباحة بنجاح في الماء. ضمان أن تمتد النهاية الأمامية إلى ما وراء قطاع الضمادات الطبية زاد بشكل كبير من بقاء اليرقات ، ويؤدي إلى ذرية عالية الجودة قادرة على التطور إلى مرحلة البلوغ والتكاثر(الشكل 2B).

التجارب اللاحقة والفحص تشير إلى أن الطفرة فارغة لدورة الجينات circadian ساعة (cyc; KM355981) جعله في الجرثومة من الأجنة المحقونة(الشكل 3). وبالنظر إلى أن مبرمجينا ضخما منطقة كبيرة من جين السيك بالقرب من مواقع القطع ، كان من الصعب مراقبة شريطين منفصلين في heterozygous ، بعوض F1. وهذا يدل على فائدة تصميم التمهيديات التي من شأنها تضخيم الشظايا التي هي ~ 100-200 نقطة أساس حول موقع القطع ، وكذلك أهمية تسلسل جميع البعوض المتحول المشتبه به. وكشف التسلسل أن ما يقرب من 10٪ من البعوض الذي تم فحصه أظهر إدخالا صغيرا أو حذفا بالقرب من موقع قطع Cas9 من الدليل الأول RNA الذي قمنا بتصميمه(الشكل 3)، مما يشير إلى أن هذا كان رنا فعالا للغاية وأننا استهدفنا بنجاح خلايا القطب أثناء عمليات الشفط الدقيق. نجح أفراد F 1 فيالتزاوج وإنتاج ذرية قابلة للحياة (جيل F2) ، وبعضها يحتوي أيضا على الطفرة.

Figure 1
الشكل 1: مثال لإبرة بوروسيليكاتي مشطوف. تم تصنيع هذه الإبرة من أنبوب صغير من البوروسيليكات السيليكوني ، تم سحبه باستخدام جهاز سحب إبرة عمودي PC-10 ، ثم مشطوف على بيفير BV-10. وينظر إلى الإبرة تحت التكبير ~ 63x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: بقاء الجيل F0 عبر تنميتها. (أ) صورة ليرقاتنجمة واحدة من فقست من 3 شرائح تحتوي على أجنة تم حقنها. (ب) تمثيل رسومي لعدد الأفراد في كل مرحلة من مراحل الحياة. ومن بين الأجنة ال 801 التي تم حقنها، فقست 441 يرقةنجمية، ومن بين هؤلاء الأفراد البالغ عددهم 149، بلغ عدد اليرقات التي تم حقنها 121 شخصا بالغا (73 ذكرا و43 أنثى). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: النتائج التمثيلية التي تبين انتقال الطفرة المرغوبة. يمثل التسلسلان الأعلى تسلسل جين الدورة في Culex quinquefascaitus (Cx.quinq؛ XP_001865023.1) وفي نوع البرية الإناث من CX. pipiens (WT. F; KM355981). تمثل التسلسلات أدناه تسلسلات في ثلاثة ذكور من ذرية F1 (I.DM1؛ II.JM4; II.K10M). يمثل الصندوق الأخضر تسلسل PAM المعترف به من قبل بروتين Cas9 (CGG) في حين يمثل السهم الأخضر المكان الذي يمثل فيه بروتين Cas9 الحمض النووي الجينومي المشقوق. وتبين هذه النتائج أن الحذف القصير ل 2 أو 4 نويدات ورث في الذكور F1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يقدم هذا البروتوكول طرقا لإدخال طفرات محددة في جينوم بعوض Culex ويمكن استخدامه لتحرير جينوم البعوض الآخر أيضا. البروتوكول مهم من حيث أنه يوفر تفاصيل محددة ليس فقط عن كيفية إعداد مواد الحقن ، ولكن أيضا لمحة عامة مفصلة عن كيفية حث البعوض على وضع البيض ، وكذلك كيفية إعداد وحقن تلك البيضات. كما نلخص كيفية الاستفادة من بيولوجيا الإناث Cx. pipiens لوضع البيض في الطوافات الفردية وبالتالي فحص نسبة أصغر من النسل من كل أنثى للطفرات المطلوبة. تم تحسين الأساليب المعروضة هنا ل Cx. pipiens ولكن يمكن تكييفها ، مع تعديلات صغيرة ، لتحرير جينوم البعوض أو الحشرات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بروتوكولات الميكروبانيبيشن والتحنيم الدقيق الموصوفة هنا قابلة لحقن العديد من المواد المختلفة في أجنة الحشرات ، بما في ذلك الإرسال والاستقبال ، أو الحمض النووي الريبي (dsRNA) أو غيرها من الغدد الرحمية مثل TALENs أو نواة الزنك الإصبع. وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول شطب يولد الإبر microinjection مع أحجام فتح متغير وبالتالي خلق الإبر التي يمكن استخدامها لحقن مجموعة واسعة من مواد الحقن. يمكن استنتاج الحجم المفتوح للابرة عن طريق تقليل ضغط الهواء ببطء بعد شطب الإبرة ، مع ونحيطنا بالضغط الذي تتوقف فيه فقاعات الهواء عن التدفق من طرف الإبرة المفتوحة حديثا. انخفاض ضغط الهواء المطلوب لإنتاج فقاعات يشير إلى أن الإبرة لديها أكبر حجم الفتحة، وعلى العكس من ذلك، ارتفاع ضغط الهواء تشير إلى أن الإبرة لديها حجم فتحة أصغر. الإبر ذات أحجام فتحة أكبر هي أفضل لحقن جزيئات أكبر ومواد أكثر لزوجة، ولكن من المرجح أن تسبب ضررا أكبر للجنين وبالتالي تقليل البقاء على قيد الحياة.

