Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kvantitativ SERS-detektion av urinsyra via bildning av exakta plasmoniska nanojunktioner inom aggregat av guldnanopartiklar och cucurbit[n]uril

Published: October 3, 2020 doi: 10.3791/61682
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemistry, University College London (UCL), 2Institute for Materials Discovery, University College London (UCL)

Summary

Ett värd-gästkomplex av cucurbit[7]uril och urinsyra bildades i en vattenlösning innan en liten mängd tillsattes i Au NP-lösning för kvantitativ ytförstärkt Ramanspektroskopi (SERS) avkänning med hjälp av en modulär spektrometer.

Abstract

Detta arbete beskriver en snabb och mycket känslig metod för kvantitativ detektion av en viktig biomarkör, urinsyra (UA), via ytförstärkt Ramanspektroskopi (SERS) med en låg detektionsgräns på ~ 0,2 μM för flera karakteristiska toppar i fingeravtrycksområdet, med hjälp av en modulär spektrometer. Detta biosenseringsschema förmedlas av värd-gästkomplexationen mellan en makrocykel, cucurbit[7]uril (CB7) och UA, och den efterföljande bildningen av exakta plasmoniska nanojunktioner inom de självmonterade Au NP: CB7-nanoaggregaten. En facil Au NP-syntes av önskvärda storlekar för SERS-substrat har också utförts baserat på den klassiska citratreduktionsmetoden med möjlighet att underlättas med hjälp av en laboratoriebyggd automatiserad synthesizer. Detta protokoll kan lätt utvidgas till multiplexerad detektion av biomarkörer i kroppsvätskor för kliniska tillämpningar.

Introduction

Urinsyra, som är slutprodukten av metabolism av purinnukleotider, är en viktig biomarkör i blodserum och urin för diagnos av sjukdomar som gikt, preeklampsi, njursjukdomar, högt blodtryck, hjärt-kärlsjukdomar och diabetes 1,2,3,4,5. Nuvarande metoder för urinsyradetektion inkluderar kolorimetriska enzymatiska analyser, högpresterande vätskekromatografi och kapillärelektrofores, som är tidskrävande, dyra och kräver sofistikerad provberedning 6,7,8,9.

Ytförstärkt Ramanspektroskopi är en lovande teknik för rutinmässig vårddiagnos eftersom den möjliggör selektiv detektion av biomolekyler via deras vibrationsfingeravtryck och erbjuder många fördelar som högkänslighet, snabb respons, användarvänlighet och ingen eller minimal provberedning. SERS-substrat baserade på ädelmetallnanopartiklar (t.ex. Au NPs) kan förbättra Raman-signalerna från analytmolekylerna med 4 till 10 storleksordningar10 via stark elektromagnetisk förbättring orsakad av ytplasmonresonans11. Au NPs av skräddarsydda storlekar kan enkelt syntetiseras i motsats till den tidskrävande tillverkningen av komplexa metallnanokompositer12, och används därför i stor utsträckning i biomedicinska tillämpningar på grund av deras överlägsna egenskaper 13,14,15,16. Fastsättning av makrocykliska molekyler, cucurbit[n]urils (CBn, där n = 5-8, 10), på ytan av Au NPs kan ytterligare förbättra SERS-signalerna från analytmolekylerna eftersom de mycket symmetriska och styva CB-molekylerna kan styra det exakta avståndet mellan Au NPs och lokalisera analytmolekylerna i mitten eller i närheten av de plasmoniska hotspotsna genom bildning av värd-gästkomplex (figur 1)17, 18 19,20. Tidigare exempel på SERS-studier med Au NP: CBn nanoaggregat inkluderar nitroexplosiva ämnen, polycykliska aromater, diaminostilben, neurotransmittorer och kreatinin 21,22,23,24,25, där SERS-mätningarna antingen utförs i en kyvett eller genom att ladda en liten droppe på en skräddarsydd provhållare. Detta detektionsschema är särskilt användbart för att snabbt kvantifiera biomarkörer i en komplex matris med hög reproducerbarhet.

Här demonstrerades en lätt metod för att bilda värd-gästkomplex av CB7 och en viktig biomarkör UA och för att kvantifiera UA med en detektionsgräns på 0,2 μM via CB7-medierade aggregeringar av Au NPs i vattenhaltiga medier med hjälp av en modulär spektrometer, vilket är lovande för diagnostiska och kliniska tillämpningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntes av Au NPs

  1. Syntes av Au-frön via den konventionella Turkevich-metoden26
    1. Förbered 10 ml 25 mM HAuCl4-lösning genom att lösa upp 98,5 mg HAuCl4· 3H2O-prekursor med 10 ml avjoniserat vatten i en glasflaska.
      OBS: Överför en liten mängd HAuCl 4-prekursor till en vägningsbåt och använd en plastspatel istället för metallspatel för att väga ut kristallerna eftersom HAuCl4-prekursorn kommer att korrodera metalllabware. Vägningssteget bör utföras så snabbt som möjligt, eftersom HAuCl4 är hygroskopiskt och därför kommer att öka sin vikt över tiden genom att absorbera vatten från atmosfären. HAuCl4 är mycket frätande och kan orsaka allvarliga hudbrännskador och ögonskador. Var extra försiktig när du hanterar den.
    2. Förbered 0,5 ml 500 mM natriumcitratlösning genom att lösa upp 64,5 mg natriumcitratpulver med 0,5 ml avjoniserat vatten i en glasflaska.
    3. Späd 1 ml av 25 mM HAuCl4-lösningen med 99 ml vatten i en 250 ml blåhuvad flaska för att ge 100 ml 0,25 mM HAuCl4-lösning .
    4. Tillsätt 99,5 ml av 0,25 mM HAuCl4-lösningen i en 250 ml trehalsad rundbottnad kolv utrustad med en kondensor. Värm lösningen till 90 °C under kraftig omrörning och håll temperaturen i 15 min.
    5. Injicera 0,5 ml av 500 mM natriumcitratlösningen i reaktionsblandningen och behåll temperaturen och rör om tills lösningens färg blir rubinröd.
      OBS: Reaktionen tar cirka 30 minuter.
  2. Sådd tillväxt av Au NPs via den kinetiskt kontrollerade metoden13
    1. Kyl den as-syntetiserade Au-frölösningen till 70 °C.
    2. Förbered 10 ml 60 mM natriumcitratlösning genom att lösa upp 154,8 mg natriumcitratpulver med 10 ml avjoniserat vatten i en glasflaska.
    3. Injicera 0,67 ml av 25 mM HAuCl4-lösningen och 0,67 ml av 60 mM natriumcitratlösningen till Au-fröna med ett tidsintervall på 2 min.
    4. Upprepa steg 1.2.3 för att gradvis öka storleken på Au NPs till 40 nm.
      OBS: Det tar cirka 10 växande steg för att nå 40 nm. Det faktiska antalet steg som behövs kan vara beroende av den exakta uppsättningen.
  3. Sådd tillväxt av Au NPs med hjälp av automatiserad synthesizer (Figur 2)
    1. Överför 25 ml au-frölösning framställd i sektion 1 till ett koniskt centrifugrör på 50 ml och kyl till 70 °C i en termomixer.
      OBS: Övervaka temperaturen inuti termomixern med en termoelementtermometer placerad i ett 50 ml centrifugrör som innehåller 25 ml vatten.
    2. Fyll en engångsspruta med 3 ml Luer-lås med 2,5 ml 25 mM HAuCl4-lösning . Fyll ytterligare en 3 ml Luer lås engångsspruta med 2,5 ml 60 mM natriumcitratlösning.
    3. Placera sprutorna i sprutpumparna och använd Luer-to-MicroTight-adaptrar för att ansluta PEEK-slangen (150 μm inre diameter) till sprutorna. Sätt in slangen i centrifugröret som innehåller Au-frölösningen i termomixern.
    4. Ställ in båda sprutpumparna så att de avger 0,1675 ml lösning under 20 minuter (8,357 μL per min).
    5. Ställ in termomixerns rotationshastighet på 700 rpm och tryck på Start på sprutpumpen som innehåller 25 mM HAuCl4-lösningen .
    6. Efter 2 minuter trycker du på Start på sprutpumpen som innehåller 60 mM natriumcitratlösningen.
    7. 30 minuter efter start av HAuCl4-injektionen i lösning, ta bort en alikvot av Au NP-lösningen för analys.
    8. Upprepa steg 1.3.5 – 1.3.7 för att gradvis öka Au NPs diameter upp till 40 nm.
      OBS: Denna inställning kan användas för att växa Au NPs upp till 40 nm i ett steg genom att öka volymen reaktanter som läggs till i steg 1.3.4. Detta uppnås genom att öka doseringstiden samtidigt som samma injektionshastighet bibehålls.

2. Karakterisering av Au NPs

  1. UV-Vis-spektroskopi
    1. Tillsätt 1 ml Au NP-lösningen till en halvmikrokvartskyvett.
    2. Slå på spektrometern.
    3. Ställ in våglängdsområdet på 400 - 800 nm.
    4. Förvärva UV-Vis-spektrumet för varje prov.
  2. Dynamisk ljusspridning (DLS)
    1. Filtrera provlösningen i en halvmikrokyvett av plast med ett 0,22 μm filter.
    2. Slå på DLS-instrumentet.
    3. Ställ in temperaturen på 25 °C och balansera i 60 s.
    4. Mät den hydrodynamiska storleken på varje prov.
  3. Transmissionselektronmikroskopi (TEM)
    1. Drop-gjut en 5 μL droppe av provlösningen på ett C-belagt 300-mesh Cu-galler och torka i luft.
      OBS: Utspädning behövs för mer koncentrerade Au NP-lösningsprover för att erhålla väl dispergerade Au NPs på ett TEM-nät.
    2. Hämta flera TEM-bilder för varje prov med hjälp av en TEM vid 200 kV accelerationsspänning.
    3. Mät diametern på 200 Au NPs för varje prov med ImageJ för att beräkna medelstorlek och standardavvikelse.

3. Bildning av CB7-UA-komplex

  1. Framställning av 0,4 mM CB7-lösning
    1. Tillsätt 4,65 mg CB7 till en 15 ml glasflaska.
      OBS: Mängden CB7 beräknas baserat på formelvikten för CB7 (= 1163 Da) som har använts av de flesta rapporter i litteraturen. Ändå innehåller CB7-fasta prover vanligtvis vatten, HCl, metanol och andra salter kvar från syntes- och reningsstegen, vilket bidrar till ~ 10 - 20% dödvikt i provet. De fångade lösningsmedlen och salterna kunde inte avlägsnas genom uppvärmning i vakuumugn eller på annat sätt. Deras mängder varierar mellan olika partier av prover men kan kvantifieras med hjälp av elementär analys. Ändå är det presenterade protokollet inte känsligt för närvaron av okvantifierad mängd lösningsmedel och salter i CB7-proverna.
    2. Tillsätt 10 ml vatten i injektionsflaskan och dra åt locket.
    3. Sonicate provet vid rumstemperatur tills CB7 fast ämne är helt upplöst.
      OBS: CB7 syntetiserades enligt litteratur27 men det är också kommersiellt tillgängligt.
  2. Framställning av 0,4 mM UA-lösning
    1. Tillsätt 2,69 mg UA till ett 50 ml centrifugrör.
    2. Tillsätt 40 ml vatten i röret och dra åt locket.
    3. Använd en termomixer för att virvla provlösningen genom att ställa in temperaturen till 70 ° C, hastigheten till 800 rpm och tiden till 2 timmar. Låt lösningen svalna till rumstemperatur.
      OBS: UA har en låg löslighet i vatten (0,40 mM)5. Virvla längre om UA-pulvret inte har lösts helt. Alternativt kan ultraljud användas för att underlätta upplösningen.
  3. Sekventiella utspädningar av 0,4 mM UA-lösningen
    1. Späd 5 ml av 0,4 mM UA-lösningen med 5 ml vatten i en 15 ml glasflaska för att ge 10 ml 0,2 mM UA-lösning. Dra åt locket och sonicate i 30 s.
    2. Upprepa steg 3.3.1 med en lämplig mängd obeyrtnad och vatten enligt beskrivningen i tabell 1.
  4. Beredning av CB7-UA-komplexen
    1. Tillsätt 0,75 ml av 0,4 mM CB7-lösningen och 0,75 ml 0,4 mM UA-lösning i ett 1,5 ml rör. Säkra locket och sonicate i 30 s.
    2. Vänta i 30 minuter för att säkerställa bildandet av värd-gästkomplex.
    3. Upprepa steg 3.4.1 – 3.4.2 med UA-lösning med olika koncentrationer.

4. SERS-avkänning av UA

  1. Experimentell uppbyggnad av Raman-systemet (figur 3)
    1. Slå på 633 nm He-Ne-lasern (22,5 mW).
    2. Slå på den modulära Raman-spektrometern.
    3. Slå på datorn och starta programvaran.
    4. Klicka på ikonen Spectroscopy Application Wizards och välj sedan Raman.
    5. Starta ett nytt förvärv. Ställ in integrationstiden på 30 s, skanningar till genomsnitt till 5 och boxcar till 0.
    6. Lagra bakgrundsspektrum och ange laservåglängden (dvs 633 nm).
      OBS: Integrationstiden är tiden för varje skanning, skanningar till genomsnittet är antalet skanningar i genomsnitt för att skapa varje spektrum och boxcar är antalet angränsande pixlar i genomsnitt28.
  2. Bildandet av SERS-substraten
    1. Tillsätt 0,9 ml av 40 nm Au NP-lösningen och 0,1 ml av den förformade CB7-UA-komplexlösningen i ett 1,5 ml rör. Säkra locket och sonicate tills lösningen ändras från rubinröd till lila.
      OBS: Kommersiella citratstabiliserade 40 nm Au NP-lösningsprover kan också användas. Typiskt justeras den optiska densiteten hos den lokaliserade ytplasmonresonansen (LSPR) till 1 via utspädning från koncentrerade stamlösningsprover. Citratkoncentrationen i provet hålls vanligtvis som 2 mM.
    2. Överför provlösningen till en halvmikrokyvett. Placera kyvetten i Raman-provhållaren och stäng locket.
    3. Starta mätningen.
    4. Ställ in den automatiska sparningen för att spela in fem på varandra följande SERS-spektra.
    5. Stoppa mätningen och byt provet.
    6. Upprepa steg 4.2.1–4.2.5 med CB7-UA-lösning med olika koncentrationer.
      ANM.: Aggregeringstiden har visat sig vara beroende av koncentrationen av obemannat obemannat material i nanoaggregnen, från 30 s för 0,1 μM UA till 30 min för 20 μM obemannat obemannat material, på grund av skillnaden i koncentrationen av tomt CB7, vilket i hög grad bidrar till att förmedla aggregeringen av Au NPs. För CB7-UA-komplexet blockeras en portal av den skrymmande UA-molekylen, vilket gör den otillgänglig för bindning till Au NP-ytan och därför inte kan förmedla NP-aggregeringen21. Provet är klart för mätning när lösningens färg ändras från rubinröd till lila.

5. Analys av data

  1. Databehandling
    1. Ladda ned och installera baslinjen med plugin-programmet asymmetriska minsta kvadrater (ALS) i Origin.
      OBS: ALS-plugin kräver OriginPro.
    2. Infoga rådata i Origin.
    3. Beräkna ett medelvärde från de fem SERS-spektra för varje prov. Dela värdet med laserns effekt (dvs 22,5 mW) och med integrationstiden (dvs 30 s).
    4. Klicka på ALS-ikonen för att öppna dialogrutan. Ställ in den asymmetriska faktorn på 0,001, tröskelvärdet till 0,03 %, utjämningsfaktorn till 2 och antalet iterationer till 20 för att korrigera baslinjen för varje genomsnittligt spektrum.
    5. Plotta SERS-spektra av olika UA-koncentrationer med hjälp av staplade linjer med y-förskjutningar. Utgången ska vara intensitet (räknar s-1 mW-1) mot Raman shift (cm-1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I den presenterade Au NP-syntesen visar UV-Vis-spektra en förskjutning av LSPR-topparna från 521 nm till 529 nm efter 10 växande steg (figur 4A,B) medan DLS-data visar en smal storleksfördelning när storleken på Au NPs ökar från 25,9 nm till 42,8 nm (figur 4C,D). De genomsnittliga storlekarna på G0, G5 och G10 mätt från TEM-bilder (figur 4E) är 20,1 ± 2,1 nm, 32,5 ± 2,3 nm respektive 40,0 ± 2,2 nm, med 200 partiklar räknade i varje enskilt fall. Dessa resultat indikerar att detta protokoll är effektivt för att syntetisera enhetliga och snävt spridda Au NPs.

I de presenterade SERS-studierna bildades värd-gästkomplex av CB7 och UA med tom CB7 som förmedlade bildandet av exakta plasmoniska nanojunktioner inom Au NP: CB7-nanoaggregaten, vilket stöds av de karakteristiska UA-signalerna i SERS-spektrumet (figur 5A).

Tilldelningarna för Raman-topparna i CB (markerade med +) och UA (markerade med *) visas i tabell 2. Omvänt kan inga SERS-signaler från UA observeras i avsaknad av CB7, vilket illustrerar CB7: s nyckelroll för att utlösa aggregeringen av Au NPs.

En konstant CB7-koncentration på 20 μM användes vid SERS-titreringen av UA genomgående för att säkerställa in situ-bildning av reproducerbara plasmoniska nanostrukturer (dvs. SERS-substrat). Den höga känsligheten hos detektionsschemat som presenteras i detta protokoll demonstrerades genom observation av tydliga SERS-signaler från UA-topparna vid 640 cm-1 och 1130 cm-1 (hänförlig till skelettringens deformation respektive C-N-vibration) ner till ~ 0,2 μM (figur 5B−D), vilket är känt som detektionsgränsen. Dessutom erhölls mycket starka korrelationer (R2 > 0,98) mellan SERS-intensiteten och loggkoncentrationen av UA genom effektlag för båda topparna, med linjära regioner som hittades i intervallet 0,2 till 2 μM (figur 5E,F). Det bör noteras att linjära korrelationer mellan SERS-intensiteten och loggkoncentrationen kan approximeras för ett smalt intervall av analytkoncentrationer, medan SERS-signalen närmar sig 0 när loggkoncentrationen närmar sig negativ oändlighet (dvs. analytkoncentrationen närmar sig 0), vilket observerats i våra data. SERS-signalerna är också mycket reproducerbara, vilket framgår av de små felstaplarna som visas i figur 5E,F.

Figure 1
Figur 1: Schematisk illustration av de exakta plasmoniska nanojunktionerna inom självmonterade Au NP: CB7-nanoaggregat. Infällningen visar en inzoomning av de plasmoniska nanojunktionerna där aggregeringen förmedlas av tom CB7 medan UA berikas på ytan av Au NPs via värd-gästkomplexation. Det noteras att systemet inte dras i skala. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: a) Schematisk illustration och b) fotografi av den automatiserade Au NP-synthesizern. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Schematisk illustration av Raman-systemet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Representativ karakterisering av Au NPs. (A) UV-Vis-spektra av Au NPs och (B) zoom-in-spektra som visar förskjutningen av LSPR-topparna när antalet växande steg ökar till 10. (C) Hydrodynamisk storlek på Au NPs och (D) motsvarande plot av partikelstorlek som en funktion av antalet odlingssteg. (E) TEM-bilder av Au NPs, som visar storleken på Au-frön och Au NPs efter 5 och 10 odlingssteg. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Representativa SERS-resultat av UA-detektion inom Au NP: CB7-nanoaggregat. (A) SERS-spektra av obeyckade ämnen i närvaro eller frånvaro av CB7. Raman-toppar av CB7 och UA är markerade med + respektive * . (B) Full räckvidd, (C) 600 - 700 cm-1 zoom-in och (D) 1100 - 1180 cm-1 zooma in SERS-spektra av UA med koncentrationer från 0 till 20 μM. De viktigaste Raman-topparna i UA är markerade med *. Spektra korrigerades och kompenserades för tydlighetens skull. (E,F) Motsvarande diagram över SERS-toppintensiteten mot koncentrationen av UA. Klicka här för att se en större version av denna figur.

av UA-stamlösning (μM) Volym av tillsatt UA-stamlösning (ml) Volym av tillsatt vatten (ml) av ny UA-stamlösning (μM)
400 5 5 200
200 5 5 100
100 4 6 40
40 5 5 20
20 5 5 10
10 4 6 4
4 5 5 2

Tabell 1: Sekventiella utspädningar av obeyckad lösning.

CB7 UA
SERS-topp (cm-1) Topptilldelning SERS-topp (cm-1) Topptilldelning
446 Ring saxläge 491 C-N-C ring vibration
831 Ring deformation 640 Deformation av skelettring
1375 Symmetrisk C-N-sträckning 896 N-H böjning
1420 Asymmetrisk C-N-sträckning 1020 Ring vibrationer
- - 1130 C-N vibration
- - 1202 N-C-C sträckning och böjning

Tabell 2: Tilldelningar för Raman-topparna CB7 och UA 2,4,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den automatiserade syntesmetoden som beskrivs i protokollet gör det möjligt att reproducera Au NPs av ökande storlekar reproducerbart syntetiseras. Även om det finns vissa element som fortfarande behöver utföras manuellt, såsom snabb tillsats av natriumcitrat under frösyntesen och kontroll regelbundet för att säkerställa att PEEK-slangen är säker, tillåter denna metod Au NPs av stora storlekar (upp till 40 nm), vilket vanligtvis skulle kräva flera manuella injektioner av HAuCl4 och natriumcitrat, att syntetiseras via kontinuerlig tillsats under en lång tidsperiod.

Ytterligare karakterisering kan utföras för att belysa CB-komplexens grundläggande egenskaper. Till exempel kan bildandet av värd-gästkomplex typiskt bekräftas med hjälp av 1H kärnmagnetisk resonans (NMR), som bör visa uppfältsförskjutning och breddning av signaler vid komplexbildning 21,22,25. Ändå är 1H NMR inte tillämpligt på UA på grund av dess brist på icke-utbytbara protoner. Alternativa tekniker som 13C NMR och masspektrometri kan också användas för att karakterisera komplexbildningen. Bindningskonstanter mellan CB7 och UA kan mätas med hjälp av titreringstekniker, såsom UV-Vis-spektroskopititrering och isotermisk titreringskalorimetri (ITC)21,22,25. Samtidigt kan molekylär modellering baserad på DFT-modeller (force-field and density functional theory) beräknas för att få teoretiska insikter i bindningsgeometrin hos värd-gästkomplexen 21,22,25,29. Dessutom kan IR- och Ramanspektra beräknas med frekvensberäkningar 21,25,29.

SERS är en mycket känslig och selektiv analysteknik som möjliggör identifiering av spåranalyter via deras molekylspecifika vibrationsfingeravtryck. SERS får intressen inom olika vetenskapliga discipliner, särskilt biomedicinska studier, på grund av dess kraftigt förbättrade signaler, mycket kortare förvärvstid och hög tolerans mot flytande vatten (lämplig för avkänning i biofluider)30,31,32,33,34,35. Till skillnad från tidigare rapporter om UA-avkänning 1,2,3,4,36,37 definierar cb7:s styva struktur ett exakt avstånd på 0,9 nm mellan Au NPs via karbonylportalbindning medan den ytbundna CB7 kan fånga UA-molekyler i dess hålighet (Figur 1 ), vilket resulterar i starka och lokaliserade plasmoniska hotspots, och därmed de mycket känsliga (ner till ~ 0,2 μM) och reproducerbara (inom 2% fel) SERS-signalerna från UA med mycket starka korrelationer (R2 > 0,98) mellan SERS-intensiteten och loggkoncentrationen (figur 5).

I ett försök att optimera koncentrationen av CB7 noterar vi att 20 μM CB7 användes för att säkerställa bildandet av reproducerbara SERS-substrat. I synnerhet är den absoluta koncentrationen av CB7 som används beroende av det övergripande systemet (dvs. Au NPs, analyter och bakgrundsmolekyler, om sådana finns)18,22. En högre koncentration av CB7 bör användas om aggregeringen av Au NPs är för långsam. Omvänt bör en lägre koncentration av CB7 användas om provlösningen fälls ut snabbt och leder till kortare mätfönster. Aggregeringen av Au NPs medierade av CB7 i vår experimentella miljö förväntas följa diffusionsbegränsad kolloidal aggregering (DLCA) kinetik19, där öppna och långsträckta kedjeliknande strukturer snabbt bildades initialt innan de sammanfogades som kvasi-fraktalt nätverk. DLCA-kinetik uppträder vanligtvis vid ett högt CB: Au NP-förhållande (efter antal), vilket är lika med 106: 1 i vårt fall. Det bör noteras att urinsyra är närvarande i kroppsvätskor (t.ex. blodserum, urin) vid en högre koncentration. Till exempel är den normala koncentrationen av urinsyra 3,5 – 7,0 mg/dl i blodserum38 respektive 16–100 mg/dl i urin2 (koncentration över eller under den normala koncentrationen kallas hyperurikemi och hypourikemi)39. Därför behövs endast en mycket liten mängd prov för detektion av biomarkörer i detta mycket känsliga system där en hög utspädningsfaktor används för att sänka provets koncentration till ett lämpligt intervall. Detta är särskilt viktigt för patientövervakning av terminalt sjuka patienter vars urinutsöndring är mycket låg. Mycket utspädda prover resulterar i större provvolymer och minskar därmed fel i kvantifieringen av biomarkörer på grund av vattenavdunstning och förlust av prover på grund av vätskeöverföring, samtidigt som andra fördelar, inklusive minimering av matriseffekterna25. På grund av den selektiva karaktären hos denna sonderingsmetod är den begränsad till analytmolekyler som kan bilda värd-gästkomplex med CB. Det bör noteras att det är möjligt att observera störningar från andra molekyler eftersom CB kan binda till olika gästmolekyler. Ändå kan provrening såsom gelelektrofores och HPLC utföras före SERS-mätning.

Detektionsschemat som demonstreras i detta protokoll har potential för multiplexerad detektion av biomarkörer i en komplex matris för kliniska tillämpningar när den är kopplad till avancerade dataanalystekniker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

TCL är tacksam för stödet från Royal Society Research Grant 2016 R1 (RG150551) och UCL BEAMS Future Leader Award som finansieras genom Institutional Sponsorship Award av EPSRC (EP/P511262/1). WIKC, TCL och IPP är tacksamma för studentskapet som finansieras av A * STAR-UCL Research Attachment Programme genom EPSRC M3S CDT (EP / L015862/1). GD och TJ vill tacka EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1) för att de sponsrat deras studentskap. TJ och TCL erkänner Camtech Innovations för bidrag till TJ: s studentskap. Alla författare är tacksamma för UCL Open Access Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40 nm gold nanoparticles NanoComposix AUCN40-100M NanoXact, 0.05 mg/ mL, bare (citrate)
Centrifuge tube Corning Falcon 14-432-22 50 mL volume
Cucurbit[7]uril Lab-made see ref. 19
Gold(III) chloride trihydrate Sigma aldrich 520918 ≥99.9% trace metals basis
Luer lock disposable syringe Cole-Parmer WZ-07945-15 3 mL volume
Luer-to-MicroTight adapter LuerTight P-662 360 μm outer diameter Tubing to Luer Syringe
PEEK tubing IDEX 1572 360 μm outer diameter, 150 μm inner diameter
PEEK tubing cutter IDEX WZ-02013-30 Capillary Polymer Chromatography Tubing Cutter For 360 µm to 1/32" OD tubing
Raman spectrometer Ocean Optics QE pro
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma aldrich S4641 ACS reagent, ≥99.0%
Sonicator
Standard Probe Digi-Sense WZ-08516-55 Type-K
Syringe pump Aladdin ALADDIN2-220 2 syringes, maximum syringe volume 60 mL
Thermocouple thermometer Digi-Sense WZ-20250-91 Single-Input Thermocouple Thermometer with NIST-Traceable Calibration
ThermoMixer Eppendorf 5382000031 With an Eppendorf SmartBlock for 50 mL tubes
Uric acid Sigma aldrich U2625 ≥99%, crystalline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Villa, J. E. L., Poppi, R. J. A portable SERS method for the determination of uric acid using a paper-based substrate and multivariate curve resolution. Analyst. 141 (6), 1966-1972 (2016).
  2. Westley, C., et al. Absolute Quantification of Uric Acid in Human Urine Using Surface Enhanced Raman Scattering with the Standard Addition Method. Analytical Chemistry. 89 (4), 2472-2477 (2017).
  3. Zhao, L., Blackburn, J., Brosseau, C. L. Quantitative Detection of Uric Acid by Electrochemical-Surface Enhanced Raman Spectroscopy Using a Multilayered Au/Ag Substrate. Analytical Chemistry. 87 (1), 441-447 (2015).
  4. Goodall, B. L., Robinson, A. M., Brosseau, C. L. Electrochemical-surface enhanced Raman spectroscopy (E-SERS) of uric acid: a potential rapid diagnostic method for early preeclampsia detection. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (5), 1382-1388 (2013).
  5. Lytvyn, Y., Perkins, B. A., Cherney, D. Z. I. Uric Acid as a Biomarker and a Therapeutic Target in Diabetes. Canadian Journal of Diabetes. 39 (3), 239-246 (2015).
  6. Ali, S. M. U., Ibupoto, Z. H., Kashif, M., Hashim, U., Willander, M. A Potentiometric Indirect Uric Acid Sensor Based on ZnO Nanoflakes and Immobilized Uricase. Sensors. 12 (3), 2787-2797 (2012).
  7. Yu, J., Wang, S., Ge, L., Ge, S. A novel chemiluminescence paper microfluidic biosensor based on enzymatic reaction for uric acid determination. Biosensors and Bioelectronics. 26 (7), 3284-3289 (2011).
  8. Yang, Y. D. Simultaneous determination of creatine, uric acid, creatinine and hippuric acid in urine by high performance liquid chromatography. Biomedical Chromatography. 12 (2), 47-49 (1999).
  9. Zhao, S., Wang, J., Ye, F., Liu, Y. M. Determination of uric acid in human urine and serum by capillary electrophoresis with chemiluminescence detection. Analytical Biochemistry. 378 (2), 127-131 (2008).
  10. Fang, Y., Seong, N. H., Dlott, D. D. Measurement of the Distribution of Site Enhancements in Surface-Enhanced Raman Scattering. Science. 321 (5887), 388-392 (2008).
  11. Jeong, H. H., et al. Dispersion and shape engineered plasmonic nanosensors. Nature Communications. 7, 11331 (2016).
  12. Alula, M. T., et al. Preparation of silver nanoparticles coated ZnO/Fe3O4 composites using chemical reduction method for sensitive detection of uric acid via surface-enhanced Raman spectroscopy. Analytica Chimica Acta. 1073, 62-71 (2019).
  13. Bastús, N. G., Comenge, J., Puntes, V. Kinetically Controlled Seeded Growth Synthesis of Citrate-Stabilized Gold Nanoparticles of up to 200 nm: Size Focusing versus Ostwald Ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
  14. Jeong, H. H., et al. Selectable Nanopattern Arrays for Nanolithographic Imprint and Etch-Mask Applications. Advanced Science. 2 (7), 1500016 (2016).
  15. Loh, X. J., Lee, T. C., Dou, Q., Deen, G. R. Utilising inorganic nanocarriers for gene delivery. Biomaterials Science. 4 (1), 70-86 (2016).
  16. Celiz, A. D., Lee, T. C., Scherman, O. A. Polymer-Mediated Dispersion of Gold Nanoparticles: Using Supramolecular Moieties on the Periphery. Advanced Materials. 21 (38), 3937-3940 (2009).
  17. Lee, T. C., Scherman, O. A. Formation of Dynamic Aggregates in Water by Cucurbit[5]uril Capped with Gold Nanoparticles. ChemComm. 46 (14), 2438-2440 (2010).
  18. Lee, T. C., Scherman, O. A. A Facile Synthesis of Dynamic Supramolecular Aggregates of Cucurbit[n]uril (n = 5-8) Capped with Gold Nanoparticles in Aqueous Media. Chemistry-A European Journal. 18 (6), 1628-1633 (2012).
  19. Taylor, R. W., et al. Precise Subnanometer Plasmonic Junctions for SERS within Gold Nano- particle Assemblies Using Cucurbit[n]uril "Glue". ACS Nano. 5 (5), 3878-3887 (2011).
  20. Peveler, W. J., et al. Cucurbituril-mediated quantum dot aggregates formed by aqueous self-assembly for sensing applications. ChemComm. 55 (38), 5495-5498 (2019).
  21. Chio, W. I. K., et al. Selective Detection of Nitroexplosives Using Molecular Recognition within Self-Assembled Plasmonic Nanojunctions. The Journal of Physical Chemistry C. 123 (25), 15769-15776 (2019).
  22. Kasera, S., Biedermann, F., Baumberg, J. J., Scherman, O. A., Mahajan, S. Quantitative SERS Using the Sequestration of Small Molecules Inside Precise Plasmonic Nanoconstructs. Nano Letters. 12 (11), 5924-5928 (2012).
  23. Taylor, R. W., et al. In Situ SERS Monitoring of Photochemistry within a Nanojunction Reactor. Nano Letters. 13 (12), 5985-5990 (2013).
  24. Kasera, S., Herrmann, L. O., Barrio, J. d, Baumberg, J. J., Scherman, O. A. Quantitative Multiplexing with Nano-Self-Assemblies in SERS. Scientific Reports. 4, 6785 (2014).
  25. Chio, W. I. K., et al. Dual-triggered nanoaggregates of cucurbit[7]uril and gold nanoparticles for multi-spectroscopic quantification of creatinine in urinalysis. Journal of Materials Chemistry C. 8, 7051-7058 (2020).
  26. Turkevich, J., Stevenson, P. C., Hillier, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discussions of the Faraday Society. 11, 55-75 (1951).
  27. Lagona, J., Mukhopadhyay, P., Chakrabarti, S., Issacs, L. The cucurbit[n]uril family. Angewandte Chemie International Edition. 44 (31), 4844-4870 (2005).
  28. OceanView Installation and Operation Manual. , Available from: https://www.oceaninsight.com/globalassets/catalog-blocks-and-images/manuals--instruction-old-logo/software/oceanviewio.pdf (2013).
  29. Mahajan, S., et al. Raman and SERS spectroscopy of cucurbit[n]urils. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10429-10433 (2010).
  30. Langer, J., et al. Present and Future of Surface-Enhanced Raman Scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
  31. Pilot, R., et al. A Review on Surface-Enhanced Raman Scattering. Biosensors. 9 (2), 57 (2019).
  32. Bantz, K. C., et al. Recent progress in SERS biosensing. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (24), 11551-11567 (2011).
  33. Moore, T. J., et al. In Vitro and In Vivo SERS Biosensing for Disease Diagnosis. Biosensors. 8 (2), 46 (2018).
  34. Bonifacio, A., Cervo, S., Sergo, V. Label-free surface-enhanced Raman spectroscopy of biofluids: fundamental aspects and diagnostic applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (27), 8265-8277 (2015).
  35. Jeong, H. H., Choi, E., Ellis, E., Lee, T. C. Recent advances in gold nanoparticles for biomedical applications: from hybrid structures to multi-functionality. Journal of Materials Chemistry B. 7 (22), 3480-3496 (2019).
  36. Premasiri, W. R., Clarke, R. H., Womble, M. E. Urine Analysis by Laser Raman Spectroscopy. Lasers in Surgery and Medicine. 28 (4), 330-334 (2001).
  37. Lu, Y., et al. Superhydrophobic silver film as a SERS substrate for the detection of uric acid and creatinine. Biomedical Optics Express. 9 (10), 4988-4997 (2018).
  38. Feig, D. I., et al. Serum Uric Acid: A Risk Factor and a Target for Treatment. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (4), 69-73 (2006).
  39. Maiuolo, J., Oppedisano, F., Gratteri, S., Muscoli, C., Mollace, V. Regulation of uric acid metabolism and excretion. International Journal of Cardiology. 213, 8-14 (2016).

Tags

Kemi utgåva 164 guldnanopartiklar automatiserad synthesizer cucurbit[n]uril värd-gästkomplexation självmontering ytförstärkt Ramanspektroskopi sensor biomarkörer sjukdomsdiagnos
Kvantitativ SERS-detektion av urinsyra via bildning av exakta plasmoniska nanojunktioner inom aggregat av guldnanopartiklar och cucurbit[<em>n</em>]uril
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chio, W. I. K., Davison, G., Jones,… More

Chio, W. I. K., Davison, G., Jones, T., Liu, J., Parkin, I. P., Lee, T. C. Quantitative SERS Detection of Uric Acid via Formation of Precise Plasmonic Nanojunctions within Aggregates of Gold Nanoparticles and Cucurbit[n]uril. J. Vis. Exp. (164), e61682, doi:10.3791/61682 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter