Summary
Hier wird ein Protokoll für die Einzelzellelektroporation vorgestellt, das Gene sowohl in exzitatorischen als auch in inhibitorischen Neuronen über eine Reihe von In-vitro-Hippocampus-Schichtkulturaltern hinweg liefern kann. Unser Ansatz bietet eine präzise und effiziente Expression von Genen in einzelnen Zellen, mit denen zellautonome und interzelluläre Funktionen untersucht werden können.
Abstract
Die Elektroporation hat sich als kritische Methode etabliert, um bestimmte Gene in Zellen zu übertragen, um ihre Funktion zu verstehen. Hier beschreiben wir eine Einzelzell-Elektroporationstechnik, die die Effizienz (~ 80%) der In-vitro-Gentransfektion in exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen in organotypischer Hippocampus-Slice-Kultur von Mäusen maximiert. Mit großen Glaselektroden, Tetrodotoxin-haltiger künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit und milden elektrischen Impulsen lieferten wir ein interessantes Gen in kultivierte Hippocampus-CA1-Pyramidenneuronen und inhibitorische Interneuronen. Darüber hinaus konnte die Elektroporation in kultivierten Hippocampus-Scheiben bis zu 21 Tage in vitro ohne Verringerung der Transfektionseffizienz durchgeführt werden, was die Untersuchung unterschiedlicher Entwicklungsstadien der Scheibenkultur ermöglichte. Mit wachsendem Interesse an der Untersuchung der molekularen Funktionen von Genen in einer Vielzahl von Zelltypen zeigt unsere Methode einen zuverlässigen und unkomplizierten Ansatz für die In-vitro-Gentransfektion im Gehirngewebe von Mäusen, der mit vorhandenen elektrophysiologischen Geräten und Techniken durchgeführt werden kann.
Introduction
In der Molekularbiologie ist eine der wichtigsten Überlegungen für einen Forscher, wie man ein Gen von Interesse in eine Zelle oder Zellpopulation liefert, um seine Funktion aufzuklären. Die verschiedenen Verabreichungsmethoden können entweder als biologisch (z. B. ein viraler Vektor), chemisch (z. B. Calciumphosphat oder Lipid) oder physikalisch (z. B. Elektroporation, Mikroinjektion oder Biolistik)1,2kategorisiert werden. Biologische Methoden sind hocheffizient und können zelltypspezifisch sein, sind aber durch die Entwicklung spezifischer genetischer Werkzeuge begrenzt. Chemische Ansätze sind in vitro sehr leistungsfähig, aber Transfektionen sind im Allgemeinen zufällig; Darüber hinaus sind diese Ansätze meist nur Primärzellen vorbehalten. Von den physikalischen Ansätzen ist die Biolistik aus technischer Sicht die einfachste und einfachste, produziert aber wiederum zufällige Transfektionsergebnisse mit einer relativ geringen Effizienz. Für Anwendungen, die den Transfer in bestimmte Zellen erfordern, ohne dass genetische Werkzeuge entwickelt werden müssen, schauen wir uns die Einzelzellelektroporationan 3,4.
Während sich die Elektroporation früher nur auf die Feldelektroporation bezog, wurden in den letzten zwanzig Jahren mehrere in vitro und in vivo Einzelzellelektroporationsprotokolle entwickelt, um die Spezifität und Effizienz zu verbessern5,6,7, die zeigen, dass die Elektroporation verwendet werden kann, um Gene auf einzelne Zellen zu übertragen und daher äußerst präzise sein kann. Die Verfahren sind jedoch technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig und relativ ineffizient. In der Tat haben neuere Arbeiten die Machbarkeit von mechanisierten Elektroporationsrigs8,9untersucht,die dazu beitragen können, mehrere dieser Barrieren für Forscher zu beseitigen, die an der Installation solcher Robotik interessiert sind. Aber für diejenigen, die nach einfacheren Mitteln suchen, bleiben die Probleme mit der Elektroporation, nämlich Zelltod, Transfektionsversagen und Pipettenverstopfung, ein Problem.
Wir haben kürzlich eine Elektroporationsmethode entwickelt, die größere Glaspipetten, mildere elektrische Pulsparameter und einen einzigartigen Druckzyklusschritt verwendet, der eine viel höhere Transfektionseffizienz in exzitatorischen Neuronen erzeugte als frühere Methoden und es uns zum ersten Mal ermöglichte, Gene in inhibitorischen Interneuronen zu transfizieren, einschließlich somatostatin-exprimierender inhibitorischer Interneuronen in der Hippocampus-CA1-Region der organotypischen Scheibenkultur der Maus10. Die Zuverlässigkeit dieser Elektroporationsmethode in verschiedenen inhibitorischen Interneurontypen und neuronalen Entwicklungsstadien wurde jedoch nicht untersucht. Hier haben wir gezeigt, dass diese Elektroporationstechnik in der Lage ist, Gene sowohl in exzitatorische Neuronen als auch in verschiedene Klassen von Interneuronen zu transfizieren. Wichtig ist, dass die Transfektionseffizienz unabhängig von den getesteten Tagen in vitro (DIV) Scheibenkultur hoch war. Diese etablierte und benutzerfreundliche Technik wird jedem Forscher empfohlen, der daran interessiert ist, die Einzelzellelektroporation für verschiedene Zelltypen im Zusammenhang mit In-vitro-Mausgehirngewebe zu verwenden.
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Protocol
Alle Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Massachusetts Medical School überprüft und genehmigt. Scheibenkulturvorbereitung, Plasmidvorbereitung und Elektroporation sind ebenfalls in unseren zuvor veröffentlichten Methoden detailliert beschrieben und können für zusätzliche Informationen10erwähnt werden.
1. Zubereitung der Scheibenkultur
- Bereiten Sie organotypische Hippocampus-Scheibenkulturen der Maus wie zuvor beschrieben11vor, wobei postnatale 6 bis 7 Tage alte Mäuse beiderlei Geschlechts verwendet werden.
- Präpariermittel für die organotypische Scheibenkultur bestehend aus (in mM): 238 Saccharose, 2,5 KCl, 1CaCl2,4MgCl2,26 NaHCO3, 1NaH2PO4und 11 Glucose in entionisiertem Wasser, dann Gas mit 5%CO2/95% O2 bis zueinem pH-Wert von 7,4.
- Organotypische Scheibenkulturmedien werden hergestellt, bestehend aus: 78,8% (v/v) Minimum Essential Medium Eagle, 20% (v/v) Pferdeserum, 17,9 mM NaHCO3,26,6 mM Glucose, 2 M CaCl2,2 M MgSO4,30 mM HEPES, Insulin (1 μg/ml) und 0,06 mM Ascorbinsäure, pH-Wert auf 7,3 eingestellt. Stellen Sie die Osmolarität mit einem Osmometer auf 310-330 Osmol ein.
- Sezieren Sie Hippocampi aus dem gesamten Gehirn, indem Sie zwei Spatel verwenden, und schneiden Sie (400 μm) mit einem Gewebehäcksler. Trennen Sie die Scheiben mit zwei Zinnen und geben Sie sie auf 30 mm Zellkultureinsätze in einer 6-Well-Platte, die mit Nährmedien (950 μL) unter den Einsätzen gefüllt ist.
- Lagern Sie organotypische Scheibenkulturen in einem Gewebekultur-Inkubator (35°C, 5% CO2)und wechseln Sie die Scheibenkulturmedien alle zwei Tage.
2. Plasmidpräparation
- Bereiten Sie das Plasmid für das interessierende Gen vor.
- Subclone enhanced green fluorescent protein (EGFP) Gen in einen pCAG-Vektor.
- Reinigen Sie das pCAG-EGFP-Plasmid mit einem endotoxinfreien Reinigungskit und lösen Sie es in einer internen Lösung auf, die aus mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser besteht, das 140 mM K-Methansulfonat, 0,2 mM EGTA, 2 mMMgCl2und 10 mM HEPES enthält, eingestellt auf pH 7,3 mit KOH (Plasmidkonzentration: 0,1 μg/μL).
3. Glaspipettenvorbereitung
- Ziehen Sie Borosilikatglaspipetten (4,5 – 8 MΩ) auf einem Mikropipettenzieher (Abbildung 1A).
HINWEIS: Die Glaspipetten, die für Ganzzellen-Patch-Clamp-Aufnahmen verwendet werden, sind ideal für die Elektroporation. - Glaspipetten über Nacht bei 200°C backen, um sie zu sterilisieren.
- Überprüfen Sie die Größe der Pipettenspitze unter einem Seziermikroskop, um den elektrischen Widerstand anzunähern.
- Optional:Überprüfen Sie den Pipettenwiderstand, indem Sie die Pipette an der Elektroporationselektrode befestigen und den Mikromanipulator verwenden, um die Pipettenspitze in filtersterilisierte künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) zu manövrieren, die (in mM) enthält: 119 NaCl,2,5KCl, 0,5 CaCl2, 5MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4 und 11 Glucose in entionisiertem Wasser, vergast mit 5%CO2/95%O2 bis zu einem pH-Wert von 7,4. Bestätigen Sie den tatsächlichen Widerstand mit der Ablesung am Elektroporator.
HINWEIS: Je schärfer die Pipettenspitze, desto größer der elektrische Widerstand. Der Pipettenwiderstand sollte unter 10 MΩ liegen. Glaspipetten mit hohem Pipettenwiderstand (Abbildung 1B) verstopfen bei wiederholter Elektroporation oft an der Spitze.
- Optional:Überprüfen Sie den Pipettenwiderstand, indem Sie die Pipette an der Elektroporationselektrode befestigen und den Mikromanipulator verwenden, um die Pipettenspitze in filtersterilisierte künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) zu manövrieren, die (in mM) enthält: 119 NaCl,2,5KCl, 0,5 CaCl2, 5MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4 und 11 Glucose in entionisiertem Wasser, vergast mit 5%CO2/95%O2 bis zu einem pH-Wert von 7,4. Bestätigen Sie den tatsächlichen Widerstand mit der Ablesung am Elektroporator.
4. Einrichtung der Elektroporationsanlage
- Installieren Sie den Elektroporator in einem Standard-Ganzzellen-Elektrophysiologie-Rig, das mit einem aufrechten Mikroskop ausgestattet ist, das auf einem Schalttisch mit einem Mikromanipulator und einer Peristaltikpumpe montiert ist.
- Installieren Sie die Kopfbühne des Elektroporators auf einem Mikromanipulator und verbinden Sie ein Paar Lautsprecher mit dem Elektroporator. Verbinden Sie den Elektroporator mit einem Fußpedal, mit dem bei Bereitschaft ein Impuls gesendet werden kann.
HINWEIS: Die Lautsprecher geben beim Einschalten einen Ton ab, der einen Indikator für den elektrischen Widerstand an der Elektrode ist. Dies ermöglicht es, relative Widerstandsänderungen zu bestimmen, ohne die Aufmerksamkeit vom Verfahren abzuwenden.
5. Elektroporationsvorbereitung
- Übertragen Sie die Scheibenkultureinsätze von 6 Well-Platten auf 3 cm Petrischalen, die mit 900 μL Nährmedien beladen sind, und lagern Sie sie ineinem CO 2-Inkubator auf der Tischplatte, bis sie zur Elektroporation bereit sind.
- Frische Kultureinsätze mit Scheibenkulturmedien (1 ml) für mindestens 30 min in einer 3,5 cm Petrischale zu Kulturscheiben nach der Elektroporation vorbestellen.
- Reinigen und bereiten Sie das Rig für die Elektroporation vor.
- Durchseuchen Sie die Linien mit 10% Bleichmittel für 5 Minuten, um den Schlauch und die Kammer zu sterilisieren, bevor Sie mit dem Experiment für den Tag beginnen.
- Die Leitungen mindestens 30 Minuten lang mit entionisiertem autoklaviertem Wasser durchträgen, um sie vollständig abzuspülen.
- Durchtuchen Sie die Leitungen mit filtersterilisiertem aCSF, das 0,001 mM Tetrodotoxin (TTX) enthält.
HINWEIS: TTX minimiert die zelluläre Toxizität und den Tod durch Übererregung der Interneuronen10.
- Stellen Sie die Pulsparameter des Elektroporators ein: Amplitude von –5 V, quadratischer Impuls, Zug von 500 ms, Frequenz von 50 Hz und eine Pulsbreite von 500 μs.
- Glaspipette mit 5 μL plasmidhaltiger Innenlösung füllen.
- Entfernen Sie alle eingeschlossenen Luftblasen von der Pipettenspitze, indem Sie mehrmals streichen und vorsichtig auf die Spitze tippen.
- Überprüfen Sie die Spitze auf Beschädigungen, indem Sie sie unter einem Dissektionsmikroskop visualisieren oder Schritt 3.3.1 wiederholen, um den Pipettenwiderstand zu überprüfen.
HINWEIS: Wenn die Spitze beschädigt ist, muss die Glaspipette entsorgt werden, und dieser Schritt muss mit einer neuen Glaspipette wiederholt werden, die zuvor in Schritt 3 vorbereitet wurde.
- Befestigen Sie die Pipettenspitze sicher an der Elektrode und schalten Sie die Lautsprecher ein. Notieren Sie die Auslesung (den Widerstand der Pipette) des Elektroporators, wenn die Spitze mit dem aCSF-Medium in Kontakt gekommen ist.
- Schneiden Sie die Kultureinsatzmembran mit einer scharfen Klinge ab und isolieren Sie eine Scheibenkultur. Übertragen Sie die Scheibenkultur vorsichtig mit einer scharf abgewinkelten Schärfe in die Elektroporationskammer und fixieren Sie ihre Position mit einem Scheibenanker.
- Halten Sie die Scheibenkultur nicht mehr als 30 Minuten am Stück außerhalb des Inkubators, um Nebenwirkungen wie Veränderungen der neuronalen Gesundheit oder Funktion zu vermeiden12.
6. Elektropulverzellen von Interesse
- Drücken Sie mit dem Mund oder mit einer 1-ml-Spritze (0,2 - 0,5 ml Druck), die am Schlauch befestigt ist, auf die Pipette.
- Verwenden Sie die 3-dimensionalen Knopfsteuerungen des Mikromanipulators, um die Pipettenspitze in der Nähe der Oberfläche der Scheibenkultur zu manövrieren.
- Wählen Sie eine Zielzelle und nähern Sie sich ihr, wobei der übermässige Druck ausgeübt wird, bis sich ein Grübchen auf der Zelloberfläche bildet, das auf dem Mikroskop sichtbar ist.
- Führen Sie Druckzyklen durch.
- Schnell leichten Unterdruck durch den Mund ausüben, so dass sich zwischen der Pipettenspitze und der Plasmamembran eine lose Versiegelung bildet, die optisch durch die Membran angezeigt wird, die etwas in die Pipettenspitze hinaufgeht. Beobachten Sie eine Erhöhung (~ 2,5x des Anfangswiderstands) des Pipettenwiderstands, indem Sie auf eine Tonerhöhung von den Lautsprechern hören. Wenden Sie schnell wieder Überdruck an, damit sich der Grübchen neu bildet.
- Schließen Sie sofort mindestens zwei weitere Druckzyklen ohne Pause ab und halten Sie dann den Unterdruck für 1 s.
HINWEIS: Eine Pause zwischen den Zyklen, zu viel Druck oder zu langes Halten des Unterdrucks kann zu erheblichen Zellschäden führen und möglicherweise dazu führen, dass die Zelle während der Elektroporation stirbt.
- Pulsieren Sie den Elektroporator schnell mit dem Fußpedal, wenn der Ton der Lautsprecher einen stabilen Scheitelpunkt in der Tonhöhe erreicht, was den maximalen elektrischen Widerstand anzeigt. Warten Sie nicht länger als 1 s am Spitzenwiderstand, bevor Sie den Impuls senden.
HINWEIS: Wir haben bei Verwendung dieses Protokolls10keine Off-Target-Elektroporation beobachtet. Nur die Zellen, die während der Druckzyklen mit der Glaspipette in Kontakt kamen, wurden transfiziert. Die Positionierung der Pipette in der Nähe anderer Neuronen führt nicht zu einer Gentransfektion. - Ziehen Sie die Pipette vorsichtig ca. 100 μm aus der Zelle zurück, ohne Druck auszuüben.
- Wenden Sie erneut einen positiven Druck an, um sicherzustellen, dass der Widerstand dem aufgezeichneten Auslesen in Schritt 5.5 ähnelt, und nähern Sie sich dann der nächsten Zelle.
- Entfernen Sie potenzielle Verstopfungen, die visuell oder durch einen signifikant erhöhten (>15% höheren) Pipettenwiderstand nach der Elektroporation angezeigt werden, indem Sie einen positiven Druck ausüben.
HINWEIS: Wenn es keine sichtbare Verstopfung gibt und der Widerstand immer noch deutlich höher ist, entsorgen Sie die Pipette und verwenden Sie eine neue. Im Durchschnitt kann eine Pipette für bis zu 20 Elektroporationsereignisse verwendet werden, wenn der Benutzer vorsichtig ist10.
- Entfernen Sie potenzielle Verstopfungen, die visuell oder durch einen signifikant erhöhten (>15% höheren) Pipettenwiderstand nach der Elektroporation angezeigt werden, indem Sie einen positiven Druck ausüben.
- Nach der Elektroporation die Scheibenkultur auf einen frischen Kultureinsatz übertragen und bei 35°C im Inkubator bis zu 3 Tage inkubieren.
7. Fixierung, Färbung und Bildgebung von organotypischen Hippocampus-Scheibenkulturen
- Elektroporierte organotypische Scheibenkulturen 2 – 3 Tage nach der Transfektion mit 4% Paraformaldehyd und 4% Saccharose in 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) für 1,5 h bei Raumtemperatur fixieren.
- Fixiermittel entfernen und Scheiben in 30% Saccharose in 0,1 M Phosphatpuffer (1x PB) für 2 h inkubieren.
- Legen Sie die Scheiben auf ein Diaglas und frieren Sie sie ein, indem Sie das Diaglas auf zerkleinertes Trockeneis legen. Die Scheiben bei Raumtemperatur auftauen und auf eine 6-Well-Platte geben, die mit 1x PBS gefüllt ist.
- Die Scheiben mit Maus-Anti-GFP- und Kaninchen-Anti-RFP-Antikörpern in GDB-Puffer (0,1% Gelatine, 0,3% Triton X-100, 450 mM NaCl und 32% 1x PB, pH 7,4) für 2 h bei Raumtemperatur einfärben.
- Waschen Sie die Scheiben mit 1x PBS dreimal bei Raumtemperatur für jeweils 10 min.
- Inkubieren Sie Scheiben mit Anti-Maus Alexa 488-konjugiertem sekundären Antikörper und Anti-Kaninchen Alexa 594-konjugiertem sekundären Antikörper im GDB-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie Scheiben mit DAPI (4 μg/ml) in 1x PBS für 10 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Scheiben mit 1x PBS dreimal bei Raumtemperatur für jeweils 3 min.
- Montieren Sie Scheiben mit einem Montagemedium auf Glasobjektträgern und führen Sie eine Fluoreszenzbildgebung durch.
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Representative Results
Unsere Einzelzellelektroporation ist in der Lage, Gene präzise in visuell identifizierte exzitatorische und hemmende Neuronen zu liefern. Wir haben drei verschiedene neuronale Zelltypen zu drei verschiedenen Zeitpunkten elektroporiert. Parvalbumin (Pv) oder vesikuläre Glutamat Typ 3 (VGT3) exprimierende Neuronen wurden visualisiert, indem Pvcre (JAX #008069) oder VGT3cre (JAX #018147) Linien mit TdTomato (eine Variante des rot fluoreszierenden Proteins) Reporterlinie (Jax #007905) überquert wurden, die jeweils Als Pv/TdTomato bzw. VGT3/TdTomato Bezeichnet wurden. Organotypische Scheibenkulturen wurden aus C57BL/6J-, Pv/TdTomato- und VGT3/TdTomato-Mäusen hergestellt.
Zuerst wurde die Elektroporation in CA1-Pyramidenneuronen (Py) entweder nach 7, 14 oder 21 Tagen in vitro (DIV) durchgeführt. EGFP wurde in 5-20 pyramidale Neuronen im Hippocampus CA1-Bereich über diese Slice-Kulturalter hinweg transfiziert (Abbildung 2B-D). CA1-Pyramidenneuronen wurden mit Differential Interference Contrast (DIC) identifiziert. Um die anatomische Verteilung und die morphologischen Unterschiede zwischen pyramidalen Neuronen und inhibitorischen Interneuronen in Slice-Kultur zu demonstrieren, wurden CA1-Pyramidenneuronen mit EGFP in einer DIV7 Pv/TdTomato-Maus elektroporiert und eine nukleare Gegenfärbung durchgeführt, um die eindeutige Position von EGFP-positiven Neuronen in der CA1-Pyramidenzellschicht anzuzeigen (Abbildung 2A).
Als nächstes wurde dieses Protokoll auch auf TdTomato-positive Pv- und VGT3-Interneuronen angewendet. Die EGFP-Elektroporation wurde in 1-10 fluoreszierend markierten Interneuronen durchgeführt. TdTomato-positive Pv- (Abbildung 3) und VGT3- (Abbildung 4) Neuronen wurden erfolgreich im Hippocampus CA1-Bereich elektroporiert. Interessanterweise wurde die Transfektion des EGFP-Gens von Interesse bei all diesen inhibitorischen neuronalen Typen nicht signifikant von DIV beeinflusst und unterschied sich nicht mit der Transfektionseffizienz (~ 80%), die bei CA1-Pyramidenneuronen beobachtet wurde (Abbildung 5).
Abbildung 1: Zwei repräsentative Glaspipettenbilder.
(A) Zeigen Pipetten mit niedrigerem Widerstand (6,5 MΩ), die in diesem Protokoll verwendet werden, und (B) Pipetten mit höherem Widerstand (10,4 MΩ), die für Elektroporationsprotokolle typisch sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Organotypische Hippocampus-Scheibenkulturen wurden zu drei verschiedenen Zeitpunkten mit EGFP (grün) elektroporiert.
(A) Repräsentative organotypische Hippocampus-Scheibenkultur in einer DIV7 Pv/TdTomato-Maus. CA1-Pyramidenneuronen wurden mit EGFP (grüne, weiße Pfeilspitzen) elektroporiert und zeigten keine Überlappung mit TdTomato (TdT)-positiven Pv-Interneuronen (rote, gelbe Pfeilspitzen). DAPI Nuclear Counterstaining (blau) wurde durchgeführt. DG: Gyrus dentatus. (B-D) CA1-Pyramidenneuronen wurden mit EGFP zu drei verschiedenen Zeitpunkten elektroporiert: (B) DIV7, (C) DIV14 und (D) DIV21. Organotypische Schnittkulturen wurden mit 4% Saccharose, 4% Paraformaldehyd/ 1x PBS fixiert und ohne weitere Schnittbildung abgebildet. Oben links, Bilder mit geringer Vergrößerung des Hippocampus CA1-Bereichs. Pfeilspitzen stellen einzelne PYRAMIDENEURONEN VON CA1 dar, die für die Elektroporation vorgesehen sind. Transfizierte Neuronen mit gelben Pfeilspitzen werden in den unteren Bereichen gezoomt. Weiße Pfeilspitzen bedeuten zusätzliche elektroporierte Neuronen außerhalb der Ansicht mit hoher Vergrößerung. Oben rechts, Bilder mit geringer Vergrößerung von überlagerten (Sup) fluoreszierenden und Nomarski-Bildern. Maßstabsbalken: 500, 50, 100, 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Pv/TdTomato organotypische Hippocampus-Scheibenkulturen wurden zu drei verschiedenen Zeitpunkten mit EGFP (grün) elektroporiert.
(A) DIV7, (B) DIV14 und (C) DIV21. Überlappungen mit Pv-markierten TdTomato (TdT)-positiven Zellen (rot) wurden in der pyramidalen Zellschicht und den Oriens des Hippocampus CA1 beobachtet. In den Einsätzen mit niedriger Vergrößerung (obere Reihe) stellen gelbe Pfeilspitzen einzelne Pv-Interneuronen dar, die für die Elektroporation vorgesehen sind. Weiße Pfeilspitzen bedeuten zusätzliche TdTomato-positive Pv-Interneuronen, die außerhalb der Ansicht mit hoher Vergrößerung elektroporiert wurden. Maßstabsleisten: 50, 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: VGT3/TdTomato organotypische Hippocampus-Scheibenkulturen wurden mit EGFP (grün) zu drei verschiedenen Zeitpunkten elektroporiert.
(A) DIV7, (B) DIV14 und (C) DIV21. Überlappungen mit VGT3-markierten TdTomato (TdT)-positiven Zellen (rot) wurden in der pyramidalen Zellschicht und den Oriens des Hippocampus CA1 beobachtet. In den Einlagen mit niedriger Vergrößerung (obere Reihe) stellen gelbe Pfeilspitzen einzelne VGT3-Interneuronen dar, die für die Elektroporation vorgesehen sind. Weiße Pfeilspitzen bedeuten zusätzliche TdTomato-positive VGT3-Interneuronen, die außerhalb der Ansicht mit hoher Vergrößerung elektroporiert wurden. Maßstabsleisten: 50, 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Vergleichbare Transfektionseffizienz in CA1-Pyramidenneuronen, Pv/TdTomato und VGT3/TdTomato-Interneuronen in drei verschiedenen In-vitro-Slice-Kulturalternen.
Zusammenfassende Balkendiagramme von drei verschiedenen Slice-Kulturaltern: DIV7 (links), DIV14 (Mitte) und DIV21 (rechts). Jedes Symbol repräsentiert die Transfektionseffizienz, die aus einer organotypischen Scheibenkultur CA1 Py erhalten wird: DIV7 (12 Scheibenkulturen von 2 Mäusen), DIV14 (8/2), DIV21 (8/2); Pv: DIV7 (5/2), DIV14 (6/2), DIV21 (6/2); VGT3: DIV7 (6/2), DIV14 (7/2), DIV21 (6/2). Einweg-ANOVA; n.s. (nicht signifikant). Die gezeigten Daten beziehen sich ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir beschreiben hier eine Elektroporationsmethode, die sowohl exzitatorische als auch hemmende Neuronen mit hoher Effizienz und Präzision transfiziert. Unser optimiertes Elektroporationsprotokoll verfügt über drei innovative Durchbrüche, um eine hocheffiziente Gentransfektion zu erreichen. Unsere erste Modifikation bestand darin, die Pipettengröße im Vergleich zu den zuvor veröffentlichten Protokollen3,5,6zuerhöhen. Diese Veränderung ermöglichte es uns, viele Neuronen ohne Pipettenverstopfung zu elektroporieren. Darüber hinaus ist es möglich, dass die Pipetten mit niedrigerem Widerstand die Verwendung milderer elektrischer Impulsparameter im Vergleich zu früheren Methoden ermöglichen und gleichzeitig das gewünschte Ergebnis erzielen3. Als nächstes reduzierten wiederholte Druckzyklen vor der Elektroporation den Zelltod deutlich10. Wir beobachteten oft, dass bei der Anwendung eines einzigen Unterdruckimpulses vor der Elektroporation die Plasmamembran an der Innenseite der Pipettenspitze klebte und die Zelle beschädigte. Die Druckzyklen halfen, dass weit weniger Plasmamembran an der Pipette haftete, was das Überleben und die Erholung der Zellen während des Eingriffs verbesserte10. Schließlich verbesserte die Zugabe von TTX in aCSF den Erfolg der Elektroporation in inhibitorischen Neuronen erheblich10. Wir sind der Ansicht, dass Elektroporation eine tödliche Zellübererregung verursachen kann, die durch TTX verhindert werden kann. Diese kritischen Verbesserungen bieten vor allem bemerkenswert hohe Erfolgsraten bei der Elektroporation sowohl für erregende als auch für inhibitorische Neuronen (Abbildung 5). Obwohl wir keine elektrophysiologischen Anomalien in unseren Neuronen nach transfektion mit dieser Methode10 in den Zielzellen gefunden haben, wurde berichtet, dass lokale pH-Veränderungen während der Elektroporation die Zelllebensfähigkeit verringern und die Optimierung der Elektroporationsparameter im Vergleich zu anderen Gentransfektionsmethoden relativ schwierig sein kann13,14. Daher ist es wichtig, unvorhergesehene Nebenwirkungen der Elektroporation zu berücksichtigen und die elektrischen Parameter bei Bedarf neu zu optimieren, um eine hohe Transfektionseffizienz für jede spezifische Anwendung zu erreichen.
Die Mikroinjektionstechnologie wurde auch als leistungsfähiger Ansatz zur Abgabe von Transgenen an Zellen2,15,16verwendet. Dieser Ansatz führt jedoch im Allgemeinen zu einer geringeren Transfektionsausbeute und erfordert ein hohes Maß an Geschicklichkeit. Im Gegensatz dazu kann unsere Methode relativ einfach und zu minimalen Kosten für Labore verwendet werden, die routinemäßig Elektrophysiologie-Studien mit ganzen Zellen durchführen.
Vor kurzem haben wir gezeigt, dass mehrere Gene sowohl in erregende als auch in Somatostatin-exprimierende inhibitorische Neuronen transfiziert werden können, ohne Dass dies Nebenwirkungen auf die elektrophysiologischen Eigenschaftenhat 10. In dieser Studie zeigen wir, dass diese Elektroporationsmethode bei CA1-Pyramidenneuronen (Abbildung 2) und Pv (Abbildung 3) und VGT3 (Abbildung 4) inhibitorischen Interneuronen hocheffizient ist. Darüber hinaus ermöglicht uns diese Elektroporationstechnik, Gene von Interesse mit einer Erfolgsrate von ~ 80% unabhängig vom Zelltyp oder der Anzahl der Tage in vitro zu transfizieren (Abbildung 5). Obwohl die Technik nur in vitro getestet wurde, haben sich organotypische Hippocampus-Scheibenkulturen zu den von uns getesteten DIV-Zeitpunkten als altersangepasste synaptische Morphologie und Aktivität in vivo gezeigt, wie in akut präparierten Hippocampus-Scheiben17zu sehen ist. Da wir diese Methode nur an Hippocampus-Neuronen getestet haben, ist es möglich, dass es unerwartete Herausforderungen bei der Anwendung dieser Technik auf Neuronen in anderen Gehirnregionen geben könnte. Die Methode lädt zur Erforschung von Genen während der Entwicklung organotypischer Schnittkulturen ein, in denen sich unter anderem die synaptische Übertragung und Dichte im Laufe der Zeit ändern.
Dieses Protokoll ist eine Verbesserung gegenüber zuvor etablierten, da es gleichzeitig kostengünstig, weniger technisch anspruchsvoll und effizienter bei der Erzeugung von Einzelneuron-Gentransfektion5,6 ,7,8,9ist . Es scheint auch eine Verbesserung gegenüber früheren Methoden in Bezug auf niedrigere Raten von Zellschäden oder Tod zu sein, da wir beobachteten, dass ~ 80% der Zellen nach dem Eingriff erfolgreich transfiziert und gesund waren. Diese Methode bietet daher eine neue Möglichkeit, die Rolle von Genen in mehreren neuronalen Zelltypen mit fluoreszierenden Mausmodellen zu untersuchen. Zukünftige Studien mit dieser Methode können sich auf Protein-Protein-Interaktionen zwischen Zellen konzentrieren, um spezifische molekulare oder physiologische Funktionen zu untersuchen, einschließlich transsynaptischer Proteininteraktionen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von National Institutes of Health Grants (R01NS085215 bis K.F., T32 GM107000 und F30MH122146 bis A.C.) unterstützt. Die Autoren danken Frau Naoe Watanabe für die geschickte technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), Pt 2 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A.
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F.
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, Pt 1 135-147 (2003).