تجارب الميكرويكشن هي في نواح كثيرة سباق ضد عقارب الساعة. أولا ، يجب على المرء حقن الأجنة الفردية في غضون أول ساعتين من oviposition ، قبل أن يصلب الكوريون ويحدث تشكيل blastoderm. لذلك ، من الضروري ملاحظة متى تم وضع البعوض لأول مرة في غرفة التموضع ، وكم من الوقت يستغرق للتلاعب بالبويضات للحقن (نوصي بما لا يزيد عن 20-30 دقيقة) ، وكم من الوقت يستغرق لحقن جميع الأجنة. الوقت محدود أيضا عند فحص البعوض البالغ بحثا عن الطفرات حيث أن Cx. pipiens حساسة جدا لمحيطها والبعوض عموما لا يبقى على قيد الحياة إلا لمدة 3-5 أيام في قوارير زجاجية فردية. لذلك ، من الضروري فحص التوفيا البعوضية في أسرع وقت ممكن. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء أيضا استخراج الحمض النووي الجينومي من ساق بعوضة واحدة14. من أجل القيام بذلك ، ومع ذلك ، يجب تخدير البعوض أولا على الجليد. كما كنا بالضجر من كيفية العلاج البارد وفقدان الأطراف قد تؤثر على بقاء البعوض وقدرتها على التزاوج ووضع البيض قابلة للحياة، قررنا بدلا من ذلك فحص التوفيا الجرو المهملة للطفرات. من المرجح أن يكون مستوى gDNA داخل exuvia أقل مما هو عليه داخل ساق البعوض ، وهذا يضيف جهدا ووقتا إضافيا لفصل البعوض في مرحلة الجرو ، ولكنه يضمن أيضا أن جميع البالغين غير ممسحة عند إطلاقها في أقفاصها المناسبة ، وهو أمر حيوي للغاية. ونحن نرى أن النتائج تستحق كل هذا العناء، ولكن نشجع الآخرين على النظر في ما إذا كانت إزالة الساق قد يكون مسار عمل أفضل لاحتياجاتهم التجريبية.

