Summary
在水溶液中形成葫芦[7]尿酸和尿酸的宿主 - 客体复合物,然后向Au NP溶液中加入少量,以使用模块化光谱仪进行定量表面增强拉曼光谱(SERS)传感。
Abstract
这项工作描述了一种快速且高度灵敏的方法,用于通过表面增强拉曼光谱(SERS)定量检测重要的生物标志物尿酸(UA),使用模块化光谱仪对指纹区域中的多个特征峰具有约0.2μM的低检测限。这种生物传感方案由大环,葫芦[7]uril(CB7)和UA之间的宿主 - 客体络合以及随后在自组装的Au NP:CB7纳米聚集体内形成精确的等离子体纳米结介导。基于经典的柠檬酸盐还原方法,还进行了SERS底物所需尺寸的简单Au NP合成,并可以选择使用实验室制造的自动合成器来促进。该方案可以很容易地扩展到体液中生物标志物的多重检测,用于临床应用。
Introduction
尿酸是嘌呤核苷酸代谢的最终产物,是血清和尿液中诊断痛风,先兆子痫,肾脏疾病,高血压,心血管疾病和糖尿病等疾病的重要生物标志物1,2,3,4,5。目前用于尿酸检测的方法包括比色酶法、高效液相色谱法和毛细管电泳,这些方法既耗时又昂贵,并且需要复杂的样品制备6,7,8,9。
表面增强拉曼光谱是一种用于常规床旁诊断的有前途的技术,因为它允许通过其振动指纹选择性检测生物分子,并提供许多优点,如高灵敏度,快速响应,易用性以及无或最少的样品制备。基于贵金属纳米颗粒(例如,Au NPs)的SERS衬底可以通过表面等离子体共振引起的强电磁增强10将分析物分子的拉曼信号增强4至10个数量级10。与耗时的复杂金属纳米复合材料12相比,定制尺寸的Au NPs可以很容易地合成,因此由于其优越的性能13,14,15,16,因此被广泛用于生物医学应用。将大环分子,葫芦[n]尿素(CBn,其中n = 5-8,10)附着在Au NPs的表面上可以进一步增强分析物分子的SERS信号,因为高度对称和刚性的CB分子可以控制Au NPs之间的精确间距,并通过形成宿主 - 客体复合物将分析物分子定位在中心或靠近等离子体热点(图1)17,18,19,20.以前使用Au NP的SERS研究示例:CBn纳米聚集物包括硝基爆破剂,多环芳烃,二氨基二苯乙烯,神经递质和肌酐21,22,23,24,25,SERS测量在比色皿中进行或通过将小液滴加载到定制的样品架上。该检测方案对于快速定量具有高再现性的复杂基质中的生物标志物特别有用。
本文使用模块化光谱仪展示了一种简单的方法来形成CB7的宿主 - 客体复合物和重要的生物标志物UA,并通过CB7介导的Au NPs在水介质中的聚集物以0.2μM的检测限量化UA,这在诊断和临床应用中是有希望的。
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Protocol
1. 金核素的合成
- 通过传统的图尔克维奇方法合成金种子26
- 通过溶解98.5mg HAuCl4 , 制备10 mL 25 mM HAuCl4溶液3H2O前驱体与10mL去离子水在玻璃小瓶中。
注意:将少量HAuCl4 前驱体转移到称量船中,并使用塑料刮刀代替金属刮刀称量晶体,因为HAuCl4 前驱体会腐蚀金属实验室器具。称量步骤应尽可能快地进行,因为HAuCl4 具有吸湿性,因此会通过从大气中吸收水分来增加其重量。HAuCl4 具有高度腐蚀性,可引起严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。处理时要格外小心。 - 通过将64.5mg柠檬酸钠粉末与0.5mL去离子水溶解在玻璃瓶中来制备0.5mL 500mM柠檬酸钠溶液。
- 在250 mL蓝封瓶中用99 mL水稀释1 mL 25 mM HAuCl4 溶液,得到100 mL 0.25 mM HAuCl4 溶液。
- 将 99.5 mL 0.25 mM HAuCl4 溶液加入配备冷凝器的 250 mL 三颈圆底烧瓶中。在剧烈搅拌下将溶液加热至90°C并保持温度15分钟。
- 将0.5mL的500mM柠檬酸钠溶液注入反应混合物中,并保持温度并搅拌,直到溶液的颜色变成红宝石红色。
注意:反应大约需要30分钟。
- 通过溶解98.5mg HAuCl4 , 制备10 mL 25 mM HAuCl4溶液3H2O前驱体与10mL去离子水在玻璃小瓶中。
- 通过动力学控制方法对Au NPs进行种子生长13
- 将合成的Au种子溶液冷却至70°C。
- 通过将154.8mg柠檬酸钠粉末与10mL去离子水溶解在玻璃瓶中来制备10mL 60mM柠檬酸钠溶液。
- 向Au种子注入0.67mL的25mM HAuCl4 溶液和0.67mL的60mM柠檬酸钠溶液,时间间隔为2分钟。
- 重复步骤1.2.3,逐渐将Au NPs的尺寸增加到40nm。
注意:大约需要10个生长步骤才能达到40nm。所需的实际步骤数可能取决于精确的设置。
- 使用自动合成器对金NPs进行种子生长(图2)
- 将第1节中制备的25mL Au种子溶液转移到50mL锥形离心管中,并在热混合器中冷却至70°C。
注:使用放置在装有25 mL水的50 mL离心管中的热电偶温度计监测热混合器内部的温度。 - 在 3 mL 鲁尔锁一次性注射器中加入 2.5 mL 25 mM HAuCl4 溶液。用2.5 mL 60 mM柠檬酸钠溶液填充另一个3 mL鲁尔锁一次性注射器。
- 将注射器放入注射泵中,并使用鲁尔到微密适配器将PEEK管(内径150μm)连接到注射器。将管子插入热混合器中含有Au种子溶液的离心管中。
- 设置两个注射泵,在20分钟(每分钟8.357μL)内分配0.1675 mL溶液。
- 将热混合器转速设置为700 rpm,然后在含有25 mM HAuCl4溶液的注射泵上按“启动”。
- 2分钟后,在含有60mM柠檬酸钠溶液的注射泵上按 开始 。
- 开始HAuCl4 溶液注射后30分钟,除去等分试样的Au NP溶液进行分析。
- 重复步骤1.3.5 – 1.3.7,逐渐将Au NPs的直径增加到40nm。
注意:该设置可用于通过增加步骤1.3.4中添加的反应物的体积,一步将Au NPs生长到40nm。这是通过增加分配时间同时保持相同的注射速率来实现的。
- 将第1节中制备的25mL Au种子溶液转移到50mL锥形离心管中,并在热混合器中冷却至70°C。
2. 金核素的表征
- 紫外-可见光谱
- 将1 mL Au NP溶液加入半微量石英比色皿中。
- 打开光谱仪。
- 将波长范围设置为 400 - 800 nm。
- 获取每个样品的紫外-可见光谱。
- 动态光散射
- 用0.22μm过滤器将样品溶液过滤到塑料半微比色皿中。
- 打开 DLS 仪器。
- 将温度设置为25°C并平衡60秒。
- 测量每个样品的流体动力学尺寸。
- 透射电子显微镜
- 将 5 μL 样品溶液液滴滴浇注到 C 涂层的 300 目 Cu 网格上,并在空气中干燥。
注意:对于更浓缩的Au NP溶液样品,需要稀释才能在TEM网格上获得均匀分散的Au NPs。 - 在200 kV加速电压下使用TEM为每个样品采集多个TEM图像。
- 使用ImageJ计算平均尺寸和标准偏差,测量每个样品的200 Au NP的直径。
- 将 5 μL 样品溶液液滴滴浇注到 C 涂层的 300 目 Cu 网格上,并在空气中干燥。
3. CB7-UA复合物的形成
- 0.4 mM CB7溶液的制备
- 向15毫升玻璃瓶中加入4.65毫克CB7。
注:CB7的用量是根据CB7(= 1163 Da)的公式重量计算的,该公式重量已被文献中的大多数报告所采用。然而,CB7固体样品通常含有合成和纯化步骤中留下的水,HCl,甲醇和其他盐,有助于样品中的自重约为10-20%。滞留的溶剂和盐不能通过在真空炉或其他方式中加热来去除。它们的量因不同批次的样品而异,但可以使用元素分析进行量化。然而,所提出的方案对CB7样品中存在未定量的溶剂和盐不敏感。 - 向小瓶中加入10 mL水并拧紧盖子。
- 在室温下对样品进行超声处理,直到CB7固体完全溶解。
注:CB7是根据文献27 合成的,但它也是市售的。
- 向15毫升玻璃瓶中加入4.65毫克CB7。
- 0.4 mM UA溶液的制备
- 向50 mL离心管中加入2.69mg UA。
- 向管中加入40 mL水并拧紧盖子。
- 使用热混合器将温度设置为70°C,速度设置为800 rpm,时间设置为2小时,从而旋转样品溶液。让溶液冷却至室温。
注:UA在水中的溶解度较低(0.40 mM)5。如果UA粉末尚未完全溶解,则旋转更长时间。或者,超声处理可用于促进溶解。
- 0.4 mM UA溶液的顺序稀释
- 在15 mL玻璃瓶中用5 mL水稀释5 mL 0.4 mM UA溶液,得到10 mL 0.2 mM UA溶液。拧紧盖子并超声处理30秒。
- 重复步骤3.3.1,使用适量的UA和水,如表1所述。
- CB7-UA复合物的制备
- 将0.75 mL的0.4 mM CB7溶液和0.75 mL的0.4 mM UA溶液加入1.5 mL试管中。盖上盖子并超声处理30秒。
- 等待30分钟,以确保形成东宾综合体。
- 重复步骤3.4.1 – 3.4.2,使用不同浓度的UA溶液。
4. 用户获取的 SERS 传感
- 拉曼系统的实验设置(图3)
- 打开 633 nm 氦氖激光器 (22.5 mW)。
- 打开模块化拉曼光谱仪。
- 打开计算机并启动软件。
- 单击“ 光谱学应用程序向导” 图标,然后选择“ 拉曼”。
- 开始新的收购。将积分时间设置为 30 秒,将扫描设置为平均值 5,将 boxcar 设置为 0。
- 存储背景光谱并输入激光波长(即633nm)。
注意:积分时间是每次扫描的时间,平均扫描是平均扫描次数,以创建每个光谱,boxcar是平均28的相邻像素数。
- SERS基板的形成
- 将0.9 mL的40nm Au NP溶液和0.1mL的预成型CB7-UA复合溶液加入1.5mL管中。盖上盖子并超声处理,直到溶液从红宝石红色变为紫色。
注意:也可以使用商用柠檬酸盐稳定的40nm Au NP溶液样品。通常,通过从浓缩的储备溶液样品中稀释,将局部表面等离子体共振(LSPR)峰的光密度调节至1。样品中的柠檬酸盐浓度通常保持在2mM。 - 将样品溶液转移到半微比色皿中。将比色皿放入拉曼样品架中,然后合上盖子。
- 开始测量。
- 设置自动保存以记录五个连续的SERS光谱。
- 停止测量并更换样品。
- 重复步骤4.2.1 – 4.2.5,使用不同浓度的CB7-UA溶液。
注意:发现聚集时间取决于纳米团聚体中UA的浓度,范围从0.1μM UA的30 s到20μM UA的30分钟,这是由于空CB7浓度的差异,这对介导Au NPs的聚集有重大贡献。对于CB7-UA复合物,一个门户被笨重的UA分子阻断,使其无法与Au NP表面结合,因此无法介导NP聚集体21。当溶液的颜色从红宝石红色变为紫色时,样品就可以进行测量了。
- 将0.9 mL的40nm Au NP溶液和0.1mL的预成型CB7-UA复合溶液加入1.5mL管中。盖上盖子并超声处理,直到溶液从红宝石红色变为紫色。
5. 数据分析
- 数据处理
- 将带有非对称最小二乘 (ALS) 插件的基线下载并安装到 Origin 中。
注意:ALS 插件需要 OriginPro。 - 将原始数据插入到源中。
- 根据每个样品的五个SERS光谱计算平均值。将该值除以激光器的功率(即22.5 mW)和积分时间(即30 s)。
- 单击 ALS 图标以打开对话框。将非对称因子设置为 0.001,阈值设置为 0.03%,将平滑因子设置为 2,将迭代次数设置为 20,以校正每个平均频谱的基线。
- 使用按 y 偏移的堆叠线绘制不同 UA 浓度的 SERS 光谱。输出应为强度(计数 s-1 mW-1)与拉曼位移 (cm-1)。
- 将带有非对称最小二乘 (ALS) 插件的基线下载并安装到 Origin 中。
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Representative Results
在所提出的Au NP合成中,紫外 - 可见光谱显示LSPR峰在10个生长步骤后从521 nm移动到529 nm(图4A,B),而DLS数据显示随着Au NPs的尺寸从25.9 nm增加到42.8 nm而窄尺寸分布(图4C,D)。从TEM图像(图4E)测量的G0,G5和G10的平均尺寸分别为20.1±2.1nm,32.5±2.3nm和40.0±2.2nm,每种情况下计数200个颗粒。这些结果表明,该协议在合成均匀和窄分散的Au NPs方面是有效的。
在所提出的SERS研究中,CB7和UA的宿主 - 客体复合物由空CB7形成,介导在Au NP:CB7纳米聚集体内形成精确的等离子体纳米结,由SERS光谱中的特征UA信号支持(图5A)。
CB(用+标记)和UA(用*标记)的拉曼峰的分配如 表2所示。相反,在没有CB7的情况下,无法观察到UA的SERS信号,这表明CB7在触发Au NPs聚集方面的关键作用。
在整个UA的SERS滴定中使用20μM的恒定CB7浓度,以确保原位形成可重复的等离子体纳米结构(即SERS底物)。通过观察来自640 cm-1和1130 cm-1的UA峰(分别归因于骨骼环变形和C-N振动)到~0.2μM(图5B−D)的透明SERS信号,证明了该协议中提出的检测方案的高灵敏度,这被称为检测限。此外,通过幂律,两个峰的SERS强度和UA的对数浓度之间非常强的相关性(R2>0.98),线性区域在0.2至2μM的范围内发现(图5E,F)。应该注意的是,对于狭窄范围的分析物浓度,SERS强度和对数浓度之间的线性相关性可以近似,而当对数浓度接近负无穷大(即分析物浓度接近0)时,SERS信号接近0,正如我们在数据中观察到的那样。SERS信号也具有高度的可重复性,如图5E,F所示的小误差线所示。
图1:自组装的Au NP:CB7纳米聚集体中精确等离子体纳米结的示意图。 插图显示了等离子体纳米结的放大,其中聚集由空CB7介导,而UA通过宿主 - 客体络合在Au NPs的表面上富集。需要指出的是,该计划不是按比例绘制的。 请点击此处查看此图的大图。
图2:(a)自动Au NP合成器的示意图和(b)照片。请点击此处查看此图的大图。
图3:拉曼系统的示意图。请点击此处查看此图的大图。
图4:金核氮化物的代表性表征。 (A)Au NPs的紫外-可见光谱和(B)放大光谱,显示随着生长步数增加到10,LSPR峰的偏移。(C)Au NPs的流体动力学尺寸和(D)相应的粒度图作为生长步骤数的函数。(E)金氮化物的透射电镜图像,显示5和10个生长步骤后金种子和金氮素的大小。 请点击此处查看此图的大图。
图5:Au NP:CB7纳米聚集物中UA检测的代表性SERS结果。 (A) 在存在或不存在 CB7 的情况下 UA 的 SERS 光谱。CB7和UA的拉曼峰分别用+和*标记。(B) UA 的全量程 600 - 700 cm-1 放大和 (D) 1100 - 1180 cm-1 放大 SERS 光谱,浓度范围为 0 至 20 μM。UA的主要拉曼峰以*标记。光谱经过基线校正和偏移以保持清晰。(英、华)SERS峰值强度与UA浓度的对应图。请点击此处查看此图的大图。
UA储备溶液的浓度(μM) | 添加的 UA 库存溶液的体积 (mL) | 加水量(毫升) | 新型 UA 储备溶液 (μM) 的浓度 |
400 | 5 | 5 | 200 |
200 | 5 | 5 | 100 |
100 | 4 | 6 | 40 |
40 | 5 | 5 | 20 |
20 | 5 | 5 | 10 |
10 | 4 | 6 | 4 |
4 | 5 | 5 | 2 |
表1:UA溶液的顺序稀释。
断续器 CB7 | 用户获取 | ||
SERS 峰值 (cm-1) | 峰值分配 | SERS 峰值 (cm-1) | 峰值分配 |
446 | 环形剪刀模式 | 491 | C-N-C 环振动 |
831 | 环变形 | 640 | 骨架环变形 |
1375 | 对称 C-N 拉伸 | 896 | N-H 弯曲 |
1420 | 不对称 C-N 拉伸 | 1020 | 环振动 |
- | - | 1130 | C-N 振动 |
- | - | 1202 | N-C-C 拉伸和弯曲 |
表2:CB7和UA 2,4,29的拉曼峰的分配。
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Discussion
协议中描述的自动合成方法允许可重复地合成尺寸增加的Au NPs。虽然有一些元素仍然需要手动进行,例如在种子合成过程中快速添加柠檬酸钠并定期检查以确保PEEK管是安全的,但这种方法允许大尺寸(高达40nm)的Au NPs,这通常需要多次手动注射HAuCl4 和柠檬酸钠, 通过长时间的连续加法合成。
可以进行进一步的表征以阐明CB配合物的基本性质。例如,宿主 - 客体复合物的形成通常可以使用1H核磁共振(NMR)来确认,其在复合的情况下应显示上场偏移和信号的扩大21,22,25。然而,1H NMR不适用于UA,因为它缺乏不可交换的质子。也可以使用13C NMR和质谱等替代技术来表征络合。CB7和UA之间的结合常数可以使用滴定技术测量,例如紫外 -可见光谱滴定和等温滴定量热法(ITC)21,22,25。同时,可以计算基于力场和密度泛函理论(DFT)模型的分子建模,以获得对主客体配合物21,22,25,29结合几何的理论见解。此外,红外和拉曼光谱可以通过频率计算21,25,29来计算。
SERS是一种高度灵敏和选择性的分析技术,允许通过其分子特异性振动指纹识别痕量分析物。SERS在不同的科学学科中越来越感兴趣,特别是生物医学研究,因为它的信号大大增强,采集时间更短,对液态水具有高耐受性(适用于生物流体中的传感)30,31,32,33,34,35。与之前关于UA传感1,2,3,4,36,37的报告相比,CB7的刚性结构通过羰基门结合定义了Au NPs之间0.9nm的精确间距,而表面结合的CB7可以将UA分子捕获在其腔内(图1),产生强烈和局部的等离子体热点,因此UA的高灵敏度(低至~0.2μM)和可重复(误差在2%以内)SERS信号,SERS强度和对数浓度之间具有非常强的相关性(R2>0.98)(图5)。
为了优化CB7的浓度,我们注意到使用20μM CB7来确保形成可重复的SERS底物。特别是,所使用的CB7的绝对浓度取决于整个系统(即,Au NPs,分析物和背景分子,如果有的话)18,22。如果Au NPs的聚集太慢,则应使用更高浓度的CB7。相反,如果样品溶液快速沉淀并导致较短的测量窗口,则应使用较低浓度的CB7。在我们的实验环境中,由CB7介导的Au NPs的聚集预计将遵循扩散限制胶体聚集(DLCA)动力学19,其中开放和细长的链状结构在连接在一起成为准分形网络之前被迅速形成。DLCA动力学通常以高CB:Au NP比(按数字)发生,在我们的例子中等于106:1。应该注意的是,尿酸以较高浓度存在于体液(例如,血清,尿液)中。例如,血清38 中尿酸的正常浓度分别为3.5 –7.0 mg / dL,尿液2 中的正常浓度分别为16 – 100 mg / dL(高于或低于正常浓度的浓度称为高尿酸血症和低尿酸血症)39。因此,在这种高灵敏度的方案中,只需要非常少量的样品进行生物标志物检测,其中使用高稀释因子将样品的浓度降低到合适的范围。这对于尿液排泄非常低的绝症患者的床旁监测尤为重要。高度稀释的样品导致更大的样品体积,从而减少由于水分蒸发引起的生物标志物定量误差和由于液体转移而导致的样品损失,同时提供其他优点,包括最小化基质效应25。由于这种探测方法的选择性,它仅限于可与CB形成宿主 - 客体复合物的分析物分子。应该注意的是,可以观察到来自其他分子的干扰,因为CB可以与不同的客体分子结合。然而,可以在SERS测量之前进行凝胶电泳和HPLC等样品纯化。
该方案中演示的检测方案在与高级数据分析技术相结合时,具有在复杂基质中多重检测生物标志物的潜力,用于临床应用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
TCL感谢英国皇家学会研究补助金2016 R1(RG150551)和UCL BEAMS未来领袖奖的支持,该奖项由EPSRC的机构赞助奖(EP/P511262/1)资助。WIKC,TCL和IPP感谢A * STAR-UCL研究实习计划通过EPSRC M3S CDT(EP / L015862 / 1)资助的学生奖学金。GD和TJ要感谢EPSRC M3S CDT(EP / L015862 / 1)赞助他们的学生奖学金。TJ和TCL感谢Camtech Innovations对TJ学生的贡献。所有作者都感谢伦敦大学学院开放获取基金。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
40 nm gold nanoparticles | NanoComposix | AUCN40-100M | NanoXact, 0.05 mg/ mL, bare (citrate) |
Centrifuge tube | Corning Falcon | 14-432-22 | 50 mL volume |
Cucurbit[7]uril | Lab-made | see ref. 19 | |
Gold(III) chloride trihydrate | Sigma aldrich | 520918 | ≥99.9% trace metals basis |
Luer lock disposable syringe | Cole-Parmer | WZ-07945-15 | 3 mL volume |
Luer-to-MicroTight adapter | LuerTight | P-662 | 360 μm outer diameter Tubing to Luer Syringe |
PEEK tubing | IDEX | 1572 | 360 μm outer diameter, 150 μm inner diameter |
PEEK tubing cutter | IDEX | WZ-02013-30 | Capillary Polymer Chromatography Tubing Cutter For 360 µm to 1/32" OD tubing |
Raman spectrometer | Ocean Optics | QE pro | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma aldrich | S4641 | ACS reagent, ≥99.0% |
Sonicator | |||
Standard Probe | Digi-Sense | WZ-08516-55 | Type-K |
Syringe pump | Aladdin | ALADDIN2-220 | 2 syringes, maximum syringe volume 60 mL |
Thermocouple thermometer | Digi-Sense | WZ-20250-91 | Single-Input Thermocouple Thermometer with NIST-Traceable Calibration |
ThermoMixer | Eppendorf | 5382000031 | With an Eppendorf SmartBlock for 50 mL tubes |
Uric acid | Sigma aldrich | U2625 | ≥99%, crystalline |
References
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