Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Количественное SERS-обнаружение мочевой кислоты путем формирования точных плазмонных нанопереходов в агрегатах наночастиц золота и кукурбита[n]uril

Published: October 3, 2020 doi: 10.3791/61682
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemistry, University College London (UCL), 2Institute for Materials Discovery, University College London (UCL)

Summary

Хост-гостевой комплекс кукурбита[7]урила и мочевой кислоты формировали в водном растворе перед добавлением небольшого количества в раствор Au NP для количественного поверхностно-усиленного рамановского спектроскопии (SERS) с использованием модульного спектрометра.

Abstract

Эта работа описывает быстрый и высокочувствительный метод количественного обнаружения важного биомаркера, мочевой кислоты (UA), с помощью поверхностно-расширенной рамановской спектроскопии (SERS) с низким пределом обнаружения ~ 0,2 мкМ для нескольких характерных пиков в области отпечатков пальцев с использованием модульного спектрометра. Эта схема биозондирования опосредована комплексом хозяин-гость между макроциклом, кукурбитом[7]урилом (CB7) и UA, и последующим формированием точных плазмонных нанопереходов в самосборных наноагрегатах Au NP: CB7. Упрощенный синтез Au NP желаемых размеров для подложек SERS также был выполнен на основе классического подхода к восстановлению цитратов с возможностью облегчения с использованием автоматизированного синтезатора, построенного в лаборатории. Этот протокол может быть легко распространен на мультиплексированное обнаружение биомаркеров в жидкостях организма для клинического применения.

Introduction

Мочевая кислота, являющаяся конечным продуктом метаболизма пуриновых нуклеотидов, является важным биомаркером в сыворотке крови и моче для диагностики таких заболеваний, как подагра, преэклампсия, заболевания почек, гипертония, сердечно-сосудистые заболевания и сахарный диабет 1,2,3,4,5. Современные методы обнаружения мочевой кислоты включают колориметрические ферментативные анализы, высокоэффективную жидкостную хроматографию и капиллярный электрофорез, которые являются трудоемкими, дорогостоящими и требуют сложной пробоподготовки 6,7,8,9.

Поверхностно-расширенная рамановская спектроскопия является перспективным методом для рутинной диагностики в местах оказания медицинской помощи, поскольку она позволяет выборочно обнаруживать биомолекулы с помощью их вибрационных отпечатков пальцев и предлагает многочисленные преимущества, такие как высокая чувствительность, быстрый ответ, простота использования и отсутствие или минимальная подготовка образцов. Подложки SERS на основе наночастиц благородных металлов (например, Au NPs) могут усиливать рамановские сигналы молекул анализируемого вещества на 4-10 порядков10 за счет сильного электромагнитного усиления, вызванного поверхностным плазмонным резонансом11. Au NP индивидуальных размеров могут быть легко синтезированы, в отличие от трудоемкого изготовления сложных металлических нанокомпозитов12, и, таким образом, широко используются в биомедицинских приложениях благодаря их превосходным свойствам 13,14,15,16. Прикрепление макроциклических молекул, cucurbit[n]urils (CBn, где n = 5-8, 10), к поверхности Au NPs может дополнительно усилить сигналы SERS молекул анализируемого вещества, поскольку высокосимметричные и жесткие молекулы CB могут контролировать точное расстояние между Au NPs и локализовать молекулы анализируемого вещества в центре или в непосредственной близости от плазмонных горячих точек путем формирования комплексов хозяин-гость (рисунок 1)17, 18,19,20. Предыдущие примеры исследований SERS с использованием наноагрегатов Au NP: CBn включают нитроэксплозивные вещества, полициклические ароматические вещества, диаминостильбен, нейротрансмиттеры и креатинин 21,22,23,24,25, причем измерения SERS либо выполняются в кювете, либо путем загрузки небольшой капли на изготовленный на заказ держатель образца. Эта схема обнаружения особенно полезна для быстрой количественной оценки биомаркеров в сложной матрице с высокой воспроизводимостью.

В настоящем описано, что с помощью модульного спектрометра, перспективного для диагностического и клинического применения, был продемонстрирован фациальный способ формирования хост-гостевых комплексов CB7 и важного биомаркера UA, а также количественной оценки UA с пределом обнаружения 0,2 мкМ через CB7-опосредованные агрегации Au NPs в водных средах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Синтез Au NPs

  1. Синтез семян Au традиционным методом Туркевича26
    1. Приготовьте 10 мл раствора HAuCl4 25 мМ, растворив 98,5 мг HAuCl4· Предшественник3H2Oс 10 мл деионизированной воды в стеклянном флаконе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перенесите небольшое количество прекурсора HAuCl4 в весовую лодку и используйте пластиковый шпатель вместо металлического шпателя для взвешивания кристаллов, потому что предшественник HAuCl4 будет разъедать металлическую лабораторную посуду. Этап взвешивания должен быть выполнен как можно быстрее, так как HAuCl4 гигроскопичен и поэтому со временем увеличит свой вес за счет поглощения воды из атмосферы. HAuCl4 обладает высокой коррозионной активностью и может вызвать серьезные ожоги кожи и повреждение глаз. Будьте особенно осторожны при обращении с ним.
    2. Готовят 0,5 мл раствора цитрата натрия 500 мМ, растворяя 64,5 мг порошка цитрата натрия с 0,5 мл деионизированной воды во флаконе.
    3. Разбавить 1 мл раствора HAuCl4 25 мМ с водой 99 мл в бутылке с синей крышкой 250 мл, чтобы получить 100 мл 0,25 мМ раствора HAuCl4 .
    4. Добавьте 99,5 мл раствора HAuCl4 емкостью 0,25 мМ в колбу с круглым дном объемом 250 мл, оснащенную конденсатором. Нагрейте раствор до 90 °C при энергичном перемешивании и поддерживайте температуру в течение 15 мин.
    5. Вводят в реакционную смесь 0,5 мл раствора цитрата натрия 500 мМ и поддерживают температуру и перемешивают до тех пор, пока цвет раствора не станет рубиново-красным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция занимает около 30 минут.
  2. Посевной рост Au NPs с помощью кинетически контролируемого метода13
    1. Охладите синтезированный раствор семян Au до 70 °C.
    2. Приготовьте 10 мл раствора цитрата натрия 60 мМ, растворив 154,8 мг порошка цитрата натрия в 10 мл деионизированной воды во флаконе.
    3. Вводят 0,67 мл раствора HAuCl4 25 мМ и 0,67 мл раствора цитрата натрия 60 мМ в семена Au с интервалом времени 2 мин.
    4. Повторите шаг 1.2.3, чтобы постепенно увеличить размер Au NP до 40 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется около 10 шагов роста, чтобы достичь 40 нм. Фактическое количество необходимых шагов может зависеть от точной настройки.
  3. Посевной рост Au NP с помощью автоматизированного синтезатора (рисунок 2)
    1. Переложить 25 мл семенного раствора Au, приготовленного в секции 1, в коническую центрифужную трубку объемом 50 мл и охладить до 70 °C в термомикшере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте температуру внутри термомикшера с помощью термопарного термометра, помещенного в центрифужную трубку объемом 50 мл, содержащую 25 мл воды.
    2. Наполните одноразовый шприц Luer lock 3 мл 2,5 мл раствора HAuCl4 емкостью 25 мМ. Наполните еще 3 мл одноразового шприца Luer lock 2,5 мл раствора цитрата натрия 60 мМ.
    3. Поместите шприцы в шприцевые насосы и используйте адаптеры Luer-to-MicroTight для подключения трубки PEEK (внутренний диаметр 150 мкм) к шприцам. Вставьте трубку в центрифужную трубку, содержащую раствор семян Au в термомиксоре.
    4. Установите оба шприцевых насоса на дозирование 0,1675 мл раствора в течение 20 мин (8,357 мкл в минуту).
    5. Установите скорость вращения термомикшера на 700 об/мин и нажмите start на шприцевом насосе, содержащем раствор HAuCl4 емкостью 25 мМ.
    6. Через 2 мин нажмите Start на шприцевом насосе, содержащем 60 мМ раствора цитрата натрия.
    7. Через 30 мин после начала инъекции раствора HAuCl4 удаляют аликвоту раствора Au NP для анализа.
    8. Повторите шаги 1.3.5 – 1.3.7, чтобы постепенно увеличивать диаметр Au NPs до 40 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта установка может быть использована для выращивания Au NPs до 40 нм за один шаг путем увеличения объема реагентов, добавленных на шаге 1.3.4. Это достигается за счет увеличения времени дозирования при сохранении прежней скорости инъекции.