أفضل طريقة لتسريع فحص الطفرات هي حقن البلازميد الذي يحتوي على علامة وراثية ، مثل بروتين الفلورسنت ، محاط بتسلسل متجانس على جانبي موقع القطع. معدلات الطفرات ضرب في باستخدام التماثل الموجه إصلاح (HDR) هي عموما أقل من غير متجانسة نهاية الانضمام (NHEJ)، والطفرات خروج المغلوب (HDR = 0.71٪؛ NHEJ = 24.87٪؛ 22). لذلك ، من المرجح أن يحدث إدخال العلامة بتردد أقل بكثير ، ولكن التوفير الزمني الذي توفره القدرة على فحص يرقات البعوض بسرعة تحت المجهر الفلوري قد يكون يستحق المخاطرة ، اعتمادا على المشروع. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تعزيز معدلات HDR والطفرات طرق في عندما يحقن المرء أيضا البلازميد التي تحتوي على التسلسل الجيني للبروتين Cas9 ، مدفوعا الترويجي الجنينية تتميز جيدا ، وgRNA يقودها الترويجي U624،26. وهذا مرجح لأن في وقت مبكر من التطور الجنيني، عندما النوى تنقسم بسرعة (S المرحلة من دورة الخلية)، وآلية NHEJ المعرضة للخطأ ولكن مناسبة ويبدو أن الطريقة المفضلة لإصلاح فواصل مزدوجة تقطعت بهم السبل (استعرضت18). ومع ذلك ، مع تقدم تكوين الجنين ، يتم تجهيز الآلات الخلوية لاستخدام آلية HDR الأكثر دقة لإصلاح فواصل مزدوجة تقطعت بها السبل (مرحلة S المتأخرة ومرحلة G2). حقن البلازميد الذي يحتوي على تسلسل Cas9 في وقت مبكر من التطور الجنيني يسمح للبروتين Cas9 للوصول إلى معظم الخلايا المستهدفة في حين أن الجنين لا يزال في حالته التزامنية وقبل أن تتشكل الأغشية الخلوية، ولكن التأخير الطفيف المطلوب لتدوين وترجمة بروتين Cas9 يبدو أنه يزيد من احتمال أن يكون الإندونوكليايز نشطا في وقت يكون فيه الجنين النامي أكثر عرضة لاستخدام HDR لإصلاح فواصل مزدوجة تقطعت بهم السبل بدقة في الحمض النووي الجينومي. على سبيل المثال، اكتشف لين وآخرون27 أن معدلات HDR تم تعزيزها إلى ~ 33٪ عندما تم حقن بروتين Cas9 المعقد مع الحمض النووي الريبي في خطوط الخلايا البشرية التي تم القبض عليها في المرحلة M من دورة الخلية. فائدة إضافية من تسليم Cas9 وgRNAs على البلازميدات هو أنها أقل لزوجة وبالتالي أقل عرضة لتسد الإبرة أثناء الحقن (R. هاريل، الملاحظة الشخصية). ومع ذلك ، حتى يتم وصف المروجين النقشية والتحقق من صحتها في البعوض Culex ، نوصي بحقن بروتين Cas9 أو مرنا كما هو موضح هنا.

