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Biology

CRISPR/Cas9 का उपयोग करके नल उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए क्यूलेक्स मच्छरों के भ्रूण तैयार करना और इंजेक्शन लगाना

Published: September 10, 2020 doi: 10.3791/61651
Automatic Translation
1, 2
1Department of Entomology, The Ohio State University, 2Insect Transformation Facility, Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

Summary

CRISPR/Cas9 का उपयोग गैर-मॉडल जीवों में जीन समारोह की विशेषता के लिए तेजी से किया जाता है । यह प्रोटोकॉल बताता है कि कैसे Culex pipiensकी नॉक आउट लाइनों को उत्पन्न करने के लिए, इंजेक्शन घोला जा सकता है तैयार करने से, प्राप्त करने और मच्छर भ्रूण इंजेक्शन के लिए, साथ ही कैसे पीछे, पार करने के लिए, और स्क्रीन इंजेक्शन मच्छरों और वांछित म्यूटेशन के लिए उनकी संतान ।

Abstract

क्यूलेक्स मच्छर कई बीमारियों के प्रमुख वैक्टर हैं जो पश्चिम नील वायरस और कैनाइन हार्टवार्म और एलीफें हाथी जैसे फिलेरियल नेमाटोड के कारण होने वाली बीमारियों सहित मानव और पशु स्वास्थ्य को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं । हाल ही में, CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन का उपयोग Cas9 प्रोटीन को इंजेक्शन देकर साइट-निर्देशित उत्परिवर्तनों को प्रेरित करने के लिए किया गया है जिसे एक गाइड आरएनए (जीआरएनए) के साथ कई कीट प्रजातियों के हौसले से रखे भ्रूण में जटिल किया गया है, जिसमें मच्छर शामिल हैं जो जेनेरा एनोफेल्स और एडीज से संबंधित हैं। क्यूलेक्स मच्छरों में हेरफेर और इंजेक्शन लगाना थोड़ा अधिक कठिन है क्योंकि ये मच्छर मच्छरों की अन्य प्रजातियों की तरह व्यक्तिगत रूप से राफ्ट में अपने अंडे सीधे रखते हैं। यहां हम वर्णन करते हैं कि GRNAs को कैसे डिजाइन किया जाए, उन्हें Cas9 प्रोटीन के साथ जटिल किया जाए, क्यूलेक्स पिपियंस के मादा मच्छरों को अंडे देने के लिए प्रेरित किया जाए, और Cas9/gRNA के साथ माइक्रोइंजेक्शन के लिए नए रखे भ्रूण को कैसे तैयार और इंजेक्ट किया जाए। हम यह भी वर्णन करते हैं कि वांछित उत्परिवर्तन के लिए मच्छरों को पीछे और स्क्रीन कैसे किया जाए। प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि इस तकनीक का उपयोग क्यूलेक्स मच्छरों के जीनोम में साइट-निर्देशित म्यूटेशन को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है और मामूली संशोधनों के साथ, अन्य मच्छर प्रजातियों में भी नल-म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

क्यूलेक्स मच्छरों को दुनिया के समशीतोष्ण और उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में वितरित कियाजाताहै और वेस्ट नील वायरस 1 , सेंट लुइस इंसेफेलाइटिस2 के साथ -साथ फाइलेरिया नेमाटोड सहित कई घातक वायरस प्रसारित किए जाते हैं जो कैनाइन हार्ट कीड़ा3 और एलिफेंटियासिस 4 का कारणबनतेहैं । क्यूलेक्स पिपिएन्स कॉम्प्लेक्स के सदस्य, जिसमें सीएक्स. क्विंक्विफासिटस, सीएक्स पिपिएन्स पिपियंस और सीएक्स पिपियंस छेड़छाड़शामिल हैं, उनके जीव विज्ञान के कई पहलुओं में हड़ताली भिन्नताएं दिखाते हैं। उदाहरण के लिए, जबकि सीएक्स क्विंक्विफासिटस और सीएक्स पिपिएन्स छेड़छाड़ एक ओवरविंटरिंग निद्रा5, 6में प्रवेश करने में असमर्थहैं,सीएक्स पिपियंस पिपियंस मजबूत मौसमी प्रतिक्रियाएं प्रदर्शित करते हैं और कम दिनों7,8के जवाब में डायपोज दर्ज करते हैं। इसके अतिरिक्त, सीएक्स पिपियंस छेड़छाड़ अधिक मानवरूपी होते हैं जबकि सीएक्स पिपिएन्स और सीएक्स क्विंक्फासियस अधिक ज़ूफिलिक6होते हैं। हालांकि, संयुक्त राज्य अमेरिका में और दुनिया के कई अन्य स्थानों पर, इन प्रजातियों ने इंटरब्रीड किया, जिसमें सीएक्स के संकर के रूप में रोग संचरण के लिए मजबूत निहितार्थ हैं। पिपियंस पिपियंस छेड़छाड़ अवसरवादी फीडर हैं और पक्षियों और मनुष्यों दोनों कोकाटेंगे 9,जिससे पश्चिम नील वायरस के लिए पुल वेक्टर के रूप में कार्य करते हैं। क्यूलेक्स मच्छरों के जीव विज्ञान के इन और अन्य आकर्षक पहलुओं का अध्ययन करना, भाग में बाधा उत्पन्न किया गया है, क्योंकि क्यूलेक्स मच्छरों को एडीज मच्छरों की तुलना में प्रयोगशाला में पीछे करना थोड़ा अधिक कठिन होता है, जो10 क्विसेंट और डेसिकेशन प्रतिरोधी अंडे का उत्पादन करते हैं और क्योंकि कार्यात्मक आणविक उपकरण क्यूलेक्स प्रजातियों के लिए भी विकसित नहीं होते हैं।

CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन एक शक्तिशाली तकनीक है जिसका उपयोग मच्छरों की कई महत्वपूर्ण प्रजातियों11 , 12,13के जीव विज्ञान का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है, जिसमें दक्षिणी घर मच्छर, क्यूलेक्स क्विंक्विफासिटस14,15,16शामिल हैं । जेनिफर डौडना और इमैनुएल चार्पेंटियर द्वारा विकसित यह तकनीक बैक्टीरियल-व्युत्पन्न, CRISPR-संबद्ध एंडोन्यूक्लियस (कैस प्रोटीन; वान डेर ऊस्ट एट अल17)द्वारा समीक्षा देखें द्वारा वायरस के खिलाफ एक प्राकृतिक जीवाणु रक्षा का शोषण करती है । जब पशु भ्रूण में इंजेक्शन, एक उपयुक्त गाइड आरएनए के साथ संयोजन में Cas9 प्रोटीन जीनोम के भीतर डबल फंसे टूट का उत्पादन कर सकते हैं । यह सबसे अधिक बार Cas9 प्रोटीन का उपयोग करके किया जाता है जो गाइड आरएनए के साथ जटिल होता है, जो जीनोम के एक विशिष्ट क्षेत्र में एंडोन्यूलेज गतिविधि को निर्देशित करता है। Cas9 प्रोटीन के बाद एक साइट विशिष्ट डबल फंसे तोड़ बनाया गया है, सेलुलर मशीनरी को दो तंत्र में से एक का उपयोग कर तोड़ने की मरंमत का प्रयास करता है । पहले गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने (एनएचईजे) के माध्यम से दोनों सिरों को एक साथ लिटिंग करने पर जोर देता है, जो त्रुटि-प्रवण है और अक्सर जीनोम में आउट-फ्रेम इंडालने और विलोपन पैदा करता है जिसके परिणामस्वरूप गैर-कार्यात्मक प्रोटीन हो सकते हैं, जिससे नॉक आउट उत्परिवर्तन उत्पन्न होता है। वैकल्पिक रूप से, सेलुलर मशीनरी को तोड़ने की सही ढंग से मरम्मत करने के लिए इसी तरह के दृश्यों को खोजने के द्वारा होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) का उपयोग कर सकती है। इसी तरह का अनुक्रम जीव के भीतर दूसरे गुणसूत्र द्वारा प्रदान किया जा सकता है (समीक्षा18देखें) । हालांकि, अगर मरम्मत अनुक्रम बिल्कुल मूल अनुक्रम से मेल खाता है, Cas9 प्रोटीन फिर से डीएनए में कटौती करने में सक्षम हो जाएगा । वैकल्पिक रूप से, शोधकर्ताओं ने एक दाता प्लाज्मिड भी शामिल कर सकते हैं जिसमें वैकल्पिक मरम्मत अनुक्रम के साथ लक्ष्य अनुक्रम के कट साइट के दोनों ओर समरूप दृश्य होते हैं- अक्सर एक फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन, मूल जीन का संशोधित संस्करण, या अन्य संशोधन- जिसे जीनोम में कॉपी और डाला जा सकता है, या "खटखटाया हुआ" होता है।

भ्रूण इंजेक्शन देते समय समय महत्वपूर्ण है, और कीड़ों में उत्परिवर्तन बनाने के लिए CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन का उपयोग करते समय यह विशेष रूप से मामला है। इसका कारण यह है कि Cas9 प्रोटीन और gRNAs में उत्परिवर्तन उत्पन्न करने की सबसे बड़ी क्षमता है, जब भ्रूण अपनी समकालिक स्थिति में होता है, इससे पहले कि सेलुलर झिल्ली का गठन होता है और जब भ्रूण के भीतर कई नाभिक सुलभ होते हैं। मच्छरों के लिए, नाभिक तापमान19के आधार पर, ओविपोशन के बाद परिधि ~ 2-4 घंटे तक पहुंचता है, और इसलिए इस समय से पहले सफल माइक्रोइंजेक्शन होना चाहिए। इसके अतिरिक्त, Cas9 प्रोटीन किसी भी परमाणु डीएनए में कटौती करेगा जो यह उपयोग कर सकता है, जैसे कि इंजेक्शन के परिणामस्वरूप व्यक्ति में कोशिकाओं की पच्चीकारी होगी, कुछ वांछित उत्परिवर्तन होते हैं, और अन्य नहीं। आदेश में इन उत्परिवर्तनों को सफलतापूर्वक विरासत में मिला है, Cas9 प्रोटीन डीएनए कि अंकुरण में रहता है कि भविष्य के अंडे और शुक्राणु को जंम देना होगा में कटौती करनी चाहिए । यह सुनिश्चित करने के लिए कि म्यूटेशन जर्मलाइन में उत्पन्न होते हैं, भ्रूण के भीतर ध्रुव कोशिकाओं के स्थान के करीब सभी सामग्रियों को इंजेक्ट करना सबसे अच्छा होता है, जो कीट जर्मलाइन के जनक हैं। ध्रुव कोशिकाएं 20 क्यूलेक्स भ्रूण के पीछे के छोर के पास स्थित हैं । भ्रूण इंजेक्शन के अलावा, वांछित उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए संतानों को पार करने और स्क्रीनिंग के लिए एक सावधान योजना विकसित करना अनिवार्य है।

यह प्रोटोकॉल इस बात का वर्णन करता है कि इंजेक्शन मिक्स तैयार करने के लिए GRNAs उत्पन्न करें और उन्हें Cas9 प्रोटीन के साथ जटिल कैसे करें, साथ ही क्यूलेक्स पिपियंस के मादा मच्छरों को अंडे देने के लिए कैसे प्रेरित करें और CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन के लिए उन अंडों को कैसे तैयार और इंजेक्ट करें । इसके अतिरिक्त, हम वर्णन कैसे पीछे, पार और स्क्रीन इंजेक्शन भ्रूण और उनकी संतान की पुष्टि करने के लिए कि वांछित उत्परिवर्तन प्राप्त किया गया है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हमने क्यूलेक्स पिपियंसके बकेये तनाव में ब्याज, चक्रके जीन के लिए शून्य उत्परिवर्तन उत्पन्न किए। यह तनाव मूल रूप से कोलंबस, ओहियो में क्षेत्र एकत्र मच्छरों से २०१३ में स्थापित किया गया था और Meuti प्रयोगशाला द्वारा बनाए रखा है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग अतिरिक्त अध्ययनों के लिए किया जा सकता है जिसके लिए क्यूलेक्स मच्छरों के साथ-साथ अन्य मच्छर प्रजातियों में CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन की आवश्यकता होती है, और आम तौर पर, किसी भी कीट प्रजाति के लिए CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन को नियोजित करने के लिए प्रासंगिक है ।

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Protocol

अधिकांश अनुसंधान संस्थानों में, ट्रांसजेनिक कीड़े उत्पन्न होने या बनाए रखने से पहले एक अनुमोदित जैव सुरक्षा प्रोटोकॉल लागू होना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि आनुवंशिक रूप से संशोधित जीव प्रयोगशाला सुविधा से बच नहीं पाएंगे या हटा दिए जाएंगे । अतिरिक्त सरकारी विनियम भी लागू हो सकते हैं । इस प्रकृति की एक परियोजना शुरू करने से पहले, सभी संस्थागत नीतियों और प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए निर्धारित क्या दस्तावेजों और अनुमोदन की आवश्यकता है ।

1. GRNAs डिजाइनिंग और इंजेक्शन घोला जा सकता है तैयार

  1. डिजाइन 2-5 gRNAs प्रत्येक लक्ष्य जीन के लिए के रूप में कुछ gRNAs दूसरों की तुलना में बेहतर काम करते हैं । रुचि के जीन को लक्षित करने वाले जीआरएन का उपयोग या तो मैन्युअल रूप से डिज़ाइन किया जा सकता है या फिर चॉप-चॉप जैसे मुफ्त कार्यक्रमों का उपयोग किया जा सकता है।
  2. डिजाइन और ऑर्डर प्राइमर जो प्रत्येक जीएनए के चारों ओर 100-200 बीपी के टुकड़ों को बढ़ाएंगे। आदर्श रूप से, कट साइट पीसीआर उत्पाद के मध्य तीसरे से आधे हिस्से में स्थित होनी चाहिए। ध्यान दें कि कट की प्रत्येक साइट पर कितना बीपी पैदा होगा।
  3. जीआरएन प्राप्त करें।
    1. एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज, फिशर साइंटिफिक, जेनेस्क्रिप्ट और अन्य जैसी वाणिज्यिक कंपनियों से जीआरएएनए खरीदें। यह सबसे आसान विकल्प है।
    2. वैकल्पिक रूप से, बाद में आइसोथेमल संश्लेषण के लिए टेम्पलेट्स उत्पन्न करने के लिए पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग करके प्रयोगशाला में जीआरएएनए बनाएं। पोर्ट एट अल21 और किस्लर एट अल22द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल देखें ।
    3. प्लाज्मिड के माध्यम से जीआरएएनए प्रदान करें जो भ्रूण में इंजेक्ट किया जाता है। इस मामले में, GRNA U6 प्रमोटर द्वारा संचालित किया जाना चाहिए (विवरण के लिए 23,24 देखें) ।
  4. Cas9 प्रोटीन प्राप्त करें।
    1. आदेश Cas9 वाणिज्यिक फिशर वैज्ञानिक सहित कई कंपनियों से । यह सबसे आसान विकल्प है।
    2. बासु एट अल 25 और किस्लर एट अल22 के अनुसारकैस9प्रोटीन बनाएं और लैब में शुद्ध करें ।
    3. Cas9 mRNA को भ्रूण में इंजेक्ट करें, जहां बाद में इसका सक्रिय Cas9 प्रोटीन में अनुवाद किया जाएगा। Cas9 mRNA या तो इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन22 का उपयोग कर प्रयोगशाला में संश्लेषित किया जा सकता है या सिग्मा जैसे विक्रेताओं से खरीदा जा सकता है।
      नोट: अनुवादित Cas9 प्रोटीन सी-टर्मिनस पर एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत (NLS) शामिल होना चाहिए, और इसलिए एनएलएस भी इंजेक्शन Cas9 mRNA में मौजूद होना चाहिए ।
    4. प्लाज्मिड-आधारित अभिव्यक्ति के माध्यम से वीवो में एक्सप्रेस Cas9 प्रोटीन। इस मामले में, एक भ्रूणीय प्रमोटर द्वारा संचालित प्लाज्मिड पर Cas9 की अभिव्यक्ति करना सबसे अच्छा है जिसे लक्षित प्रजातियों में अच्छी तरह से चिह्नित किया गया है।
      नोट: आज तक, भ्रूणीय प्रमोटरों को क्यूलेक्स मच्छरों में अच्छी तरह से विशेषता नहीं दी गई है, और इसलिए शुद्ध प्रोटीन या Cas9 mRNA इंजेक्शन की सिफारिश की जाती है।
  5. कैस 9 प्रोटीन के साथ जीआरएएनए को जटिल करें, जो किस्टलर एट अल22से अनुकूलित है।
    1. यदि एक साथ GRNA के साथ Cas9 प्रोटीन इंजेक्शन (सिफारिश की), सुनिश्चित करें कि Cas9 प्रोटीन की अंतिम सांद्रता ३०० एनजी/μL है और एक ही gRNA की अंतिम एकाग्रता ८० μg/μL है । प्रोटीन और एक व्यक्ति gRNA एक ०.२ एमएल पीसीआर ट्यूब में मिलाएं ।
    2. बर्फ पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  6. इन विट्रो परख (उदाहरण के लिए, गाइड-आईटी sgRNA स्क्रीनिंग किट) के साथ GRNAs का परीक्षण।
    1. पीसीआर का उपयोग करके प्रत्येक जीएनए के लिए कट साइट के चारों ओर टुकड़ों को बढ़ाना।
    2. पीसीआर उत्पादों को जेल पर चलाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे सही आकार के हैं। फिर, पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें और उन्हें यह सुनिश्चित करने के लिए अनुक्रम करें कि वे सही जीन क्षेत्र को लक्षित करें।
    3. Cas9 रिएक्शन बफर के 1 माइक्रोन के साथ बचे हुए शुद्ध पीसीआर उत्पाद के 200 एनजी, बीएसए के 1 माइक्रोन, कॉम्प्लेक्स Cas9 के 1.5 माइक्रोन के साथ मिलाएं: gRNA और कुल प्रतिक्रिया मात्रा 15 माइक्रोन करने के लिए लाने के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    4. उत्पाद को फिर से जेल पर चलाएं। यदि Cas9 प्रोटीन सफलतापूर्वक पीसीआर उत्पाद में कटौती, प्राथमिक बैंड को और अधिक बेहोश होना चाहिए और अतिरिक्त छोटे बैंड मौजूद होना चाहिए । मूल पीसीआर उत्पाद के आकार में कमी पर ध्यान दें, और, यदि वांछित हो, तो काटने की दक्षता का अनुमान लगाने के लिए बैंड तीव्रता में कमी की गणना करें।
  7. अंतिम इंजेक्शन मिश्रण की तैयारी
    1. प्रत्येक gRNA के लिए है कि सफलतापूर्वक अपने लक्षित पीसीआर उत्पाद में कटौती, प्रत्येक Cas9 और gRNA की मात्रा एक ०.५ एमएल ट्यूब में मिश्रण इस तरह है कि अंतिम मात्रा ३०० एनजी/Cas9 प्रोटीन के μL और प्रत्येक gRNA के ८० एनजी/μL रहता है ।
    2. जटिल Cas9 और gRNAs को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि उन्हें इंजेक्शन के लिए आवश्यक न हो जाए।

2. खींचने और सुई beveling

नोट: सफल इंजेक्शन और भ्रूण के अस्तित्व तेज सुई(चित्रा 1) कीआवश्यकता है ।

  1. या तो 1 मिमी बाहरी व्यास बोरोसिलिकेट या क्वार्ट्ज ग्लास माइक्रोकैपिलरी का उपयोग करें। खींचा जा रहा है पहले एक रासायनिक धुएं हुड में माइक्रोकैपिलरी सिलिकॉन।
    1. संक्षेप में, सिग्माकोट के 3 एमएल को ग्लास बीकर में रखें और वैक्यूम कम से कम 4 घंटे के लिए ग्लास माइक्रोकैपिलरी युक्त एक दूसरे बीकर में आकर्षित होता है, जिससे सिलिकॉनिंग समाधान को माइक्रोकैपिलरी की सभी सतहों पर वाष्पित और व्यवस्थित करने की अनुमति मिलती है।
    2. बाद में, धीरे-धीरे वैक्यूम चैंबर को स्टॉपकॉक वाल्व खोलकर परिवेश के दबाव के बराबर करने की अनुमति दें और हवा को कक्ष में लौटने की अनुमति दें। इसके बाद सुइयों को खींचने की तैयारी हो जाती है।
    3. उपयोग से पहले हमेशा सुई खींचने वालों के अनुदेश मैनुअल को पढ़ें।
      नोट: विस्तार से नीचे दिए गए निर्देश ग्लास सुई खींचने के लिए पी-2000 लेजर सुई पुलर का उपयोग कैसे करें। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एक ही ब्रांड के सभी सुई खींचने वालों को विभिन्न इकाइयों में बिल्कुल एक ही सुई खींचने के लिए कैलिब्रेट नहीं किया जाता है। अच्छी सुइयों को प्राप्त करने की कुंजी मापदंडों के दिए गए सेट पर शुरू करना है, फिर इन मूल्यों के ऊपर और नीचे के मापदंडों का उपयोग करके सुई खींचें। सुई कितनी अच्छी तरह भ्रूण पियर्स और कितनी अच्छी तरह इंजेक्शन मिश्रण सुई से बहती है मूल्यांकन करके इन मापदंडों में से प्रत्येक पर सुई का परीक्षण करें। जब तक सुई प्राप्त नहीं होती है तब तक मापदंडों को परिष्कृत करें जो खोलना या बेवेल करना आसान है, जो भ्रूण को आसानी से छेदता है और जो इंजेक्शन मिश्रण को आसानी से बचाता है।
  2. पी-2000 लेजर सुई खींचने का उपयोग कर सुई खींच
    1. लेजर सुई खींचने पर बारी और लेजर पहले पुल से पहले 15 मिनट के लिए गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं।
    2. कार्यक्रम ग्लास माइक्रोकैपिलरी ट्यूब के प्रकार के लिए मशीन (किसी भी सुई खींचने वाले मापदंडों को याद रखें एक प्रारंभिक बिंदु है क्योंकि सुई खींचने वालों को सभी पुलर्स में एक ही सुई का उत्पादन करने के लिए कैलिब्रेट नहीं किया जाता है):
      क्वार्ट्ज: हीट = 730; फिल = 4; वेल = 40; डेल = 122; पुल = 156
    3. सुई खींचने के बाद, एक माइक्रोकैपिलरी लोड करें और इसे जगह में दबाएं, केवल माइक्रोकैपिलरी ट्यूब के अंत को छूने का ख्याल रखते हैं और लेजर द्वारा गर्म किए जाने वाले क्षेत्र को नहीं।
    4. माइक्रोकैपिलरी को क्लैंप करने के बाद, उंगली सलाखों पर अंगूठे और तर्जनी रखें और फिर वसंत को एक बार में एक रिलीज करके पुल सलाखों को छोड़ दें।
    5. पूरी तरह से एक साथ सलाखों को खींचने के लिए अंगूठे और तर्जनी निचोड़ें।
    6. अपने क्लैंप में माइक्रोकैपिलरी ट्यूब के दूसरे पक्ष को इस तरह रखें कि ट्यूब का एक छोटा सा हिस्सा दोनों तरफ से फैली हुई है। यह सुनिश्चित करने के लिए क्लैंप को कस लें कि दोनों क्लैंप उंगली से तंग हैं और वे "पुल बार" को दृढ़ता से रखते हैं।
    7. पुलर पर सुरक्षात्मक कफन बंद करें।
    8. पुल बटन दबाएं और लेजर ग्लास को गर्म करना शुरू कर देगा, जो कफन के नीचे स्थित लाल "लेजर ऑन" प्रकाश द्वारा इंगित किया गया है। पुल पूरा हो गया है जब पुल सलाखों को पूरी तरह से अलग कर रहे हैं, एक धातु thud के साथ ।
    9. सुनिश्चित करें कि कफन उठाने से पहले "लेजर ऑन" प्रकाश प्रकाश नहीं है।
    10. माइक्रोकैपिलरी ट्यूब के छोटे से अंत को पकड़ें जो अंगूठे और तर्जनी के साथ क्लैंप से परे फैली हुई है और क्लैंप को ढीला कर रही है। फिर क्लैंप से माइक्रोकैपिलरी ट्यूब को उठाएं।
    11. दो तरफा टेप के साथ लाइन में खड़ा एक वर्ग पेट्री डिश में माइक्रोकैपिलरी ट्यूब को ध्यान से रखने के लिए संदंश का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि सुई को होल्डिंग बॉक्स में रखते समय सुई का पीछा सिरा पहले छूता है और सुई को धीरे-धीरे जगह में उतारा जाता है ताकि तेज टिप क्षतिग्रस्त न हो।
  3. पीसी-10/पीसी-100 सुई खींचने वाला का उपयोग कर सुई खींच
    1. 4 वजन का उपयोग करके पीसी-10 पुलर सेट करें और एक कदम खींचने के लिए 50.4 डिग्री सेल्सियस के लिए अस्थायी सेट करें।
    2. शीर्ष क्लैंप में एक बोरोसिलिकेट ग्लास माइक्रोकैपिलरी रखें। फिर भारित नीचे क्लैंप को स्थिति में उठाएं और माइक्रोकैपिलरी के निचले हिस्से को दबाएं, जिससे यह सुनिश्चित किया जा सके कि केशिका दो अच्छी सुइयों को खींचने की स्थिति में है। यह एक जगह लंबे पुल चक्र है, लेकिन यह beveling के लिए अच्छी सुई पैदा करता है ।
  4. बेवेलिंग सुई।
    नोट: गीले beveling की यह विधि सुई के सापेक्ष खोलने के आकार पर वास्तविक समय प्रतिक्रिया देता है ।
    1. घर्षण प्लेट को इकट्ठा करें और सुई बेवेलर की अंगूठी को बनाए रखें। सुनिश्चित करें कि घर्षण प्लेट का ग्रे साइड ऊपरी और निचले बनाए रखने की अंगूठी के बीच ऊपर की ओर उन्मुख है। बनाए रखने की अंगूठी पर शिकंजा कस, पेंच से पेंच के लिए बारी सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक पेंच समान रूप से कड़ा है। घर्षण प्लेट और बनाए रखने के छल्ले इसके बाद पीसने विधानसभा के रूप में संदर्भित किया जाएगा ।
    2. ऑप्टिकल फ्लैट सतह पर आसन तेल की 13 बूंदें (~ 520 माइक्रोन) रखें, और फिर प्लेट के शीर्ष पर पीसने वाली असेंबली रखें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे विधानसभा रखें, और फिर बेलेवर चालू करें। सूटर की सिफारिश की तुलना में थोड़ा अतिरिक्त तेल का उपयोग किया जाता है, क्योंकि यह इस गीले बेवेलिंग विधि के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किए जाने पर घर्षण प्लेट को लंबी अवधि के लिए घूमते रहता है।
    3. पीसने वाली सतह में 1% फोटो-फ्लो समाधान जोड़ें और बाती को स्थिति में ले जाएं ताकि यह फोटो-फ्लो समाधान में डूबे।
    4. मुख्य स्रोत पर हवा चालू करें। फिर धारक में एक खींची गई बोरोसिलिकेट सुई रखें और बनाए रखने की अंगूठी को कस दें। नियामक पर हवा चालू करें और जब तक दबाव 26 पीएसआई तक नहीं पहुंच जाता तब तक बढ़ें।
    5. साइड से देखते हुए, मोटे समायोजन घुंडी का उपयोग करके सुई को कम करें जब तक कि यह फोटो-फ्लो तरल सतह को लगभग छू न जाए।
    6. देखने के क्षेत्र में सुई का पता लगाने के लिए माइक्रोस्कोप समायोजित करें। सबसे कम आवर्धन पर शुरू करें और आवर्धन बढ़ाएं। मोटे समायोजन घुंडी का उपयोग करके सुई की स्थिति को ध्यान से समायोजित करें जब तक कि यह फोटो-फ्लो तरल की सतह को छू न जाए।
    7. मोटे समायोजन घुंडी का उपयोग करना और माइक्रोस्कोप के नीचे देखना जारी रखना, सुई को तब तक कम करें जब तक कि यह घर्षण सतह के करीब न हो लेकिन इसे छू न जाए।
    8. ठीक समायोजन घुंडी का उपयोग करना, ध्यान से और धीरे-धीरे सुई को कम करना, सुई पर करीब से ध्यान देना और यह बेवेलर की घर्षण सतह पर छोड़ता है। जब सुई और उसकी छाया की तरह वे घर्षण सतह को छूने के बारे में हैं, सुई को और भी धीरे और ध्यान से कम करने के लिए जारी है ।
    9. सुई को घर्षण सतह पर कम करके "बेवेल" देने के बीच वैकल्पिक, और फिर इसे बढ़ाते हुए। सुई उठाने से पहले, जल्दी से ठीक समायोजन घुंडी पर माइक्रोमीटर पर सेटिंग ध्यान दें ताकि सुई को एक ही स्थिति में उतारा जा सके या यदि आवश्यक हो, तो थोड़ा कम स्थिति में। फोटो-फ्लो तरल परत के नीचे सुई रखने के लिए याद रखें। एक बार सुई घर्षण सतह के ऊपर उठाया गया है, जल्दी से बंद करो और बुलबुले के लिए जांच करने के लिए beveler के रोटेशन पुनः आरंभ । यदि सुई को पर्याप्त रूप से beveled किया गया है, तो हवा के बुलबुले सुई से और फोटो-फ्लो में प्रवाहित होने चाहिए। यदि प्लेट बंद नहीं की जाती है, तो बुलबुले तब तक दिखाई नहीं देंगे जब तक कि सुई खोलना बहुत बड़ा न हो जाए।
    10. यदि कोई बुलबुले दिखाई देते हैं जब सुई घर्षण सतह के ऊपर उठाया जाता है और बेलेलर बंद हो गया है, तो बेवेलिंग प्रक्रिया को दोहराएं, सुई को ठीक समायोजन घुंडी पर स्थित माइक्रोमीटर पर थोड़ा कम स्थिति में कम करें, सुई को बढ़ाएं, सुई को रोकें, बेवेलर प्लेट को रोकें और हवा के बुलबुले के लिए जांच करें। बुलबुले की एक छोटी लेकिन स्थिर धारा दिखाई देने तक दोहराएं।
    11. एक बार हवा के बुलबुले मौजूद होने के बाद, घर्षण प्लेट को रोककर और हवा के दबाव को कम करके सापेक्ष उद्घाटन आकार की जांच करें, पीएसआई को ध्यान में रखते हुए, जिस पर बुलबुला गठन बंद हो जाता है, क्योंकि यह बेवल सुई के उद्घाटन के आकार का एक सापेक्ष संकेत है। जिस दबाव पर हवा सुई टिप से बचने से रोकती है, वही कम होती है, सुई खोलने में बड़ी होती है। सुई उस बिंदु पर होती है जिस पर बुलबुले 18-20 पीएसआई पर सुई से बचने से रोकते हैं, इंगित करता है कि सुई में अपेक्षाकृत छोटा उद्घाटन होता है और माइक्रोइंजेक्शन के लिए उपयोग किए जाने पर भ्रूण को न्यूनतम क्षति होनी चाहिए।
    12. सुई खोलने की जांच करने के बाद, सुई में प्रवेश करने से तरल को रोकने के लिए हवा के दबाव को 26 साई तक बढ़ाएं। फिर मोटे समायोजन घुंडी का उपयोग करके सुई को फोटो-फ्लो परत से ऊपर और बाहर उठाएं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जब तक हवा सुई से बाहर बह रही है फोटो-फ्लो सुई में प्रवेश नहीं करता है, और इसलिए सुई के अंदर संदूषण से संरक्षित है।
    13. एक बार सुई फोटो-फ्लो से बाहर निकल जाने के बाद हवा बंद कर दें और सुई धारक से सुई निकाल लें।
    14. संदंश का उपयोग करना, नई beveled सुई को पेट्री डिश में रखें जिसमें इसे रखने के लिए या तो दो तरफा टेप या मॉडलिंग क्ले है। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि 10-20 बेवेल्ड सुई का उत्पादन न हो जाए।

3. मच्छरों की माता-पिता की पीढ़ी को रक्त-भोजन करना

  1. 25-27 डिग्री सेल्सियस पर स्पष्ट लंबे दिन की स्थितियों (>13 एच ऑफ लाइट/डे) के तहत सीएक्स पिपियंस मच्छरों का रियर लार्वा यह सुनिश्चित करने के लिए कि मच्छर अपने ओवरविंटरिंग निद्रा या डायपोज में प्रवेश न करें।
  2. पीक एडल्ट उद्भव के सात से दस दिन बाद हीटिंग यूनिट्स को बिजली सप्लाई में प्लग करके हीमोटेक झिल्ली फीडिंग सिस्टम तैयार करें । प्रत्येक इकाई के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस (मानव आंतरिक शरीर के तापमान) या 41 डिग्री सेल्सियस (चिकन आंतरिक शरीर के तापमान) को समायोजित करें इकाई के शीर्ष पर समायोजन पेंच का उपयोग करके। सुनिश्चित करें कि सही तापमान एक इलेक्ट्रिक थर्मामीटर का उपयोग कर तक पहुंच गया है।
  3. भोजन के लिए रक्त-भोजन जलाशय तैयार करें।
    1. प्रत्येक रक्त-भोजन सिलेंडर के लिए पैराफिल्म का एक वर्ग काटें, और नंगे पैरों के खिलाफ पैराफिल्म रगड़ें। यह मच्छरों के लिए आकर्षक सुगंध प्रदान करता है।
    2. पैराफिल्म को यथासंभव बारीकी से फैलाएं, और किनारों को भोजन जलाशय के चारों ओर कसकर लपेटें। यदि वांछित है, तो रबर ओ-रिंग के साथ जगह में सुरक्षित करें।
    3. ताजा या गल पूरे, सोडियम साइट्रेट-इलाज चिकन रक्त के 15 एमएल के लिए 0.1 एम एटीपी समाधान के लगभग 200 μL जोड़ें। एटीपी रक्त आहार को प्रोत्साहित करने में मदद करता है, और सोडियम साइट्रेट रक्त को कोगुलांग से रोकता है।
    4. जलाशय को पकड़ें ताकि पैराफिल्म साइड नीचे का सामना कर रहा हो, और जलाशय को भरने के लिए सावधानी से डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग करें। प्रत्येक जलाशय में ~ 3 एमएल रक्त होता है। प्लास्टिक प्लग के साथ भरने बंदरगाहों सील।
    5. हीटिंग इकाइयों में भोजन जलाशयों पेंच और मच्छर पिंजरे के शीर्ष पर जगह है कि पैराफिल्म पक्ष नीचे का सामना करना पड़ रहा है और मच्छर जाल के माध्यम से खिला सकते हैं ।
  4. शाम को अनुकरण करने के लिए काले कचरा बैग के साथ पिंजरों को कवर करें और प्रत्येक पिंजरे में तेजी से उड़ा दें क्योंकि बढ़ी हुई सीओ2 एकाग्रता रक्त-भोजन को उत्तेजित करती है।
  5. रक्त आहार को अधिकतम करने के लिए फीडर को पिंजरे पर 2-8 घंटे तक रखें। समय-समय पर जांच करें और उन महिलाओं के अनुपात पर ध्यान दें जिन्होंने रक्त भोजन लिया है (उनके लाल और डिटेन्ड पेट से स्पष्ट)।

4. वयस्क मच्छरों में अंडा बिछाने को प्रेरित करना

  1. रक्त आहार के चार से पांच दिन बाद, मच्छर अंडाशय के लिए 50 एमएल शंकु नली तैयार करें।
    1. शंकु नली के नीचे के पास एक ~ 20 मिमी छेद बनाएं।
    2. छेद को दो वर्गों (35 मिमी2)दंत बांध रबर के साथ कवर करें, एक क्षैतिज भट्ठा के साथ और दूसरा ऊर्ध्वाधर भट्ठा के साथ। शंकु नली के लिए दंत बांध के वर्गों संलग्न करने के लिए टेप का उपयोग करें।
    3. फिल्टर पेपर का 4.25 सेमी टुकड़ा 35 एमएम x 10 एमएम पेट्री डिश पर रखें और फिल्टर पेपर को 750 माइक्रोन डिस्टिल पानी के साथ गीला करें।
    4. फिल्टर पेपर पर शंकु नली उलटा और आगे और पीछे मोड़ कई बार सुनिश्चित करने के लिए कि यह सुरक्षित है ।
  2. अपने पिंजरे से सीएक्स पिपियन की ~ 10 महिलाओं को ध्यान से हटाने और उन्हें तैयार शंकु नली में स्थानांतरित करने के लिए एक मुंह एस्पिरेटर का उपयोग करें।
  3. मच्छरों को अंधेरा प्रदान करने के लिए शंकु नली पर एक अपारदर्शी सिलेंडर रखें क्योंकि यह अंडे बिछाने को उत्तेजित करता है, और 20-25 मिनट इंतजार करें।

5. सूक्ष्म हेरफेर हौसले से रखी Culex अंडे

  1. माइक्रोइंजेक्शन के लिए मच्छर भ्रूण को संलग्न करने के लिए स्लाइड तैयार करें।
    1. कवर ग्लास की चौड़ाई में दो तरफा टेप का एक टुकड़ा संलग्न करें।
    2. पारदर्शी चिकित्सा ड्रेसिंग (जैसे, टेगडर्म, 2-3 मिमी चौड़ा) की एक पतली पट्टी को डबल-तरफा टेप में संलग्न करें ताकि यह कवर ग्लास के छोटे अंत के समानांतर चलता है और कवर ग्लास के अंत से लगभग 5 मिमी तैनात है।
    3. एक तेज रेजर ब्लेड के साथ अतिरिक्त डबल-तरफा टेप निकालें, और कवर ग्लास के प्रत्येक छोर से 2-3 मिमी चिकित्सा ड्रेसिंग और डबल-तरफा टेप हटा दें। यह अंडे को कवर ग्लास पर चढ़ने के बाद स्लाइड पर तेल की एक परत रहने की अनुमति देता है।
    4. एक मोम पेंसिल का उपयोग करना, डबल तरफा टेप और चिकित्सा ड्रेसिंग की पट्टी के आसपास एक "डी" आकार आकर्षित । यह इंजेक्शन के बाद अंडे के आसपास पानी को पकड़ने के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करेगा।
  2. स्लाइड तैयार होने के बाद और 20-25 मिनट बीत चुके हैं, अपारदर्शी ट्यूब को हटा दें और यह निर्धारित करें कि मच्छरों ने कोई अंडे रखे हैं या नहीं।
    1. यदि नहीं, तो उन्हें एक और 5-10 मिनट के लिए कवर करें।
    2. यदि मच्छरों ने अंडे रखे हैं, तो ध्यान से लेकिन जल्दी से शंकु नली को उठाएं और टोपी के साथ कवर करें। मच्छरों को एक अलग पिंजरे में रखें, और उस समय को रिकॉर्ड करें कि अंडे स्प्रेडशीट पर एकत्र किए गए थे। फिर अंडे राफ्ट युक्त फिल्टर पेपर में डीआई पानी का 50-100 माइक्रोन जोड़ें।
  3. अंडों को विच्छेदन माइक्रोस्कोप लाइन के नीचे।
    1. फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा (10 मिमी x 30 मिमी आयत तेज प्रवाह दर के साथ मोटे फिल्टर पेपर से काटा जाता है) 24 मिमी x 40 मिमी कवर ग्लास के तहत इस तरह की स्थिति है कि कवर ग्लास फिल्टर पेपर के बाएं हाथ की ओर का 50-60% कवर करता है।
    2. डीआई पानी के 50 माइक्रोन के साथ फिल्टर पेपर गीला। पानी कवर ग्लास के नीचे धीरे-धीरे फैल जाएगा, जिससे फिल्टर पेपर और माइक्रोमैनिमुलेशन के दौरान अंडे गीले रखने के लिए एक जलाशय बन जाएगा। पानी की सही मात्रा लागू होने पर कवर ग्लास और फिल्टर पेपर के बीच एक मेनिस्कस बनेगी।
    3. एक ठीक पेंट ब्रश का उपयोग कर उनके अंडे राफ्ट से अंडे अलग, और स्थिति इतना है कि भ्रूण के संकीर्ण, पीछे अंत कवर ग्लास (बाएं) को छू रहा है और व्यापक, पूर्वकाल अंत सही करने के लिए है ।
    4. अंडे को 20 मिनट के लिए संरेखित करें, ध्यान से एक दूधिया सफेद से एक बहुत हल्के भूरे रंग में उनके रंग के परिवर्तन को देख रहे हैं। नियमित रूप से कवर ग्लास के नीचे पानी फिल्म का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहां पानी की एक पर्याप्त मात्रा में है । यदि अंडे सूखते दिखाई देते हैं, तो फिल्टर पेपर में थोड़ी मात्रा में डीआई पानी (20-30 माइक्रोन) जोड़ें।
    5. 20 मिनट के बाद, शेष सभी अंडे त्याग दें।
  4. अंडे को माइक्रोइंजेक्शन स्लाइड में ट्रांसफर करें।
    1. संतृप्त फिल्टर पेपर के किनारे से पानी बाती करने के लिए मोटे फिल्टर पेपर के एक छोटे (10 मिमी x 30 मिमी) टुकड़े का उपयोग करें, और संदंश के साथ बाती फिल्टर पेपर को हटा दें। यह सुनिश्चित करने के लिए 2-3 बार दोहराएं कि अंडे के साथ फिल्टर पेपर जितना संभव हो उतना सूखा है।
    2. फिल्टर पेपर का एक ताजा, सूखा आयत बिछाएं और इसे एक जोड़ी संदंश के साथ रखें। गठबंधन अंडे से दूर, बाईं ओर कवर ग्लास को ध्यान से खींचें।
    3. गठबंधन अंडे वाले छोटे फिल्टर पेपर को परेशान किए बिना मंच पर अतिरिक्त पानी सुखाएं। अंडे के साथ गीले फिल्टर पेपर को कई बार सुखाते रहें, अंगूठे और/या संदंश के साथ फिल्टर पेपर के छोटे आयतों पर दबाव डालने के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंडे इंजेक्शन स्लाइड में स्थानांतरित करने से पहले जितना संभव हो उतना शुष्क हैं।
    4. संदंश का उपयोग करना, बढ़ते स्लाइड से चिकित्सा ड्रेसिंग की पट्टी के बंद कागज का समर्थन हटा दें ।
    5. एक अंगूठे और मध्यम उंगली और उजागर चिकित्सा ड्रेसिंग नीचे का सामना करना पड़ के साथ बढ़ते स्लाइड पकड़ो, और गठबंधन अंडे की रेखा पर एक ४५ ° कोण पर कम । स्लाइड को ऐसी स्थिति दें कि अंडे (बाएं) का व्यापक, पूर्वकाल का अंत चिकित्सा ड्रेसिंग के अंत से थोड़ा लटका हुआ है, क्योंकि यह क्यूलेक्स लार्वा की क्षमता को सफलतापूर्वक घुड़सवार अंडों से हैच करने की क्षमता को बढ़ाता है।
    6. कवर ग्लास के नीचे के लिए प्रेस इंडेक्स फिंगर, अंगूठे और मध्यम उंगली के बीच कवर ग्लास को पकड़ना जारी रखते हुए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी गठबंधन अंडे दृढ़ता से चिकित्सा ड्रेसिंग से जुड़े हुए हैं।
    7. तुरंत कवर ग्लास को उलटा दें ताकि अंडे का सामना करना पड़ रहा हो, और अंडे के लिए तेल हेलोकार्बन तेल (2-3 बूंदें; ~ 20 माइक्रोल) की एक पतली परत लागू करें। यह माइक्रोइंजेक्शन के दौरान अंडों को गाद निकालने से रोकता है। किसी भी अंडे को हटा दें जो चिकित्सा ड्रेसिंग से जुड़ा नहीं है या तेल द्वारा कवर नहीं किया गया है।
    8. माइक्रोइंजेक्शन के लिए परिवहन के लिए गीले फिल्टर पेपर के एक बड़े वर्ग के साथ एक वर्ग पेट्री डिश के अंदर का सामना कर रहे घुड़सवार अंडे के साथ ग्लास कवर रखें।

6. क्यूलेक्स भ्रूण इंजेक्शन

  1. इंजेक्शन मिश्रण के साथ इंजेक्शन सुइयों को वापस भरना
    1. एक सुई भराव या जेल लोडिंग टिप चुनें जो चयनित इंजेक्शन सुई के पीछे के अंत में आसानी से फिट होगा, और सुई भराव और इंजेक्शन सुई के अंत के बीच थोड़ी जगह होगी।
    2. ध्यान से इंजेक्शन सुई में इंजेक्शन मिश्रण (~ 0.5-1 μL) की एक और छोटी बूंद जगह, सुई भराव का उपयोग करने के लिए वापस भरने सुई । इंजेक्शन मिश्रण की बूंद को उस जगह रखें जहां इंजेक्शन सुई टेपर करना शुरू करती है।
  2. इंजेक्शन सुई को माइक्रो इंजेक्टर से अटैच करें।
  3. माइक्रोस्कोप के चरण पर भ्रूण युक्त स्लाइड रखें।
  4. सुई खोलना
    नोट: यदि beveled सुइयों का उपयोग कर, यह आवश्यक नहीं है ।
    1. ~ 30 पीएसआई के एक शुरुआती इंजेक्शन दबाव का उपयोग करें और इंजेक्शन मिश्रण की एक उचित मात्रा देने के लिए आवश्यक के रूप में समायोजित करें।
    2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, भ्रूण के ऊपर सुई की स्थिति, और ध्यान से भ्रूण पर सुई कम करने के लिए माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करें। एक बार सुई मुश्किल से भ्रूण को छू रहा है, जल्दी से सुई की लंबवत धुरी के लिए भ्रूण ले जाएँ।
    3. यह निर्धारित करने के लिए कि सुई सफलतापूर्वक खोली गई थी, इंजेक्शन ट्रिगर दबाएं और देखें कि क्या सुई से कोई बुलबुले/इंजेक्शन मिश्रण बच जाता है। यदि नहीं, तो सुई के खिलाफ भ्रूण को तब तक दोहराएं जब तक सुई खुली न हो और ट्रिगर दबाए जाने पर इंजेक्शन मिश्रण बच न जाए।
  5. भ्रूण इंजेक्शन
    1. माइक्रोस्कोप में देखने के केंद्र में लाइन में पहले भ्रूण की स्थिति और यह सुनिश्चित करें कि यह ध्यान में है ।
    2. सुई को पहले अंडे पर रखें, माइक्रोस्कोप के भीतर देखने के क्षेत्र के केंद्र के भीतर भी।
    3. उत्तरोत्तर माइक्रोस्कोप पर आवर्धन बढ़ाएं, ध्यान से सुई को कम करने के लिए इसे पहले भ्रूण के ठीक ऊपर रखें, केंद्रित और ध्यान में। जब तक माइक्रोस्कोप अपने उच्चतम आवर्धन तक पहुंच गया है और दोनों भ्रूण और सुई ध्यान में हैं।
    4. ध्यान से मंच पर भ्रूण को थोड़ा बाईं ओर ले जाएं और सुई को थोड़ा कम करें ताकि सुई और भ्रूण अब देखने के एक ही विमान में हों।
    5. भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए माइक्रोस्कोप चरण का उपयोग करना, ध्यान से और धीरे से सुई की नोक पर भ्रूण को छूने। भ्रूण के संकीर्ण, पीछे के अंत को थोड़ा मोड़ना चाहिए। यदि यह बहुत अधिक या बहुत कम है तो सुई की ऊंचाई को समायोजित करें।
    6. माइक्रोस्कोप चरण का उपयोग करके, भ्रूण के पीछे के छोर को सुई पर ले जाएं और मच्छर अंडे के कोरियोन को भेदने वाली सुई का निरीक्षण करें। सुई सिर्फ Culex भ्रूण के भीतर ध्रुव कोशिकाओं के अनुमानित स्थान में झिल्ली घुसना चाहिए। एक बार ऐसा होने पर, इंजेक्शन को भ्रूण में इंजेक्शन मिश्रण शूट करने के लिए 1-3 बार ट्रिगर करें। इंजेक्शन मिश्रण की एक छोटी राशि वितरित करें, बस पर्याप्त है कि भ्रूणप्लाज्म में एक छोटे से समाशोधन का पता लगाया जा सकता है।
    7. मंच का उपयोग करना, भ्रूण को दाईं ओर ले जाएं, सुई की नोक को दूर और बंद करें। यदि इंजेक्शन अच्छी तरह से चला गया, कोई तरल पदार्थ भ्रूण से रिसाव करना चाहिए ।
    8. मंच को नीचे ले जाएं ताकि लाइन में अगला भ्रूण सुई के सामने तैनात हो। फिर, मंच को बाईं ओर ले जाएं, इंजेक्शन सुई पर भ्रूण को स्थिति में रखें और इंजेक्शन ट्रिगर खींचें।
    9. यदि इंजेक्शन मिश्रण बाहर आ रहा है और/या यदि सुई निकालने के बाद भ्रूण से तरल पदार्थ की एक बड़ी मात्रा में बच प्रतीत नहीं होता है, इंजेक्शन सुई की जगह और फिर से शुरू करते हैं ।
    10. किसी भी संयुक्त राष्ट्र के इंजेक्शन या क्षतिग्रस्त अंडे को नष्ट करें।
  6. इंजेक्शन के बाद भ्रूण के लिए प्रवृत्त
    1. स्लाइड पर सभी भ्रूण इंजेक्शन के बाद, एक धार की बोतल के साथ रिवर्स ऑस्मोसिस पानी लागू करके हेलोकार्बन तेल को धो लें, जैसे कि पानी की धारा इंजेक्शन भ्रूण के ऊपर ग्लास कवरलिप के शीर्ष पर निर्देशित होती है और पानी को कवर्लिप के नीचे प्रवाहित करने और भ्रूण पर तेल को कुल्ला करने की अनुमति देती है। यह नुकसान या उन्हें चिकित्सा ड्रेसिंग से अलग हो सकता है के रूप में सीधे भ्रूण पर पानी की धारा प्रत्यक्ष नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें। यह प्रक्रिया हेलोकार्बन तेल की सबसे अधिक, लेकिन सभी नहीं हटाती है।
    2. डीआई पानी के 150 माइक्रोन के साथ स्लाइड को कवर करें।
    3. एक वर्ग पेट्री डिश के अंदर गीले फिल्टर पेपर पर इंजेक्शन भ्रूण के साथ स्लाइड रखें ।
    4. एक पर्यावरण कक्ष में इंजेक्शन भ्रूण युक्त पेट्री पकवान रखें 25-27 डिग्री सेल्सियस, 70-80% आरएच के लिए सेट एक लंबे दिन फोटोपीरियोड (>13 एच प्रकाश/दिन) के साथ ।

7. इंजेक्शन भ्रूण (एफ0)वयस्कता के लिए पालन और पार की स्थापना

  1. इंजेक्शन भ्रूण की स्लाइडों की जांच करें, उम्मीद है कि इंजेक्शन के 1.5 दिन बाद 1.5 दिन में 1सेंट इंस्टार लार्वा निकलना चाहिए।
  2. 1सेंट इंस्टार लार्वा की संख्या गिनें, और 100-200 लार्वा को 450 मिली लीटर डीआई पानी के साथ एक शोबॉक्स आकार के टपरवेयर कंटेनर में रखें, और 50 मिलीग्राम ग्राउंड फिश भोजन करें। इस समय, 1-5 गुना अधिक कंटेनर बनाएं जिनमें जंगली प्रकार या गैर-इंजेक्शन लार्वा होते हैं जिनका उपयोग इंजेक्शन मच्छरों के साथ पार करने के लिए किया जाएगा।
  3. लार्वा को दैनिक रूप से खिलाएं, लार्वा जीवन के 6 वें दिन 300-500 मिलीग्राम तक पहुंचने तक प्रत्येक दिन प्राप्त भोजन की मात्रामें थोड़ी वृद्धि करें।
  4. एक बार pupae दिखाई देते हैं, एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करने के लिए एक 2 मिली माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में एक pupae जगह 50-75% DI पानी से भरा । सभी पिल्ले के लिए दोहराएं, दोनों पिल्ले जिन्हें भ्रूण के साथ-साथ यूनिजेनेक्टेड, जंगली प्रकार के पिल्ले के रूप में इंजेक्ट किया गया था। ढक्कन को सावधानी से दबाएं ताकि वे थोड़ा अजार हों, मच्छरों को बचने से रोकें लेकिन फिर भी थोड़ी मात्रा में गैस एक्सचेंज की अनुमति दें।
  5. एक बार वयस्क मच्छर अपने माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों के अंदर उभरते हैं, तो मादा मच्छरों को कुंवारी जंगली प्रकार के नर मच्छरों वाले पिंजरे में इंजेक्ट करें, हर इंजेक्शन वाली मादा के लिए कम से कम 1 जंगली प्रकार के पुरुष का अनुपात प्राप्त करें। इसी तरह, पुरुष मच्छरों को कुंवारी जंगली प्रकार की महिलाओं वाले पिंजरे में इंजेक्ट किया गया, जो हर इंजेक्शन वाले पुरुष के लिए लगभग 5-10 कुंवारी जंगली प्रकार की महिलाओं का अनुपात प्राप्त करता है। इंजेक्शन पुरुषों के लिए जंगली प्रकार की महिलाओं के एक उच्च अनुपात की सिफारिश की है के रूप में प्रत्येक पुरुष मच्छर कई बार दोस्त कर सकते हैं । इसलिए, जंगली प्रकार की महिलाओं की अधिक संख्या होने कि इंजेक्शन पुरुषों के साथ दोस्त F1 संतान की संख्या बढ़ जाती है कि उत्पादन किया जा सकता है ।

8. एफ1 मच्छरों को प्राप्त करना और पालना और म्यूटेशन के लिए उनकी स्क्रीनिंग करना

  1. वयस्क उद्भव के सात से दस दिन बाद, प्रत्येक पिंजरे में महिलाओं को रक्त भोजन प्रदान करें जैसा कि ऊपर वर्णित है (चरण 3)।
  2. खून भरने के चार दिन बाद, प्रत्येक पिंजरे में पानी रखें। प्रत्येक अंडा बेड़ा एक ही मादा मच्छर की संतान का प्रतिनिधित्व करता है, और इसलिए ओविपोजिशन के तुरंत बाद अपने प्लास्टिक, शोबॉक्स आकार के पालन कंटेनर में रखा जाना चाहिए। प्रत्येक कंटेनर को एक अद्वितीय पहचानकर्ता के साथ लेबल करें, और यह भी इंगित करें कि लार्वा ब्याज के जीन के लिए एफ1 पीढ़ी से संबंधित है, चाहे पुरुष या महिला माता-पिता को इंजेक्शन दिया गया हो, पैन की स्थापना की तारीख, पालन की स्थिति और प्रयोगकर्ता के प्रथमाक्षर।
  3. रोजाना लार्वा के पैन की निगरानी करें। जैसे ही पैन में लार्वा निकलता है, 50 मिलीग्राम जमीन मछली भोजन प्रदान करें। ऊपर वर्णित 6 दिनों के लिए दैनिक भोजन बढ़ाएं (चरण 7.3)।
  4. डीआई पानी के 1-1.5 एमएल के बीच युक्त 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में व्यक्तिगत प्यूपे स्थानांतरित करें, प्रत्येक ट्यूब को लेबल करें, और ढक्कन को क्रैक करें।
  5. एक बार वयस्क मच्छर उभरने के बाद, 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को सावधानी से खोलें, एक इंडेक्स फिंगर से कवर करें, और दूसरे हाथ का उपयोग करके, माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के शीर्ष पर 3 ड्राम ग्लास शीशी रखें। मच्छर की प्राकृतिक वृत्ति ऊपर और कांच की शीशी में उड़ने के लिए होना चाहिए। एक बार ऐसा होने पर, कांच की शीशी के उद्घाटन पर एक उंगली स्लाइड करें, और जल्दी से इसे उलटा करें, कपास की एक छोटी सी गेंद को रखें जिसे शीशी के शीर्ष में 10% सुक्रोज समाधान के साथ थोड़ा गीला किया गया है। यह मच्छर को बचने से रोकता है और एक आवश्यक भोजन और जल स्रोत प्रदान करता है।
  6. दोनों ट्यूब जिसमें प्यूपल एक्सुविया और वयस्क मच्छर युक्त ग्लास शीशी को लार्वा पैन से इंगित करने के लिए लेबल करें, जिससे यह उत्पन्न हुआ, मच्छर का लिंग, और उस व्यक्ति के लिए अद्वितीय पहचानकर्ता। पूर्व: द्वितीय.C. M32, जहां "द्वितीय" का प्रतिनिधित्व करता है कि पुरुष माता पिता इंजेक्शन था, "सी" पैन का प्रतिनिधित्व करता है/
  7. वयस्क मच्छरों को उनके व्यक्तिगत ग्लास शीशियों के भीतर पर्यावरण कक्ष में वापस रखें, और रोजाना अपने कपास के लिए 10% सुक्रोज समाधान की एक छोटी राशि (~ 20 μL) जोड़ें। सुनिश्चित करें कि कपास को ओवरफीड या संतृप्त न करें क्योंकि मच्छर सुक्रोज समाधान में फंस जाएंगे और मर जाएंगे।
  8. वांछित उत्परिवर्तन के लिए मच्छरों की स्क्रीनिंग
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार Phire प्रत्यक्ष पीसीआर किट का उपयोग कर लार्वा के प्रत्येक अंडे बेड़ा/पैन से 5-10 पुपल एक्सुविया से जीनोमिक डीएनए निकालें, साथ ही साथ 1-2 जंगली प्रकार के व्यक्तियों जो एक नियंत्रण के रूप में काम करेंगे ।
      नोट: प्रत्येक बेड़ा से संतान की संभावना पूर्ण भाई बहन हैं, प्रत्येक पैन से 5-10 लार्वा स्क्रीनिंग निर्धारित करेगा कि उत्परिवर्तन संतानों को पारित किया गया है या नहीं। यदि एक पैन से जांच किए गए लार्वा में से किसी में वांछित उत्परिवर्तन नहीं है, तो अतिरिक्त वयस्कों को स्क्रीन न करें। यदि कुछ लार्वा में उत्परिवर्तन होता है, तो उस पैन से हर व्यक्ति की जांच की जानी चाहिए।
    2. पहले से डिजाइन किए गए पीसीआर प्राइमर (चरण 1.2) का उपयोग करके, जंगली-प्रकार और एफ 1 संतान दोनों में Phire पीसीआर किट का उपयोग करके अपने उत्परिवर्तन के अनुमानित स्थान के चारों ओर टुकड़े को बढ़ाना और पीसीआर टुकड़ों को 3-4% एगर उठे जेल पर चलाने के लिए निर्धारित करें कि क्या कोई दृश्यमान सम्मिलन सम्मिलन या विलोपन (indels) हैं।
      नोट: किसी भी व्यक्ति है कि वांछित उत्परिवर्तन है विषम हो जाएगा और 2 बैंड, एक जंगली प्रकार और एक या तो थोड़ा कम या वांछित स्थिति में अब प्रदर्शित करना चाहिए । इन भेद करने के लिए, स्थिति और F1 संतान में बैंड में उन लोगों के साथ जंगली प्रकार के व्यक्तियों के बैंड की मोटाई की तुलना करें । आदर्श रूप से 2 असतत बैंड दिखाई देगा, लेकिन अगर इंडेल बहुत छोटा है, तो बैंड व्यापक और/या धुंधला दिखाई दे सकता है ।
    3. पीसीआर उत्पाद को या तो संदिग्ध इनडेल (अनुशंसित) वाले बैंड को उत्तेजित करके या शेष पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करके, जिसे जेल में लोड नहीं किया गया था। अनुक्रमण के लिए शुद्ध पीसीआर प्रस्तुत करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि वांछित उत्परिवर्तन मौजूद है या नहीं।

9. एफ2 और एफ3 मच्छरों को प्राप्त करना और पालन करना और उन्हें म्यूटेशन के लिए स्क्रीनिंग करना

  1. सभी एफ1 वयस्क मच्छरों को छोड़ दें जिनके लिए वांछित उत्परिवर्तन उनके व्यक्तिगत ग्लास शीशियों से अपने प्यूपल एक्सयूविया की स्क्रीनिंग करके और विपरीत लिंग के जंगली प्रकार, संयुक्त राष्ट्र-इंजेक्शन मच्छरों वाले पिंजरे में पाया गया था। इस दूसरी पीढ़ी के लिए बैकक्रॉसिंग इंजेक्शन और इनब्रीडिंग के सभी हानिकारक प्रभावों को दूर करना चाहिए।
  2. रक्त उत्परिवर्ती एफ1 मच्छरों और उनके जंगली प्रकार के समकक्षों के पिंजरों को खिलाएं जैसा कि पहले वर्णित है। चार से पांच दिन बाद, परिणामस्वरूप एफ2 अंडे राफ्ट इकट्ठा करें।
  3. ऊपर वर्णित एफ2 लार्वा को लेबल और पीछे करें, प्रत्येक अंडे के बेड़ा को एक अलग, लेबल वाले कंटेनर में रखें। पिल्ला पर, फिर से अलग-अलग 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में अलग-अलग प्यूप, और प्रत्येक वयस्क को उभरने पर सुक्रोज-लथपथ कपास के साथ छाया हुआ अलग ग्लास शीशियों में स्थानांतरित करें। फिर प्रत्येक एफ2 व्यक्ति के प्यूपल एक्सुविया को पहले वर्णित वांछित उत्परिवर्तन (चरण 8.5-8.8) स्क्रीन करें।
    नोट: यहां वांछित उत्परिवर्तन वाले सभी व्यक्ति विषम होंगे, और इसलिए पीसीआर उत्पाद को 3-4% एगर उठे जेल पर चलने पर आदर्श रूप से 2 अलग-अलग बैंड का उत्पादन करना चाहिए।
  4. एक बार उत्परिवर्ती एफ2 लार्वा की पहचान की गई है, सभी पुरुषों और महिलाओं को रखें जो साथी के लिए एक ही पिंजरे में उत्परिवर्तन है। वयस्क उद्भव के 7-10 दिन बाद रक्त फ़ीड, और 4-5 दिन बाद, एफ3 अंडे राफ्ट इकट्ठा करें।
  5. प्रत्येक एफ 3 अंडेबेड़ा को एक अलग लार्वा पालन कंटेनर में रखें, और ऊपर वर्णित लेबल और फ़ीड करें।
  6. एफ3 प्यूप को अलग-अलग 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में अलग करें। एक बार जब वयस्क उभरते हैं, तो उन्हें 10% सुक्रोज-लथपथ कपास के साथ छाया हुआ व्यक्तिगत ग्लास शीशियों में स्थानांतरित करें। पहले वर्णित पुपल एक्सुविया को स्क्रीन करें। इस बार, प्रत्येक पैन में लगभग 25% संतान शून्य उत्परिवर्तन के लिए होमोज़िगस होना चाहिए। इन व्यक्तियों को एक पिंजरे में रखें, और मच्छरों की नई उत्पन्न उत्परिवर्ती रेखा बनाने और बनाए रखने के लिए उनका उपयोग करें।
    नोट: यदि होमोज़िगस मच्छरों की कम संख्या मौजूद है, तो एफ4 पीढ़ी में अतिरिक्त होमोज़िगस-नल मच्छरों को उत्पन्न करने के लिए विषम एफ3 पुरुषों और महिलाओं को एक दूसरे के साथ पार किया जा सकता है।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम सीएक्स पिपियनके भ्रूण को सफलतापूर्वक इंजेक्ट करने में सक्षम थे, और इंजेक्शन भ्रूण (~ 55%, चित्रा 1)के बीच जीवित रहने की उच्च दर देखी गई। पहले के परीक्षणों में जीवित रहने का प्रतिशत कम था, संभावना है क्योंकि अंडे के कूप का पूर्वकाल चिकित्सा ड्रेसिंग पट्टी से जुड़ा हुआ था, मच्छर लार्वा को को कोरियन से बचने और सफलतापूर्वक पानी में तैरने से रोकता था। यह सुनिश्चित करना कि पूर्वकाल का अंत चिकित्सा ड्रेसिंग की पट्टी से परे बहुत बढ़ गया लार्वा अस्तित्व, और परिणामस्वरूप उच्च गुणवत्ता वाले संतान होते हैं जो वयस्कता और प्रजनन(चित्रा 2B)के लिए विकसित करने में सक्षम होते हैं।

बाद के प्रयोगों और स्क्रीनिंग से संकेत मिलता है कि सर्कैडियन घड़ी जीन चक्र के लिए शून्य उत्परिवर्तन (सीईसी) KM355981) इंजेक्शन भ्रूण(चित्रा 3)के जर्मलाइन में बनाया है । यह देखते हुए कि हमारे प्राइमर कट साइटों के पास cyc जीन के एक बड़े क्षेत्र परिलक्षित, यह विषम, एफ1 मच्छरों में दो अलग बैंड का पालन करने के लिए मुश्किल था । यह उन प्राइमर को डिजाइन करने की उपयोगिता को दर्शाता है जो कट साइट के चारों ओर ~ 100-200 बीपी वाले टुकड़ों को बढ़ाते हैं, और सभी संदिग्ध उत्परिवर्ती मच्छरों को अनुक्रमित करने का महत्व भी है। अनुक्रमण से पता चला है कि जांच मच्छरों के लगभग 10% पहले गाइड आरएनए कि हम डिजाइन किया था(चित्रा 3)के Cas9 कट साइट के पास एक छोटे से प्रविष्टि या हटाने से पता चला, सुझाव है कि यह एक बेहद प्रभावी gRNA था और है कि हम सफलतापूर्वक microinjections के दौरान ध्रुव कोशिकाओं को लक्षित । एफ1 व्यक्तियों ने सफलतापूर्वक संभोग किया और व्यवहार्य संतान (एफ2 पीढ़ी) का उत्पादन किया, जिनमें से कुछ में उत्परिवर्तन भी शामिल था।

Figure 1
चित्रा 1: एक बेवेल्ड बोरोसिलिकेट सुई का उदाहरण। यह सुई एक सिलिकॉनीकृत बोरोसिलिकेट माइक्रोकैपिलरी ट्यूब से बनाई गई थी, जिसे पीसी-10 ऊर्ध्वाधर सुई खींचने वाला का उपयोग करके खींचा गया था, और फिर बीवी-10 बेवेलर पर बनाया गया था। सुई ~ 63x आवर्धन के तहत देखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: उनके विकास में एफ0 पीढ़ी का अस्तित्व। (A)1सेंट इंस्टार लार्वा की छवि जो इंजेक्शन भ्रूण युक्त 3 स्लाइड्स से रची गई थी । (ख)प्रत्येक जीवन स्तर पर व्यक्तियों की संख्या का चित्रमय प्रतिनिधित्व । इंजेक्शन दिए गए 801 भ्रूणों में से 441 1सेंट इंस्टार लार्वा रची गई, और इन 149 व्यक्तियों में से पिल्ला पहुंच गया, जिसके परिणामस्वरूप कुल 121 वयस्क (73 पुरुष और 43 महिलाएं) थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: वांछित उत्परिवर्तन के संचरण को दर्शाने वाले प्रतिनिधि परिणाम। शीर्ष दो अनुक्रम क्यूलेक्स क्विंक्विफास्किटस (सीएक्स.क्विंक) में चक्र जीन के अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करते हैं; XP_001865023.1) और सीएक्स पिपियंस (डब्ल्यूटीई) की जंगली प्रकार की महिलाओं में। F; KM355981) । नीचे दिए गए दृश्य तीन पुरुष एफ1 संतानों (I.DM1) में दृश्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं; II.JM4; II.K10M) । ग्रीन बॉक्स Cas9 प्रोटीन (CGG) द्वारा मान्यता प्राप्त पाम अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि हरे तीर का प्रतिनिधित्व करता है जहां Cas9 प्रोटीन क्लीव्ड जीनोमिक डीएनए । इन परिणामों से पता चलता है कि एफ1 पुरुषों में 2 या 4 न्यूक्लियोटाइड के छोटे विलोपन विरासत में मिले थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल क्यूलेक्स मच्छरों के जीनोम में विशिष्ट उत्परिवर्तन पेश करने के तरीके प्रस्तुत करता है और इसका उपयोग अन्य मच्छरों के जीनोम को संपादित करने के लिए भी किया जा सकता है। प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है कि यह न केवल इंजेक्शन सामग्री तैयार करने का विशिष्ट विवरण प्रदान करता है, बल्कि मच्छरों को अंडे डालने के लिए प्रेरित करने के तरीके के साथ-साथ उन अंडों को कैसे तैयार करना और इंजेक्ट करना है, इसका एक विस्तृत वीडियो अवलोकन भी प्रदान करता है। हम यह भी संक्षेप में प्रस्तुत करते हैं कि व्यक्तिगत राफ्ट में अंडे देने के लिए महिला सीएक्स पिपियंस के जीव विज्ञान का लाभ कैसे उठाया जाता है और इस प्रकार वांछित उत्परिवर्तनों के लिए प्रत्येक महिला से संतान का एक छोटा अनुपात स्क्रीन किया जाता है। यहां प्रस्तुत किए गए तरीकों को सीएक्स पिपियंस के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन अन्य मच्छरों या कीड़ों के जीनोम को संपादित करने के लिए छोटे समायोजन के साथ अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यहां वर्णित माइक्रोमैनिमुलेशन और माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल कीट भ्रूण में कई अलग-अलग सामग्रियों को इंजेक्ट करने के लिए उत्तरदायी हैं, जिनमें ट्रांसोपसंस, डीएसआरएनए या अन्य एंडोन्यूक्लिस जैसे टैलेन्स या जिंक-फिंगर न्यूक्लियस शामिल हैं। इसके अलावा, बेवेलिंग प्रोटोकॉल चर खोलने के आकार के साथ माइक्रोइंजेक्शन सुई उत्पन्न करता है इसलिए सुई बनाते हैं जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार की इंजेक्शन सामग्री को इंजेक्शन लगाने के लिए किया जा सकता है। सुई के खुले आकार को धीरे-धीरे हवा के दबाव को कम करके अनुमानित किया जा सकता है क्योंकि सुई को बेव्वेित किया गया है, और यह ध्यान में रखते हुए कि हवा के बुलबुले नई खोली गई सुई की नोक से बहने से रोकते हैं। बुलबुले का उत्पादन करने के लिए आवश्यक कम हवा का दबाव इंगित करता है कि सुई में खोलने का आकार बड़ा होता है, और इसके विपरीत, उच्च हवा के दबाव से संकेत मिलता है कि सुई का एक छोटा उद्घाटन आकार होता है। एक बड़े उद्घाटन आकार के साथ सुई बड़े कणों और अधिक चिपचिपा सामग्री इंजेक्शन के लिए बेहतर कर रहे हैं, लेकिन संभावना भ्रूण को अधिक नुकसान का कारण होगा और इसलिए अस्तित्व को कम ।

माइक्रोइंजेक्शन प्रयोग कई मायनों में घड़ी के खिलाफ एक दौड़ रहे हैं । सबसे पहले, किसी को ओविपोशन के पहले 2 घंटों के भीतर व्यक्तिगत भ्रूण इंजेक्ट करना चाहिए, इससे पहले कि कोरीन कठोर हो जाए और ब्लास्टोडर्म गठन होता है। इसलिए, यह ध्यान रखना जरूरी है कि मच्छरों को पहली बार अंडाशय कक्ष में कब रखा गया था, इंजेक्शन के लिए अंडों में हेरफेर करने में कितना समय लगता है (हम 20-30 मिनट से अधिक नहीं की सलाह देते हैं), और सभी भ्रूणों को इंजेक्ट करने में कितना समय लगता है। समय भी सीमित है जब सीएक्स के रूप में म्यूटेशन के लिए वयस्क मच्छरों की स्क्रीनिंग। pipiens अपने परिवेश के प्रति काफी संवेदनशील होते हैं और मच्छर आम तौर पर केवल व्यक्तिगत ग्लास शीशियों में 3-5 दिनों तक जीवित रहते हैं। इसलिए, मच्छर प्यूपल एक्सयूविया को जितनी जल्दी हो सके स्क्रीन करना अनिवार्य है। वैकल्पिक रूप से, कोई भी एक मच्छर पैर14से जीनोमिक डीएनए निकाल सकता है। लेकिन ऐसा करने के लिए मच्छरों को सबसे पहले बर्फ पर एनेस्थेटाइज्ड करना चाहिए । जैसा कि हम थके हुए थे कि कैसे ठंडे उपचार और अंगों की हानि मच्छरों के अस्तित्व और उनके साथी और व्यवहार्य अंडे डालने की क्षमता को प्रभावित कर सकती है, हमने इसके बजाय म्यूटेशन के लिए फेंके गए प्यूपल एक्सुविया को स्क्रीन करने का फैसला किया। एक्सयूविया के भीतर जीडीएनए का स्तर मच्छर पैर के अंदर की तुलना में कम होने की संभावना है, और यह प्यूपल चरण में मच्छरों को अलग करने के लिए अतिरिक्त प्रयास और समय जोड़ता है, लेकिन यह भी सुनिश्चित करता है कि सभी वयस्कों को उनके उपयुक्त पिंजरों में छोड़े जाने पर बिना संतुष्ट किया जाता है, जो बिल्कुल महत्वपूर्ण है। हमें लगता है कि परिणाम इसके लायक हैं, लेकिन दूसरों को प्रोत्साहित करने पर विचार अगर एक पैर को हटाने उनके प्रयोगात्मक जरूरतों के लिए कार्रवाई का एक बेहतर पाठ्यक्रम हो सकता है ।

म्यूटेशन के लिए स्क्रीनिंग में तेजी लाने का सबसे अच्छा तरीका यह है कि एक जेनेटिक मार्कर युक्त प्लाज्मिड इंजेक्ट करें, जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन, कट साइट के दोनों तरफ समरूप दृश्यों से घिरा हुआ है। होमोलॉजी निर्देशित-मरम्मत (एचडीआर) का उपयोग करके नॉक-इन म्यूटेशन की दरें आम तौर पर गैर-मुताबिक़ अंत-जुड़ने (एनएचईजे), नॉक-आउट म्यूटेशन (एचडीआर = 0.71%; NHEJ =24.87%; 22)इसलिए, मार्कर की प्रविष्टि की संभावना बहुत कम आवृत्ति के साथ हो जाएगी, लेकिन परियोजना के आधार पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत मच्छर लार्वा को जल्दी से स्क्रीन करने में सक्षम होने से पेश की जाने वाली समय-बचत जोखिम के लायक हो सकती है। इसके अतिरिक्त, एचडीआर और नॉक-इन म्यूटेशन की दरों में वृद्धि की जाती है जब कोई भी Cas9 प्रोटीन के आनुवंशिक अनुक्रम वाले प्लाज्मिड को इंजेक्ट करता है, जो एक अच्छी तरह से विशेषता वाले भ्रूणीय प्रमोटर द्वारा संचालित होता है, और यू6 प्रमोटर24,26द्वारा संचालित जीआरएनए। यह संभावना है क्योंकि भ्रूण विकास में जल्दी, जब नाभिक तेजी से विभाजित कर रहे है (सेल चक्र के एस चरण), त्रुटि प्रवण लेकिन समीचीन NHEJ तंत्र के लिए डबल फंसे टूट की मरंमत की पसंदीदा विधि प्रतीत होता है(18की समीक्षा) । हालांकि, भ्रूण की प्रगति के रूप में सेलुलर मशीनरी डबल फंसे ब्रेक (देर से एस चरण और G2 चरण) की मरम्मत के लिए अधिक सटीक एचडीआर तंत्र का उपयोग करने के लिए प्रिंड है। एक प्लाज्मिड इंजेक्शन जिसमें Cas9 अनुक्रम भ्रूण के विकास में जल्दी होता है, Cas9 प्रोटीन को अधिकांश लक्षित कोशिकाओं तक पहुंचने की अनुमति देता है, जबकि भ्रूण अभी भी अपने सिंक्टियल राज्य में है और सेलुलर झिल्ली बनने से पहले, लेकिन Cas9 प्रोटीन को टाइप करने और अनुवाद करने के लिए आवश्यक मामूली देरी इस संभावना को बढ़ाने लगती है कि एंडोन्यूक्लियेज एक समय में सक्रिय होगा जब विकासशील भ्रूण को डीएनएमिक में सही तरीके से मरम्मत करने के लिए एचडीआर का उपयोग करने की अधिक संभावना है। उदाहरण के लिए, लिन एट अल27 ने पता लगाया कि एचडीआर की दरों को ~ 33% तक बढ़ाया गया था जब GRNA के साथ जटिल Cas9 प्रोटीन को कोशिका चक्र के एम चरण में गिरफ्तार मानव सेल लाइनों में इंजेक्ट किया गया था। प्लाज्मिड पर Cas9 और gRNAs देने का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि वे कम चिपचिपा हैं और इसलिए इंजेक्शन (आर हैरेल, व्यक्तिगत अवलोकन) के दौरान सुई को रोकना कम होने की संभावना कम है। हालांकि, जब तक एम्बिट्रोनिक प्रमोटरों को क्यूलेक्स मच्छरों में विशेषता और मान्य नहीं किया जाता है, तब तक हम यहां वर्णित Cas9 प्रोटीन या एमआरएनए इंजेक्शन की सलाह देते हैं।

इसके अतिरिक्त, समय की मात्रा को देखते हुए कि किसी को मच्छरों के पालन और स्क्रीनिंग के लिए समर्पित करना चाहिए, हम इस कार्य के लिए समर्पित कम से कम एक पूर्णकालिक तकनीशियन, छात्र या शोधकर्ता होने की सलाह देते हैं। हम यह भी रणनीतिक रूप से विचार करने की सलाह देते हैं कि किसी दिए गए प्रयोग के लिए कितने नल म्यूटेंट की आवश्यकता होती है और नल रेखा के भीतर आनुवंशिक विविधता का महत्व होता है। जब तक हम एफ1 और एफ2 पीढ़ियों में मच्छरों की पहचान करने में सक्षम थे, जिनमें उत्परिवर्तन था, केवल मुट्ठी भर एफ2 मच्छर वयस्कता के लिए बच गए थे, विषम उत्परिवर्ती मच्छर व्यवहार्य संतान पैदा करने में विफल रहे। हमें लगता है कि यह उत्परिवर्तन के साथ करने के लिए बहुत कम है, और अधिक संभावना समय की लंबी अवधि का परिणाम है कि दोनों पुरुष और महिला मच्छरों कांच ट्यूबों तक ही सीमित थे, जबकि हम उंहें स्क्रीनिंग कर रहे थे । अलगाव की यह लंबी अवधि सबसे अधिक संभावना सफलतापूर्वक दोस्त करने की उनकी क्षमता के साथ हस्तक्षेप किया और, महिलाओं के मामले में, एक रक्त भोजन प्राप्त करने और व्यवहार्य अंडे रखना । एक पीढ़ी के लिए आउटक्रॉसिंग और/या जगह में अनुकूलित स्क्रीनिंग तकनीकों होने से इस मुद्दे को भविष्य में होने से रोकना चाहिए । इसलिए, इस प्रोटोकॉल का पालन करके हमें विश्वास है कि शोधकर्ता क्यूलेक्स मच्छरों की नल लाइनों को सफलतापूर्वक उत्पन्न करने में सक्षम होंगे और मामूली समायोजन, अतिरिक्त कीड़े के साथ।

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Disclosures

आरएच कीट परिवर्तन सुविधा के लिए काम करता है, जो कीट आनुवंशिक संशोधन में सेवाएं प्रदान करता है।

Acknowledgments

हम डॉ डेविड ओ ब्रोचटा और कीट जेनेटिक टेक्नोलॉजीज समन्वय अनुसंधान नेटवर्क के सभी सदस्यों को आनुवंशिक प्रौद्योगिकियों के कार्यान्वयन पर हमें और अन्य लोगों को प्रदान करने वाली मदद और प्रशिक्षण के लिए धन्यवाद देते हैं । हम विशेष रूप से माइक्रोमैनिमुलेशन प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए चन्ना अलुविहारे को धन्यवाद देते हैं ताकि क्यूलेक्स भ्रूण को इंजेक्ट और हैच करने की अनुमति दी जा सके। हम भी Devante सिमंस और यूसुफ Urso, स्नातक Meuti प्रयोगशाला में काम कर रहे छात्रों को धन्यवाद, उनकी सहायता के लिए देखभाल और ट्रांसजेनिक मच्छरों की स्क्रीनिंग, और सहायता पालन और इंजेक्शन के लिए मच्छरों prepping के लिए आईटीएफ से Zora Elmkami । इस काम को एमईएम को प्रदान किए गए ओसु में संक्रामक रोग संस्थान से एक अंतःविषय बीज अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artificial Membrane Feeder Hemotek SP5W1-3 Company location: Blackburn, UK
ATP Invitrogen 18330019 Company location: Carlsbad, CA, USA
Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter World Precision Instruments 1B100-6 Company Location: Sarasota, FL, USA
BV10 Needle Beveler Sutter Instruments BV-10-B Company Location: Nobato, CA, USA
Whatman Circular filter paper (12.5 cm) Sigma Aldrich WHA1001125 Company Location: St. Louis, MO, USA
Conical tube (50 mL) Thermo Fisher Scientific 339652 Company Location: Waltham, MA, USA
Fisherbrand course filter paper with fast flow rate Thermo Fisher Scientific 09-800 Company Location: Waltham, MA, USA
Cover glass (24 x 40 mm) Thermo Fisher Scientific 50-311-20 Company Location: Waltham, MA, USA
Dental dam Henry Schein Inc 1010171 Company Location: Melville, NY USA
Scotch double-sided tape Thermo Fisher Scientific NC0879005 Company Location: Waltham, MA, USA
FemtoJet 4i microinjector Eppendorf 5252000021 Company Location: Hamburg, Germany
Glass vial (2 dram) Thermo Fisher Scientific 033401C Company Location: Waltham, MA, USA
Halocarbon oil Sigma Aldrich H8898-50ML Company Location: St. Louis, MO, USA
P-2000 Laser Needle Puller Sutter Instruments P-2000/G Company Location: Nobato, CA, USA
Parafilm Thermo Fisher Scientific 50-998-944 Company Location: Waltham, MA, USA
PC-100 Weighted Needle Puller Narishige PC-100 This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA
Phire Direct PCR Kit Thermo Fisher Scientific F140WH Company Location: Waltham, MA, USA
Kodak Photo-Flo (1%) Thermo Fisher Scientific 50-268-05 Company Location: Waltham, MA, USA
Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter Capillary Tube Supplies Limited QGCT 1.0 Company Location: Cornwall, UK
Guide-it™ sgRNA Screening Kit Takara, Bio USA 632639 This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA
Sigmacote Sigma Aldrich SL2-100ML Company Location: St. Louis, MO, USA
Small petri dishes (35X10 mm) Thermo Fisher Scientific 50-190-0273 Company Location: Waltham, MA, USA
Sodium citrate chicken blood Lampire biologicals 7201406 Company Location: Everett, PA, USA
Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) Thermo Fisher Scientific FB0875711A Company Location: Waltham, MA, USA
Tegaderm Henry Schein Inc. 7771180 Company Location: Melville, NY USA
Tropical fish food Tetramin N/A
Whatman filter paper Thermo Fisher Scientific 09-927-826 Company Location: Waltham, MA, USA
Whatman filter paper, 4.25 cm Sigma Aldrich 1001-042 Company Location: St. Louis, MO, USA

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References

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जीव विज्ञान अंक 163 डिजाइनिंग गाइड आरएनए माइक्रोमैनिमुलेशन माइक्रोइंजेक्शन मच्छर भ्रूण उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग उत्तरी घर मच्छर जीनोम संपादन
CRISPR/Cas9 का उपयोग करके नल उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए <em>क्यूलेक्स</em> मच्छरों के भ्रूण तैयार करना और इंजेक्शन लगाना
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Meuti, M. E., Harrell, R. Preparing… More

Meuti, M. E., Harrell, R. Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (163), e61651, doi:10.3791/61651 (2020).

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