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Chemistry

Quantitativer SERS-Nachweis von Harnsäure durch Bildung präziser plasmonischer Nanoverbindungen in Aggregaten von Goldnanopartikeln und Cucurbit[n]uril

Published: October 3, 2020 doi: 10.3791/61682
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemistry, University College London (UCL), 2Institute for Materials Discovery, University College London (UCL)

Summary

Ein Host-Gast-Komplex aus Cucurbit[7]uril und Harnsäure wurde in einer wässrigen Lösung gebildet, bevor eine kleine Menge in die Au NP-Lösung für die quantitative oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS) mit einem modularen Spektrometer gegeben wurde.

Abstract

Diese Arbeit beschreibt eine schnelle und hochempfindliche Methode zum quantitativen Nachweis eines wichtigen Biomarkers, Harnsäure (UA), mittels oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie (SERS) mit einer niedrigen Nachweisgrenze von ~0,2 μM für mehrere charakteristische Peaks im Fingerabdruckbereich unter Verwendung eines modularen Spektrometers. Dieses Biosensorschema wird durch die Wirt-Gast-Komplexierung zwischen einem Makrozyklus, Kürbis[7]uril (CB7) und UA und der anschließenden Bildung präziser plasmonischer Nanoverbindungen innerhalb der selbstorganisierten Au NP: CB7-Nanoaggregate vermittelt. Eine einfache Au NP-Synthese der gewünschten Größen für SERS-Substrate wurde ebenfalls auf der Grundlage des klassischen Citratreduktionsansatzes mit der Option durchgeführt, mit einem im Labor gebauten automatisierten Synthesizer erleichtert zu werden. Dieses Protokoll kann leicht auf den Multiplex-Nachweis von Biomarkern in Körperflüssigkeiten für klinische Anwendungen erweitert werden.

Introduction

Harnsäure, das Endprodukt des Stoffwechsels von Purinnukleotiden, ist ein wichtiger Biomarker in Blutserum und Urin für die Diagnose von Krankheiten wie Gicht, Präeklampsie, Nierenerkrankungen, Bluthochdruck, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes 1,2,3,4,5. Zu den aktuellen Methoden für den Harnsäurenachweis gehören kolorimetrische enzymatische Assays, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Kapillarelektrophorese, die zeitaufwendig und teuer sindund eine ausgeklügelte Probenvorbereitung erfordern 6,7,8,9.

Die oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie ist eine vielversprechende Technik für die routinemäßige Point-of-Care-Diagnose, da sie die selektive Detektion von Biomolekülen über ihre Vibrationsfingerabdrücke ermöglicht und zahlreiche Vorteile wie hohe Empfindlichkeit, schnelle Reaktion, Benutzerfreundlichkeit und keine oder nur minimale Probenvorbereitung bietet. SERS-Substrate auf Basis von Edelmetall-Nanopartikeln (z.B. Au NPs) können die Raman-Signale der Analytmoleküle durch starke elektromagnetische Verstärkung durch Oberflächenplasmonenresonanz 11 um 4 bis10 Größenordnungen10 verstärken. Au NPs mit maßgeschneiderten Größen können im Gegensatz zur zeitaufwändigen Herstellung komplexer Metall-Nanokomposite12 leicht synthetisiert werden und werden daher aufgrund ihrer überlegenen Eigenschaften13,14,15,16 häufig in biomedizinischen Anwendungen eingesetzt. Die Anlagerung makrozyklischer Moleküle, Kürbis[n]urile (CB n, wobei n = 5-8, 10), an die Oberfläche von Au-NPs kann die SERS-Signale der Analytmoleküle weiter verstärken, da die hochsymmetrischen und starren CB-Moleküle den genauen Abstand zwischen den Au-NPs kontrollieren und die Analytmoleküle im Zentrum oder in unmittelbarer Nähe zu den plasmonischen Hotspots durch Bildung von Wirt-Gast-Komplexen lokalisieren können (Abbildung 1)17, 18,19,20. Frühere Beispiele für SERS-Studien mit Au NP: CBn Nanoaggregate umfassen Nitrosprengstoffe, polyzyklische Aromaten, Diaminostilbene, Neurotransmitter und Kreatinin 21,22,23,24,25, wobei die SERS-Messungen entweder in einer Küvette oder durch Laden eines kleinen Tröpfchens auf einen maßgefertigten Probenhalter durchgeführt werden. Dieses Nachweisschema ist besonders nützlich, um Biomarker in einer komplexen Matrix mit hoher Reproduzierbarkeit schnell zu quantifizieren.

Hierin wurde eine einfache Methode zur Bildung von Wirt-Gast-Komplexen von CB7 und einem wichtigen Biomarker UA und zur Quantifizierung von UA mit einer Nachweisgrenze von 0,2 μM über CB7-vermittelte Aggregationen von Au-NPs in wässrigen Medien unter Verwendung eines modularen Spektrometers demonstriert, das für diagnostische und klinische Anwendungen vielversprechend ist.

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Protocol

1. Synthese von Au-NPs

  1. Synthese von Au-Samen nach der konventionellen Turkevich-Methode26
    1. Bereiten Sie 10 ml 25 mM HAuCl4-Lösung vor, indem Sie 98,5 mg HAuCl4 auflösen. 3H2O Vorläufer mit 10 ml entionisiertem Wasser in einer Glasdurchstechflasche.
      HINWEIS: Übertragen Sie eine kleine Menge HAuCl 4-Vorläufer in ein Wiegeboot und verwenden Sie einen Kunststoffspatel anstelle eines metallischen Spatels, um die Kristalle auszuwiegen, da der HAuCl4-Vorläufer Metalllaborgeräte korrodiert. Der Wiegeschritt sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, daHAuCl 4 hygroskopisch ist und daher sein Gewicht im Laufe der Zeit erhöht, indem es Wasser aus der Atmosphäre aufnimmt. HAuCl4 ist stark korrosiv und kann schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen. Seien Sie besonders vorsichtig bei der Handhabung.
    2. Bereiten Sie 0,5 ml 500 mM Natriumcitratlösung vor, indem Sie 64,5 mg Natriumcitratpulver mit 0,5 ml entionisiertem Wasser in einer Durchstechflasche aus Glas auflösen.
    3. Verdünnen Sie 1 ml der 25 mM HAuCl4-Lösung mit 99 mL Wasser in einer 250 mL Flasche mit blauem Deckel, um 100 ml 0,25 mMHAuCl 4-Lösung zu erhalten.
    4. 99,5 ml der 0,25 mM HAuCl4-Lösung in einen 250 ml Dreihalskolben mit rundem Boden geben, der mit einem Kondensator ausgestattet ist. Die Lösung unter starkem Rühren auf 90 °C erhitzen und die Temperatur 15 min halten.
    5. Injizieren Sie 0,5 ml der 500 mM Natriumcitratlösung in das Reaktionsgemisch und halten Sie die Temperatur und das Rühren aufrecht, bis die Farbe der Lösung rubinrot wird.
      HINWEIS: Die Reaktion dauert ca. 30 min.
  2. Seeded Growth von Au NPs über die kinetisch kontrollierte Methode13
    1. Die as-synthetisierte Au-Samenlösung wird auf 70 °C abgekühlt.
    2. Bereiten Sie 10 ml 60 mM Natriumcitratlösung vor, indem Sie 154,8 mg Natriumcitratpulver mit 10 ml entionisiertem Wasser in einer Durchstechflasche aus Glas auflösen.
    3. Es werden 0,67 ml der 25 mM HAuCl4-Lösung und 0,67 ml der 60 mM Natriumcitratlösung mit einem Zeitintervall von 2 min in die Au-Samen injiziert.
    4. Wiederholen Sie Schritt 1.2.3, um die Größe von Au NPs schrittweise auf 40 nm zu erhöhen.
      HINWEIS: Es dauert etwa 10 Wachstumsschritte, um 40 nm zu erreichen. Die tatsächliche Anzahl der erforderlichen Schritte kann von der genauen Einrichtung abhängen.
  3. Seeded Growth von Au NPs mit automatisiertem Synthesizer (Abbildung 2)
    1. 25 ml der in Abschnitt 1 hergestellten Au-Saatgutlösung in ein konisches 50 mL Zentrifugenröhrchen geben und in einem Thermomischer auf 70 °C abkühlen.
      HINWEIS: Überwachen Sie die Temperatur im Thermomischer mit einem Thermoelement-Thermometer, das in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 25 ml Wasser platziert ist.
    2. Füllen Sie eine 3 mL Luer-Lock-Einwegspritze mit 2,5 ml 25 mM HAuCl4-Lösung . Füllen Sie eine weitere 3 mL Luer-Lock-Einwegspritze mit 2,5 ml 60 mM Natriumcitratlösung.
    3. Legen Sie die Spritzen in die Spritzenpumpen und verwenden Sie Luer-to-MicroTight-Adapter, um den PEEK-Schlauch (150 μm Innendurchmesser) mit den Spritzen zu verbinden. Führen Sie den Schlauch in das Zentrifugenröhrchen mit der Au-Saatgutlösung im Thermomischer ein.
    4. Stellen Sie beide Spritzenpumpen so ein, dass sie 0,1675 ml Lösung über 20 min (8,357 μL pro min) dosieren.
    5. Stellen Sie die Drehzahl des Thermomixers auf 700 U/min ein und drücken Sie Start an der Spritzenpumpe, die die 25 mM HAuCl4-Lösung enthält.
    6. Drücken Sie nach 2 Minuten auf Start an der Spritzenpumpe, die die 60 mM Natriumcitratlösung enthält.
    7. Entfernen Sie 30 Minuten nach Beginn der Injektion der HAuCl 4-Lösung ein Aliquot der AuNP-Lösung zur Analyse.
    8. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.5 – 1.3.7, um den Durchmesser der Au NPs schrittweise auf bis zu 40 nm zu erhöhen.
      HINWEIS: Dieses Setup kann verwendet werden, um Au-NPs in einem Schritt auf bis zu 40 nm zu erhöhen, indem das Volumen der in Schritt 1.3.4 hinzugefügten Reaktanten erhöht wird. Dies wird erreicht, indem die Dosierzeit bei gleichbleibender Injektionsrate erhöht wird.

2. Charakterisierung von Au-NPs

  1. UV-Vis-Spektroskopie
    1. Fügen Sie 1 ml der Au NP-Lösung zu einer Semi-Mikro-Quarzküvette hinzu.
    2. Schalten Sie das Spektrometer ein.
    3. Stellen Sie den Wellenlängenbereich auf 400 - 800 nm ein.
    4. Erfassen Sie das UV-Vis-Spektrum für jede Probe.
  2. Dynamische Lichtstreuung (DLS)
    1. Filtern Sie die Probenlösung in eine Kunststoff-Semi-Mikro-Küvette mit einem 0,22-μm-Filter.
    2. Schalten Sie das DLS-Instrument ein.
    3. Stellen Sie die Temperatur auf 25 °C ein und gleichen Sie sie für 60 s.
    4. Messen Sie die hydrodynamische Größe jeder Probe.
  3. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
    1. Ein 5-μL-Tropfen der Probenlösung wird auf ein C-beschichtetes 300-Mesh-Cu-Gitter getropft und an der Luft getrocknet.
      HINWEIS: Für konzentriertere Au NP-Lösungsproben ist eine Verdünnung erforderlich, um gut dispergierte Au-NPs auf einem TEM-Gitter zu erhalten.
    2. Erfassen Sie mehrere TEM-Bilder für jede Probe mit einem TEM bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV.
    3. Messen Sie den Durchmesser von 200 Au-NPs für jede Stichprobe mit ImageJ, um die durchschnittliche Größe und die Standardabweichung zu berechnen.

3. Bildung von CB7-UA-Komplexen

  1. Herstellung einer 0,4 mM CB7-Lösung
    1. 4,65 mg CB7 in eine 15 ml Durchstechflasche aus Glas geben.
      HINWEIS: Die Menge an CB7 wird basierend auf dem Formelgewicht von CB7 (= 1163 Da) berechnet, das von den meisten Berichten in der Literatur verwendet wurde. Dennoch enthalten CB7-Feststoffproben typischerweise Wasser, HCl, Methanol und andere Salze, die von den Synthese- und Reinigungsschritten übrig geblieben sind, was zu ~ 10 - 20% Eigengewicht in der Probe beiträgt. Die eingeschlossenen Lösungsmittel und Salze konnten nicht durch Erhitzen in einem Vakuumofen oder auf andere Weise entfernt werden. Ihre Mengen variieren zwischen verschiedenen Probenchargen, können aber mit Hilfe der Elementaranalyse quantifiziert werden. Das vorgelegte Protokoll reagiert jedoch nicht empfindlich auf das Vorhandensein einer nicht quantifizierten Menge an Lösungsmitteln und Salzen in den CB7-Proben.
    2. Geben Sie 10 ml Wasser in die Durchstechflasche und ziehen Sie die Kappe fest.
    3. Beschallen Sie die Probe bei Raumtemperatur, bis der CB7-Feststoff vollständig gelöst ist.
      HINWEIS: CB7 wurde gemäß Literatur27 synthetisiert, ist aber auch im Handel erhältlich.
  2. Vorbereitung einer 0,4 mM UA-Lösung
    1. 2,69 mg UA in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen geben.
    2. Geben Sie 40 ml Wasser in den Schlauch und ziehen Sie die Kappe fest.
    3. Verwenden Sie einen Thermomixer, um die Probenlösung zu schwenken, indem Sie die Temperatur auf 70 °C, die Drehzahl auf 800 U/min und die Zeit auf 2 h einstellen. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen.
      HINWEIS: UA hat eine geringe Löslichkeit in Wasser (0,40 mM)5. Länger schwenken, wenn das UA-Pulver nicht vollständig gelöst wurde. Alternativ kann Ultraschall verwendet werden, um die Auflösung zu erleichtern.
  3. Sequentielle Verdünnungen der 0,4 mM UA-Lösung
    1. Verdünnen Sie 5 ml der 0,4 mM UA-Lösung mit 5 mL Wasser in einer 15 mL Glasdurchstechflasche, um 10 mL 0,2 mM UA-Lösung zu erhalten. Ziehen Sie die Kappe fest und beschallen Sie für 30 s.
    2. Wiederholen Sie Schritt 3.3.1 mit einer angemessenen Menge UA und Wasser, wie in Tabelle 1 beschrieben.
  4. Vorbereitung der CB7-UA-Komplexe
    1. 0,75 ml der 0,4 mM CB7-Lösung und 0,75 ml 0,4 mM UA-Lösung in ein 1,5-ml-Rohr geben. Befestigen Sie Deckel und Beschallung für 30 s.
    2. Warten Sie 30 Minuten, um die Bildung von Gastgeber-Gäste-Komplexen sicherzustellen.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.1 – 3.4.2 mit UA-Lösung in verschiedenen Konzentrationen.

4. SERS-Erfassung von UA

  1. Versuchsaufbau des Raman-Systems (Abbildung 3)
    1. Schalten Sie den 633 nm He-Ne Laser (22,5 mW) ein.
    2. Schalten Sie das modulare Raman-Spektrometer ein.
    3. Schalten Sie den Computer ein und starten Sie die Software.
    4. Klicken Sie auf das Symbol Spektroskopie-Anwendungsassistenten , und wählen Sie dann Raman aus.
    5. Starten Sie eine neue Akquisition. Stellen Sie die Integrationszeit auf 30 s, scannt auf durchschnittlich 5 und boxcar auf 0.
    6. Speichern Sie das Hintergrundspektrum und geben Sie die Laserwellenlänge (d. h. 633 nm) ein.
      HINWEIS: Die Integrationszeit ist die Zeit für jeden Scan, die durchschnittlichen Scans sind die Anzahl der Scans, die gemittelt werden, um jedes Spektrum zu erstellen, und Boxcar ist die Anzahl der benachbarten Pixel, diedurchschnittlich 28 beträgt.
  2. Bildung der SERS-Substrate
    1. 0,9 ml der 40 nm Au NP-Lösung und 0,1 ml der vorgeformten CB7-UA-Komplexlösung in ein 1,5-ml-Rohr geben. Befestigen Sie den Deckel und beschallen Sie, bis die Lösung von rubinrot zu lila wechselt.
      HINWEIS: Kommerzielle Citrat-stabilisierte 40 nm Au NP-Lösungsproben können ebenfalls verwendet werden. Typischerweise wird die optische Dichte des LSPR-Peaks (Localized Surface Plasmon Resonance) durch Verdünnung aus konzentrierten Stammlösungsproben auf 1 eingestellt. Die Citratkonzentration in der Probe wird typischerweise als 2 mM gehalten.
    2. Übertragen Sie die Probenlösung auf eine Semi-Mikroküvette. Legen Sie die Küvette in den Raman-Probenhalter und schließen Sie die Abdeckung.
    3. Starten Sie die Messung.
    4. Richten Sie die automatische Speicherung ein, um fünf aufeinanderfolgende SERS-Spektren aufzuzeichnen.
    5. Stoppen Sie die Messung und ändern Sie die Probe.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1 – 4.2.5 mit CB7-UA-Lösung in verschiedenen Konzentrationen.
      HINWEIS: Die Aggregationszeit hängt von der Konzentration von UA in den Nanoaggregaten ab, die von 30 s für 0,1 μM UA bis 30 min für 20 μM UA reicht, da die Konzentration von leerem CB7 einen großen Beitrag zur Vermittlung der Aggregation von Au-NPs leistet. Für den CB7-UA-Komplex ist ein Portal durch das sperrige UA-Molekül blockiert, wodurch es für die Bindung an die Au-NP-Oberfläche nicht verfügbar ist und daher nicht in der Lage ist, die NP-Aggregation21 zu vermitteln. Die Probe ist bereit für die Messung, wenn sich die Farbe der Lösung von rubinrot zu violett ändert.

5. Datenanalyse

  1. Datenverarbeitung
    1. Lade die Baseline mit dem ALS-Plugin (Asymmetric Least Squares) herunter und installiere es in Origin.
      HINWEIS: Das ALS-Plugin erfordert OriginPro.
    2. Fügen Sie die Rohdaten in Origin ein.
    3. Berechnen Sie einen Durchschnittswert aus den fünf SERS-Spektren jeder Probe. Teilen Sie den Wert durch die Leistung des Lasers (d. h. 22,5 mW) und durch die Integrationszeit (d. h. 30 s).
    4. Klicken Sie auf das ALS-Symbol , um das Dialogfeld zu öffnen. Legen Sie den asymmetrischen Faktor auf 0,001, den Schwellenwert auf 0,03 %, den Glättungsfaktor auf 2 und die Anzahl der Iterationen auf 20 fest, um die Basislinie jedes gemittelten Spektrums zu korrigieren.
    5. Zeichnen Sie die SERS-Spektren verschiedener UA-Konzentrationen mit gestapelten Linien durch y-Offsets auf. Die Ausgabe sollte Intensität (zählt s-1 mW-1) gegen Raman-Verschiebung (cm-1) sein.

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Representative Results

In der vorgestellten Au-NP-Synthese zeigen die UV-Vis-Spektren eine Verschiebung der LSPR-Peaks von 521 nm auf 529 nm nach 10 Wachstumsschritten (Abbildung 4 A,B), während die DLS-Daten eine enge Größenverteilung zeigen, da die Größe der Au NPs von 25,9 nm auf 42,8 nm zunimmt (Abbildung 4C,D). Die durchschnittlichen Größen von G0, G5 und G10, die anhand von TEM-Bildern gemessen werden (Abbildung 4E), betragen 20,1 ± 2,1 nm, 32,5 ± 2,3 nm bzw. 40,0 ± 2,2 nm, wobei jeweils 200 Partikel gezählt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Protokoll bei der Synthese einheitlicher und eng verteilter Au-NPs wirksam ist.

In den vorgestellten SERS-Studien wurden Host-Gast-Komplexe von CB7 und UA mit leerem CB7 gebildet, wodurch die Bildung präziser plasmonischer Nanoübergänge innerhalb der Au NP: CB7-Nanoaggregate vermittelt wurde, wie sie durch die charakteristischen UA-Signale im SERS-Spektrum unterstützt werden (Abbildung 5A).

Die Zuordnungen für die Raman-Gipfel von CB (markiert durch +) und UA (markiert durch *) sind in Tabelle 2 dargestellt. Umgekehrt können in Abwesenheit von CB7 keine SERS-Signale von UA beobachtet werden, was die Schlüsselrolle von CB7 bei der Auslösung der Aggregation von Au-NPs veranschaulicht.

Bei der SERS-Titration von UA wurde durchgehend eine konstante CB7-Konzentration von 20 μM verwendet, um die In-situ-Bildung reproduzierbarer plasmonischer Nanostrukturen (d.h. SERS-Substrate) sicherzustellen. Die hohe Empfindlichkeit des in diesem Protokoll dargestellten Detektionsschemas wurde durch die Beobachtung klarer SERS-Signale von den UA-Spitzen bei 640 cm-1 und 1130 cm-1 (zugeschrieben auf Skelettringverformung bzw. C-N-Schwingung) bis hinunter zu ~0,2 μM (Abbildung 5B−D), die als Nachweisgrenze bekannt ist, demonstriert. Darüber hinaus wurden sehr starke Korrelationen (R2 > 0,98) zwischen der SERS-Intensität und der logarithmischen Konzentration von UA durch Potenzgesetz für beide Peaks erhalten, wobei lineare Bereiche im Bereich von 0,2 bis 2 μM gefunden wurden (Abbildung 5E,F). Es sollte beachtet werden, dass lineare Korrelationen zwischen der SERS-Intensität und der logarithmischen Konzentration für einen engen Bereich von Analytkonzentrationen angenähert werden können, während sich das SERS-Signal 0 nähert, wenn sich die logarithmische Konzentration der negativen Unendlichkeit nähert (d. h. die Analytkonzentration nähert sich 0), wie in unseren Daten beobachtet. Die SERS-Signale sind auch in hohem Maße reproduzierbar, wie die kleinen Fehlerbalken in Abbildung 5E,F zeigen.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der präzisen plasmonischen Nanoübergänge innerhalb selbstassemblierter Au NP: CB7-Nanoaggregate. Inset zeigt ein Zoom-in der plasmonischen Nanoübergänge, bei denen die Aggregation durch leeres CB7 vermittelt wird, während UA auf der Oberfläche von Au-NPs über Host-Gast-Komplexierung angereichert wird. Es wird darauf hingewiesen, dass das Schema nicht maßstabsgetreu gezeichnet ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: (a) Schematische Darstellung und (b) Foto des automatisierten Au NP-Synthesizers. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische Darstellung des Raman-Systems. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Charakterisierung von Au-NPs. (A) UV-Vis-Spektren von Au-NPs und (B) Zoom-in-Spektren, die die Verschiebung der LSPR-Spitzen zeigen, wenn die Anzahl der Wachstumsschritte auf 10 ansteigt. (C) Hydrodynamische Größe von Au NPs und (D) entsprechendes Diagramm der Partikelgröße als Funktion der Anzahl der Wachstumsschritte. (E) TEM-Bilder von Au-NPs, die Größen von Au-Samen und Au-NPs nach 5 und 10 Wachstumsschritten zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative SERS-Ergebnisse des UA-Detektions innerhalb von Au NP: CB7-Nanoaggregate. (A) SERS-Spektren von UA bei Vorhandensein oder Fehlen von CB7. Raman-Gipfel von CB7 und UA sind durch + bzw. * gekennzeichnet. (B) Vollbereich, (C) 600 - 700 cm-1 Zoom-in und (D) 1100 - 1180 cm-1 Zoom-in SERS-Spektren von UA mit Konzentrationen von 0 bis 20 μM. Die wichtigsten Raman-Gipfel der UA sind mit * gekennzeichnet. Die Spektren wurden zur Verdeutlichung korrigiert und versetzt. (E,F) Entsprechende Diagramme der SERS-Spitzenintensität gegen die Konzentration von UA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Konz. der UA-Stammlösung (μM) Vol. UA-Stammlösung hinzugefügt (mL) Vol. des zugesetzten Wassers (mL) Konz. der neuen UA-Stammlösung (μM)
400 5 5 200
200 5 5 100
100 4 6 40
40 5 5 20
20 5 5 10
10 4 6 4
4 5 5 2

Tabelle 1: Sequentielle Verdünnungen von UA-Lösung.

CB7 UA
SERS-Spitze (cm-1) Spitzenzuweisung SERS-Spitze (cm-1) Spitzenzuweisung
446 Ringscherenmodus 491 C-N-C Ringvibration
831 Ringverformung 640 Verformung des Skelettrings
1375 Symmetrische C-N-Dehnung 896 N-H Biegung
1420 Asymmetrische C-N-Dehnung 1020 Ring-Vibration
- - 1130 C-N-Vibration
- - 1202 N-C-C Dehnen und Biegen

Tabelle 2: Zuordnungen für die Raman-Gipfel von CB7 und UA 2,4,29.

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Discussion

Das im Protokoll beschriebene automatisierte Syntheseverfahren ermöglicht es, Au NPs zunehmender Größe reproduzierbar zu synthetisieren. Obwohl es einige Elemente gibt, die noch manuell durchgeführt werden müssen, wie die schnelle Zugabe von Natriumcitrat während der Saatgutsynthese und die regelmäßige Überprüfung, um sicherzustellen, dass der PEEK-Schlauch sicher ist, ermöglicht diese Methode Au NPs großer Größe (bis zu 40 nm), die normalerweise mehrere manuelle Injektionen von HAuCl4 und Natriumcitrat erfordern würden. durch kontinuierliche Addition über einen langen Zeitraum synthetisiert werden.

Eine weitere Charakterisierung kann durchgeführt werden, um die grundlegende Eigenschaft der CB-Komplexe aufzuklären. Zum Beispiel kann die Bildung von Wirt-Gast-Komplexen typischerweise mit 1H-Kernspinresonanz (NMR) bestätigt werden, die im Falle einer Komplexierung21,22,25 eine Aufwärtsverschiebung und Verbreiterung der Signale zeigen sollte. 1H NMR ist jedoch aufgrund des Fehlens nicht austauschbarer Protonen nicht auf UA anwendbar. Alternative Techniken wie 13C NMR und Massenspektrometrie könnten ebenfalls eingesetzt werden, um die Teinteilung zu charakterisieren. Bindungskonstanten zwischen CB7 und UA können mit Titrationstechniken wie UV-Vis-Spektroskopie-Titration und isothermer Titrationkalorimetrie (ITC)21,22,25 gemessen werden. Inzwischen können molekulare Modellierungen auf der Grundlage von Kraftfeld- und Dichtefunktionaltheoriemodellen (DFT) berechnet werden, um theoretische Einblicke in die Bindungsgeometrie der Wirt-Gast-Komplexe21,22,25,29 zu erhalten. Darüber hinaus können IR- und Raman-Spektren durch Frequenzberechnungen21,25,29 berechnet werden.

SERS ist eine hochempfindliche und selektive Analysetechnik, die die Identifizierung von Spurenanalyten über ihre molekülspezifischen Schwingungsfingerabdrücke ermöglicht. SERS gewinnt an Interesse in verschiedenen wissenschaftlichen Disziplinen, insbesondere in biomedizinischen Studien, aufgrund seiner stark verbesserten Signale, seiner viel kürzeren Aufnahmezeit und seiner hohen Toleranz gegenüber flüssigem Wasser (geeignet für die Erfassung in Bioflüssigkeiten) 30,31,32,33,34,35. Im Gegensatz zu früheren Berichten über die UA-Erfassung 1,2,3,4,36,37 definiert die starre Struktur von CB7 einen präzisen Abstand von 0,9 nm zwischen Au-NPs über Carbonyl-Portalbindung, während die oberflächengebundene CB7 UA-Moleküle in ihrem Hohlraum einfangen kann (Abbildung 1 ), was zu starken und lokalisierten plasmonischen Hotspots und damit zu den hochempfindlichen (bis zu ~0,2 μM) und reproduzierbaren (innerhalb von 2% Fehler) SERS-Signalen von UA mit sehr starken Korrelationen (R2 > 0,98) zwischen der SERS-Intensität und der Log-Konzentration führt (Abbildung 5).

In einem Versuch, die Konzentration von CB7 zu optimieren, stellen wir fest, dass 20 μM CB7 verwendet wurden, um die Bildung von reproduzierbaren SERS-Substraten sicherzustellen. Insbesondere ist die absolute Konzentration des verwendeten CB7 vom Gesamtsystem abhängig (d. h. Au-NPs, Analyten und Hintergrundmoleküle, falls vorhanden)18,22. Eine höhere Konzentration von CB7 sollte verwendet werden, wenn die Aggregation von Au-NPs zu langsam ist. Umgekehrt sollte eine niedrigere Konzentration von CB7 verwendet werden, wenn die Probenlösung schnell ausfällt und zu kürzeren Messfenstern führt. Es wird erwartet, dass die Aggregation von Au-NPs, die durch CB7 in unserem experimentellen Setting vermittelt werden, der diffusionsbegrenzten kolloidalen Aggregation (DLCA) -Kinetik19 folgt, in der offene und längliche kettenartige Strukturen zunächst schnell gebildet wurden, bevor sie sich als quasi-fraktales Netzwerk zusammenfügten. DLCA-Kinetik tritt typischerweise bei einem hohen CB: Au-NP-Verhältnis (nach Zahl) auf, das in unserem Fall gleich 106: 1 ist. Es sollte beachtet werden, dass Harnsäure in Körperflüssigkeiten (z. B. Blutserum, Urin) in einer höheren Konzentration vorhanden ist. Zum Beispiel beträgt die normale Konzentration von Harnsäure 3,5 – 7,0 mg/dl im Blutserum38 bzw. 16 – 100 mg/dl im Urin2 (Konzentration über oder unter der Normalkonzentration wird als Hyperurikämie und Hypourikämie bezeichnet)39. Daher wird in diesem hochempfindlichen Schema, bei dem ein hoher Verdünnungsfaktor verwendet wird, um die Konzentration der Probe auf einen geeigneten Bereich zu senken, nur eine sehr geringe Menge an Probe für den Nachweis von Biomarkern benötigt. Dies ist besonders wichtig für die Point-of-Care-Überwachung von todkranken Patienten, deren Urinausscheidung sehr gering ist. Hochverdünnte Proben führen zu größeren Probenvolumina und reduzieren somit Fehler bei der Quantifizierung von Biomarkern aufgrund von Wasserverdunstung und Probenverlust durch Flüssigkeitstransfer, während sie gleichzeitig andere Vorteile bieten, einschließlich der Minimierung der Matrixeffekte25. Aufgrund der selektiven Natur dieser Sondierungsmethode ist sie auf Analytmoleküle beschränkt, die mit CB Wirt-Gast-Komplexe bilden können. Es sollte beachtet werden, dass es möglich ist, Interferenzen von anderen Molekülen zu beobachten, da CB an verschiedene Gastmoleküle binden kann. Dennoch können Probenreinigungen wie Gelelektrophorese und HPLC vor der SERS-Messung durchgeführt werden.

Das in diesem Protokoll demonstrierte Nachweisschema hat das Potenzial für den multiplexten Nachweis von Biomarkern in einer komplexen Matrix für klinische Anwendungen, wenn es mit fortschrittlichen Datenanalysetechniken gekoppelt ist.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

TCL ist dankbar für die Unterstützung durch den Royal Society Research Grant 2016 R1 (RG150551) und den UCL BEAMS Future Leader Award, der durch den Institutional Sponsorship Award des EPSRC (EP/P511262/1) finanziert wird. WIKC, TCL und IPP danken der Studentenschaft, die durch das A*STAR-UCL Research Attachment Programme durch das EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1) finanziert wird. GD und TJ danken dem EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1) für das Sponsoring ihres Stipendiums. TJ und TCL würdigen Camtech Innovations für ihren Beitrag zum Studium von TJ. Alle Autorinnen und Autoren danken dem UCL Open Access Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40 nm gold nanoparticles NanoComposix AUCN40-100M NanoXact, 0.05 mg/ mL, bare (citrate)
Centrifuge tube Corning Falcon 14-432-22 50 mL volume
Cucurbit[7]uril Lab-made see ref. 19
Gold(III) chloride trihydrate Sigma aldrich 520918 ≥99.9% trace metals basis
Luer lock disposable syringe Cole-Parmer WZ-07945-15 3 mL volume
Luer-to-MicroTight adapter LuerTight P-662 360 μm outer diameter Tubing to Luer Syringe
PEEK tubing IDEX 1572 360 μm outer diameter, 150 μm inner diameter
PEEK tubing cutter IDEX WZ-02013-30 Capillary Polymer Chromatography Tubing Cutter For 360 µm to 1/32" OD tubing
Raman spectrometer Ocean Optics QE pro
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma aldrich S4641 ACS reagent, ≥99.0%
Sonicator
Standard Probe Digi-Sense WZ-08516-55 Type-K
Syringe pump Aladdin ALADDIN2-220 2 syringes, maximum syringe volume 60 mL
Thermocouple thermometer Digi-Sense WZ-20250-91 Single-Input Thermocouple Thermometer with NIST-Traceable Calibration
ThermoMixer Eppendorf 5382000031 With an Eppendorf SmartBlock for 50 mL tubes
Uric acid Sigma aldrich U2625 ≥99%, crystalline

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References

  1. Villa, J. E. L., Poppi, R. J. A portable SERS method for the determination of uric acid using a paper-based substrate and multivariate curve resolution. Analyst. 141 (6), 1966-1972 (2016).
  2. Westley, C., et al. Absolute Quantification of Uric Acid in Human Urine Using Surface Enhanced Raman Scattering with the Standard Addition Method. Analytical Chemistry. 89 (4), 2472-2477 (2017).
  3. Zhao, L., Blackburn, J., Brosseau, C. L. Quantitative Detection of Uric Acid by Electrochemical-Surface Enhanced Raman Spectroscopy Using a Multilayered Au/Ag Substrate. Analytical Chemistry. 87 (1), 441-447 (2015).
  4. Goodall, B. L., Robinson, A. M., Brosseau, C. L. Electrochemical-surface enhanced Raman spectroscopy (E-SERS) of uric acid: a potential rapid diagnostic method for early preeclampsia detection. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (5), 1382-1388 (2013).
  5. Lytvyn, Y., Perkins, B. A., Cherney, D. Z. I. Uric Acid as a Biomarker and a Therapeutic Target in Diabetes. Canadian Journal of Diabetes. 39 (3), 239-246 (2015).
  6. Ali, S. M. U., Ibupoto, Z. H., Kashif, M., Hashim, U., Willander, M. A Potentiometric Indirect Uric Acid Sensor Based on ZnO Nanoflakes and Immobilized Uricase. Sensors. 12 (3), 2787-2797 (2012).
  7. Yu, J., Wang, S., Ge, L., Ge, S. A novel chemiluminescence paper microfluidic biosensor based on enzymatic reaction for uric acid determination. Biosensors and Bioelectronics. 26 (7), 3284-3289 (2011).
  8. Yang, Y. D. Simultaneous determination of creatine, uric acid, creatinine and hippuric acid in urine by high performance liquid chromatography. Biomedical Chromatography. 12 (2), 47-49 (1999).
  9. Zhao, S., Wang, J., Ye, F., Liu, Y. M. Determination of uric acid in human urine and serum by capillary electrophoresis with chemiluminescence detection. Analytical Biochemistry. 378 (2), 127-131 (2008).
  10. Fang, Y., Seong, N. H., Dlott, D. D. Measurement of the Distribution of Site Enhancements in Surface-Enhanced Raman Scattering. Science. 321 (5887), 388-392 (2008).
  11. Jeong, H. H., et al. Dispersion and shape engineered plasmonic nanosensors. Nature Communications. 7, 11331 (2016).
  12. Alula, M. T., et al. Preparation of silver nanoparticles coated ZnO/Fe3O4 composites using chemical reduction method for sensitive detection of uric acid via surface-enhanced Raman spectroscopy. Analytica Chimica Acta. 1073, 62-71 (2019).
  13. Bastús, N. G., Comenge, J., Puntes, V. Kinetically Controlled Seeded Growth Synthesis of Citrate-Stabilized Gold Nanoparticles of up to 200 nm: Size Focusing versus Ostwald Ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
  14. Jeong, H. H., et al. Selectable Nanopattern Arrays for Nanolithographic Imprint and Etch-Mask Applications. Advanced Science. 2 (7), 1500016 (2016).
  15. Loh, X. J., Lee, T. C., Dou, Q., Deen, G. R. Utilising inorganic nanocarriers for gene delivery. Biomaterials Science. 4 (1), 70-86 (2016).
  16. Celiz, A. D., Lee, T. C., Scherman, O. A. Polymer-Mediated Dispersion of Gold Nanoparticles: Using Supramolecular Moieties on the Periphery. Advanced Materials. 21 (38), 3937-3940 (2009).
  17. Lee, T. C., Scherman, O. A. Formation of Dynamic Aggregates in Water by Cucurbit[5]uril Capped with Gold Nanoparticles. ChemComm. 46 (14), 2438-2440 (2010).
  18. Lee, T. C., Scherman, O. A. A Facile Synthesis of Dynamic Supramolecular Aggregates of Cucurbit[n]uril (n = 5-8) Capped with Gold Nanoparticles in Aqueous Media. Chemistry-A European Journal. 18 (6), 1628-1633 (2012).
  19. Taylor, R. W., et al. Precise Subnanometer Plasmonic Junctions for SERS within Gold Nano- particle Assemblies Using Cucurbit[n]uril "Glue". ACS Nano. 5 (5), 3878-3887 (2011).
  20. Peveler, W. J., et al. Cucurbituril-mediated quantum dot aggregates formed by aqueous self-assembly for sensing applications. ChemComm. 55 (38), 5495-5498 (2019).
  21. Chio, W. I. K., et al. Selective Detection of Nitroexplosives Using Molecular Recognition within Self-Assembled Plasmonic Nanojunctions. The Journal of Physical Chemistry C. 123 (25), 15769-15776 (2019).
  22. Kasera, S., Biedermann, F., Baumberg, J. J., Scherman, O. A., Mahajan, S. Quantitative SERS Using the Sequestration of Small Molecules Inside Precise Plasmonic Nanoconstructs. Nano Letters. 12 (11), 5924-5928 (2012).
  23. Taylor, R. W., et al. In Situ SERS Monitoring of Photochemistry within a Nanojunction Reactor. Nano Letters. 13 (12), 5985-5990 (2013).
  24. Kasera, S., Herrmann, L. O., Barrio, J. d, Baumberg, J. J., Scherman, O. A. Quantitative Multiplexing with Nano-Self-Assemblies in SERS. Scientific Reports. 4, 6785 (2014).
  25. Chio, W. I. K., et al. Dual-triggered nanoaggregates of cucurbit[7]uril and gold nanoparticles for multi-spectroscopic quantification of creatinine in urinalysis. Journal of Materials Chemistry C. 8, 7051-7058 (2020).
  26. Turkevich, J., Stevenson, P. C., Hillier, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discussions of the Faraday Society. 11, 55-75 (1951).
  27. Lagona, J., Mukhopadhyay, P., Chakrabarti, S., Issacs, L. The cucurbit[n]uril family. Angewandte Chemie International Edition. 44 (31), 4844-4870 (2005).
  28. OceanView Installation and Operation Manual. , Available from: https://www.oceaninsight.com/globalassets/catalog-blocks-and-images/manuals--instruction-old-logo/software/oceanviewio.pdf (2013).
  29. Mahajan, S., et al. Raman and SERS spectroscopy of cucurbit[n]urils. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10429-10433 (2010).
  30. Langer, J., et al. Present and Future of Surface-Enhanced Raman Scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
  31. Pilot, R., et al. A Review on Surface-Enhanced Raman Scattering. Biosensors. 9 (2), 57 (2019).
  32. Bantz, K. C., et al. Recent progress in SERS biosensing. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (24), 11551-11567 (2011).
  33. Moore, T. J., et al. In Vitro and In Vivo SERS Biosensing for Disease Diagnosis. Biosensors. 8 (2), 46 (2018).
  34. Bonifacio, A., Cervo, S., Sergo, V. Label-free surface-enhanced Raman spectroscopy of biofluids: fundamental aspects and diagnostic applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (27), 8265-8277 (2015).
  35. Jeong, H. H., Choi, E., Ellis, E., Lee, T. C. Recent advances in gold nanoparticles for biomedical applications: from hybrid structures to multi-functionality. Journal of Materials Chemistry B. 7 (22), 3480-3496 (2019).
  36. Premasiri, W. R., Clarke, R. H., Womble, M. E. Urine Analysis by Laser Raman Spectroscopy. Lasers in Surgery and Medicine. 28 (4), 330-334 (2001).
  37. Lu, Y., et al. Superhydrophobic silver film as a SERS substrate for the detection of uric acid and creatinine. Biomedical Optics Express. 9 (10), 4988-4997 (2018).
  38. Feig, D. I., et al. Serum Uric Acid: A Risk Factor and a Target for Treatment. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (4), 69-73 (2006).
  39. Maiuolo, J., Oppedisano, F., Gratteri, S., Muscoli, C., Mollace, V. Regulation of uric acid metabolism and excretion. International Journal of Cardiology. 213, 8-14 (2016).

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Chemie Ausgabe 164 Gold-Nanopartikel automatisierter Synthesizer Cucurbit[n]uril Wirt-Gast-Komplexierung Selbstorganisation oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie Sensor Biomarker Krankheitsdiagnose
Quantitativer SERS-Nachweis von Harnsäure durch Bildung präziser plasmonischer Nanoverbindungen in Aggregaten von Goldnanopartikeln und Cucurbit[<em>n</em>]uril
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Chio, W. I. K., Davison, G., Jones,… More

Chio, W. I. K., Davison, G., Jones, T., Liu, J., Parkin, I. P., Lee, T. C. Quantitative SERS Detection of Uric Acid via Formation of Precise Plasmonic Nanojunctions within Aggregates of Gold Nanoparticles and Cucurbit[n]uril. J. Vis. Exp. (164), e61682, doi:10.3791/61682 (2020).

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