بالإضافة إلى ذلك ، نظرا للوقت الذي يجب على المرء تكريسه لتربية البعوض وفحصه ، نوصي بتخصيص فني أو طالب أو باحث واحد على الأقل بدوام كامل لهذه المهمة. كما نوصي بالنظر استراتيجيا في عدد المسوخ الفارغة التي يحتاجها المرء لتجربة معينة وأهمية التنوع الوراثي داخل الخط الخالي. في حين تمكنا من تحديد البعوض في الجيلين F1 و F2 الذي كان لديه الطفرة ، إلا أن حفنة فقط من البعوض F2 نجا حتى سن البلوغ فشل البعوض المتحول heterozygous في إنتاج ذرية قابلة للحياة. نعتقد أن هذا أقل بكثير من ذلك بكثير للقيام مع الطفرة ، وعلى الأرجح هو نتيجة لفترة طويلة من الزمن أن البعوض الذكور والإناث على حد سواء كانت تقتصر على أنابيب زجاجية بينما كنا فحصها. هذه الفترة الطويلة من العزلة تتداخل على الأرجح مع قدرتها على التزاوج بنجاح ، وفي حالة الإناث ، والحصول على وجبة دم ووضع بيض قابل للحياة. وينبغي أن يمنع تجاوز جيل واحد و/أو وجود تقنيات فحص محسنة في مكان هذه المشكلة من الحدوث في المستقبل. لذلك ، من خلال اتباع هذا البروتوكول ، نحن واثقون من أن الباحثين سيتمكنون من توليد خطوط فارغة بنجاح من بعوض Culex ، ومع تعديلات طفيفة ، حشرات إضافية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعمل RH في مرفق تحويل الحشرات ، الذي يقدم خدمات في التعديل الوراثي للحشرات.

Acknowledgments

نشكر الدكتور ديفيد أوبروشتا وجميع أعضاء شبكة أبحاث تنسيق التقنيات الوراثية الحشرية على المساعدة والتدريب الذي يقدمونه لنا وللآخرين على تنفيذ التقنيات الوراثية. نشكر بشكل خاص تشانا الوفيهاري لتحسين بروتوكول الضخ الدقيق للسماح بحقن أجنة Culex وتفقيسها. كما نشكر ديفانتي سيمونز وجوزيف أورسو، الطلاب الجامعيين العاملين في مختبر ميوتي، على مساعدتهم في رعاية وفحص البعوض المعدل وراثيا، وزورا إلمكامي من ال ITF للمساعدة في تربية البعوض وإعداده للحقن. وقد دعم هذا العمل منحة متعددة التخصصات من معهد الأمراض المعدية في جامعة ولاية أوسو قدمت إلى وزارة الميكنة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artificial Membrane Feeder Hemotek SP5W1-3 Company location: Blackburn, UK
ATP Invitrogen 18330019 Company location: Carlsbad, CA, USA
Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter World Precision Instruments 1B100-6 Company Location: Sarasota, FL, USA
BV10 Needle Beveler Sutter Instruments BV-10-B Company Location: Nobato, CA, USA
Whatman Circular filter paper (12.5 cm) Sigma Aldrich WHA1001125 Company Location: St. Louis, MO, USA
Conical tube (50 mL) Thermo Fisher Scientific 339652 Company Location: Waltham, MA, USA
Fisherbrand course filter paper with fast flow rate Thermo Fisher Scientific 09-800 Company Location: Waltham, MA, USA
Cover glass (24 x 40 mm) Thermo Fisher Scientific 50-311-20 Company Location: Waltham, MA, USA
Dental dam Henry Schein Inc 1010171 Company Location: Melville, NY USA
Scotch double-sided tape Thermo Fisher Scientific NC0879005 Company Location: Waltham, MA, USA
FemtoJet 4i microinjector Eppendorf 5252000021 Company Location: Hamburg, Germany
Glass vial (2 dram) Thermo Fisher Scientific 033401C Company Location: Waltham, MA, USA
Halocarbon oil Sigma Aldrich H8898-50ML Company Location: St. Louis, MO, USA
P-2000 Laser Needle Puller Sutter Instruments P-2000/G Company Location: Nobato, CA, USA
Parafilm Thermo Fisher Scientific 50-998-944 Company Location: Waltham, MA, USA
PC-100 Weighted Needle Puller Narishige PC-100 This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA
Phire Direct PCR Kit Thermo Fisher Scientific F140WH Company Location: Waltham, MA, USA
Kodak Photo-Flo (1%) Thermo Fisher Scientific 50-268-05 Company Location: Waltham, MA, USA
Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter Capillary Tube Supplies Limited QGCT 1.0 Company Location: Cornwall, UK
Guide-it™ sgRNA Screening Kit Takara, Bio USA 632639 This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA
Sigmacote Sigma Aldrich SL2-100ML Company Location: St. Louis, MO, USA
Small petri dishes (35X10 mm) Thermo Fisher Scientific 50-190-0273 Company Location: Waltham, MA, USA
Sodium citrate chicken blood Lampire biologicals 7201406 Company Location: Everett, PA, USA
Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) Thermo Fisher Scientific FB0875711A Company Location: Waltham, MA, USA
Tegaderm Henry Schein Inc. 7771180 Company Location: Melville, NY USA
Tropical fish food Tetramin N/A
Whatman filter paper Thermo Fisher Scientific 09-927-826 Company Location: Waltham, MA, USA
Whatman filter paper, 4.25 cm Sigma Aldrich 1001-042 Company Location: St. Louis, MO, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamer, G. L., et al. Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).
  2. Bailey, C. L., et al. Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes. Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).
  3. Sabry, M. A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis. The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).
  4. Cancrini, G., et al. Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy. Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).
  5. Wilton, D. P., Smith, G. C. Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).
  6. Mattingly, P. F. The Culex pipiens complex. Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).
  7. Eldridge, B. F. The effect of temperature and photoperiod on blood-feeding and ovarian development in mosquitoes of the Culex pipiens complex. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17 (1), 133-140 (1968).
  8. Spielman, A., Wong, J. Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens. Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).
  9. Fritz, M. L., Walker, E. D., Miller, J. R., Severson, D. W., Dworkin, I. Divergent host preferences of above-and below-ground Culex pipiens mosquitoes and their hybrid offspring. Medical and Veterinary Entomology. 29 (2), 115-123 (2015).
  10. Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Annals of the Entomological Society of America. 57 (4), 468-472 (1964).
  11. Dong, S., Lin, J., Held, N. L., Clem, R. J., Passarelli, A. L., Franz, A. W. Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 10 (3), (2015).
  12. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  13. Liu, T., et al. Construction of an efficient genomic editing system with CRISPR/Cas9 in the vector mosquito Aedes albopictus. Insect Science. 26 (6), 1045-1054 (2019).
  14. Itokawa, K., Komagata, O., Kasai, S., Ogawa, K., Tomita, T. Testing the causality between CYP9M10 and pyrethroid resistance using the TALEN and CRISPR/Cas9 technologies. Scientific Reports. 6, 24652 (2016).
  15. Li, M., Li, T., Liu, N., Raban, R. R., Wang, X., Akbari, O. S. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29, 214-220 (2019).
  16. Anderson, M. E., et al. CRISPR/Cas9 gene editing in the West Nile Virus vector, Culex quinquefasciatus Say. PloS one. 14 (11), (2019).
  17. Van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends in Biochemical Sciences. 34 (8), 401-407 (2009).
  18. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  19. Monnerat, A. T., et al. Anopheles albitarsis embryogenesis: morphological identification of major events. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 97 (4), 589-596 (2002).
  20. Davis, C. W. C. A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae). Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).
  21. Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (29), 2967-2976 (2014).
  22. Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
  23. Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).
  24. Hwang, W. Y., et al. Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  25. Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).
  26. Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
  27. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).

Tags

علم الأحياء، العدد 163، تصميم دليل RNAs، micromanipulation، microinjection، جنين البعوض، فحص الطفرات، البعوض البيت الشمالي، تحرير الجينوم
إعداد وحقن أجنة البعوض <em>Culex</em> لتوليد الطفرات فارغة باستخدام CRISPR / Cas9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meuti, M. E., Harrell, R. Preparing… More

Meuti, M. E., Harrell, R. Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (163), e61651, doi:10.3791/61651 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter