Summary
Здесь представлен протокол для одноклеточной электропорации, который может доставлять гены как в возбуждающие, так и в тормозные нейроны в диапазоне возрастов культуры среза гиппокампа in vitro. Наш подход обеспечивает точную и эффективную экспрессию генов в отдельных клетках, которая может быть использована для изучения клеточных автономных и межклеточных функций.
Abstract
Электропорация зарекомендовала себя как критический метод передачи определенных генов в клетки для понимания их функции. Здесь мы описываем метод одноклеточной электропорации, который максимизирует эффективность (~ 80%) трансфекции гена in vitro в возбуждающих и специфических для класса тормозных нейронах в органотипической культуре среза гиппокампа мыши. Используя большие стеклянные электроды, тетродотоксинсодержащую искусственную спинномозговую жидкость и мягкие электрические импульсы, мы доставили ген, представляющий интерес, в культивируемые пирамидные нейроны ГИПпокампа CA1 и тормозные интернейроны. Кроме того, электропорация может проводиться в культивированных срезах гиппокампа до 21 дня in vitro без снижения эффективности трансфекции, что позволяет изучать различные стадии развития культуры срезов. С ростом интереса к изучению молекулярных функций генов в различных типах клеток наш метод демонстрирует надежный и простой подход к трансфекции генов in vitro в ткани мозга мыши, который может быть выполнен с помощью существующего электрофизиологического оборудования и методов.
Introduction
В молекулярной биологии одним из наиболее важных соображений для исследователя является то, как доставить ген, представляющий интерес, в клетку или популяцию клеток, чтобы прояснить его функцию. Различные способы доставки могут быть классифицированы как биологические (например, вирусный вектор), химические (например, фосфат кальция или липиды) или физические (например, электропорация, микроинъекция или биолистика)1,2. Биологические методы очень эффективны и могут быть специфичными для типа клеток, но ограничены разработкой конкретных генетических инструментов. Химические подходы очень сильны in vitro, но трансфекции, как правило, случайны; кроме того, эти подходы в основном зарезервированы только для первичных клеток. Из физических подходов биолистика является самой простой и легкой с технической точки зрения, но опять же дает случайные результаты трансфекции при относительно низкой эффективности. Для применений, которые требуют переноса в конкретные клетки без необходимости разработки генетических инструментов, мы смотрим на одноклеточную электропорацию3,4.
В то время как электропорация раньше относится только к полевой электропорации, за последние двадцать лет были разработаны множественные протоколы электропорации in vitro и in vivo с одной ячейкой для повышения специфичности и эффективности5,6,7,демонстрируя, что электропорация может использоваться для переноса генов в отдельные клетки и, следовательно, может быть чрезвычайно точной. Однако процедуры технически сложны, трудоемки и относительно неэффективны. Действительно, более поздние работы исследовали целесообразность механизированных электропорационных установок8,9,которые могут помочь устранить некоторые из этих барьеров для исследователей, заинтересованных в установке такой робототехники. Но для тех, кто ищет более простые средства, проблемы с электропорацией, а именно гибель клеток, отказ трансфекции и засорение пипетки, остаются проблемой.
Недавно мы разработали метод электропорации, который использует стеклянные пипетки с большим наконечником, более мягкие параметры электрического импульса и уникальный этап циклического давления, который генерировал гораздо более высокую эффективность трансфекции в возбуждающих нейронах, чем предыдущие методы, и позволил нам впервые трансфектировать гены в ингибирующих интернейронах, включая соматостатин-экспрессирующие ингибирующие интернейроны в области гиппокампа CA1 органотипической культуры срезов мыши10. Однако надежность этого метода электропорации в различных ингибирующих типах интернейронов и стадиях развития нейронов не была рассмотрена. Здесь мы продемонстрировали, что этот метод электропорации способен трансфектировать гены как в возбуждающие нейроны, так и в различные классы интернейронов. Важно отметить, что эффективность трансфекции была высокой независимо от дней in vitro (DIV) среза культуры, проверенных возрастом. Этот установленный и удобный для пользователя метод настоятельно рекомендуется любому исследователю, заинтересованному в использовании одноклеточной электропорации для различных типов клеток в контексте ткани мозга мыши in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинской школе Массачусетского университета. Подготовка культуры среза, плазмидная подготовка и электропорация также подробно описаны в наших ранее опубликованных способах и могут быть упомянуты для получения дополнительной информации10.
1. Приготовление культуры нарезок
- Подготовьте органотипические культуры срезов гиппокампа мышей, какописано ранее 11,используя постнатальных 6-7-дневных мышей любого пола.
- Готовят рассеченную жиму для олово-лепетровых культур, состоящих из (в мМ): 238 сахарозы, 2,5 ККл,1 CaCl2,4 MgCl2, 26 NaHCO3,1 NaH2 PO4и 11 глюкозы в деионизированной воде, затем газ с 5% CO2/95%O2 до рН 7,4.
- Готовят органотипическую культурную среду, состоящую из: 78,8% (v/v) минимальной основной среды Eagle, 20% (v/v) конской сыворотки, 17,9 мМ NaHCO3,26,6 мМ глюкозы, 2 M CaCl2,2 M MgSO4,30 мМ HEPES, инсулина (1 мкг/мл) и 0,06 мМ аскорбиновой кислоты, рН с поправкой на 7,3. Отрегулируйте осмолярность до 310-330 осмоль с помощью осмометра.
- Рассеките гиппокампы из всего мозга с помощью двух шпательных ран и нарежьте (400 мкм) с помощью измельчителя тканей. Отделяют срезы с помощью двух щипцов и переносят на 30 мм ячеек культуры в 6-ю скважинную пластину, заполненную культуральная среда (950 мкл) под вставками.
- Храните олово-ломоорганические культуры в инкубаторе тканевых культур (35°C, 5% CO2)и меняйте питательную муть среза каждые два дня.
2. Плазмидный препарат
- Подготовьте плазмиду для интересуящая гена.
- Субклон усиленный ген зеленого флуоресцентного белка (EGFP) в вектор pCAG.
- Очистите плазмиду pCAG-EGFP с помощью набора для очистки без эндотоксинов и растворите во внутреннем растворе, который состоит из воды, обработанной диэтилпирокарбонатом, содержащей 140 мМ K-метансульфоната, 0,2 мМ EGTA, 2 мМ MgCl2и 10 мМ HEPES, скорректированную до рН 7,3 с KOH (концентрация плазмиды: 0,1 мкг/мкл).
3. Подготовка стеклянной пипетки
- Вытягиваем боросиликатные стеклянные пипетки (4,5 – 8 МОм) на съемник микропипетки(рисунок 1А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные пипетки, используемые для записи зажимов для целых ячеек, идеально подходят для электропорации. - Выпекайте стеклянные пипетки на ночь при 200°C для стерилизации.
- Проверьте размер наконечника пипетки под рассеченным микроскопом, чтобы приблизиться к электрическому сопротивлению.
- Опционально: Проверьте сопротивление пипетки, присоединив пипетку к электроду электрода электрода и используйте микроманипулятор для маневрирования наконечником пипетки в стерилизованную фильтром искусственную спинномозговую жидкость (aCSF), содержащую (в мМ): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2,5 MgCl2,26 NaHCO3,12PO4 и 11 глюкозу в деионизированной воде, отравленную газом 5% CO2/95% O2 до рН 7,4. Подтвердите фактическое сопротивление с помощью считывания на электропораторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чем острее наконечник пипетки, тем больше электрическое сопротивление. Сопротивление пипетки должно быть ниже 10 МОм. Стеклянные пипетки с высоким сопротивлением пипетки(рисунок 1B)часто засоряются на наконечнике во время повторной электропорации.
- Опционально: Проверьте сопротивление пипетки, присоединив пипетку к электроду электрода электрода и используйте микроманипулятор для маневрирования наконечником пипетки в стерилизованную фильтром искусственную спинномозговую жидкость (aCSF), содержащую (в мМ): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2,5 MgCl2,26 NaHCO3,12PO4 и 11 глюкозу в деионизированной воде, отравленную газом 5% CO2/95% O2 до рН 7,4. Подтвердите фактическое сопротивление с помощью считывания на электропораторе.
4. Установка электропорационной установки
- Установите электропоратор на стандартную цельноячечную электрофизиологическую установку, оснащенную вертикальным микроскопом, установленным на повязочном столе с микроманипулятором и перистальтическим насосом.
- Установите головную часть электропоратора на микроманипулятор и подключите пару динамиков к электропоратору. Подключите электропоратор к ножной педали, которую можно использовать для отправки импульса, когда она будет готова.
ПРИМЕЧАНИЕ: Динамики издают тон при включении, который является индикатором электрического сопротивления на электроде. Это дает возможность определить относительные изменения сопротивления, не оттягивая внимания от процедуры.
5. Электропорационный препарат
- Переложите срезовые вставки с 6 пластин скважины на 3 см чашки Петри, загруженные 900 мкл культурального носителя, и храните в настольном инкубаторе CO2 до готовности к выполнению электропорации.
- Вставки для предварительной культуры с ломтикой (1 мл) в течение не менее 30 мин в чашке Петри 3,5 см для культивирования ломтиков после электропорации.
- Очистите и подготовьте установку к электропорации.
- Перфьируйте линии 10% отбеливателем в течение 5 мин, чтобы стерилизовать трубку и камеру перед началом эксперимента в течение дня.
- Прополняйте линии деионизированной автоклавной водой не менее 30 минут, чтобы полностью промыть.
- Перфьюзируйте линии фильтруемо-стерилизованным aCSF, содержащим 0,001 мМ тетродотоксина (TTX).
ПРИМЕЧАНИЕ: TTX минимизирует клеточную токсичность и смерть из-за перевозбуждения интернейронов10.
- Задайте параметры импульса электропоратора: амплитуда –5 В, квадратный импульс, поезд 500 мс, частота 50 Гц и ширина импульса 500 мкс.
- Наполните стеклянную пипетку 5 мкл плазмидсодержащего внутреннего раствора.
- Удалите все захваченные пузырьки воздуха с наконечника пипетки, щелкнув и осторожно постукивая по наконечнику несколько раз.
- Проверьте наконечник на наличие повреждений, визуализируя его под рассеченным микроскопом или повторив шаг 3.3.1, чтобы проверить сопротивление пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если наконечник поврежден, стеклянная пипетка должна быть выброшена, и этот шаг должен быть повторен с новой стеклянной пипеткой, предварительно подготовленной на этапе 3.
- Надежно прикрепите наконечник пипетки к электроду и включите динамики. Запишите показания (сопротивление пипетки) электропоратора, когда наконечник соприкоснется со средой aCSF.
- Нарежьте мембрану вставки культуры острым лезвием и изолируйте один срез культуры. Аккуратно перенесите культуру среза в электропорационную камеру с помощью остроугольных щипцов и зафиксируйте ее положение с помощью срезового анкера.
- Не храните культуру срезов вне инкубатора более 30 минут за один раз, чтобы предотвратить побочные эффекты, такие как изменения в здоровье нейронов или функции12.
6. Электропоратные ячейки, представляющие интерес
- Нанесите положительное давление на пипетку с помощью рта или с помощью шприца 1 мл (давление 0,2 - 0,5 мл), прикрепленного к трубке.
- Используйте 3-мерные ручек управления микроманипулятора для маневрирования наконечником пипетки вблизи поверхности культуры среза.
- Выберите клетку-мишень и подойдите к ней, сохраняя приложенное положительное давление до тех пор, пока на поверхности клетки не образуется ямочка, видимая на микроскопе.
- Выполняйте циклы давления.
- Быстро применяйте мягкое отрицательное давление через рот, чтобы между кончиком пипетки и плазматической мембраной образовывалась рыхлое уплотнение, визуально обозначенное мембраной, несколько подойдя в кончик пипетки. Наблюдайте за увеличением (~ 2,5x начального сопротивления) сопротивления пипетки, прислушиваясь к увеличению тона, исходящего от динамиков. Быстро повторно применяйте положительное давление, чтобы ямочка вновь сформировываться.
- Немедленно завершите, по крайней мере, еще два цикла давления без паузы, затем удерживайте отрицательное давление в течение 1 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пауза между циклами, применение слишком большого давления или слишком долгое удержание отрицательного давления может привести к значительному повреждению клеток и, возможно, привести к гибели клетки во время электропорации.
- Быстро набирайте электропоратор один раз, используя ножную педаль, когда тон от динамиков достигает стабильной вершины в тангажу, указывая на пиковое электрическое сопротивление. Не ждите на пике сопротивления более 1 с перед отправкой импульса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не наблюдали нецелевой электропорации при использовании этого протокола10. Трансфицировались только клетки, контактии с стеклянной пипеткой во время циклов давления. Позиционирование пипетки рядом с другими нейронами не приводит к трансфекции генов. - Осторожно втяни пипетку примерно на 100 мкм от ячейки без давления.
- Повторно примените положительное давление, убедившись, что сопротивление аналогично записанного показаниям на шаге 5.5, затем подойдите к следующей ячейке.
- Удалите потенциальные засоры, обозначенные визуально или значительно повышенным (>15% выше) сопротивлением пипетки после электропорации, путем применения положительного давления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если видимого засора нет и сопротивление все еще значительно выше, выбросьте пипетку и используйте новую. В среднем, пипетка может использоваться для 20 событий электропорации, если пользователь осторожен10.
- Удалите потенциальные засоры, обозначенные визуально или значительно повышенным (>15% выше) сопротивлением пипетки после электропорации, путем применения положительного давления.
- После электропорации переложите культуру ломтика на свежую культурную вставку и инкубируют при 35°C в инкубаторе в течение 3 дней.
7. Фиксация, окрашивание и визуализация оловоорганических культур срезов гиппокампа
- Фиксируют электропорированные оловоорганические культуры срезов через 2 – 3 дня после трансфекции 4% параформальдегидом и 4% сахарозой в 0,01 М фосфатного буферного физиологического раствора (1x PBS) в течение 1,5 ч при комнатной температуре.
- Удаляют фиксаторные и инкубационные ломтики в 30% сахарозе в 0,1 М фосфатного буфера (1x PB) в течение 2 ч.
- Поместите ломтики на стакан для слайдов и заморозьте их, положив стакан на измельченный сухой лед. Разморозьте ломтики при комнатной температуре и переложите их на плиту из 6 скважин, заполненную 1x PBS.
- Окрашивайте срезы антителами против GFP мыши и анти-RFP кролика в буфер GDB (0,1% желатина, 0,3% тритона X-100, 450 мМ NaCl и 32% 1x PB, рН 7,4) в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Трижды стирайте ломтики с 1x PBS при комнатной температуре в течение 10 минут каждую стирку.
- Инкубировать срезы с антимышечным Alexa 488-конъюгированным вторичным антителом и анти-кроликом Alexa 594-конъюгированным вторичным антителом в буфере GDB в течение 1 ч при комнатной температуре. Инкубировать ломтики с DAPI (4 мкг/мл) в 1x PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Трижды вымывайте ломтики с 1x PBS при комнатной температуре в течение 3 минут каждую стирку.
- Монтирование срезов на стеклянные слайды с помощью монтажного носителя и выполнение флуоресцентной визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наша одноклеточная электропорация способна точно доставлять гены в визуально идентифицированные возбуждающие и тормозные нейроны. Мы электропорировали три различных типа нейронных клеток в трех разных временных точках. Парвалбумин (Pv) или везикулярный глутамат типа 3 (VGT3), экспрессирующий нейроны, визуализировали путем пересечения линий Pvcre (JAX #008069) или VGT3cre (JAX #018147) с репортерной линией TdTomato (вариант красного флуоресцентного белка) (Jax #007905), соответственно названными линиями Pv / TdTomato и VGT3 / TdTomato. Олово-водоорганические культуры были получены из мышей C57BL/6J, Pv/TdTomato и VGT3/TdTomato.
Во-первых, электропорацию проводили в пирамидных нейронах CA1 (Py) через 7, 14 или 21 день in vitro (DIV). EGFP трансфицировался в 5-20 пирамидальных нейронов в области ГИППОКАМПА CA1 в течение этих возрастов культуры срезов(рисунок 2B-D). Пирамидальные нейроны CA1 были идентифицированы с использованием дифференциального интерференционного контраста (DIC). Чтобы продемонстрировать анатомическое распределение и морфологические различия между пирамидальными нейронами и тормозными интернейронами в культуре срезов, пирамидальные нейроны CA1 были электропорированы EGFP в мыши DIV7 Pv / TdTomato и выполнено ядерное контрокрашение для отображения различного расположения EGFP-положительных нейронов в пирамидальном клеточном слое CA1(рисунок 2A).
Затем этот протокол был также применен к TdTomato-положительным Pv и VGT3 интернейронам. Электропорацию EGFP проводили в 1-10 флуоресцентно меченых интернейронах. TdTomato-положительные Pv(Рисунок 3)и VGT3(Рисунок 4)нейроны были успешно электропорированы в области ГИППОКАМПА CA1. Интересно, что трансфекция гена EGFP, интересующая всех этих ингибирующих типов нейронов, не была существенно затронута DIV и не отличалась эффективностью трансфекции (~80%), наблюдаемой у пирамидальных нейронов CA1(рисунок 5).
Рисунок 1: Два репрезентативных изображения стеклянной пипетки.
(A) Отображение пипеток с более низким сопротивлением (6,5 МОм), используемых в этом протоколе, и(B)пипеток с более высоким сопротивлением (10,4 МОм), типичных для протоколов электропорации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Олово-липкие культуры гиппокампа были электропорированы EGFP (зеленым) в трех разных временных точках.
(A) Репрезентативная органотипическая культура среза гиппокампа у мыши DIV7 Pv/TdTomato. Пирамидальные нейроны CA1 были электропорированы EGFP (зеленые, белые наконечники стрелок) и не показали перекрытия с TdTomato (TdT)-положительными Pv интернейронами (красные, желтые наконечники стрел). Было выполнено ядерное контрокрашение DAPI (синий). ДГ: вятинистые извилины. (Б-Д) Пирамидальные нейроны CA1 были электропорированы EGFP в трех разных временных точках: (B) DIV7, (C) DIV14 и (D) DIV21. Олово-лепетры фиксировали 4% сахарозой, 4% параформальдегидом/ 1x PBS и визуалировали без дальнейшего сечения. Вверху слева, изображения с низким увеличением области гиппокампа CA1. Наконечники стрел представляют собой отдельные пирамидальные нейроны CA1, предназначенные для электропорации. Трансфекциированные нейроны с желтыми наконечниками стрелок масштабируются в нижних панелях. Белые наконечники стрел означают дополнительные электропорированные нейроны за пределами вида с высоким увеличением. Вверху справа, изображения с низким увеличением наложенных (Sup) флуоресцентных и номарских изображений. Шкала стержней: 500, 50, 100, 20 мкм соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Pv/TdTomato органотипические культуры срезов гиппокампа были электропорированы EGFP (зеленым) в трех разных временных точках.
(A)DIV7,(B)DIV14 и(C)DIV21. Перекрытие с Pv-мечеными TdTomato (TdT)-положительными клетками (красными) наблюдалось в пирамидальном клеточном слое гиппокампа CA1 и ориенсах. В вставках с низким увеличением (верхний ряд) желтые наконечники стрелок представляют собой отдельные Pv интернейроны, предназначенные для электропорации. Белые наконечники стрел означают дополнительные TdTomato-положительные Pv интернейроны, электропорированные за пределами вида с высоким увеличением. Шкала стержней: 50, 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: VGT3/TdTomato органотипические культуры срезов гиппокампа были электропорированы EGFP (зеленым) в трех разных точках времени.
(A)DIV7,(B)DIV14 и(C)DIV21. Перекрытие с VGT3-мечеными TdTomato (TdT)-положительными клетками (красными) наблюдалось в пирамидальном клеточном слое ГИППОКАМПА CA1 и ориенсах. В вставках с низким увеличением (верхний ряд) желтые наконечники стрелок представляют отдельные интернейроны VGT3, предназначенные для электропорации. Белые наконечники стрел означают дополнительные TdTomato-положительные интернейроны VGT3, электропорированные за пределами вида с высоким увеличением. Шкала стержней: 50, 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Сопоставимые уровни эффективности трансфекции в пирамидных нейронах CA1, Pv/TdTomato и VGT3/TdTomato интернейронах при трех различных возрастах культур срезов in vitro.
Сводные гистограммы трех различных возрастов культуры срезов: DIV7 (слева), DIV14 (средняя) и DIV21 (справа). Каждый символ представляет эффективность трансфекции, полученную из одной органотипической культуры среза CA1 Py: DIV7 (12 культур срезов от 2 мышей), DIV14 (8/2), DIV21 (8/2); Pv: DIV7 (5/2), DIV14 (6/2), DIV21 (6/2); VGT3: DIV7 (6/2), DIV14 (7/2), DIV21 (6/2). Односторонняя ANOVA; n.s. (не значимый). Показанные данные имеют среднее значение ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем метод электропорации, который трансфектирует как возбуждающие, так и тормозные нейроны с высокой эффективностью и точностью. Наш оптимизированный протокол электропорации имеет три инновационных прорыва для достижения высокоэффективной трансфекции генов. Наша первая модификация заключалась в увеличении размера пипетки по сравнению с ранее опубликованными протоколами3,5,6. Это изменение позволило нам электропорировать многие нейроны без засорения пипетки. Кроме того, возможно, что пипетки с более низким сопротивлением позволяют использовать более мягкие параметры электрических импульсов по сравнению с предыдущими методами при достижении желаемого результата3. Затем повторный цикл давления перед электропорацией заметно снижал гибель клеток10. Мы часто наблюдали, что при приложении одного импульса отрицательного давления перед электропорацией плазматическая мембрана прилипает к внутренней стороне кончика пипетки, повреждая клетку. Циклы давления помогли гораздо меньшему прилипать плазматической мембране к пипетке, что улучшило выживание и восстановление клеток во время процедуры10. Наконец, добавление TTX в aCSF значительно улучшило успех электропорации в тормозных нейронах10. Мы считаем, что электропорация может вызвать летальное перевозбуждение клеток, которое может быть предотвращено TTX. Прежде всего, эти критические улучшения обеспечивают удивительно высокие показатели успеха в электропорации как возбуждающе, так и тормозящим нейронам(рисунок 5). Хотя мы не обнаружили электрофизиологических аномалий в наших нейронах после трансфекции с помощью этого метода10 в клетках-мишенях, сообщалось, что локальные изменения рН во время электропорации снижают жизнеспособность клеток, а оптимизация параметров электропорации может быть относительно сложной по сравнению с другими методами трансфекции генов13,14. Поэтому важно учитывать непредвиденные побочные эффекты электропорации и повторно оптимизировать электрические параметры по мере необходимости для достижения высокой эффективности трансфекции для любого конкретного применения.
Технология микроинъекции также использовалась в качестве мощного подхода для доставки трансгенов в клетки2,15,16. Однако этот подход, как правило, дает более низкий выход трансфекции и требует высокого уровня квалификации. Напротив, наш метод может быть использован с относительной легкостью и с минимальными затратами для лабораторий, которые регулярно выполняют исследования электрофизиологии цельных клеток.
Недавно мы показали, что множественные гены могут трансфектироваться как в возбуждающие, так и в соматостатиновые экспрессирующие тормозные нейроны без побочных эффектов на электрофизиологические свойства10. В этом исследовании мы демонстрируем, что этот метод электропорации очень эффективен в пирамидных нейронах CA1(рисунок 2)и Pv(Рисунок 3)и VGT3(Рисунок 4)ингибирующих интернейронах. Кроме того, этот метод электропорации позволяет нам трансфектировать гены, представляющие интерес, с вероятностью успеха ~ 80% независимо от типа клетки или количества дней in vitro(рисунок 5). Хотя этот метод был протестирован только in vitro, было показано, что органотипические культуры срезов гиппокампа в те же временные точки DIV, которые мы тестировали, следуют соответствующей возрасту синаптической морфологии и активности in vivo, как видно из остро подготовленных срезов гиппокампа17. Более того, поскольку мы протестировали этот метод только на нейронах гиппокампа, возможно, что могут возникнуть непредвиденные проблемы в применении этой техники к нейронам в других областях мозга. Метод предлагает исследовать гены во время развития органотипической культуры срезов, в которой синаптическая передача и плотность, среди других свойств, изменяются с течением времени.
Этот протокол является улучшением по сравнению с ранее установленными в том, что он одновременно является недорогим, менее технически сложным и более эффективным в генерации трансфекции гена одного нейрона5,6,7,8,9. Это также, по-видимому, является улучшением по сравнению с предыдущими методами с точки зрения более низких показателей повреждения или гибели клеток, поскольку мы наблюдали, что ~ 80% клеток были успешно трансфектражировались и здоровы после процедуры. Таким образом, этот метод предоставляет новую возможность изучить роли генов в нескольких типах нейронных клеток с использованием флуоресцентных моделей мышей. Будущие исследования с использованием этого метода могут быть сосредоточены на белково-белковых взаимодействиях между клетками для изучения конкретных молекулярных или физиологических функций, включая транссинаптические белковые взаимодействия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Грантами Национальных институтов здравоохранения (R01NS085215 для K.F., T32 GM107000 и F30MH122146 для A.C.). Авторы благодарят г-жу Наоэ Ватанабэ за умелую техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), Pt 2 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A. Single-cell electroporation. Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. High-throughput single-cell manipulation in brain tissue. PLoS One. 7 (4), 35603 (2012).
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, Pt 1 135-147 (2003).
