Summary
Præsenteret her er en protokol for enkelt-celle elektroporation, der kan levere gener i både excitatoriske og hæmmende neuroner på tværs af en række in vitro hippocampal skive kultur aldre. Vores tilgang giver præcis og effektiv ekspression af gener i individuelle celler, som kan bruges til at undersøge celle-autonome og intercellulære funktioner.
Abstract
Elektroporation har etableret sig som en kritisk metode til overførsel af specifikke gener til celler for at forstå deres funktion. Her beskriver vi en enkeltcellet elektroporationsteknik, der maksimerer effektiviteten (~ 80%) af in vitro-gentransfekt i excitatoriske og klassespecifikke hæmmende neuroner i musorganotypisk hippocampal skivekultur. Ved hjælp af store glaselektroder, tetrodotoxinholdige kunstige cerebrospinalvæske og milde elektriske impulser leverede vi et gen af interesse i dyrkede hippocampale CA1 pyramide neuroner og hæmmende internuroner. Desuden kunne elektroporation udføres i dyrkede hippocampale skiver op til 21 dage in vitro uden reduktion i transfekteffektivitet, hvilket giver mulighed for undersøgelse af forskellige skivekulturudviklingsstadier. Med stigende interesse for at undersøge geners molekylære funktioner på tværs af en bred vifte af celletyper demonstrerer vores metode en pålidelig og ligetil tilgang til in vitro-gentransfekt i musehjernevæv, der kan udføres med eksisterende elektrofysiologiudstyr og -teknikker.
Introduction
I molekylærbiologi er en af de vigtigste overvejelser for en efterforsker, hvordan man leverer et gen af interesse til en celle eller population af celler for at belyse dens funktion. De forskellige leveringsmetoder kan kategoriseres som enten biologiske (f.eks. en viral vektor), kemisk (f.eks. calciumphosphat eller lipid) eller fysisk (f.eks. elektroporation, mikroinjection eller biolistics)1,2. Biologiske metoder er yderst effektive og kan være celletypespecifikke, men er begrænset af udviklingen af specifikke genetiske værktøjer. Kemiske tilgange er meget kraftige in vitro, men transfekt er generelt tilfældige; Desuden er disse tilgange for det meste forbeholdt primærceller. Af de fysiske tilgange er biolistik den enkleste og nemmeste fra et teknisk synspunkt, men producerer igen tilfældige transfektresultater med en relativt lav effektivitet. For applikationer, der kræver overførsel til specifikke celler uden behov for at udvikle genetiske værktøjer, ser vi mod enkeltcelleelektroporation3,4.
Mens elektroporation kun refererer til feltelektroporation, er der i løbet af de sidste tyve år udviklet flere in vitro- og in vivo-elektroporationsprotokoller med en enkelt celle for at forbedre specificitet og effektivitet5,6,7,hvilket viser, at elektroporation kan bruges til at overføre gener til individuelle celler og derfor kan være ekstremt præcis. Procedurerne er imidlertid teknisk krævende, tidskrævende og relativt ineffektive. Faktisk har nyere papirer undersøgt muligheden for mekaniserede elektroporationsplatforme8,9, som kan bidrage til at fjerne flere af disse barrierer for efterforskere, der er interesseret i at installere sådan robotteknologi. Men for dem, der leder efter enklere midler, er problemerne med elektroporation, nemlig celledød, transfekturesvigt og pipettestopning, fortsat et problem.
Vi har for nylig udviklet en elektroporation metode, der bruger større tippet glas pipetter, mildere elektrisk puls parametre, og et unikt tryk cykling skridt, som genererede en langt højere transfekt effektivitet i excitatoriske neuroner end tidligere metoder, og gjorde det muligt for os for første gang at transfekt gener i hæmmende interneurons, herunder somatostatin-udtrykke hæmmende internurons i hippocampal CA1 region af mus organotypic skive kultur10. Pålideligheden af denne elektroporationsmetode i forskellige hæmmende interneurontyper og neuronale udviklingsstadier er imidlertid ikke blevet behandlet. Her demonstrerede vi, at denne elektroporationsteknik er i stand til at transfektere gener til både excitatoriske neuroner og forskellige klasser af interneuroner. Det er vigtigt, at transfekteffektiviteten var høj, uanset hvilke dage in vitro (DIV) skivekulturalderen blev testet. Denne etablerede og brugervenlige teknik anbefales stærkt til enhver efterforsker, der er interesseret i at bruge enkeltcelleelektroporation til forskellige celletyper i forbindelse med in vitro-musehjernevæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprotokoller blev gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Massachusetts Medical School. Skivekulturforberedelse, plasmidpræparat og elektroporation er også beskrevet i vores tidligere offentliggjorte metoder og kan henvises til for yderligere information10.
1. Skær kultur forberedelse
- Forbered mus organotypiske hippocampal skive kulturer som tidligere beskrevet11, ved hjælp af postnatal 6- til 7-dages gamle mus af begge køn.
- Forbered dissektion medier til organotypic skive kultur bestående af (i mM): 238 saccharose, 2,5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, og 11 glukose i deioniseret vand, derefter gas med 5% CO2/95% O2 til en pH på 7,4.
- Forbered organotypiske skivekulturmedier bestående af: 78,8% (v/ v) Minimum Essential Medium Eagle, 20% (v/v) hesteserum, 17,9 mM NaHCO3,26,6 mM glukose, 2 M CaCl2, 2 M MgSO4, 30 mM HEPES, insulin (1 μg/mL) og 0,06 mM ascorbinsyre, pH justeret til 7,3. Juster osmolariteten til 310-330 osmol ved hjælp af et osmometer.
- Disseker hippocampi ud fra hele hjernen ved hjælp af to spatler, og skær (400 μm) ved hjælp af en vævshelikopter. Separate skiver ved hjælp af to tang og overfør til 30 mm cellekulturindsatser i en 6 brøndplade fyldt med dyrkningsmedier (950 μL) under indsatserne.
- Opbevar organotypiske skivekulturer i en vævskulturinkubator (35 °C, 5% CO2) og skift skivekulturmedierne hver anden dag.
2. Plasmid-præparat
- Forbered plasmid for genet af interesse.
- Subclone forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) gen i en pCAG vektor.
- Rense pCAG-EGFP plasmid med et endotoksinfrit rensesæt og opløses i en intern opløsning, der består af diethyl pyrocarbonatbehandlet vand indeholdende 140 mM K-metansulfonat 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2og 10 mM HEPES, justeret til pH 7,3 med KOH (plasmidkoncentration: 0,1 μg/μL).
3. Glaspipetteforberedelse
- Træk borosilikatglaspipetter (4,5 – 8 MΩ) på en mikropipettetrækker (Figur 1A).
BEMÆRK: De glaspipetter, der bruges til helcelleklemmeoptagelser, er ideelle til elektroporation. - Bag glaspipetter natten over ved 200 °C for at sterilisere.
- Kontroller størrelsen af pipettespidsen under et dissektionsmikroskop for at tilnærme den elektriske modstand.
- Valgfrit:Kontroller pipettemodstanden ved at fastgøre pipetten til elektroporationselektroden, og brug mikromanipulatoren til at manøvrere pipettespidsen ind i filtersteriliseret kunstig cerebrospinalvæske (aCSF), der indeholder (i mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 og 11 glukose i deioniseret vand, gasset med 5% CO2/95% O2 til en pH på 7,4. Bekræft den faktiske modstand ved hjælp af udlæsningen på elektroporatoren.
BEMÆRK: Jo skarpere pipettespidsen er, jo større er den elektriske modstand. Pipettemodstanden skal være under 10 MΩ. Glaspipetter med høj pipettemodstand (Figur 1B) tilstopper ofte ved spidsen under gentagen elektroporation.
- Valgfrit:Kontroller pipettemodstanden ved at fastgøre pipetten til elektroporationselektroden, og brug mikromanipulatoren til at manøvrere pipettespidsen ind i filtersteriliseret kunstig cerebrospinalvæske (aCSF), der indeholder (i mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 og 11 glukose i deioniseret vand, gasset med 5% CO2/95% O2 til en pH på 7,4. Bekræft den faktiske modstand ved hjælp af udlæsningen på elektroporatoren.
4. Opsætning af elektroporationsrig
- Installer elektroporatoren på en standard fuldcelleelektrofysiologiplatform, der er udstyret med et opretstående mikroskop monteret på et skiftende bord med en mikromanipulator og peristaltisk pumpe.
- Installer elektroporatorens headstage på en mikromanipulator og tilslut et par højttalere til elektroporatoren. Tilslut elektroporatoren til en fodpedal, som kan bruges til at sende en puls, når den er klar.
BEMÆRK: Højttalerne udsender en tone, når de tændes, hvilket er en indikator for den elektriske modstand ved elektroden. Dette gør det muligt at bestemme relative ændringer i modstand uden at trække opmærksomheden væk fra proceduren.
5. Elektroporationspræparat
- Overfør skivekulturindsatser fra 6 brøndplader til 3 cm Petri-retter fyldt med 900 μL kulturmedier og opbevares i en bordplade CO 2-inkubator, indtil den er klar til at udføre elektroporation.
- Preincubate frisk kultur indsætter med skivekultur medier (1 mL) i mindst 30 min i en 3,5 cm Petri parabol til kultur skiver efter elektroporation.
- Rengør og forbered riggen til elektroporation.
- Perfuse linjerne med 10% blegemiddel i 5 minutter for at sterilisere slangen og kammeret, før du begynder eksperimentet for dagen.
- Perfuse linjerne med deioniseret autoklaveret vand i mindst 30 minutter for at skylle helt.
- Gennemgå linjerne med filtersteriliseret aCSF, der indeholder 0,001 mM tetrodotoxin (TTX).
BEMÆRK: TTX minimerer celletoksicitet og død på grund af overexcitation af interneurons10.
- Indstil elektroporatorens pulsparametre: amplitude på –5 V, firkantet puls, tog på 500 ms, frekvens på 50 Hz og en pulsbredde på 500 μs.
- Fyld glaspipette med 5 μL plasmidholdig intern opløsning.
- Fjern eventuelle indespærrede luftbobler fra pipettespidsen ved at svirpe og forsigtigt trykke på spidsen flere gange.
- Kontroller spidsen for skader ved at visualisere den under et dissektionsmikroskop eller ved at gentage trin 3.3.1 for at kontrollere pipettemodstanden.
BEMÆRK: Hvis spidsen beskadiges, skal glaspipetten kasseres, og dette trin skal gentages med en ny glaspipette, der tidligere er fremstillet i trin 3.
- Fastgør pipettespidsen til elektroden, og tænd højttalerne. Oplæsningen (pipettens modstand) af elektroporatoren registreres, når spidsen har fået kontakt med aCSF-mediet.
- Skær kulturindsatsmembranen over ved hjælp af et skarpt blad, og isoler en skivekultur. Overfør forsigtigt skivekulturen til elektroporationskammeret ved hjælp af skarpe vinklede pincet og fastgør dets position med et skiveanker.
- Hold ikke skivekulturen uden for inkubatoren i mere end 30 minutter ad gangen for at forhindre bivirkninger såsom ændringer i neuronal sundhed eller funktion12.
6. Elektroporatceller af interesse
- Påfør positivt tryk på pipetten med munden eller ved at bruge en 1 mL sprøjte (0,2 - 0,5 mL tryk) fastgjort til slangen.
- Brug mikromanipulatorens 3-dimensionelle knopstyringer til at manøvrere pipettespidsen nær overfladen af skivekulturen.
- Vælg en målcelle, og indflyvning til den, og hold det positive tryk anvendt, indtil der dannes en smilehul på celleoverfladen, som er synlig på mikroskopet.
- Udfør trykcyklusser.
- Påfør hurtigt mildt undertryk gennem munden, så der dannes en løs tætning mellem pipettespidsen og plasmamembranen, der visuelt angives af membranen, der går noget op i pipettespidsen. Overhold en stigning (~2,5x den oprindelige modstand) i pipettemodstanden ved at lytte efter en stigning i tonen fra højttalerne. Hurtigt igen anvende positivt pres, så smilehullet re-former.
- Umiddelbart fuldføre mindst to mere trykcyklusser uden pause, derefter holde undertryk i 1 s.
BEMÆRK: Hvis du holder pause mellem cyklusserne, lægger for meget tryk eller holder undertrykket for længe, kan det forårsage betydelig celleskade og muligvis få cellen til at dø under elektroporation.
- Pulse hurtigt elektroporatoren, når du bruger fodpedalen, når tonen fra højttalerne når et stabilt højdepunkt i tonehøjde, hvilket indikerer maksimal elektrisk modstand. Vent ikke ved topmodstanden i mere end 1 s, før du sender pulsen.
BEMÆRK: Vi har ikke observeret nogen off-target elektroporation ved brug af denne protokol10. Kun cellerne i kontakt med glaspipetten under trykcyklusserne blev transfected. Placering af pipetten i nærheden af andre neuroner resulterer ikke i gentransfekt. - Træk forsigtigt pipetten ca. 100 μm tilbage fra cellen uden at trykke.
- Påfør positivt tryk igen, og kontroller, at modstanden svarer til den registrerede udlæsning i trin 5.5, og nærmer dig derefter den næste celle.
- Fjern potentielle træsko, der er angivet visuelt eller med en signifikant øget (>15% højere) pipettemodstand efter elektroporation, ved at anvende positivt tryk.
BEMÆRK: Hvis der ikke er nogen synlig tilstopning, og modstanden stadig er betydeligt højere, skal du kassere pipetten og bruge en ny. I gennemsnit kan en pipette bruges til op til 20 elektroporationshændelser, hvis brugeren er forsigtig10.
- Fjern potentielle træsko, der er angivet visuelt eller med en signifikant øget (>15% højere) pipettemodstand efter elektroporation, ved at anvende positivt tryk.
- Efter elektroporation overføres skivekulturen til et friskkulturindsats og inkuberes ved 35 °C i inkubatoren i op til 3 dage.
7. Fiksering, farvning og billeddannelse af organotypiske hippocampale skivekulturer
- Fix elektroporated organotypic skive kulturer 2 - 3 dage efter transfekt med 4% paraformaldehyd og 4% saccharose i 0,01 M fosfat buffered saltvand (1x PBS) i 1,5 timer ved stuetemperatur.
- Der fjernes fikserings- og inkubatskiver i 30% saccharose i 0,1 M fosfatbuffer (1x PB) i 2 timer.
- Placer skiver på et slideglas og frys dem ved at lægge slideglasset oven på knust tøris. Tø skiverne ved stuetemperatur og overføre dem til en 6 godt plade fyldt med 1x PBS.
- Plette skiverne med mus anti-GFP og kanin anti-RFP antistoffer i GDB buffer (0,1% gelatine, 0,3% Triton X-100, 450 mM NaCl, og 32% 1x PB, pH 7,4) for 2 timer ved stuetemperatur.
- Vask skiver med 1x PBS tre gange ved stuetemperatur i 10 min hver vask.
- Inkuber skiver med antimus Alexa 488-konjugeret sekundært antistof og antikanin Alexa 594-konjugeret sekundært antistof i GDB buffer i 1 time ved stuetemperatur. Inkuber skiver med DAPI (4 μg/mL) i 1x PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Vask skiver med 1x PBS tre gange ved stuetemperatur i 3 min hver vask.
- Monter skiver på glasrutsjebaner ved hjælp af monteringsmediet, og udfør fluorescensbilleddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores enkeltcellede elektroporation er i stand til præcist at levere gener til visuelt identificerede excitatoriske og hæmmende neuroner. Vi elektroporated tre forskellige neuronale celletyper på tre forskellige tidspunkter. Parvalbumin (Pv) eller vesikulær glutamat type 3 (VGT3), der udtrykker neuroner, blev visualiseret ved at krydse Pvcre-linjer (JAX #008069) eller VGT3cre-linjer (JAX #018147) med TdTomato (en variant af rødt fluorescerende protein) (Jax #007905), henholdsvis kaldet Pv/TdTomato- og VGT3/TdTomato-linjer. Organotypic skivekulturer blev fremstillet af C57BL/6J, Pv/TdTomato og VGT3/TdTomato mus.
For det første blev elektroporation udført i CA1 pyramide neuroner (Py) på enten 7, 14 eller 21 dage in vitro (DIV). EGFP blev transfected i 5-20 pyramideformede neuroner i hippocampal CA1 område på tværs af disse skive kultur aldre(Figur 2B-D). CA1 pyramide neuroner blev identificeret ved hjælp af differentialinterferens kontrast (DIC). For at demonstrere den anatomiske fordeling og morfologiske forskelle mellem pyramide neuroner og hæmmende internuroner i skivekulturen blev CA1-pyramide neuroner elektroporated med EGFP i en DIV7 Pv / TdTomato mus og nuklear modstudning blev udført for at vise den særskilte placering af EGFP-positive neuroner i CA1 pyramidecellelaget (Figur 2A).
Dernæst blev denne protokol også anvendt på TdTomato-positive Pv og VGT3 interneurons. EGFP elektroporation blev udført i 1-10 fluorescerende mærket interneurons. TdTomato-positive Pv (Figur 3) og VGT3 (Figur 4) neuroner blev med succes elektroporated i hippocampal CA1 området. Interessant nok blev transfekten af EGFP-genet af interesse for alle disse hæmmende neuronale typer ikke væsentligt påvirket af DIV og adskiller sig ikke med transfekteffektiviteten (~ 80%) observeret i CA1 pyramide neuroner(Figur 5).
Figur 1: To repræsentative glaspipettebilleder.
(A) Vis lavere modstandspipetter (6,5 MΩ), der anvendes i denne protokol, og (B) højere modstandspipetter (10,4 MΩ), der er typiske for elektroporationsprotokoller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Organotypiske hippocampale skivekulturer blev elektroporated med EGFP (grøn) på tre forskellige tidspunkter.
(A) Repræsentativ organotypisk hippocampal skivekultur i en DIV7 Pv/TdTomato-mus. CA1 pyramide neuroner blev elektroporated med EGFP (grøn, hvid pilespidser) og viste ingen overlapning med TdTomato (TdT)-positive Pv interneurons (rød, gul pilespidser). DAPI nukleare modstævring (blå) blev udført. GD: dentate gyrus. (B-D) CA1-pyramide neuroner blev elektroporated med EGFP på tre forskellige tidspunkter: (B) DIV7, (C) DIV14 og (D) DIV21. Organotypiske skivekulturer blev fastsat med 4% saccharose, 4% paraformaldehyd / 1x PBS og afbildet uden yderligere sektion. Øverst til venstre, lav forstørrelse billeder af hippocampal CA1 område. Pilespidser repræsenterer individuelle CA1 pyramide neuroner målrettet til elektroporation. Transfected neuroner med gule pilespidser er zoomet ind i de nederste paneler. Hvide pilespidser betyder yderligere elektroporated neuroner uden for den høje forstørrelsesvisning. Øverst til højre, lav forstørrelse billeder af overlejret (Sup) fluorescerende og Nomarski billeder. Skalastænger: henholdsvis 500, 50, 100, 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Pv/TdTomato organotypic hippocampal slice cultures blev elektroporated med EGFP (grøn) på tre forskellige tidspunkter.
(A)DIV7, (B) DIV14 og (C) DIV21. Overlapning med TdT-positive celler (TdT) med navnet Pv-mærket blev observeret i hippocampalt CA1-pyramidecellelag og oriens. I de lave forstørrelsesanlæg (øverste række) repræsenterer gule pilespidser individuelle Pv-interneuroner, der er målrettet mod elektroporation. Hvide pilespidser betyder yderligere TdTomato-positive Pv interneurons elektroporated uden for den høje forstørrelse visning. Skalastænger: 50, 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: VGT3/TdTomato organotypic hippocampal skivekulturer blev elektroporateret med EGFP (grøn) på tre forskellige tidspunkter.
(A)DIV7, (B) DIV14 og (C) DIV21. Overlapning med VGT3-mærkede TdTomato (TdT)-positive celler (rød) blev observeret i hippocampal CA1 pyramidecellelag og oriens. I de lave forstørrelsesindsætninger (øverste række) repræsenterer gule pilespidser individuelle VGT3-interneuroner, der er målrettet mod elektroporation. Hvide pilespidser betyder yderligere TdTomato-positive VGT3 interneuroner, der er elektroporated uden for visningen med høj forstørrelse. Skalastænger: 50, 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Sammenlignelige niveauer af transfekteffektivitet i CA1-pyramide neuroner, Pv/TdTomato og VGT3/TdTomato interneurons ved tre forskellige in vitro-skivekultur aldre.
Oversigtslinjediagrammer over tre forskellige udsnitskultur aldre: DIV7 (venstre), DIV14 (midten) og DIV21 (højre). Hvert symbol repræsenterer transfekteffektiviteten opnået fra en organotypisk skivekultur CA1 Py: DIV7 (12 skivekulturer fra 2 mus), DIV14 (8/2), DIV21 (8/2); Nv: DIV7 (5/2), DIV14 (6/2), DIV21 (6/2); VGT3: DIV7 (6/2), DIV14 (7/2), DIV21 (6/2). Envejs ANOVA; n.s. (ikke signifikant). De viste data er ensbetydende ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her en elektroporationsmetode, der transfects både excitatoriske og hæmmende neuroner med høj effektivitet og præcision. Vores optimerede elektroporationsprotokol har tre innovative gennembrud for at opnå højeffektiv gentransfekt. Vores første ændring var at øge pipettestørrelsen sammenlignet med tidligere offentliggjorte protokoller3,5,6. Denne ændring gjorde det muligt for os at elektroporate mange neuroner uden pipette tilstopning. Derudover er det muligt, at de lavere modstandspipetter giver mulighed for brug af mildere elektriske pulsparametre sammenlignet med tidligere metoder, mens de stadig opnår det ønskede resultat3. Dernæst reducerede gentagen trykcykling før elektroporation markant celledød10. Vi observerede ofte, at plasmamembranen med påføring af en enkelt puls af undertryk før elektroporating sad fast på indersiden af pipettespidsen og beskadigede cellen. Trykcyklusserne hjalp langt mindre plasmamembran holde sig til pipetten, hvilket forbedrede celle overlevelse og genopretning under proceduren10. Endelig forbedrede tilsætningen af TTX i aCSF i høj grad succesen med elektroporation i hæmmende neuroner10. Vi mener, at elektroporation kan forårsage dødelig celleoverledning, som kan forhindres af TTX. Frem for alt tilbyder disse kritiske forbedringer bemærkelsesværdigt høje succesrater i elektroporation til både excitatoriske og hæmmende neuroner (Figur 5). Selvom vi ikke fandt elektrofysiologiske abnormiteter i vores neuroner efter transfekt med denne metode10 i de målrettede celler, er det blevet rapporteret, at lokale pH-ændringer under elektroporation reducerer celleleveevnen, og optimering af elektroporationsparametre kan være relativt vanskelig sammenlignet med andre gentransfektmetoder13,14. Derfor er det vigtigt at overveje uforudsete bivirkninger af elektroporation og at re-optimere de elektriske parametre efter behov for at opnå en høj transfekteffektivitet for enhver specifik applikation.
Mikroinjection teknologi er også blevet brugt som en kraftfuld tilgang til at levere transgener tilcellerne 2,15,16. Denne fremgangsmåde giver imidlertid generelt et lavere udbytte af transinfektion og kræver et højt færdighedsniveau. I modsætning hertil kan vores metode bruges relativt let og med minimale omkostninger for laboratorier, der rutinemæssigt udfører helcelleelektrofysiologiundersøgelser.
For nylig viste vi, at flere gener kan transfected i både excitatoriske og somatostatin udtrykke hæmmende neuroner uden bivirkninger på elektrofysiologiske egenskaber10. I denne undersøgelse viser vi, at denne elektroporationsmetode er yderst effektiv i CA1-pyramide neuroner (figur 2) og Pv (Figur 3) og VGT3 (Figur 4) hæmmende internuroner. Desuden giver denne elektroporationsteknik os mulighed for at transfektere gener af interesse med en ~ 80% succesrate uanset celletype eller antal dage in vitro (Figur 5). Selvom teknikken kun er blevet testet in vitro, har organotypiske hippocampale skivekulturer på de samme DIV-tidspunkter, vi testede, vist sig at følge aldersmatchet in vivo synaptisk morfologi og aktivitet, som det ses i akut forberedt hippocampale skiver17. Desuden, da vi kun har testet denne metode i hippocampal neuroner, er det muligt, at der kan være uventede udfordringer ved at anvende denne teknik på neuroner i andre hjerneregioner. Metoden indbyder til udforskning af gener under organotypic skivekultur udvikling, hvor synaptisk transmission og tæthed, blandt andre egenskaber, ændre sig over tid.
Denne protokol er en forbedring i forhold til tidligere etablerede i, at det samtidig er billigt, mindre teknisk udfordrende og mere effektivt til at generere enkelt-neuron gentransfekt5,6,7,8,9. Det synes også at være en forbedring i forhold til tidligere metoder i form af lavere satser for celleskader eller død, som vi bemærkede, at ~ 80% af cellerne med succes blev transfected og sunde efter proceduren. Denne metode giver derfor en ny mulighed for at undersøge genernes roller i flere neuronale celletyper ved hjælp af fluorescerende musemodeller. Fremtidige undersøgelser ved hjælp af denne metode kan fokusere på proteinproteininteraktioner mellem celler for at undersøge specifikke molekylære eller fysiologiske funktioner, herunder transsynaptiske proteininteraktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grants (R01NS085215 til K.F., T32 GM107000 og F30MH122146 til A.C.). Forfatterne takker Ms Naoe Watanabe for dygtig teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), Pt 2 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A.
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F.
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, Pt 1 135-147 (2003).
