Summary
Présenté ici est un protocole pour l’électroporation unicellulaire qui peut livrer des gènes dans les neurones excitateurs et inhibiteurs à travers une gamme d’âges in vitro de culture de tranche hippocampique. Notre approche fournit une expression précise et efficace des gènes dans des cellules individuelles, qui peuvent être utilisées pour examiner les fonctions cellulaires autonomes et intercellulaires.
Abstract
L’électroporation s’est établie comme une méthode critique pour transférer des gènes spécifiques dans les cellules afin de comprendre leur fonction. Ici, nous décrivons une technique d’électroporation unicellulaire qui maximise l’efficacité (~ 80%) de la transfection in vitro de gène dans les neurones inhibiteurs excitateurs et classe-spécifiques dans la culture organotypique de tranche hippocampique de souris. Utilisant de grandes électrodes de verre, le fluide céphalo-rachidien artificiel tetrodotoxin-contenant et les impulsions électriques douces, nous avons livré un gène d’intérêt dans les neurones pyramidaux CA1 hippocampiques cultivés et les interneurones inhibiteurs. De plus, l’électroporation pourrait être effectuée dans des tranches hippocampiques cultivées jusqu’à 21 jours in vitro sans réduction de l’efficacité de la transfection, ce qui a permis d’étudier les différents stades de développement de la culture de tranches. Avec un intérêt croissant pour l’examen des fonctions moléculaires des gènes dans une gamme variée de types de cellules, notre méthode démontre une approche fiable et simple de la transfection in vitro des gènes dans le tissu cérébral de la souris qui peut être effectuée avec l’équipement et les techniques d’électrophysiologie existants.
Introduction
En biologie moléculaire, l’une des considérations les plus importantes pour un chercheur est de savoir comment délivrer un gène d’intérêt dans une cellule ou une population de cellules pour élucider sa fonction. Les différentes méthodes d’administration peuvent être classées comme biologiques (p. ex., un vecteur viral), chimiques (p. ex., phosphate de calcium ou lipides) ou physiques (p. ex., électroporation, microinjection ou biolistique)1,2. Les méthodes biologiques sont très efficaces et peuvent être spécifiques au type de cellule, mais sont limitées par le développement d’outils génétiques spécifiques. Les approches chimiques sont très puissantes in vitro, mais les transfections sont généralement aléatoires; de plus, ces approches sont principalement réservées aux cellules primaires seulement. Parmi les approches physiques, la biolistique est la plus simple et la plus facile d’un point de vue technique, mais produit à nouveau des résultats de transfection aléatoires à une efficacité relativement faible. Pour les applications qui nécessitent un transfert dans des cellules spécifiques sans avoir besoin de développer des outils génétiques, nous nous tournons vers l’électroporation unicellulaire3,4.
Alors que l’électroporation ne se référait qu’à l’électroporation sur le terrain, au cours des vingt dernières années, de multiples protocoles d’électroporation unicellulaire in vitro et in vivo ont été développés pour améliorer la spécificité et l’efficacité5,6,7,démontrant que l’électroporation peut être utilisée pour transférer des gènes à des cellules individuelles et peut, par conséquent, être extrêmement précise. Cependant, les procédures sont techniquement exigeantes, longues et relativement inefficaces. En effet, des articles plus récents ont étudié la faisabilité des plates-formes d’électroporation mécanisées8,9, qui peuvent aider à éliminer plusieurs de ces obstacles pour les chercheurs intéressés par l’installation d’une telle robotique. Mais pour ceux qui recherchent des moyens plus simples, les problèmes d’électroporation, à savoir la mort cellulaire, l’échec de la transfection et le colmatage de la pipette, restent préoccupants.
Nous avons récemment développé une méthode d’électroporation qui utilise des pipettes en verre à plus grande pointe, des paramètres d’impulsion électrique plus doux et une étape de cycle de pression unique, qui a généré une efficacité de transfection beaucoup plus élevée dans les neurones excitateurs que les méthodes précédentes, et nous a permis pour la première fois de transfecter des gènes dans des interneurones inhibiteurs inhibiteurs, y compris des interneurones inhibiteurs exprimant la somatostatine dans la région CA1 hippocampique de la culture de tranches organotypiques de souris10. Cependant, la fiabilité de cette méthode d’électroporation dans différents types inhibiteurs d’interneurones et stades de développement neuronaux n’a pas été abordée. Ici, nous avons démontré que cette technique d’électroporation est capable de transfecter des gènes à la fois dans des neurones excitateurs et dans différentes classes d’interneurones. Il est important de savoir que l’efficacité de la transfection était élevée, quels que soient les jours in vitro (DIV) d’âge de culture de tranche testés. Cette technique établie et conviviale est fortement recommandée à tout chercheur intéressé par l’utilisation de l’électroporation unicellulaire pour différents types de cellules dans le contexte du tissu cérébral in vitro de souris.
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Protocol
Tous les protocoles relatifs aux animaux ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la faculté de médecine de l’Université du Massachusetts. La préparation de la culture de tranches, la préparation du plasmide et l’électroporation sont également détaillées dans nos méthodes précédemment publiées et peuvent être mentionnées pour plus d’informations10.
1. Préparation de la culture de tranches
- Préparer des cultures organotypiques de tranches d’hippocampe de souris comme décrit précédemment11, en utilisant des souris postnatales âgées de 6 à 7 jours de l’un ou l’autre sexe.
- Préparer des milieux de dissection pour la culture de tranches organotypiques constitués de (en mM) : 238 saccharose, 2,5 KCl, 1CaCl2,4MgCl2,26 NaHCO3, 1NaH2PO4,et 11 glucose dans de l’eau désionisée, puis gazeux à 5 %CO2/95%O2 à un pH de 7,4.
- Préparer des milieux de culture de tranches organotypiques composés de : 78,8 % (v/v) minimum essentiel moyen Eagle, 20 % (v/v) de sérum de cheval, 17,9 mM de NaHCO3,26,6 mM de glucose, 2 MCaCl2,2 M MgSO4,30 mM d’HEPES, insuline (1 μg/mL) et 0,06 mM d’acide ascorbique, pH ajusté à 7,3. Ajustez l’osmolarité à 310-330 osmol à l’aide d’un osmomètre.
- Disséquer l’hippocampe de tout le cerveau à l’aide de deux spatules et trancher (400 μm) à l’aide d’un hachoir à tissus. Séparez les tranches à l’aide de deux pinces et transférez-les dans des inserts de culture cellulaire de 30 mm dans une plaque de 6 puits remplie de milieux de culture (950 μL) sous les inserts.
- Entreposer les cultures de tranches organotypiques dans un incubateur de culture tissulaire (35 °C, 5 % deCO2)et changer le milieu de culture des tranches tous les deux jours.
2. Préparation du plasmide
- Préparez le plasmide pour le gène d’intérêt.
- Subclone a augmenté le gène vert fluorescent de la protéine (EGFP) dans un vecteur de pCAG.
- Purifier le plasmide pCAG-EGFP avec un kit de purification sans endotoxine et dissoudre dans une solution interne composée d’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle contenant 140 mM de K-méthanesulfonate, 0,2 mM d’EGTA, 2 mM MgCl2et 10 mM d’HEPES, ajusté à un pH de 7,3 avec KOH (concentration de plasmide : 0,1 μg/μL).
3. Préparation de pipettes en verre
- Tirez des pipettes en verre borosilicate (4,5 – 8 MΩ) sur un tireur à micropipette(figure 1A).
REMARQUE: Les pipettes en verre utilisées pour les enregistrements de pinces de raccordement à cellules entières sont idéales pour l’électroporation. - Cuire des pipettes en verre pendant la nuit à 200 °C pour les stériliser.
- Vérifiez la taille de la pointe de la pipette sous un microscope de dissection pour vous rapprocher de la résistance électrique.
- Facultatif:Vérifiez la résistance de la pipette en fixant la pipette à l’électrode d’électroporation et utilisez le micromanipulateur pour manœuvrer la pointe de la pipette dans du liquide céphalorachidien artificiel stérilisé par filtre (aCSF) contenant (en mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5CaCl2,5MgCl2,26 NaHCO3, 1 NaH2 PO4 et 11 glucose dans de l’eau désionisée, gazé avec 5% deCO2/95%O2 à un pH de 7,4. Confirmez la résistance réelle à l’aide de la lecture sur l’électroporateur.
REMARQUE: Plus la pointe de la pipette est nette, plus la résistance électrique est grande. La résistance de la pipette doit être inférieure à 10 MΩ. Les pipettes en verre à haute résistance à la pipette(figure 1B)se boucher souvent à l’extrémité lors d’une électroporation répétée.
- Facultatif:Vérifiez la résistance de la pipette en fixant la pipette à l’électrode d’électroporation et utilisez le micromanipulateur pour manœuvrer la pointe de la pipette dans du liquide céphalorachidien artificiel stérilisé par filtre (aCSF) contenant (en mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5CaCl2,5MgCl2,26 NaHCO3, 1 NaH2 PO4 et 11 glucose dans de l’eau désionisée, gazé avec 5% deCO2/95%O2 à un pH de 7,4. Confirmez la résistance réelle à l’aide de la lecture sur l’électroporateur.
4. Configuration de la plate-forme d’électroporation
- Installez l’électroporateur sur une plate-forme d’électrophysiologie à cellules entières standard, équipée d’un microscope vertical monté sur une table de changement de vitesse avec un micromanipulateur et une pompe péristaltique.
- Installez la scène d’tête de l’électroporateur sur un micromanipulateur et connectez une paire de haut-parleurs à l’électroporateur. Connectez l’électroporateur à une pédale qui peut être utilisée pour envoyer une impulsion lorsqu’elle est prête.
REMARQUE: Les haut-parleurs émettent une tonalité lorsqu’ils sont allumés, ce qui est un indicateur de la résistance électrique à l’électrode. Cela permet de déterminer les changements relatifs de résistance sans détourner l’attention de la procédure.
5. Préparation par électroporation
- Transférer les inserts de culture de tranches de 6 plaques de puits dans des boîtes de Petri de 3 cm chargées de 900 μL de milieux de culture et les conserver dans un incubateur de CO2 sur table jusqu’à ce qu’ils soient prêts à effectuer l’électroporation.
- Pré-incuber des inserts de culture fraîche avec des milieux de culture en tranches (1 mL) pendant au moins 30 min dans une boîte de Petri de 3,5 cm pour les tranches de culture après électroporation.
- Nettoyez et préparez la plate-forme pour l’électroporation.
- Parcourez les lignes avec 10% d’eau de Javel pendant 5 min pour stériliser le tube et la chambre avant de commencer l’expérience pour la journée.
- Perfuser les lignes avec de l’eau autoclavée désionisée pendant au moins 30 min pour rincer complètement.
- Impréfusez les lignes avec de l’aCSF stérilisé par filtre contenant 0,001 mM de tétrodotoxine (TTX).
REMARQUE: TTX minimise la toxicité cellulaire et la mort due à la surexcitation des interneurones10.
- Définissez les paramètres d’impulsion de l’électroporateur: amplitude de –5 V, impulsion carrée, train de 500 ms, fréquence de 50 Hz et largeur d’impulsion de 500 μs.
- Remplissez la pipette en verre avec 5 μL de solution interne contenant du plasmide.
- Retirez toutes les bulles d’air piégées de la pointe de la pipette en feuilletant et en tapotant doucement la pointe plusieurs fois.
- Vérifiez la pointe pour les dommages en la visualisant sous un microscope de dissection ou en répétant l’étape 3.3.1 pour vérifier la résistance de la pipette.
REMARQUE: Si la pointe est endommagée, la pipette en verre doit être jetée, et cette étape doit être répétée avec une nouvelle pipette en verre préalablement préparée à l’étape 3.
- Fixez solidement la pointe de la pipette à l’électrode et allumez les haut-parleurs. Enregistrer la lecture (résistance de la pipette) de l’électroporateur lorsque la pointe est entrée en contact avec le milieu aCSF.
- Couper la membrane d’insertion de culture à l’aide d’une lame tranchante et isoler une culture de tranche. Transférer soigneusement la culture de tranche dans la chambre d’électroporation à l’aide d’une pince à angle vif et fixer sa position avec une ancre de tranche.
- Ne gardez pas la culture de tranches à l’extérieur de l’incubateur pendant plus de 30 minutes à la fois pour prévenir les effets secondaires tels que des changements dans la santé ou la fonction neuronale12.
6. Cellules électroporate d’intérêt
- Appliquer une pression positive sur la pipette avec la bouche ou à l’aide d’une seringue de 1 mL (pression de 0,2 à 0,5 mL) fixée au tube.
- Utilisez les commandes de bouton en 3 dimensions du micromanipulateur pour manœuvrer la pointe de la pipette près de la surface de la culture de la tranche.
- Choisissez une cellule cible et approchez-la, en gardant la pression positive appliquée jusqu’à ce qu’une fossette se forme à la surface de la cellule, visible au microscope.
- Effectuer des cycles de pression.
- Appliquez rapidement une légère pression négative par la bouche de sorte qu’un joint lâche se forme entre la pointe de la pipette et la membrane plasmique, indiqué visuellement par la membrane qui monte quelque peu dans la pointe de la pipette. Observez une augmentation (~2,5x la résistance initiale) de la résistance de la pipette en écoutant une augmentation de la tonalité provenant des haut-parleurs. Réappliquez rapidement une pression positive afin que la fossette se reforme.
- Complétez immédiatement au moins deux cycles de pression supplémentaires sans faire de pause, puis maintenez la pression négative pendant 1 s.
REMARQUE: Faire une pause entre les cycles, appliquer trop de pression ou maintenir la pression négative trop longtemps peut causer des dommages importants à la cellule et éventuellement provoquer la mort de la cellule pendant l’électroporation.
- Pulsez rapidement l’électroporateur une fois à l’aide de la pédale lorsque la tonalité des haut-parleurs atteint un sommet stable en hauteur, indiquant une résistance électrique maximale. N’attendez pas au pic de résistance pendant plus de 1 s avant d’envoyer l’impulsion.
REMARQUE: Nous n’avons observé aucune électroporation hors cible lors de l’utilisation de ce protocole10. Seules les cellules en contact avec la pipette de verre pendant les cycles de pression ont été transfectées. Le positionnement de la pipette près d’autres neurones n’entraîne pas de transfection génétique. - Retirez délicatement la pipette à environ 100 μm de la cellule sans appliquer de pression.
- Réappaucez la pression positive, en vérifiant que la résistance est similaire à la lecture enregistrée à l’étape 5.5, puis approchez-vous de la cellule suivante.
- Enlever les colbots potentiels, indiqués visuellement ou par une résistance significativement accrue (>15% plus élevée) de la pipette après électroporation, en appliquant une pression positive.
REMARQUE: S’il n’y a pas de sabot visible et que la résistance est encore significativement plus élevée, jetez la pipette et utilisez-en une nouvelle. En moyenne, une pipette peut être utilisée pour un nombre allant jusqu’à 20 événements d’électroporation si l’utilisateur fait attention10.
- Enlever les colbots potentiels, indiqués visuellement ou par une résistance significativement accrue (>15% plus élevée) de la pipette après électroporation, en appliquant une pression positive.
- Après l’électroporation, transférer la culture de tranches sur un insert de culture frais et incuber à 35 °C dans l’incubateur jusqu’à 3 jours.
7. Fixation, coloration et imagerie des cultures organotypiques de tranches d’hippocampe
- Fixer des cultures de tranches organotypiques électroporées 2 à 3 jours après la transfection avec 4% de paraformaldéhyde et 4% de saccharose dans une solution saline tamponnée au phosphate 0,01 M (1x PBS) pendant 1,5 h à température ambiante.
- Retirer les tranches fixatrices et incuber dans 30% de saccharose dans un tampon phosphate 0,1 M (1x PB) pendant 2 h.
- Placez les tranches sur un verre lame et congelez-les en plaçant le verre de la lame sur de la glace carbonique écrasée. Décongelez les tranches à température ambiante et transférez-les sur une plaque de 6 puits remplie de 1x PBS.
- Colorer les tranches avec des anticorps anti-GFP de souris et anti-RFP de lapin dans un tampon GDB (gélatine à 0,1%, 0,3% Triton X-100, NaCl 450 mM et 32% 1x PB, pH 7,4) pendant 2 h à température ambiante.
- Laver les tranches avec 1x PBS trois fois à température ambiante pendant 10 min chaque lavage.
- Incuber des tranches avec de l’anticorps secondaire conjugué Alexa 488 anti-souris et de l’anticorps secondaire conjugué Alexa 594 anti-lapin dans un tampon GDB pendant 1 h à température ambiante. Incuber des tranches avec du DAPI (4 μg/mL) dans 1x PBS pendant 10 min à température ambiante.
- Laver les tranches avec 1x PBS trois fois à température ambiante pendant 3 min chaque lavage.
- Montez des tranches sur des lames de verre à l’aide d’un support de montage et effectuez une imagerie par fluorescence.
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Representative Results
Notre électroporation unicellulaire est capable de délivrer avec précision des gènes dans des neurones excitateurs et inhibiteurs visuellement identifiés. Nous avons électroporé trois types de cellules neuronales différents à trois points de temps différents. La parvalbumine (Pv) ou les neurones exprimant le glutamate vésiculaire de type 3 (VGT3) ont été visualisés en croisant des lignes Pvcre (JAX #008069) ou VGT3cre (JAX #018147) avec tdTomato (une variante de la protéine fluorescente rouge) ligne rapporteure (Jax #007905), respectivement nommées lignes Pv/TdTomato et VGT3/TdTomato. Des cultures organotypiques de tranches ont été préparées à partir de souris C57BL/6J, Pv/TdTomato et VGT3/TdTomato.
D’abord, l’électroporation a été exécutée dans les neurones pyramidaux CA1 (Py) à 7, 14, ou 21 jours in vitro (DIV). EGFP a été transfecté en 5-20 neurones pyramidaux dans la zone CA1 de l’hippocampe à travers ces âges de culture de tranche (Figure 2B-D). Des neurones pyramidaux CA1 ont été identifiés utilisant le contraste différentiel d’interférence (DIC). Pour démontrer la distribution anatomique et les différences morphologiques entre les neurones pyramidaux et les interneurones inhibiteurs dans la culture de tranches, des neurones pyramidaux CA1 ont été électroporés avec EGFP chez une souris DIV7 Pv/TdTomato et une contre-altération nucléaire a été effectuée pour afficher l’emplacement distinct des neurones EGFP-positifs dans la couche cellulaire pyramidale CA1(Figure 2A).
Ensuite, ce protocole a également été appliqué aux interneurones Pv tdtomato-positifs et VGT3. L’électroporation d’EGFP a été effectuée dans 1-10 interneurones fluorescentement marqués. Les neurones Pv TdTomato-positifs (Figure 3) et VGT3 (Figure 4) ont été électroporated avec succès dans le secteur CA1 de l’hippocampe. Fait intéressant, la transfection du gène EGFP d’intérêt dans tous ces types neuronaux inhibiteurs n’a pas été significativement affectée par DIV et n’a pas différé avec l’efficacité de transfection (~ 80%) observée dans les neurones pyramidaux CA1 (Figure 5).
Figure 1 : Deux images représentatives de pipettes en verre.
(A) Afficher des pipettes à résistance plus faible (6,5 MΩ), utilisées dans ce protocole, et (B) des pipettes à résistance plus élevée (10,4 MΩ) typiques des protocoles d’électroporation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ill. 2 : Des cultures organotypiques de tranches d’hippocampe ont été électroporées avec de l’EGFP (vert) à trois moments différents.
(A) Culture représentative de tranches organotypiques d’hippocampe chez une souris DIV7 Pv/TdTomato. Des neurones pyramidaux CA1 ont été électroporated avec EGFP (vert, pointes blanches de flèche) et n’ont montré aucun chevauchement avec TdTomato (TdT) - interneurones positifs de Pv (rouges, pointes de flèche jaunes). Le contre-maintien nucléaire de DAPI (bleu) a été exécuté. DG : gyrus denté. (B-D) Les neurones pyramidaux CA1 ont été électroporés avec EGFP à trois points de temps différents : (B) DIV7, (C) DIV14 et (D) DIV21. Des cultures organotypiques de tranches ont été fixées avec du saccharose à 4 %, du paraformaldéhyde à 4 %/1x du PBS et essoinées sans autre sectionnement. En haut à gauche, images à faible grossissement de la zone CA1 de l’hippocampe. Les pointes de flèche représentent des neurones pyramidaux CA1 individuels ciblés pour l’électroporation. Les neurones transfectés avec des pointes de flèche jaunes sont zoomés dans les panneaux inférieurs. Les pointes de flèche blanches signifient des neurones électroporés supplémentaires en dehors de la vue à fort grossissement. En haut à droite, images à faible grossissement d’images fluorescentes superposées (Sup) et d’images de Nomarski. Barres d’échelle: 500, 50, 100, 20 μm respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Les cultures de tranches hippocampiques organotypiques Pv/TdTomato ont été électroporées avec de l’EGFP (vert) à trois moments différents.
(A) DIV7, (B) DIV14 et (C) DIV21. On a observé le chevauchement avec TdTomato Pv-marqué (TdT) - cellules positives (rouge) dans la couche pyramidale CA1 hippocampal de cellules et les oriens. Dans les encarts à faible grossissement (rangée du haut), les pointes de flèche jaunes représentent des interneurones pv individuels ciblés pour l’électroporation. Les pointes de flèche blanches signifient des interneurones Pv TdTomato-positifs supplémentaires électroporés en dehors de la vue à fort grossissement. Barres d’échelle: 50, 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : Les cultures de tranches hippocampiques organotypiques VGT3/TdTomato ont été électroporées avec de l’EGFP (vert) à trois moments différents.
(A) DIV7, (B) DIV14 et (C) DIV21. On a observé le chevauchement avec TdTomato VGT3-labeled (TdT) - cellules positives (rouge) dans la couche pyramidale CA1 hippocampal de cellules et les oriens. Dans les encarts à faible grossissement (rangée du haut), les pointes de flèche jaunes représentent des interneurones VGT3 individuels ciblés pour l’électroporation. Les pointes de flèche blanches signifient des interneurones VGT3 TdTomato-positifs supplémentaires électroporés en dehors de la vue à fort grossissement. Barres d’échelle: 50, 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : Niveaux comparables d’efficacité de la transfection dans les neurones pyramidaux CA1, pv/TdTomato et les interneurones VGT3/TdTomato à trois âges de culture en tranches in vitro différents.
Graphiques à barres récapitulatifs de trois âges de culture de tranche différents : DIV7 (à gauche), DIV14 (au milieu) et DIV21 (à droite). Chaque symbole représente l’efficacité de transfection obtenue à partir d’une tranche organotypique de culture CA1 Py : DIV7 (12 cultures de tranches de 2 souris), DIV14 (8/2), DIV21 (8/2) ; Pv : DIV7 (5/2), DIV14 (6/2), DIV21 (6/2) ; VGT3 : DIV7 (6/2), DIV14 (7/2), DIV21 (6/2). ANOVA à sens unique; n.s. (non significatif). Les données présentées sont moyennes ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous décrivons ici une méthode d’électroporation qui transfecte les neurones excitateurs et inhibiteurs avec l’efficacité et la précision élevées. Notre protocole d’électroporation optimisé comporte trois percées innovantes pour atteindre une transfection génétique hautement efficace. Notre première modification a été d’augmenter la taille de la pipette par rapport aux protocoles précédemment publiés3,5,6. Ce changement nous a permis d’électroporater de nombreux neurones sans colmatage de pipette. De plus, il est possible que les pipettes à résistance plus faible permettent l’utilisation de paramètres d’impulsions électriques plus doux par rapport aux méthodes précédentes tout en atteignant le résultat souhaité3. Ensuite, le cycle de pression répété avant l’électroporation a nettement réduit la mort cellulaire10. Nous avons souvent observé qu’avec l’application d’une seule impulsion de pression négative avant l’électroporation, la membrane plasmique collée à l’intérieur de la pointe de la pipette, endommageant la cellule. Les cycles de pression ont aidé beaucoup moins de membrane plasmique à coller à la pipette, ce qui a amélioré la survie et la récupération des cellules pendant la procédure10. Enfin, l’ajout de TTX dans aCSF a grandement amélioré le succès de l’électroporation dans les neurones inhibiteurs10. Nous considérons que l’électroporation peut causer la surexcitation mortelle de cellules qui peut être empêchée par TTX. Par-dessus tout, ces améliorations critiques offrent des taux de réussite remarquablement élevés dans l’électroporation des neurones excitateurs et inhibiteurs (Figure 5). Bien que nous n’ayons trouvé aucune anomalie électrophysiologique dans nos neurones après transfection avec cette méthode10 dans les cellules ciblées, il a été rapporté que les changements de pH locaux lors de l’électroporation réduisent la viabilité cellulaire et l’optimisation des paramètres d’électroporation peut être relativement difficile par rapport à d’autres méthodes de transfection de gènes13,14. Par conséquent, il est important de prendre en compte les effets secondaires imprévus de l’électroporation et de ré-optimiser les paramètres électriques au besoin pour obtenir une efficacité de transfection élevée pour toute application spécifique.
La technologie de microinjection a également été utilisée comme une approche puissante pour délivrer des transgènes aux cellules2,15,16. Cependant, cette approche produit généralement un rendement de transfection plus faible et nécessite un haut niveau de compétence. En revanche, notre méthode peut être utilisée avec une relative facilité et à un coût minimal pour les laboratoires qui effectuent régulièrement des études d’électrophysiologie de cellules entières.
Récemment, nous avons montré que plusieurs gènes peuvent être transfectés en neurones excitateurs et somatostatine exprimant des neurones inhibiteurs sans effets secondaires sur les propriétés électrophysiologiques10. Dans cette étude, nous démontrons que cette méthode d’électroporation est très efficace dans les neurones pyramidaux CA1(Figure 2)et pv (Figure 3) et VGT3 (Figure 4) interneurones inhibiteurs. De plus, cette technique d’électroporation nous permet de transfecter des gènes d’intérêt avec un taux de réussite d’environ 80% quel que soit le type de cellule ou le nombre de jours in vitro(Figure 5). Bien que la technique n’ait été testée qu’in vitro, il a été démontré que les cultures organotypiques de tranches hippocampiques aux mêmes points de temps DIV que nous avons testés suivent la morphologie et l’activité synaptiques in vivo d’âge, comme on le voit dans les tranches hippocampiques17préparées avec acuité. De plus, comme nous n’avons testé cette méthode que dans les neurones de l’hippocampe, il est possible qu’il puisse y avoir des défis imprévus dans l’application de cette technique aux neurones d’autres régions du cerveau. La méthode invite à l’exploration de gènes au cours du développement de la culture de tranches organotypiques dans lesquelles la transmission synaptique et la densité, entre autres propriétés, changent au fil du temps.
Ce protocole est une amélioration par rapport à ceux précédemment établis en ce qu’il est à la fois peu coûteux, moins techniquement difficile, et plus efficace dans la génération de transfection de gène mononeurone5,6,7,8,9. Il semble également être une amélioration par rapport aux méthodes précédentes en termes de taux plus faibles de dommages cellulaires ou de mort, car nous avons observé que ~ 80% des cellules ont été transfectées avec succès et en bonne santé après la procédure. Cette méthode offre donc une nouvelle occasion d’examiner les rôles des gènes dans plusieurs types de cellules neuronales à l’aide de modèles murins fluorescents. Les études futures utilisant cette méthode peuvent se concentrer sur les interactions protéine-protéine entre les cellules pour examiner des fonctions moléculaires ou physiologiques spécifiques, y compris les interactions protéiques trans-synaptiques.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ces travaux ont été appuyés par les National Institutes of Health Grants (R01NS085215 à K.F., T32 GM107000 et F30MH122146 à A.C.). Les auteurs remercient Mme Naoe Watanabe pour son assistance technique habile.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
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