2. Характеристика Au NPs

  1. УФ-Вис спектроскопия
    1. Добавьте 1 мл раствора Au NP в полумикроварцевую кювету.
    2. Включите спектрометр.
    3. Установите диапазон длин волн на 400 - 800 нм.
    4. Получите спектр UV-Vis для каждого образца.
  2. Динамическое рассеяние света (DLS)
    1. Отфильтруйте образец раствора в пластиковую полумикрокуэту с фильтром 0,22 мкм.
    2. Включите инструмент DLS.
    3. Установите температуру на 25 °C и уравновесьте в течение 60 с.
    4. Измерьте гидродинамический размер каждого образца.
  3. Просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ)
    1. Бросьте капельку 5 мкл раствора образца на сетку Cu с С-покрытием и высушите на воздухе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения хорошо дисперсированных Au NNP в сетке ТЕА необходимо разбавление для более концентрированных образцов раствора Au NP.
    2. Получение нескольких изображений ТЭМ для каждого образца с использованием ТЭМ при напряжении ускорения 200 кВ.
    3. Измерьте диаметр 200 Au NPs для каждого образца с помощью ImageJ для расчета среднего размера и стандартного отклонения.

3. Формирование комплексов CB7-UA

  1. Приготовление 0,4 мМ раствора CB7
    1. Добавьте 4,65 мг CB7 во флакон объемом 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество CB7 рассчитывается на основе формулы веса CB7 (= 1163 Da), которая использовалась в большинстве отчетов в литературе. Тем не менее, твердые образцы CB7 обычно содержат воду, HCl, метанол и другие соли, оставшиеся от стадий синтеза и очистки, что способствует ~ 10-20% мертвого веса в образце. Захваченные растворители и соли не могут быть удалены путем нагревания в вакуумной печи или другими способами. Их количество варьируется между различными партиями образцов, но может быть количественно определено с помощью элементного анализа. Тем не менее, представленный протокол не чувствителен к присутствию неколичественного количества растворителей и солей в образцах CB7.
    2. Добавьте 10 мл воды во флакон и затяните колпачок.
    3. Обрабатывайте образец ультразвуком при комнатной температуре до полного растворения твердого вещества CB7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CB7 был синтезирован в соответствии с литературой27 , но он также коммерчески доступен.
  2. Приготовление раствора 0,4 мМ UA
    1. Добавьте 2,69 мг UA в пробирку центрифуги объемом 50 мл.
    2. Добавьте 40 мл воды в трубку и затяните колпачок.
    3. Используйте термомикшер для закручивания раствора образца, установив температуру до 70 °C, скорость до 800 об/мин и время до 2 ч. Дайте раствору остыть до комнатной температуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: UA имеет низкую растворимость в воде (0,40 мМ)5. Закручивайтесь дольше, если порошок UA не был растворен полностью. Альтернативно, ультразвук может быть использован для облегчения растворения.
  3. Последовательные разведения раствора UA 0,4 мМ
    1. Развести 5 мл раствора UA 0,4 мМ с водой 5 мл в стеклянном флаконе 15 мл, чтобы получить 10 мл раствора 0,2 мМ UA. Затяните колпачок и обработайте ультразвуком в течение 30 с.
    2. Повторите этап 3.3.1, используя соответствующее количество UA и воды, как описано в таблице 1.
  4. Подготовка комплексов CB7-UA
    1. Добавьте 0,75 мл раствора CB7 0,4 мМ и 0,75 мл раствора UA 0,4 мМ в пробирку объемом 1,5 мл. Закрепите крышку и храните ультразвуком в течение 30 с.
    2. Подождите 30 минут, чтобы обеспечить формирование хост-гостевых комплексов.
    3. Повторите этап 3.4.1 – 3.4.2 с использованием раствора UA различных концентраций.

4. Зондирование SERS UA

  1. Экспериментальная установка рамановской системы (рисунок 3)
    1. Включите 633 нм He-Ne лазер (22,5 мВт).
    2. Включите модульный рамановский спектрометр.
    3. Включите компьютер и запустите программное обеспечение.
    4. Щелкните значок Мастера приложений спектроскопии и выберите Раман.
    5. Начните новое приобретение. Установите время интеграции на 30 с, сканирование в среднем на 5 и крытый вагон на 0.
    6. Сохраните фоновый спектр и введите длину волны лазера (т.е. 633 нм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время интеграции - это время для каждого сканирования, сканирование до среднего - это количество сканирований, усредненное для создания каждого спектра, а boxcar - это количество соседних пикселей, усредненное28.
  2. Формирование субстратов SERS
    1. Добавьте 0,9 мл раствора Au NP 40 нм и 0,1 мл предварительно сформированного комплексного раствора CB7-UA в пробирку объемом 1,5 мл. Закрепите крышку и храните ультразвуком, пока раствор не изменится с рубиново-красного на фиолетовый.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также могут быть использованы коммерческие цитрат-стабилизированные образцы раствора Au NP 40 нм. Как правило, оптическая плотность локализованного пика поверхностного плазмонного резонанса (LSPR) корректируется до 1 путем разбавления из концентрированных образцов раствора. Концентрация цитрата в образце обычно сохраняется на уровне 2 мМ.
    2. Переложите образец раствора в полумикрокуэту. Поместите кювету в рамановский держатель для образцов и закройте крышку.
    3. Запустите измерение.
    4. Настройте автоматическое сохранение для записи пяти последовательных спектров SERS.
    5. Остановите измерение и измените образец.
    6. Повторите этап 4.2.1 – 4.2.5 с использованием раствора CB7-UA различных концентраций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установлено, что время агрегации зависит от концентрации UA в наноагрегатах в диапазоне от 30 с для 0,1 мкМ UA до 30 мин для 20 мкМ UA, из-за разницы в концентрации пустого CB7, которая вносит значительный вклад в опосредование агрегации Au NPs. Для комплекса CB7-UA один портал блокируется громоздкой молекулой UA, что делает его недоступным для связывания с поверхностью Au NP и, следовательно, неспособным опосредуть агрегацию NP21. Образец готов к измерению, когда цвет раствора меняется с рубиново-красного на фиолетовый.

5. Анализ данных

  1. Обработка данных
    1. Загрузите и установите базовый файл с асимметричными наименьшими квадратами (ALS) в Origin.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для плагина ALS требуется OriginPro.
    2. Вставьте необработанные данные в Origin.
    3. Рассчитайте среднее значение из пяти спектров SERS каждого образца. Разделите значение на мощность лазера (т.е. 22,5 мВт) и на время интеграции (т.е. 30 с).
    4. Щелкните значок ALS , чтобы открыть диалоговое окно. Установите асимметричный коэффициент равным 0,001, пороговым значением 0,03 %, коэффициентом сглаживания равным 2 и числом итераций равным 20, чтобы скорректировать исходный усредненный усредненный спектр.
    5. Построение спектров SERS различных концентраций UA с использованием сложенных линий на смещения y. Выход должен быть интенсивности (счёт s-1 мВт-1) против рамановского сдвига (см-1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В представленном синтезе Au NP спектры UV-Vis показывают смещение пиков LSPR с 521 нм до 529 нм после 10 шагов роста (рисунок 4A,B), в то время как данные DLS показывают узкое распределение размеров по мере увеличения размера Au NPs с 25,9 нм до 42,8 нм (рисунок 4C,D). Средние размеры G0, G5 и G10, измеренные по изображениям TEM (рисунок 4E), составляют 20,1 ± 2,1 нм, 32,5 ± 2,3 нм и 40,0 ± 2,2 нм соответственно, при этом в каждом случае учитывается 200 частиц. Эти результаты показывают, что этот протокол эффективен в синтезе однородных и узкодисперсных Au NPs.

В представленных исследованиях SERS были сформированы хост-гостевые комплексы CB7 и UA с пустым CB7, опосредующим формирование точных плазмонных нанопереходов в пределах наноагрегатов Au NP: CB7, что подтверждается характерными сигналами UA в спектре SERS (рисунок 5A).

Назначения для рамановских пиков CB (обозначены +) и UA (отмечены *) приведены в таблице 2. И наоборот, в отсутствие CB7 не наблюдается сигналов SERS UA, что иллюстрирует ключевую роль CB7 в инициировании агрегации Au NPs.

Постоянная концентрация CB7 20 мкМ использовалась при титровании SERS UA на всем протяжении, чтобы обеспечить образование in situ воспроизводимых плазмонных наноструктур (т.е. субстратов SERS). Высокая чувствительность схемы обнаружения, представленной в этом протоколе, была продемонстрирована наблюдением четких сигналов SERS от пиков UA при 640 см-1 и 1130 см-1 (приписываемых деформации скелетного кольца и вибрации C-N соответственно) до ~0,2 мкМ (рисунок 5B−D), который известен как предел обнаружения. Кроме того, очень сильные корреляции (R2 > 0,98) между интенсивностью SERS и логарифмической концентрацией UA были получены степенным законом для обоих пиков, причем линейные области были обнаружены в диапазоне от 0,2 до 2 мкМ (рисунок 5E,F). Следует отметить, что линейные корреляции между интенсивностью СЕРС и логарифмической концентрацией могут быть аппроксимированы для узкого диапазона концентраций анализируемого вещества, тогда как сигнал SERS приближается к 0, когда логарифмическая концентрация приближается к отрицательной бесконечности (т.е. концентрация анализируемого вещества приближается к 0), как это наблюдается в наших данных. Сигналы SERS также обладают высокой воспроизводимостью, о чем свидетельствуют небольшие полосы ошибок, показанные на рисунке 5E,F.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация точных плазмонных нанопереходов в самосборных наноагрегатах Au NP: CB7. Вставка показывает увеличение плазмонных нанопереходов, где агрегация опосредована пустым CB7, в то время как UA обогащается на поверхности Au NPs с помощью комплексации хозяин-гость. Отмечается, что схема не нарисована в масштабе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: а) Схематическая иллюстрация и b) фотография автоматизированного синтезатора Au NP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Схематическая иллюстрация рамановской системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативная характеристика Au NPs. (A) УФ-Вис спектры Au NP и (B) увеличенные спектры, показывающие смещение пиков LSPR по мере увеличения числа шагов роста до 10. (C) Гидродинамический размер Au NPs и (D) соответствующий график размера частиц в зависимости от числа шагов роста. Е) изображения ТЕА Au NPs, показывающие размеры семян Au и Au NPs после 5 и 10 этапов выращивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативные результаты SERS по обнаружению UA в наноагрегатах Au NP: CB7. (A) SERS спектры UA при наличии или отсутствии CB7. Рамановские пики CB7 и UA отмечены знаками + и * соответственно. (B) Полнодиапазонный, (C) 600 - 700 см-1 зум-ин и (D) 1100 - 1180 см-1 зум-спектр SERS UA с концентрациями от 0 до 20 мкм. Основные рамановские вершины UA отмечены *. Спектры были скорректированы и смещены для ясности. (Э,Ф) Соответствующие графики пиковой интенсивности СЕРС по отношению к концентрации UA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Консьюшневой раствор UA (мкМ) Добавлено стоковое решение UA (мл) Объем добавленной воды (мл) Консьюшн новое стоковое решение UA (мкМ)
400 5 5 200
200 5 5 100
100 4 6 40
40 5 5 20
20 5 5 10
10 4 6 4
4 5 5 2

Таблица 1: Последовательные разведения раствора UA.

КБ7 УА
Пик SERS (см-1) Пиковое назначение Пик SERS (см-1) Пиковое назначение
446 Режим кольцевых ножниц 491 Вибрация кольца C-N-C
831 Кольцевая деформация 640 Кольцевая деформация скелета
1375 Симметричное растяжение C-N 896 N-H гибка
1420 Асимметричное растяжение C-N 1020 Вибрация кольца
- - 1130 Вибрация C-N
- - 1202 Растяжение и изгиб N-C-C

Таблица 2: Присвоения для рамановских пиков CB7 и UA 2,4,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанный в протоколе автоматизированный метод синтеза позволяет воспроизводимо синтезировать Au NPs возрастающих размеров. Хотя есть некоторые элементы, которые все еще необходимо проводить вручную, такие как быстрое добавление цитрата натрия во время синтеза семян и периодическая проверка, чтобы убедиться, что трубки PEEK безопасны, этот метод позволяет Использовать Au NP больших размеров (до 40 нм), что обычно требует многократных ручных инъекций HAuCl4 и цитрата натрия, синтезироваться путем непрерывного сложения в течение длительного периода времени.

Дальнейшая характеристика может быть выполнена для выяснения фундаментального свойства комплексов CB. Например, формирование комплексов хозяин-гость обычно может быть подтверждено с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) 1H, который должен показывать сдвиг вверх по полю и расширение сигналов в случае комплексообразования 21,22,25. Тем не менее, ЯМР 1Ч не применим к UA из-за отсутствия в нем необменных протонов. Альтернативные методы, такие как ЯМР 13С и масс-спектрометрия, также могут быть использованы для характеристики комплексообразования. Константы связывания между CB7 и UA могут быть измерены с использованием методов титрования, таких как титрование спектроскопии UV-Vis и изотермическая титрующая калориметрия (ITC)21,22,25. Между тем, молекулярное моделирование, основанное на моделях теории силового поля и функционала плотности (DFT), может быть вычислено для получения теоретического понимания геометрии связывания комплексов хозяин-гость 21,22,25,29. Кроме того, ИК и рамановские спектры могут быть вычислены расчетами частот 21,25,29.

SERS - это высокочувствительный и селективный аналитический метод, который позволяет идентифицировать следы аналитов по их молекулярным вибрационным отпечаткам. SERS завоевывает интерес в различных научных дисциплинах, в частности в биомедицинских исследованиях, благодаря значительно улучшенным сигналам, гораздо более короткому времени сбора и высокой толерантности к жидкой воде (подходящей для зондирования в биожидкостах) 30,31,32,33,34,35. В отличие от предыдущих отчетов о зондировании UA 1,2,3,4,36,37, жесткая структура CB7 определяет точное расстояние 0,9 нм между Au NPs через карбонильное портальное связывание, в то время как поверхностно связанный CB7 может захватывать молекулы UA в своей полости (рисунок 1). ), что приводит к сильным и локализованным плазмонным горячим точкам и, следовательно, к высокочувствительным (до ~0,2 мкМ) и воспроизводимым (с погрешностью 2%) сигналам SERS UA с очень сильными корреляциями (R2 > 0,98) между интенсивностью SERS и логарифмической концентрацией (рисунок 5).

В попытке оптимизировать концентрацию CB7 отметим, что 20 мкМ CB7 было использовано для обеспечения образования воспроизводимых субстратов SERS. В частности, абсолютная концентрация используемого CB7 зависит от общей системы (т.е. Au NPs, аналитов и фоновых молекул, если таковые имеются)18,22. Следует использовать более высокую концентрацию CB7, если агрегация Au NPs слишком медленная. И наоборот, следует использовать более низкую концентрацию CB7, если раствор образца быстро выпадает в осадок и приводит к более коротким окнам измерения. Ожидается, что агрегация Au NPs, опосредованная CB7 в наших экспериментальных условиях, будет следовать кинетике диффузионно-ограниченной коллоидной агрегации (DLCA)19, в которой открытые и вытянутые цепные структуры были быстро сформированы первоначально, прежде чем соединиться вместе в виде квазифрактальной сети. Кинетика DLCA обычно возникает при высоком соотношении CB: Au NP (по числу), которое в нашем случае равно 106:1. Следует отметить, что мочевая кислота присутствует в жидкостях организма (например, сыворотке крови, моче) в более высокой концентрации. Например, нормальная концентрация мочевой кислоты составляет 3,5 – 7,0 мг/дл в сыворотке крови38 и 16 – 100 мг/дл в моче2 соответственно (концентрация выше или ниже нормальной концентрации известна как гиперурикемия и гипоурикемия)39. Поэтому для обнаружения биомаркеров в этой высокочувствительной схеме, где для снижения концентрации образца до подходящего диапазона используется высокий коэффициент разбавления. Это особенно важно для мониторинга в местах оказания медицинской помощи неизлечимо больным пациентам, у которых выделение мочи очень низкое. Сильно разбавленные образцы приводят к увеличению объемов проб и, таким образом, уменьшают погрешности в количественной оценке биомаркеров из-за испарения воды и потери образцов из-за переноса жидкости, давая при этом другие преимущества, включая минимизацию матричных эффектов25. Из-за селективного характера этого метода зондирования он ограничен анализом молекул, которые могут образовывать комплексы хозяин-гость с CB. Следует отметить, что можно наблюдать интерференции от других молекул, поскольку CB может связываться с различными гостевыми молекулами. Тем не менее, очистка образцов, такая как гель-электрофорез и ВЭЖХ, может быть выполнена до измерения SERS.

Схема обнаружения, продемонстрированная в этом протоколе, имеет потенциал для мультиплексированного обнаружения биомаркеров в сложной матрице для клинических применений, когда она связана с передовыми методами анализа данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

TCL благодарна за поддержку исследовательского гранта Королевского общества 2016 R1 (RG150551) и премии UCL BEAMS Future Leader Award, финансируемой через награду институционального спонсорства EPSRC (EP/P511262/1). WIKC, TCL и IPP благодарны студенчеству, финансируемому Программой исследовательского прикрепления A*STAR-UCL через EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1). GD и TJ хотели бы поблагодарить EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1) за спонсирование их студенчества. TJ и TCL признают Camtech Innovations за вклад в студенчество TJ. Все авторы благодарны Фонду открытого доступа UCL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40 nm gold nanoparticles NanoComposix AUCN40-100M NanoXact, 0.05 mg/ mL, bare (citrate)
Centrifuge tube Corning Falcon 14-432-22 50 mL volume
Cucurbit[7]uril Lab-made see ref. 19
Gold(III) chloride trihydrate Sigma aldrich 520918 ≥99.9% trace metals basis
Luer lock disposable syringe Cole-Parmer WZ-07945-15 3 mL volume
Luer-to-MicroTight adapter LuerTight P-662 360 μm outer diameter Tubing to Luer Syringe
PEEK tubing IDEX 1572 360 μm outer diameter, 150 μm inner diameter
PEEK tubing cutter IDEX WZ-02013-30 Capillary Polymer Chromatography Tubing Cutter For 360 µm to 1/32" OD tubing
Raman spectrometer Ocean Optics QE pro
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma aldrich S4641 ACS reagent, ≥99.0%
Sonicator
Standard Probe Digi-Sense WZ-08516-55 Type-K
Syringe pump Aladdin ALADDIN2-220 2 syringes, maximum syringe volume 60 mL
Thermocouple thermometer Digi-Sense WZ-20250-91 Single-Input Thermocouple Thermometer with NIST-Traceable Calibration
ThermoMixer Eppendorf 5382000031 With an Eppendorf SmartBlock for 50 mL tubes
Uric acid Sigma aldrich U2625 ≥99%, crystalline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Villa, J. E. L., Poppi, R. J. A portable SERS method for the determination of uric acid using a paper-based substrate and multivariate curve resolution. Analyst. 141 (6), 1966-1972 (2016).
  2. Westley, C., et al. Absolute Quantification of Uric Acid in Human Urine Using Surface Enhanced Raman Scattering with the Standard Addition Method. Analytical Chemistry. 89 (4), 2472-2477 (2017).
  3. Zhao, L., Blackburn, J., Brosseau, C. L. Quantitative Detection of Uric Acid by Electrochemical-Surface Enhanced Raman Spectroscopy Using a Multilayered Au/Ag Substrate. Analytical Chemistry. 87 (1), 441-447 (2015).
  4. Goodall, B. L., Robinson, A. M., Brosseau, C. L. Electrochemical-surface enhanced Raman spectroscopy (E-SERS) of uric acid: a potential rapid diagnostic method for early preeclampsia detection. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (5), 1382-1388 (2013).
  5. Lytvyn, Y., Perkins, B. A., Cherney, D. Z. I. Uric Acid as a Biomarker and a Therapeutic Target in Diabetes. Canadian Journal of Diabetes. 39 (3), 239-246 (2015).
  6. Ali, S. M. U., Ibupoto, Z. H., Kashif, M., Hashim, U., Willander, M. A Potentiometric Indirect Uric Acid Sensor Based on ZnO Nanoflakes and Immobilized Uricase. Sensors. 12 (3), 2787-2797 (2012).
  7. Yu, J., Wang, S., Ge, L., Ge, S. A novel chemiluminescence paper microfluidic biosensor based on enzymatic reaction for uric acid determination. Biosensors and Bioelectronics. 26 (7), 3284-3289 (2011).
  8. Yang, Y. D. Simultaneous determination of creatine, uric acid, creatinine and hippuric acid in urine by high performance liquid chromatography. Biomedical Chromatography. 12 (2), 47-49 (1999).
  9. Zhao, S., Wang, J., Ye, F., Liu, Y. M. Determination of uric acid in human urine and serum by capillary electrophoresis with chemiluminescence detection. Analytical Biochemistry. 378 (2), 127-131 (2008).
  10. Fang, Y., Seong, N. H., Dlott, D. D. Measurement of the Distribution of Site Enhancements in Surface-Enhanced Raman Scattering. Science. 321 (5887), 388-392 (2008).
  11. Jeong, H. H., et al. Dispersion and shape engineered plasmonic nanosensors. Nature Communications. 7, 11331 (2016).
  12. Alula, M. T., et al. Preparation of silver nanoparticles coated ZnO/Fe3O4 composites using chemical reduction method for sensitive detection of uric acid via surface-enhanced Raman spectroscopy. Analytica Chimica Acta. 1073, 62-71 (2019).
  13. Bastús, N. G., Comenge, J., Puntes, V. Kinetically Controlled Seeded Growth Synthesis of Citrate-Stabilized Gold Nanoparticles of up to 200 nm: Size Focusing versus Ostwald Ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
  14. Jeong, H. H., et al. Selectable Nanopattern Arrays for Nanolithographic Imprint and Etch-Mask Applications. Advanced Science. 2 (7), 1500016 (2016).
  15. Loh, X. J., Lee, T. C., Dou, Q., Deen, G. R. Utilising inorganic nanocarriers for gene delivery. Biomaterials Science. 4 (1), 70-86 (2016).
  16. Celiz, A. D., Lee, T. C., Scherman, O. A. Polymer-Mediated Dispersion of Gold Nanoparticles: Using Supramolecular Moieties on the Periphery. Advanced Materials. 21 (38), 3937-3940 (2009).
  17. Lee, T. C., Scherman, O. A. Formation of Dynamic Aggregates in Water by Cucurbit[5]uril Capped with Gold Nanoparticles. ChemComm. 46 (14), 2438-2440 (2010).
  18. Lee, T. C., Scherman, O. A. A Facile Synthesis of Dynamic Supramolecular Aggregates of Cucurbit[n]uril (n = 5-8) Capped with Gold Nanoparticles in Aqueous Media. Chemistry-A European Journal. 18 (6), 1628-1633 (2012).
  19. Taylor, R. W., et al. Precise Subnanometer Plasmonic Junctions for SERS within Gold Nano- particle Assemblies Using Cucurbit[n]uril "Glue". ACS Nano. 5 (5), 3878-3887 (2011).
  20. Peveler, W. J., et al. Cucurbituril-mediated quantum dot aggregates formed by aqueous self-assembly for sensing applications. ChemComm. 55 (38), 5495-5498 (2019).
  21. Chio, W. I. K., et al. Selective Detection of Nitroexplosives Using Molecular Recognition within Self-Assembled Plasmonic Nanojunctions. The Journal of Physical Chemistry C. 123 (25), 15769-15776 (2019).
  22. Kasera, S., Biedermann, F., Baumberg, J. J., Scherman, O. A., Mahajan, S. Quantitative SERS Using the Sequestration of Small Molecules Inside Precise Plasmonic Nanoconstructs. Nano Letters. 12 (11), 5924-5928 (2012).
  23. Taylor, R. W., et al. In Situ SERS Monitoring of Photochemistry within a Nanojunction Reactor. Nano Letters. 13 (12), 5985-5990 (2013).
  24. Kasera, S., Herrmann, L. O., Barrio, J. d, Baumberg, J. J., Scherman, O. A. Quantitative Multiplexing with Nano-Self-Assemblies in SERS. Scientific Reports. 4, 6785 (2014).
  25. Chio, W. I. K., et al. Dual-triggered nanoaggregates of cucurbit[7]uril and gold nanoparticles for multi-spectroscopic quantification of creatinine in urinalysis. Journal of Materials Chemistry C. 8, 7051-7058 (2020).
  26. Turkevich, J., Stevenson, P. C., Hillier, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discussions of the Faraday Society. 11, 55-75 (1951).
  27. Lagona, J., Mukhopadhyay, P., Chakrabarti, S., Issacs, L. The cucurbit[n]uril family. Angewandte Chemie International Edition. 44 (31), 4844-4870 (2005).
  28. OceanView Installation and Operation Manual. , Available from: https://www.oceaninsight.com/globalassets/catalog-blocks-and-images/manuals--instruction-old-logo/software/oceanviewio.pdf (2013).
  29. Mahajan, S., et al. Raman and SERS spectroscopy of cucurbit[n]urils. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10429-10433 (2010).
  30. Langer, J., et al. Present and Future of Surface-Enhanced Raman Scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
  31. Pilot, R., et al. A Review on Surface-Enhanced Raman Scattering. Biosensors. 9 (2), 57 (2019).
  32. Bantz, K. C., et al. Recent progress in SERS biosensing. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (24), 11551-11567 (2011).
  33. Moore, T. J., et al. In Vitro and In Vivo SERS Biosensing for Disease Diagnosis. Biosensors. 8 (2), 46 (2018).
  34. Bonifacio, A., Cervo, S., Sergo, V. Label-free surface-enhanced Raman spectroscopy of biofluids: fundamental aspects and diagnostic applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (27), 8265-8277 (2015).
  35. Jeong, H. H., Choi, E., Ellis, E., Lee, T. C. Recent advances in gold nanoparticles for biomedical applications: from hybrid structures to multi-functionality. Journal of Materials Chemistry B. 7 (22), 3480-3496 (2019).
  36. Premasiri, W. R., Clarke, R. H., Womble, M. E. Urine Analysis by Laser Raman Spectroscopy. Lasers in Surgery and Medicine. 28 (4), 330-334 (2001).
  37. Lu, Y., et al. Superhydrophobic silver film as a SERS substrate for the detection of uric acid and creatinine. Biomedical Optics Express. 9 (10), 4988-4997 (2018).
  38. Feig, D. I., et al. Serum Uric Acid: A Risk Factor and a Target for Treatment. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (4), 69-73 (2006).
  39. Maiuolo, J., Oppedisano, F., Gratteri, S., Muscoli, C., Mollace, V. Regulation of uric acid metabolism and excretion. International Journal of Cardiology. 213, 8-14 (2016).

Tags

Химия Выпуск 164 Наночастицы золота автоматизированный синтезатор cucurbit[n]uril комплексация хозяин-гость самосборка поверхностно-расширенная рамановская спектроскопия датчик биомаркеры диагностика заболеваний
Количественное SERS-обнаружение мочевой кислоты путем формирования точных плазмонных нанопереходов в агрегатах наночастиц золота и кукурбита[<em>n</em>]uril
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chio, W. I. K., Davison, G., Jones,… More

Chio, W. I. K., Davison, G., Jones, T., Liu, J., Parkin, I. P., Lee, T. C. Quantitative SERS Detection of Uric Acid via Formation of Precise Plasmonic Nanojunctions within Aggregates of Gold Nanoparticles and Cucurbit[n]uril. J. Vis. Exp. (164), e61682, doi:10.3791/61682 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter