Summary
ここで提示される単細胞エレクトロポレーションのためのプロトコルは、体外海馬スライス培養年代の範囲にわたって興奮性および阻害性ニューロンの両方の遺伝子を送達することができる。このアプローチは、細胞自律機能や細胞間機能を調べるために使用できる個々の細胞内の遺伝子の正確かつ効率的な発現を提供します。
Abstract
エレクトロポレーションは、特定の遺伝子を細胞に移してその機能を理解するための重要な方法としての確立を確立しました。ここでは、マウスの組織性海馬スライス培養における興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンにおけるインビトロ遺伝子トランスフェクションの効率(約80%)を最大化する単細胞エレクトロポレーション技術について述べている。大きなガラス電極、テトロドトキシン含有人工脳脊髄液および軽度の電気パルスを用いて、培養海馬CA1錐体ニューロンおよび阻害性インターニューロンに関心のある遺伝子を送達した。さらに、エレクトロポレーションは、トランスフェクション効率の低下を伴う21日間までの培養海馬スライスで行うことができ、様々なスライス培養の発達段階の研究を可能にする。多様な細胞型にわたって遺伝子の分子機能を調べることに関心が高まる中、既存の電気生理学装置や技術で行うことができるマウス脳組織におけるインビトロ遺伝子トランスフェクションに対する信頼できる簡単なアプローチを実証しています。
Introduction
分子生物学では、研究者にとって最も重要な考慮事項の1つは、その機能を解明するために細胞または細胞の集団に関心のある遺伝子を送達する方法です。異なる送達方法は、生物学的(例えば、ウイルスベクター)、化学的(例えば、リン酸カルシウムまたは脂質)、または物理的(例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはバイオリストクス)1、2のいずれかに分類することができる。生物学的方法は高効率で、細胞種に特異的であるが、特定の遺伝的ツールの開発によって制限される。化学アプローチは、インビトロでは非常に強力ですが、トランスフェクションは一般的にランダムです。さらに、これらのアプローチは主にプライマリセル専用です。物理的アプローチの中で、バイオリスティクスは技術的な観点から最も簡単で最も簡単ですが、再び比較的低い効率でランダムトランスフェクション結果を生成します。遺伝的ツールを開発する必要なく特定の細胞への転送を必要とするアプリケーションについては、単一細胞エレクトロポレーション3、4に目を向けます。
エレクトロポレーションはフィールドエレクトロポレーションのみを指していたのに対し、過去20年間に、特異性と効率を向上させるために複数のin vitroおよびin vivo単一細胞エレクトロポレーションプロトコルが開発され、エレクトロポレーションが遺伝子を個々の細胞に移すことができることを実証し、したがって、非常に正確であることが実証されています。しかし、この手順は技術的に要求が厳しく、時間がかかり、比較的非効率的です。実際、最近の論文では、機械化されたエレクトロポレーションリグ8,9の実現可能性を調査しており、このようなロボット工学の設置に興味を持つ研究者にとってこれらの障壁のいくつかを排除するのに役立ちます。しかし、より単純な手段を探している人にとって、エレクトロポレーション、すなわち細胞死、トランスフェクション障害、ピペット詰まりの問題は依然として懸念される。
我々は最近、より大きな先端ガラスピペット、穏やかな電気パルスパラメータ、および以前の方法よりもはるかに高い経道ニューロンのトランスフェクション効率を生成するユニークな圧力サイクリングステップを使用するエレクトロポレーション法を開発し、ソマトスタチン発現阻害性インターニューロンを含む阻害ニューロンインターニューロンの遺伝子を初めてトランスフェクトすることを可能にした。しかしながら、異なる阻害性インターニューロン型および神経細胞発生段階におけるこのエレクトロポレーション法の信頼性は取り上げられていない。ここでは、このエレクトロポレーション技術が、興奮性ニューロンおよび異なるクラスのインターニューロンの両方に遺伝子をトランスフェクトできることを実証した。重要なことに、試験したインビトロ(DIV)スライス培養年齢に関係なく、トランスフェクション効率が高かった。この確立されたユーザーフレンドリーな技術は、インビトロマウス脳組織の文脈で異なる細胞タイプの単細胞エレクトロポレーションを使用することに興味のある研究者に強くお勧めします。
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Protocol
すべての動物の議定書は、マサチューセッツ大学医学部の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって見直され、承認されました。スライス培養製剤、プラスミド調製、およびエレクトロポレーションも以前に公開された方法で詳述されており、追加情報10について参照することができる。
1. スライス文化の準備
- 前に説明したようにマウスのorganotypic海馬スライス培養を準備します11,いずれかの性別の出生後6〜7日齢のマウスを使用して.
- (mM)からなるorganotypicスライス培養のための解剖培地を準備する:238スクロース、2.5 KCl、1 CaCl2、4MgCl2、26NaHCO3、1NaH2PO4、および11グルコースを脱イオン水で、5%CO2 /95%O2でガス7.4のpHにする。
- 78.8%(v/v)最小必須培地イーグル、20%(v/v)馬血清、17.9 mM NaHCO 3、26.6 mMグルコース、2 M CaCl2、2M MgSO4、30mM HEPES、インスリン(1μg/mL)、および0.06mMからなるorganotipicスライス培地を調製します。オスマメーターを使用して310-330オスモルにオスモルを調整します。
- 2つのスパチュラを使用して脳全体からカバピを解剖し、組織チョッパーを使用してスライス(400 μm)します。2つの鉗子を使用してスライスを分離し、挿入物の下に培養培地(950 μL)で満たされた6ウェルプレートの30mm細胞培養インサートに移す。
- 組織培養インキュベーター(35°C、5%CO2)にオルガノミクススライス培養物を保存し、2日ごとにスライス培養培地を交換します。
2. プラスミド製剤
- 目的の遺伝子のプラスミドを準備します。
- 亜クローンは、pCAGベクターに緑色蛍光タンパク質(EGFP)遺伝子を増強した。
- pCAG-EGFPプラスミドを内毒素を含まない精製キットで精製し、140 mM Kメタンスルホン酸、0.2 mM EGTA、2 mMMgCl2、および10 mM HEPESを含むジエチルパイロカーボネート処理水で構成される内部溶液に溶解し、PH 7.3に調整してKOH(プラミド濃度:0μG)を使用してpH 7.3に調整します。
3. ガラスピペットの準備
- マイクロピペットの引き手にホウケイ酸ガラスピペット(4.5~8 MΩ)を引き出す(図1A)。
メモ:全セルパッチクランプ記録に使用されるガラスピペットは、エレクトロポレーションに最適です。 - ガラスピペットを200°Cで一晩焼いて殺菌します。
- 解剖顕微鏡の下でピペットチップのサイズを確認し、電気抵抗を近似します。
- オプション:ピペットをエレクトロポレーション電極に取り付けてピペットの抵抗を確認し、マイクロマニピュレータを使用してピペットチップをフィルター滅菌人工脳脊髄液(aCSF)に操縦します(mM単位):119 NaCl、 2.5 KCl, 0.5 CaCl2,5 MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4 および 11 脱イオン水中の 11 グルコース, 5% CO2/95% O2 をガス化し、 7.4.エレクトロポレーターの読み出しを使用して実際の抵抗を確認します。
メモ:ピペットチップが鋭くないほど、電気抵抗が大きくなります。ピペットの抵抗は10 MΩ以下でなければなりません。ピペット抵抗の高いガラスピペット(図1B)は、エレクトロポレーションを繰り返す際に先端に詰まることがよくあります。
- オプション:ピペットをエレクトロポレーション電極に取り付けてピペットの抵抗を確認し、マイクロマニピュレータを使用してピペットチップをフィルター滅菌人工脳脊髄液(aCSF)に操縦します(mM単位):119 NaCl、 2.5 KCl, 0.5 CaCl2,5 MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4 および 11 脱イオン水中の 11 グルコース, 5% CO2/95% O2 をガス化し、 7.4.エレクトロポレーターの読み出しを使用して実際の抵抗を確認します。
4. エレクトロポレーションリグのセットアップ
- エレクトロポレーターを標準的な全細胞電気生理学リグに取り付け、マイクロマニピュレーターと蠕動ポンプを備えたシフトテーブルに取り付けられた直立した顕微鏡を装備します。
- エレクトロポレーターのヘッドステージをマイクロマニピュレーターに取り付け、一対のスピーカーをエレクトロポレーターに接続します。エレクトロポレーターをフットペダルに接続し、準備ができたらパルスを送ることができます。
メモ:スピーカーは電源を入れるとトーンを発しますが、これは電極の電気抵抗の指標です。これにより、手順から注意を引くことなく、抵抗の相対的な変化を決定することが可能になります。
5. エレクトロポレーションの準備
- 6ウェルプレートから3cmのペトリ皿にスライス培養インサートを移し、900 μLの培養培地を積み込み、エレクトロポレーションを行う準備ができるまでテーブルトップCO2 インキュベーターに保管します。
- 3.5cmのペトリ皿中にスライス培養培地(1mL)を入れたフレッシュカルチャーインサートをエレクトロポレーション後の培養スライスに30分以上入れます。
- 電気ポレーションのためにリグをきれいにして準備します。
- 1日の実験を開始する前にチューブとチャンバーを殺菌するために5分間10%の漂白剤でラインを浸透させます。
- 少なくとも30分間、脱イオン化されたオートクレーブ水でラインを浸透させ、完全にすすい水を洗い流します。
- 0.001 mMテトロドトキシン(TTX)を含むフィルター滅菌aCSFでラインを浸透します。
注:TTXは、インターニューロン10の過剰励起による細胞毒性および死を最小限に抑える。
- エレクトロポレーターのパルスパラメータを設定:–5 Vの振幅、四角パルス、500ミリ秒の列車、50Hzの周波数、および500 μsのパルス幅。
- プラスミド含有内部溶液を5 μL充填します。
- ピペットチップから閉じ込められた気泡をフリックして、先端を何度も軽くタップして取り除きます。
- 解剖顕微鏡の下で視覚化するか、ステップ3.3.1を繰り返してピペットの抵抗を確認して、チップの損傷を確認します。
注:先端が破損している場合、ガラスピペットを廃棄する必要があり、このステップは、手順3で以前に準備した新しいガラスピペットで繰り返す必要があります。
- ピペットチップを電極にしっかりと取り付け、スピーカーの電源を入れます。先端がaCSF媒体と接触した時にエレクトロポレーターの読み出し(ピペットの抵抗)を記録します。
- 鋭い刃を使用して培養インサート膜を切断し、1つのスライス培養を分離する。鋭角鉗子を使用して慎重にスライス培養液をエレクトロポレーションチャンバーに移し、スライスアンカーで位置を固定します。
- 神経の健康や機能12の変化などの副作用を防ぐために、一度に30分以上、培養器の外側にスライス培養を保管しないでください。
6. 目的のセルを電気ポレート
- 口でピペットに正圧を加える、またはチューブに取り付けられた1 mLシリンジ(0.2-0.5 mL圧)を使用して下さい。
- マイクロマニピュレーターの3次元ノブコントロールを使用して、スライス培養の表面付近でピペットチップを操作します。
- ターゲットセルを選択して近づき、顕微鏡で見える細胞表面にディンプルが形成されるまで正の圧力を加えます。
- 圧力サイクルを実行します。
- 口で軽度の陰圧を速やかに加えて、ピペット先端と血漿膜の間に緩いシールが形成されるように、膜がピペット先端に幾分上がって視覚的に示される。スピーカーからの音の増加を聞いてピペット抵抗の増加(約2.5倍の初期抵抗)を観察してください。ディンプルが再形成されるように、すぐに正の圧力を再適用します。
- 一時停止せずに少なくとも2回以上の圧力サイクルをすぐに完了し、1sの負圧を保持します。
注:サイクル間の一時停止、圧力の適用が多すぎる、または負圧を長く保持すると、細胞の損傷が大きく、エレクトロポレーション中に細胞が死ぬ可能性があります。
- スピーカーからの音がピッチの安定した頂点に達したときに、フットペダルを使用してエレクトロポレーターを一度素早くパルスし、電気抵抗のピークを示します。パルスを送信する前に、1s以上のピーク抵抗で待たないでください。
注: このプロトコル10を使用する場合、オフターゲットエレクトロポレーションは見当違いです。圧力サイクル中にガラスピペットと接触した細胞のみがトランスフェクションされた。他のニューロンの近くにピペットを配置しても遺伝子トランスフェクションは起こらない。 - 圧力をかけることなく、約100μmのピペットをセルから緩やかに引き込みます。
- 正圧を再適用し、抵抗がステップ5.5で記録された読み出しと類似していることを確認し、次のセルに近づく。
- ポテンシャルな下駄を除去し、視覚的に示されたか、またはエレクトロポレーション後にピペット抵抗を有意に増加させた(>15%高く)、正の圧力を加えることによって除去する。
注:目に見える詰まりがなく、抵抗がまだかなり高い場合は、ピペットを捨てて新しいものを使用してください。平均して、ユーザーが注意して10を使用している場合、ピペットは最大20のエレクトロポレーションイベントに使用できます。
- ポテンシャルな下駄を除去し、視覚的に示されたか、またはエレクトロポレーション後にピペット抵抗を有意に増加させた(>15%高く)、正の圧力を加えることによって除去する。
- エレクトロポレーション後、スライス培養液を新鮮な培養インサートに移し、35°Cで最大3日間インキュベーターでインキュベートします。
7. 組織の海馬スライス培養物の固定、染色、イメージング
- エレクトロポレートされたオルガノミピックスライス培養2– トランスフェクション後2–3日、0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)で4%パラホルムアルデヒドと4%スクロースを室温で1.5時間修正します。
- 固定液を取り除き、0.1 Mリン酸バッファー(1x PB)で30%スクロースでスライスを2時間インキュベートします。
- スライドグラスの上にスライスを置き、砕いたドライアイスの上にスライドグラスを置くことによってそれらを凍結します。スライスを室温で解凍し、1x PBSで満たされた6ウェルプレートに移します。
- GDBバッファー(0.1%ゼラチン、0.3%トリトンX-100、450 mM NaCl、および32%1x PB、pH 7.4)のマウス抗GFPおよびウサギ抗RFP抗体でスライスを室温で2時間染色します。
- 1回のPBSでスライスを室温で3回洗浄し、各洗浄10分間おきます。
- 抗マウスAlexa 488-コンジュゲート二次抗体と抗ウサギAlexa 594-共役二次抗体をGDBバッファー内で1時間室温でインキュベートスライス。DAPI(4 μg/mL)を1x PBSで室温で10分間インキュベートします。
- 1回PBSでスライスを室温で3回洗浄し、各洗浄を3分間行います。
- 取り付け媒体を使用してガラススライドにスライスを取り付け、蛍光イメージングを行います。
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Representative Results
当社の単細胞エレクトロポレーションは、視覚に同定された興奮性および抑制性ニューロンに遺伝子を正確に送達することができる。3つの異なる時間ポイントで3つの異なるニューロン細胞タイプを電気ポポレートしました。パーブアルブミン(Pv)またはベシキュラーグルタミン酸3型(VGT3)発現ニューロンを、それぞれPv/TdTomatoとVGT3/TdTomatoラインと呼ばれるTdTomato(赤蛍光タンパク質の変種)レポーターライン(Jax#007905)との間でPv cre(JAX#008069)またはVGT3クレイン(JAX#018147)ラインを交配することによって可視化した。C57BL/6J、Pv/TdTomato、およびVGT3/TdTomatoマウスから、オルガノミピックスライス培養を調製した。
まず、CA1錐体ニューロン(Py)で7、14、または21日間のインビトロ(DIV)のいずれかでエレクトロポレーションを行った。EGFPは、これらのスライス培養年代にわたって海馬CA1領域の5-20錐体ニューロンにトランスフェクションした(図2B-D)。CA1錐体ニューロンは、差動干渉コントラスト(DIC)を用いて同定した。スライス培養における錐体ニューロンと阻害性インターニューロンの解剖学的分布と形態学的相違を実証するために、CA1錐体ニューロンをDIV7 Pv/TdTomatoマウスでEGFPで電気ポポレートし、核反染色を行い、CA1錐体細胞層におけるEGFP陽性ニューロンの明確な位置を示す(図2A)。
次に、このプロトコルはTdTomato陽性PvおよびVGT3インターニューロンにも適用された。EGFPエレクトロポレーションは、1〜10蛍光標識インターニューロンで行った。TdTomato陽性Pv(図3)およびVGT3(図4)は、海馬CA1領域でニューロンを正常に電気泳動した。興味深いことに、これらの阻害性ニューロンタイプの全てにおいて関心のあるEGFP遺伝子のトランスフェクションは、DIVの影響を大きく受けず、CA1錐型ニューロンで観察されたトランスフェクション効率(〜80%)とは異ならなかった(図5)。
図1:2つの代表的なガラスピペット画像。
(A)このプロトコルで使用される低抵抗(6.5 MΩ)ピペットを表示し、(B)エレクトロポレーションプロトコルに典型的な高抵抗(10.4 MΩ)ピペットを表示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:オルガノピス海馬スライス培養物を、3つの異なるタイムポイントでEGFP(緑色)で電気ポポレートした。
(A)代表の組織性海馬スライス培養中のDIV7 Pv/TdTomatoマウスCA1ピラミッド型ニューロンはEGFP(緑色、白い矢印)で電気ポポレートされ、TdTomato(TdT)陽性Pvインターニューロン(赤、黄色の矢印)との重複は示さなかった。DAPI核対抗(青色)を行った。DG:デンテート回。(B-D)CA1錐体ニューロンは、EGFPを用いて、(B)DIV7、(C)DIV14、(D)DIV21の3つの異なる時点で電気ポレートされた。オルガノチピックスライス培養物を4%スクロース、4%パラホルムアルデヒド/1x PBSで固定し、さらなる断面化を行わずに画像化した。左上、海馬CA1エリアの低倍率画像。矢印は、エレクトロポレーションを対象とした個々のCA1ピラミッド型ニューロンを表します。黄色の矢印を持つトランスフェクトされたニューロンは、下部のパネルでズームされます。白い矢印は、高倍率のビューの外側に追加の電気ポレートされたニューロンを意味します。右上、重ね合わせ(Sup)蛍光画像とノマルスキー画像の低倍率画像。スケールバー:500、50、100、20μmそれぞれ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:Pv/TdTomatoの組織性海馬スライス培養物を、3つの異なる時点でEGFP(緑色)で電気ポポレートした。
(A) DIV7、 (B) DIV14 および (C) DIV21。Pv標識TdTomato(TdT)陽性細胞(赤)との重なり合いは、海馬CA1錐体細胞層およびオリエンで観察された。低倍率インセット(上段)では、黄色の矢印はエレクトロポレーションを対象とする個々のPvインターニューロンを表します。白い矢印は、高倍率のビューの外側に電気ポレートされた追加のTdTomato陽性Pvインターニューロンを意味します。スケールバー:50、20 μm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:VGT3/TdTomatoの組織性海馬スライス培養物を、3つの異なる時点でEGFP(緑色)で電気ポポレートした。
(A) DIV7、 (B) DIV14 および (C) DIV21。VGT3標識TdTomato(TdT)陽性細胞(赤)との重複は、海馬CA1錐体細胞層およびオリエンにおいて観察された。低倍率インセット(上段)では、黄色の矢印はエレクトロポレーションを対象とする個々のVGT3インターニューロンを表します。白い矢印は、高倍率のビューの外側に電気ポレートされた追加のTdTomato陽性VGT3インターニューロンを意味します。スケールバー:50、20 μm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:3つの異なるイン ビトロ スライス培養年代におけるCA1錐体ニューロン、Pv/TdTomato、およびVGT3/TdTomatoインターニューロンにおけるトランスフェクション効率の同等のレベル。
DIV7 (左)、DIV14 (中央)、DIV21 (右) の 3 つの異なるスライス カルチャの要約棒グラフ。各シンボルは、1つのorganotypicスライス培養CA1 Py:DIV7(2匹のマウスから12スライス培養)、DIV14(8/2)、DIV21(8/2)から得られたトランスフェクション効率を表します。Pv: DIV7 (5/2), DIV14 (6/2), DIV21 (6/2);VGT3: DIV7 (6/2), DIV14 (7/2), DIV21 (6/2).一方向の分散分析。n.s. (重要ではありません)。表示されるデータはSEM±意味 です。
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Discussion
ここでは、励起性ニューロンと阻害性ニューロンの両方を高効率かつ高精度にトランスフェクトするエレクトロポレーション法について説明する。当社の最適化エレクトロポレーションプロトコルは、高効率遺伝子トランスフェクションを実現するための3つの革新的なブレークスルーを有しています。私たちの最初の変更は、以前に公開されたプロトコル3、5、6と比較してピペットサイズを大きくすることでした。この変更により、ピペットの詰まりなしに多くのニューロンを電気ポポレートすることができました。さらに、低抵抗ピペットは、所望の結果3を達成しながら、以前の方法と比較して穏やかな電気パルスパラメータの使用を可能にすることができる。次に、エレクトロポレーション前に繰り返し圧力サイクルが顕著に減少細胞死10。電解前に負圧の単一パルスを適用すると、細胞膜がピペット先端の内側にくっつき、細胞に損傷を与えることがよく分かりました。圧力サイクルは、ピペットへのはるかに少ない血漿膜スティックを助け、これは、手順10の間に細胞の生存と回復を改善した。最後に、TTXをaCSFに添加すると、阻害ニューロン10におけるエレクトロポレーションの成功が大幅に向上した。エレクトロポレーションは、TTXによって防ぐことができる致死的な細胞過励起を引き起こす可能性があると考えています。とりわけ、これらの重要な改善は、興奮性ニューロンと阻害性ニューロンの両方にエレクトロポレーションにおいて著しく高い成功率を提供する(図5)。標的細胞内のこの方法10でトランスフェクションした後のニューロンに電気生理学的異常は見つからなかったが、エレクトロポレーション中の局所pH変化は細胞の生存率を低下させ、エレクトロポレーションパラメータの最適化は他の遺伝子トランスフェクション法13,14と比較して比較的困難であることが報告されている。したがって、エレクトロポレーションの予期せぬ副作用を考慮し、必要に応じて電気的パラメータを再最適化して、特定の用途に対して高いトランスフェクション効率を達成することが重要です。
マイクロインジェクション技術は、細胞2、15、16にトランス遺伝子を送達するための強力なアプローチとしても使用されています。しかし、このアプローチは一般的にトランスフェクションの低収率を生み出し、高いレベルのスキルを必要とします。対照的に、我々の方法は、日常的に全細胞電気生理学の研究を行う実験室に相対的に容易かつ最小限のコストで使用することができます。
最近、我々は、複数の遺伝子が、電気生理学的特性に副作用のない抑制性ニューロンを発現する興奮性およびソマトスタチンの両方にトランスフェクトできることを示した。本研究では、このエレクトロポレーション法がCA1錐体ニューロン(図2)およびPv(図3)およびVGT3(図4)阻害性インターニューロンにおいて高効率であることを実証した。さらに、このエレクトロポレーション技術により、細胞の種類やインビトロの日数に関係なく、興味のある遺伝子を約80%の成功率でトランスフェクトすることができます(図5)。この技術はインビトロでのみテストされているが、我々がテストしたのと同じDIV時点での組織的海馬スライス培養は、急性に調製された海馬スライス17に見られるように、生体内シナプス形態および活性に従う年齢に一致することが示されている。さらに、海馬ニューロンでこの方法をテストしただけなので、この技術を他の脳領域のニューロンに適用する際に予期せぬ課題が生じ得る可能性があります。この方法は、シナプス伝達および密度が時間の経過とともに変化する、組織語性スライス培養の開発中に遺伝子の探索を招く。
このプロトコルは、低コストで技術的に挑戦的で、単一ニューロン遺伝子トランスフェクション5、6、7、8、9を同時に生成する際により効率的であるという点で、以前に確立されたものよりも改善されています。また、処置後に細胞の約80%が正常にトランスフェクションされ、健康であることが観察されたので、細胞損傷または死亡率の低下という点で以前の方法よりも改善されたようです。したがって、この方法は、蛍光マウスモデルを使用して、複数の神経細胞タイプにおける遺伝子の役割を調べる新しい機会を提供する。この方法を用いた今後の研究では、細胞間のタンパク質間相互作用に焦点を当て、トランスシナプスタンパク質相互作用を含む特定の分子または生理機能を調べることができます。
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Disclosures
著者らは、利益相反はないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生補助金研究所(K.F.、T32 GM107000、F30MH122146からA.C.)によって支援されました。著者らは、渡辺直e氏に対し、技術面の技術支援に対し、感謝の気持ちを伝える。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), Pt 2 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A.
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F.
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, Pt 1 135-147 (2003).
