Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kwantitatieve SERS-detectie van urinezuur via de vorming van nauwkeurige plasmonische nanojunctionen in aggregaten van gouden nanodeeltjes en cucurbit[n]uril

Published: October 3, 2020 doi: 10.3791/61682
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemistry, University College London (UCL), 2Institute for Materials Discovery, University College London (UCL)

Summary

Een gastheer-gastcomplex van cucurbit[7]uril en urinezuur werd gevormd in een waterige oplossing voordat een kleine hoeveelheid werd toegevoegd aan Au NP-oplossing voor kwantitatieve oppervlakte-verbeterde Raman-spectroscopie (SERS) detectie met behulp van een modulaire spectrometer.

Abstract

Dit werk beschrijft een snelle en zeer gevoelige methode voor de kwantitatieve detectie van een belangrijke biomarker, urinezuur (UA), via oppervlakte-verbeterde Raman-spectroscopie (SERS) met een lage detectiegrens van ~ 0,2 μM voor meerdere karakteristieke pieken in het vingerafdrukgebied, met behulp van een modulaire spectrometer. Dit biosensingschema wordt gemedieerd door de gastheer-gastcomplexatie tussen een macrocyclus, cucurbit[7]uril (CB7) en UA, en de daaropvolgende vorming van precieze plasmonische nanojuncties binnen de zelfgeassembleerde Au NP: CB7 nanoaggregaten. Een gemakkelijke Au NP-synthese van gewenste afmetingen voor SERS-substraten is ook uitgevoerd op basis van de klassieke citraatreductiebenadering met een optie die kan worden gefaciliteerd met behulp van een in het laboratorium gebouwde geautomatiseerde synthesizer. Dit protocol kan gemakkelijk worden uitgebreid tot multiplexed detectie van biomarkers in lichaamsvloeistoffen voor klinische toepassingen.

Introduction

Urinezuur, het eindproduct van het metabolisme van purinenucleotiden, is een belangrijke biomarker in bloedserum en urine voor de diagnose van ziekten zoals jicht, pre-eclampsie, nierziekten, hypertensie, hart- en vaatziekten en diabetes 1,2,3,4,5. De huidige methoden voor urinezuurdetectie omvatten colorimetrische enzymatische assays, hoogwaardige vloeistofchromatografie en capillaire elektroforese, die tijdrovend en duur zijn en een geavanceerde monstervoorbereiding vereisen 6,7,8,9.

Oppervlakte-verbeterde Raman-spectroscopie is een veelbelovende techniek voor routinematige point-of-care-diagnose, omdat het selectieve detectie van biomoleculen mogelijk maakt via hun trillingsvingerafdrukken en tal van voordelen biedt, zoals hoge gevoeligheid, snelle respons, gebruiksgemak en geen of minimale monstervoorbereiding. SERS-substraten op basis van edelmetaalnanodeeltjes (bijv. Au NP's) kunnen de Raman-signalen van de analytmoleculen met 4 tot 10 ordes van magnitude10 verbeteren via sterke elektromagnetische versterking veroorzaakt door oppervlakteplasmonresonantie11. Au NP's van op maat gemaakte maten kunnen gemakkelijk worden gesynthetiseerd in tegenstelling tot de tijdrovende fabricage van complexe metalen nanocomposieten12, en worden dus veel gebruikt in biomedische toepassingen vanwege hun superieure eigenschappen 13,14,15,16. Aanhechting van macrocyclische moleculen, cucurbit[n]urils (CBn, waarbij n = 5-8, 10), op het oppervlak van Au NP's de SERS-signalen van de analytmoleculen verder kan verbeteren, aangezien de zeer symmetrische en stijve CB-moleculen de precieze afstand tussen de Au NP's kunnen regelen en de analytmoleculen in het midden of in de nabijheid van de plasmonische hotspots kunnen lokaliseren via de vorming van gastheer-gastcomplexen (figuur 1)17; 18,19,20. Eerdere voorbeelden van SERS-studies met Au NP: CBn nanoaggregaten omvatten nitroexplosieven, polycyclische aromaten, diaminostilbeen, neurotransmitters en creatinine 21,22,23,24,25, waarbij de SERS-metingen worden uitgevoerd in een cuvette of door een klein druppeltje op een op maat gemaakte monsterhouder te laden. Dit detectieschema is bijzonder nuttig om biomarkers snel te kwantificeren in een complexe matrix met een hoge reproduceerbaarheid.

Hierin werd een gemakkelijke methode gedemonstreerd om gastheer-gastcomplexen van CB7 en een belangrijke biomarker UA te vormen en om UA te kwantificeren met een detectielimiet van 0,2 μM via CB7-gemedieerde aggregaties van Au NP's in waterige media met behulp van een modulaire spectrometer, die veelbelovend is voor diagnostische en klinische toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Synthese van Au NP's

  1. Synthese van Au-zaden via de conventionele Turkevich-methode26
    1. Bereid 10 ml van 25 mM HAuCl4-oplossing door 98,5 mg HAuCl4 op te lossen 3H2O voorloper met 10 ml gedeïoniseerd water in een glazen injectieflacon.
      OPMERKING: Breng een kleine hoeveelheid HAuCl4-precursor over in een weegboot en gebruik een plastic spatel in plaats van een metalen spatel om de kristallen te wegen, omdat de HAuCl4-precursor metalen labware zal corroderen. De weegstap moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd, omdat HAuCl4 hygroscopisch is en daarom in de loop van de tijd zijn gewicht zal verhogen door water uit de atmosfeer te absorberen. HAuCl4 is zeer corrosief en kan ernstige brandwonden en oogbeschadiging veroorzaken. Wees extra voorzichtig bij het hanteren ervan.
    2. Bereid 0,5 ml natriumcitraatoplossing van 500 mM door 64,5 mg natriumcitraatpoeder op te lossen met 0,5 ml gedeïoniseerd water in een glazen injectieflacon.
    3. Verdun 1 ml van de 25 mM HAuCl4-oplossing met 99 ml water in een fles met blauwe dop van 250 ml om 100 ml 0,25 mM HAuCl4-oplossing te geven.
    4. Voeg 99,5 ml van de 0,25 mM HAuCl4-oplossing toe aan een 250 ml driehals kolf met ronde bodem, uitgerust met een condensor. Verwarm de oplossing onder krachtig roeren tot 90 °C en houd de temperatuur gedurende 15 minuten aan.
    5. Injecteer 0,5 ml van de 500 mM natriumcitraatoplossing in het reactiemengsel en handhaaf de temperatuur en roer totdat de kleur van de oplossing robijnrood wordt.
      OPMERKING: De reactie duurt ongeveer 30 minuten.
  2. Gezaaide groei van Au NP's via de kinetisch gecontroleerde methode13
    1. Koel de as-gesynthetiseerde Au seed-oplossing af tot 70 °C.
    2. Bereid 10 ml natriumcitraatoplossing van 60 mM door 154,8 mg natriumcitraatpoeder op te lossen met 10 ml gedeïoniseerd water in een glazen injectieflacon.
    3. Injecteer 0,67 ml van de 25 mM HAuCl4-oplossing en 0,67 ml van de 60 mM natriumcitraatoplossing in de Au-zaden met een tijdsinterval van 2 minuten.
    4. Herhaal stap 1.2.3 om de grootte van Au NP's geleidelijk te vergroten tot 40 nm.
      OPMERKING: Het duurt ongeveer 10 groeistappen om 40 nm te bereiken. Het werkelijke aantal stappen dat nodig is, kan afhankelijk zijn van de precieze set-up.
  3. Gezaaide groei van Au NP's met behulp van geautomatiseerde synthesizer (Figuur 2)
    1. Breng 25 ml van de in sectie 1 bereide Au-zaadoplossing over in een conische centrifugebuis van 50 ml en koel af tot 70 °C in een thermomixer.
      OPMERKING: Controleer de temperatuur in de thermomixer met behulp van een thermokoppelthermometer die in een centrifugebuis van 50 ml met 25 ml water is geplaatst.
    2. Vul een luerslot wegwerpspuit van 3 ml met 2,5 ml 25 mM HAuCl4-oplossing . Vul nog een luerslotspuit van 3 ml met 2,5 ml natriumcitraatoplossing van 60 ml.
    3. Plaats de spuiten in de spuitpompen en gebruik Luer-to-MicroTight-adapters om de PEEK-slang (inwendige diameter van 150 μm) op de spuiten aan te sluiten. Steek de slang in de centrifugebuis met de Au-zaadoplossing in de thermomixer.
    4. Stel beide spuitpompen in om 0,1675 ml oplossing af te geven gedurende 20 minuten (8,357 μl per minuut).
    5. Stel de rotatiesnelheid van de thermomixer in op 700 tpm en druk op Start op de spuitpomp met de 25 mM HAuCl4-oplossing .
    6. Druk na 2 minuten op Start op de spuitpomp met de 60 mM natriumcitraatoplossing.
    7. Verwijder 30 minuten na het starten van de injectie met HAuCl4 oplossing een aliquot van de Au NP-oplossing voor analyse.
    8. Herhaal stap 1.3.5 – 1.3.7 om de diameter van de Au NP's geleidelijk te vergroten tot 40 nm.
      OPMERKING: Deze opstelling kan worden gebruikt om Au NP's tot 40 nm in één stap te laten groeien door het volume van de reactanten die in stap 1.3.4 zijn toegevoegd, te vergroten. Dit wordt bereikt door de doseertijd te verlengen met behoud van dezelfde injectiesnelheid.

2. Karakterisering van Au NP's

  1. UV-Vis spectroscopie
    1. Voeg 1 ml van de Au NP-oplossing toe aan een semi-microkwartscuvet.
    2. Schakel de spectrometer in.
    3. Stel het golflengtebereik in op 400 - 800 nm.
    4. Verkrijg het UV-Vis-spectrum voor elk monster.
  2. Dynamische lichtverstrooiing (DLS)
    1. Filtreer de monsteroplossing in een kunststof semi-micro cuvette met een filter van 0,22 μm.
    2. Schakel het DLS-instrument in.
    3. Stel de temperatuur in op 25 °C en breng gedurende 60 s in evenwicht.
    4. Meet de hydrodynamische grootte van elk monster.
  3. Transmissie elektronenmicroscopie (TEM)
    1. Giet een druppel van 5 μL van de monsteroplossing op een C-gecoat Cu-rooster met 300 mazen en droog in de lucht.
      OPMERKING: Verdunning is nodig voor meer geconcentreerde Au NP-oplossingsmonsters om goed gedispergeerde Au NP's op een TEM-rooster te verkrijgen.
    2. Verkrijg meerdere TEM-beelden voor elk monster met behulp van een TEM bij een versnellingsspanning van 200 kV.
    3. Meet de diameter van 200 Au NP's voor elk monster met ImageJ om de gemiddelde grootte en standaarddeviatie te berekenen.

3. Vorming van CB7-UA complexen

  1. Bereiding van 0,4 mM CB7-oplossing
    1. Voeg 4,65 mg CB7 toe aan een glazen injectieflacon van 15 ml.
      OPMERKING: De hoeveelheid CB7 wordt berekend op basis van het formulegewicht van CB7 (= 1163 Da) dat door de meeste rapporten in de literatuur is gebruikt. Niettemin bevatten CB7 vaste monsters meestal water, HCl, methanol en andere zouten die overblijven uit de synthese- en zuiveringsstappen, wat bijdraagt aan ~ 10 - 20% dood gewicht in het monster. De opgesloten oplosmiddelen en zouten konden niet worden verwijderd door verhitting in een vacuümoven of andere middelen. Hun hoeveelheden variëren tussen verschillende batches monsters, maar kunnen worden gekwantificeerd met behulp van elementaire analyse. Toch is het gepresenteerde protocol niet gevoelig voor de aanwezigheid van niet-gekwantificeerde hoeveelheid oplosmiddelen en zouten in de CB7-monsters.
    2. Voeg 10 ml water toe aan de injectieflacon en draai de dop vast.
    3. Soniceer het monster bij kamertemperatuur totdat de CB7-vaste stof volledig is opgelost.
      OPMERKING: CB7 werd gesynthetiseerd volgens literatuur27 , maar het is ook commercieel verkrijgbaar.
  2. Bereiding van 0,4 mM UA-oplossing
    1. Voeg 2,69 mg UA toe aan een centrifugebuis van 50 ml.
    2. Voeg 40 ml water toe aan de buis en draai de dop vast.
    3. Gebruik een thermomixer om de monsteroplossing te draaien door de temperatuur in te stellen op 70 °C, snelheid op 800 tpm en tijd op 2 uur. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur.
      OPMERKING: UA heeft een lage oplosbaarheid in water (0,40 mM)5. Wervel langer als het UA-poeder niet volledig is opgelost. Als alternatief kan ultrasone trillingen worden gebruikt om het oplossen te vergemakkelijken.
  3. Sequentiële verdunningen van de 0,4 mM UA-oplossing
    1. Verdun 5 ml van de 0,4 mM UA-oplossing met 5 ml water in een glazen injectieflacon van 15 ml om 10 ml 0,2 mM UA-oplossing te geven. Draai de dop vast en soniceer gedurende 30 s.
    2. Herhaal stap 3.3.1 met een geschikte hoeveelheid UA en water zoals beschreven in tabel 1.
  4. Voorbereiding van de CB7-UA complexen
    1. Voeg 0,75 ml van de 0,4 mM CB7-oplossing en 0,75 ml 0,4 mM UA-oplossing toe aan een buis van 1,5 ml. Zet het deksel vast en soniceer gedurende 30 s.
    2. Wacht 30 minuten om de vorming van gastheer-gastcomplexen te garanderen.
    3. Herhaal stap 3.4.1 – 3.4.2 met UA-oplossing van verschillende concentraties.

4. SERS-detectie van UA

  1. Experimentele opstelling van het Raman-systeem (figuur 3)
    1. Schakel de 633 nm He-Ne laser (22,5 mW) in.
    2. Schakel de modulaire Raman-spectrometer in.
    3. Schakel de computer in en start de software.
    4. Klik op het pictogram Spectroscopietoepassingswizards en selecteer Raman.
    5. Start een nieuwe aanwinst. Stel de integratietijd in op 30 s, scans op gemiddeld op 5 en boxcar op 0.
    6. Sla het achtergrondspectrum op en voer de lasergolflengte in (d.w.z. 633 nm).
      OPMERKING: Integratietijd is de tijd voor elke scan, scans tot gemiddelde is het aantal scans gemiddeld om elk spectrum te creëren en boxcar is het aantal naburige pixels gemiddeld28.
  2. Vorming van de SERS-substraten
    1. Voeg 0,9 ml van de 40 nm Au NP-oplossing en 0,1 ml van de voorgevormde CB7-UA-complexe oplossing toe aan een buis van 1,5 ml. Bevestig het deksel en soniceer totdat de oplossing verandert van robijnrood in paars.
      OPMERKING: Commerciële citraatgestabiliseerde 40 nm Au NP-oplossingsmonsters kunnen ook worden gebruikt. Doorgaans wordt de optische dichtheid van de gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie (LSPR) piek aangepast naar 1 via verdunning van geconcentreerde voorraadoplossingsmonsters. De citraatconcentratie in het monster wordt doorgaans aangehouden op 2 mM.
    2. Breng de monsteroplossing over in een semi-microcuvet. Plaats de cuvette in de Raman monsterhouder en sluit de cover.
    3. Start de meting.
    4. Stel automatisch opslaan in om vijf opeenvolgende SERS-spectra op te nemen.
    5. Stop de meting en verander het monster.
    6. Herhaal stap 4.2.1 – 4.2.5 met CB7-UA-oplossing van verschillende concentraties.
      OPMERKING: De aggregatietijd blijkt afhankelijk te zijn van de concentratie UA in de nanoaggregaten, variërend van 30 s voor 0,1 μM UA tot 30 minuten voor 20 μM UA, vanwege het verschil in de concentratie van lege CB7 die een belangrijke bijdrage levert aan het bemiddelen van de aggregatie van Au NP's. Voor het CB7-UA-complex wordt één portaal geblokkeerd door het omvangrijke UA-molecuul, waardoor het niet beschikbaar is voor binding aan het Au NP-oppervlak en daarom niet in staat is om deNP-aggregatie 21 te bemiddelen. Het monster is klaar voor meting wanneer de kleur van de oplossing verandert van robijnrood naar paars.

5. Data-analyse

  1. Gegevensverwerking
    1. Download en installeer de baseline met asymmetrische kleinste kwadraten (ALS) plugin in Origin.
      OPMERKING: Voor de ALS-plug-in is OriginPro vereist.
    2. Voeg de onbewerkte gegevens in Origin in.
    3. Bereken een gemiddelde waarde uit de vijf SERS-spectra van elk monster. Deel de waarde door het vermogen van de laser (d.w.z. 22,5 mW) en door de integratietijd (d.w.z. 30 s).
    4. Klik op het ALS-pictogram om het dialoogvenster te openen. Stel de asymmetrische factor in op 0,001, de drempel op 0,03 %, de afvlakkingsfactor op 2 en het aantal iteraties op 20 om de basislijn van elk gemiddeld spectrum te corrigeren.
    5. Plot de SERS-spectra van verschillende UA-concentraties met behulp van gestapelde lijnen door y-offsets. De output moet intensiteit zijn (telt s-1 mW-1) tegen Raman-verschuiving (cm-1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In de gepresenteerde Au NP-synthese vertonen de UV-Vis-spectra een verschuiving van de LSPR-pieken van 521 nm naar 529 nm na 10 groeistappen (figuur 4A,B), terwijl de DLS-gegevens een smalle grootteverdeling laten zien naarmate de grootte van Au NP's toeneemt van 25,9 nm tot 42,8 nm (figuur 4C,D). De gemiddelde groottes van G0, G5 en G10 gemeten op basis van TEM-beelden (figuur 4E) zijn respectievelijk 20,1 ± 2,1 nm, 32,5 ± 2,3 nm en 40,0 ± 2,2 nm, waarbij in elk geval 200 deeltjes worden geteld. Deze resultaten geven aan dat dit protocol effectief is in het synthetiseren van uniforme en nauw verspreide Au NP's.

In de gepresenteerde SERS-studies werden gastheer-gastcomplexen van CB7 en UA gevormd met lege CB7 die de vorming van precieze plasmonische nanojuncties binnen de Au NP: CB7 nanoaggregaten bemiddelden, zoals ondersteund door de karakteristieke UA-signalen in het SERS-spectrum (figuur 5A).

De toewijzingen voor de Raman-pieken van CB (gemarkeerd met +) en UA (gemarkeerd door *) zijn weergegeven in tabel 2. Omgekeerd kunnen er geen SERS-signalen van UA worden waargenomen in afwezigheid van CB7, wat de sleutelrol van CB7 illustreert bij het activeren van de aggregatie van Au NP's.

Een constante CB7-concentratie van 20 μM werd gebruikt bij de SERS-titratie van UA gedurende de hele periode om de in situ vorming van reproduceerbare plasmonische nanostructuren (d.w.z. SERS-substraten) te waarborgen. De hoge gevoeligheid van het detectieschema in dit protocol werd aangetoond door de observatie van duidelijke SERS-signalen van de UA-pieken bij 640 cm-1 en 1130 cm-1 (toegeschreven aan respectievelijk skeletringvervorming en C-N-trillingen) tot ~ 0,2 μM (figuur 5B−D), wat bekend staat als de detectiegrens. Bovendien werden zeer sterke correlaties (R2 > 0,98) tussen de SERS-intensiteit en logconcentratie van UA verkregen door de vermogenswet voor beide pieken, met lineaire gebieden in het bereik van 0,2 tot 2 μM (figuur 5E,F). Opgemerkt moet worden dat lineaire correlaties tussen de SERS-intensiteit en logconcentratie kunnen worden benaderd voor een smal bereik van analytconcentraties, terwijl het SERS-signaal 0 nadert wanneer de logconcentratie negatieve oneindigheid nadert (d.w.z. de analytconcentratie nadert 0), zoals waargenomen in onze gegevens. De SERS-signalen zijn ook zeer reproduceerbaar, zoals blijkt uit de kleine foutbalken in figuur 5E,F.

Figure 1
Figuur 1: Schematische illustratie van de precieze plasmonische nanojuncties binnen zelfgeassembleerde Au NP: CB7 nanoaggregaten. Inset toont een zoom-in van de plasmonische nanojuncties waarbij de aggregatie wordt gemedieerd door lege CB7 terwijl UA wordt verrijkt op het oppervlak van Au NP's via host-guest complexatie. Opgemerkt wordt dat de regeling niet op schaal is getrokken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: (a) Schematische illustratie en (b) foto van de geautomatiseerde Au NP synthesizer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Schematische illustratie van het Raman-systeem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve karakterisering van Au NP's. (A) UV-Vis spectra van Au NP's en (B) zoom-in spectra die de verschuiving van de LSPR-pieken laten zien naarmate het aantal groeistappen toeneemt tot 10. (C) Hydrodynamische grootte van Au NP's en (D) overeenkomstige waarnemingspunten van deeltjesgrootte als functie van het aantal groeistappen. (E) TEM-afbeeldingen van Au NP's, met maten Au-zaden en Au NP's na 5 en 10 groeistappen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Representatieve SERS-resultaten van UA-detectie binnen Au NP: CB7 nanoaggregaten. (A) SERS-spectra van UA in de aan- of afwezigheid van CB7. Raman-pieken van CB7 en UA worden gemarkeerd door respectievelijk + en * . (B) Full-range, (C) 600 - 700 cm-1 zoom-in en (D) 1100 - 1180 cm-1 zoom-in SERS spectra van UA met concentraties van 0 tot 20 μM. De belangrijkste Raman-toppen van UA worden gemarkeerd door *. Spectra werden gecorrigeerd en verschoven voor de duidelijkheid. (E,F) Overeenkomstige plots van de SERS-piekintensiteit tegen de concentratie van UA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Conc. van UA-stamoplossing (μM) Vol. van UA-voorraadoplossing toegevoegd (ml) Vol. toegevoegd water (ml) Conc. van nieuwe UA-stamoplossing (μM)
400 5 5 200
200 5 5 100
100 4 6 40
40 5 5 20
20 5 5 10
10 4 6 4
4 5 5 2

Tabel 1: Sequentiële verdunningen van UA-oplossing.

Cb7 UA
SERS piek (cm-1) Piekopdracht SERS piek (cm-1) Piekopdracht
446 Ringschaarmodus 491 C-N-C ringtrilling
831 Ringvervorming 640 Vervorming van de skeletring
1375 Symmetrische C-N stretching 896 N-H buigen
1420 Asymmetrische C-N stretching 1020 Ringtrilling
- - 1130 C-N trilling
- - 1202 N-C-C strekken en buigen

Tabel 2: Opdrachten voor de Raman-pieken van CB7 en UA 2,4,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De geautomatiseerde synthesemethode die in het protocol wordt beschreven, maakt het mogelijk om Au NP's van toenemende omvang reproduceerbaar te synthetiseren. Hoewel er enkele elementen zijn die nog handmatig moeten worden uitgevoerd, zoals de snelle toevoeging van natriumcitraat tijdens de zaadsynthese en periodieke controle om ervoor te zorgen dat de PEEK-slang veilig is, maakt deze methode Au NP's van grote afmetingen (tot 40 nm) mogelijk, waarvoor gewoonlijk meerdere handmatige injecties van HAuCl4 en natriumcitraat nodig zijn, te synthetiseren via continue toevoeging gedurende een lange periode.

Verdere karakterisering kan worden uitgevoerd om de fundamentele eigenschap van de CB-complexen op te helderen. De vorming van gastheer-gastcomplexen kan bijvoorbeeld meestal worden bevestigd met behulp van 1H nucleaire magnetische resonantie (NMR), die in geval van complexatie21,22,25 een verschuiving van het veld en een verbreding van signalen zou moeten laten zien. Toch is 1H NMR niet van toepassing op UA vanwege het ontbreken van niet-uitwisselbare protonen. Alternatieve technieken zoals 13C NMR en massaspectrometrie kunnen ook worden gebruikt om de complexatie te karakteriseren. Bindingsconstanten tussen CB7 en UA kunnen worden gemeten met behulp van titratietechnieken, zoals UV-Vis-spectroscopietitratie en isotherme titratiecalorimetrie (ITC)21,22,25. Ondertussen kan moleculaire modellering op basis van krachtveld- en dichtheidsfunctionele theorie (DFT) modellen worden berekend om theoretische inzichten te verkrijgen in de bindingsgeometrie van de gastheer-gastcomplexen 21,22,25,29. Bovendien kunnen IR- en Raman-spectra worden berekend door frequentieberekeningen 21,25,29.

SERS is een zeer gevoelige en selectieve analytische techniek die identificatie van sporenanalyten mogelijk maakt via hun molecuulspecifieke vibrationele vingerafdrukken. SERS wint aan interesse in verschillende wetenschappelijke disciplines, met name biomedische studies, vanwege de sterk verbeterde signalen, de veel kortere acquisitietijd en de hoge tolerantie voor vloeibaar water (geschikt voor detectie in biovloeistoffen)30,31,32,33,34,35. In tegenstelling tot eerdere rapporten over UA-detectie 1,2,3,4,36,37, definieert de rigide structuur van CB7 een precieze afstand van 0,9 nm tussen Au NP's via carbonylportaalbinding, terwijl de oppervlaktegebonden CB7 UA-moleculen in zijn holte kan vangen (figuur 1 ), resulterend in sterke en gelokaliseerde plasmonische hotspots, en dus de zeer gevoelige (tot ~ 0,2 μM) en reproduceerbare (binnen 2% fout) SERS-signalen van UA met zeer sterke correlaties (R2 > 0,98) tussen de SERS-intensiteit en logconcentratie (figuur 5).

In een poging om de concentratie van CB7 te optimaliseren, merken we op dat 20 μM CB7 werd gebruikt om de vorming van reproduceerbare SERS-substraten te garanderen. In het bijzonder is de absolute concentratie van CB7 die wordt gebruikt afhankelijk van het totale systeem (d.w.z. Au NP's, analyten en achtergrondmoleculen, indien aanwezig)18,22. Een hogere concentratie CB7 moet worden gebruikt als de aggregatie van Au NP's te langzaam verloopt. Omgekeerd moet een lagere concentratie CB7 worden gebruikt als de monsteroplossing snel neerslaat en tot kortere meetvensters leidt. De aggregatie van Au NP's gemedieerd door CB7 in onze experimentele setting zal naar verwachting de diffusie-beperkte colloïdale aggregatie (DLCA) kinetiek19 volgen, waarin open en langwerpige ketenachtige structuren aanvankelijk snel werden gevormd voordat ze samenkwamen als quasi-fractaal netwerk. DLCA-kinetiek vindt meestal plaats bij een hoge CB: Au NP-verhouding (per aantal), die in ons geval gelijk is aan 106: 1. Opgemerkt moet worden dat urinezuur aanwezig is in lichaamsvloeistoffen (bijv. Bloedserum, urine) in een hogere concentratie. De normale concentratie urinezuur is bijvoorbeeld respectievelijk 3,5 - 7,0 mg / dL in bloedserum38 en 16 - 100 mg / dL in urine2 (concentratie boven of onder de normale concentratie staat bekend als hyperurikemie en hypourikemie)39. Daarom is slechts een zeer kleine hoeveelheid monster nodig voor de detectie van biomarkers in dit zeer gevoelige schema waarbij een hoge verdunningsfactor wordt gebruikt om de concentratie van het monster tot een geschikt bereik te verlagen. Dit is met name belangrijk voor point-of-care monitoring van terminaal zieke patiënten bij wie de urine-uitscheiding zeer laag is. Sterk verdunde monsters resulteren in grotere monstervolumes en verminderen zo fouten in de kwantificering van biomarkers als gevolg van waterverdamping en verlies van monsters als gevolg van vloeistofoverdracht, terwijl ze andere voordelen bieden, waaronder het minimaliseren van de matrixeffecten25. Vanwege het selectieve karakter van deze tastermethode is het beperkt tot analytmoleculen die gastheer-gastcomplexen kunnen vormen met CB. Opgemerkt moet worden dat het mogelijk is om interferenties van andere moleculen waar te nemen, omdat CB zich kan binden aan verschillende gastmoleculen. Niettemin kan monsterzuivering zoals gel-elektroforese en HPLC worden uitgevoerd voorafgaand aan SERS-meting.

Het detectieschema dat in dit protocol wordt gedemonstreerd, heeft het potentieel voor multiplexed detectie van biomarkers in een complexe matrix voor klinische toepassingen wanneer het is gekoppeld aan geavanceerde data-analysetechnieken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

TCL is dankbaar voor de steun van de Royal Society Research Grant 2016 R1 (RG150551) en de UCL BEAMS Future Leader Award gefinancierd via de Institutional Sponsorship award van de EPSRC (EP/P511262/1). WIKC, TCL en IPP zijn dankbaar voor het studentschap dat wordt gefinancierd door het A * STAR-UCL Research Attachment Programme via de EPSRC M3S CDT (EP / L015862 / 1). GD en TJ willen de EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1) bedanken voor het sponsoren van hun studentenschap. TJ en TCL erkennen Camtech Innovations voor hun bijdrage aan het studentenschap van TJ. Alle auteurs zijn het UCL Open Access Fund dankbaar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40 nm gold nanoparticles NanoComposix AUCN40-100M NanoXact, 0.05 mg/ mL, bare (citrate)
Centrifuge tube Corning Falcon 14-432-22 50 mL volume
Cucurbit[7]uril Lab-made see ref. 19
Gold(III) chloride trihydrate Sigma aldrich 520918 ≥99.9% trace metals basis
Luer lock disposable syringe Cole-Parmer WZ-07945-15 3 mL volume
Luer-to-MicroTight adapter LuerTight P-662 360 μm outer diameter Tubing to Luer Syringe
PEEK tubing IDEX 1572 360 μm outer diameter, 150 μm inner diameter
PEEK tubing cutter IDEX WZ-02013-30 Capillary Polymer Chromatography Tubing Cutter For 360 µm to 1/32" OD tubing
Raman spectrometer Ocean Optics QE pro
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma aldrich S4641 ACS reagent, ≥99.0%
Sonicator
Standard Probe Digi-Sense WZ-08516-55 Type-K
Syringe pump Aladdin ALADDIN2-220 2 syringes, maximum syringe volume 60 mL
Thermocouple thermometer Digi-Sense WZ-20250-91 Single-Input Thermocouple Thermometer with NIST-Traceable Calibration
ThermoMixer Eppendorf 5382000031 With an Eppendorf SmartBlock for 50 mL tubes
Uric acid Sigma aldrich U2625 ≥99%, crystalline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Villa, J. E. L., Poppi, R. J. A portable SERS method for the determination of uric acid using a paper-based substrate and multivariate curve resolution. Analyst. 141 (6), 1966-1972 (2016).
  2. Westley, C., et al. Absolute Quantification of Uric Acid in Human Urine Using Surface Enhanced Raman Scattering with the Standard Addition Method. Analytical Chemistry. 89 (4), 2472-2477 (2017).
  3. Zhao, L., Blackburn, J., Brosseau, C. L. Quantitative Detection of Uric Acid by Electrochemical-Surface Enhanced Raman Spectroscopy Using a Multilayered Au/Ag Substrate. Analytical Chemistry. 87 (1), 441-447 (2015).
  4. Goodall, B. L., Robinson, A. M., Brosseau, C. L. Electrochemical-surface enhanced Raman spectroscopy (E-SERS) of uric acid: a potential rapid diagnostic method for early preeclampsia detection. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (5), 1382-1388 (2013).
  5. Lytvyn, Y., Perkins, B. A., Cherney, D. Z. I. Uric Acid as a Biomarker and a Therapeutic Target in Diabetes. Canadian Journal of Diabetes. 39 (3), 239-246 (2015).
  6. Ali, S. M. U., Ibupoto, Z. H., Kashif, M., Hashim, U., Willander, M. A Potentiometric Indirect Uric Acid Sensor Based on ZnO Nanoflakes and Immobilized Uricase. Sensors. 12 (3), 2787-2797 (2012).
  7. Yu, J., Wang, S., Ge, L., Ge, S. A novel chemiluminescence paper microfluidic biosensor based on enzymatic reaction for uric acid determination. Biosensors and Bioelectronics. 26 (7), 3284-3289 (2011).
  8. Yang, Y. D. Simultaneous determination of creatine, uric acid, creatinine and hippuric acid in urine by high performance liquid chromatography. Biomedical Chromatography. 12 (2), 47-49 (1999).
  9. Zhao, S., Wang, J., Ye, F., Liu, Y. M. Determination of uric acid in human urine and serum by capillary electrophoresis with chemiluminescence detection. Analytical Biochemistry. 378 (2), 127-131 (2008).
  10. Fang, Y., Seong, N. H., Dlott, D. D. Measurement of the Distribution of Site Enhancements in Surface-Enhanced Raman Scattering. Science. 321 (5887), 388-392 (2008).
  11. Jeong, H. H., et al. Dispersion and shape engineered plasmonic nanosensors. Nature Communications. 7, 11331 (2016).
  12. Alula, M. T., et al. Preparation of silver nanoparticles coated ZnO/Fe3O4 composites using chemical reduction method for sensitive detection of uric acid via surface-enhanced Raman spectroscopy. Analytica Chimica Acta. 1073, 62-71 (2019).
  13. Bastús, N. G., Comenge, J., Puntes, V. Kinetically Controlled Seeded Growth Synthesis of Citrate-Stabilized Gold Nanoparticles of up to 200 nm: Size Focusing versus Ostwald Ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
  14. Jeong, H. H., et al. Selectable Nanopattern Arrays for Nanolithographic Imprint and Etch-Mask Applications. Advanced Science. 2 (7), 1500016 (2016).
  15. Loh, X. J., Lee, T. C., Dou, Q., Deen, G. R. Utilising inorganic nanocarriers for gene delivery. Biomaterials Science. 4 (1), 70-86 (2016).
  16. Celiz, A. D., Lee, T. C., Scherman, O. A. Polymer-Mediated Dispersion of Gold Nanoparticles: Using Supramolecular Moieties on the Periphery. Advanced Materials. 21 (38), 3937-3940 (2009).
  17. Lee, T. C., Scherman, O. A. Formation of Dynamic Aggregates in Water by Cucurbit[5]uril Capped with Gold Nanoparticles. ChemComm. 46 (14), 2438-2440 (2010).
  18. Lee, T. C., Scherman, O. A. A Facile Synthesis of Dynamic Supramolecular Aggregates of Cucurbit[n]uril (n = 5-8) Capped with Gold Nanoparticles in Aqueous Media. Chemistry-A European Journal. 18 (6), 1628-1633 (2012).
  19. Taylor, R. W., et al. Precise Subnanometer Plasmonic Junctions for SERS within Gold Nano- particle Assemblies Using Cucurbit[n]uril "Glue". ACS Nano. 5 (5), 3878-3887 (2011).
  20. Peveler, W. J., et al. Cucurbituril-mediated quantum dot aggregates formed by aqueous self-assembly for sensing applications. ChemComm. 55 (38), 5495-5498 (2019).
  21. Chio, W. I. K., et al. Selective Detection of Nitroexplosives Using Molecular Recognition within Self-Assembled Plasmonic Nanojunctions. The Journal of Physical Chemistry C. 123 (25), 15769-15776 (2019).
  22. Kasera, S., Biedermann, F., Baumberg, J. J., Scherman, O. A., Mahajan, S. Quantitative SERS Using the Sequestration of Small Molecules Inside Precise Plasmonic Nanoconstructs. Nano Letters. 12 (11), 5924-5928 (2012).
  23. Taylor, R. W., et al. In Situ SERS Monitoring of Photochemistry within a Nanojunction Reactor. Nano Letters. 13 (12), 5985-5990 (2013).
  24. Kasera, S., Herrmann, L. O., Barrio, J. d, Baumberg, J. J., Scherman, O. A. Quantitative Multiplexing with Nano-Self-Assemblies in SERS. Scientific Reports. 4, 6785 (2014).
  25. Chio, W. I. K., et al. Dual-triggered nanoaggregates of cucurbit[7]uril and gold nanoparticles for multi-spectroscopic quantification of creatinine in urinalysis. Journal of Materials Chemistry C. 8, 7051-7058 (2020).
  26. Turkevich, J., Stevenson, P. C., Hillier, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discussions of the Faraday Society. 11, 55-75 (1951).
  27. Lagona, J., Mukhopadhyay, P., Chakrabarti, S., Issacs, L. The cucurbit[n]uril family. Angewandte Chemie International Edition. 44 (31), 4844-4870 (2005).
  28. OceanView Installation and Operation Manual. , Available from: https://www.oceaninsight.com/globalassets/catalog-blocks-and-images/manuals--instruction-old-logo/software/oceanviewio.pdf (2013).
  29. Mahajan, S., et al. Raman and SERS spectroscopy of cucurbit[n]urils. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10429-10433 (2010).
  30. Langer, J., et al. Present and Future of Surface-Enhanced Raman Scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
  31. Pilot, R., et al. A Review on Surface-Enhanced Raman Scattering. Biosensors. 9 (2), 57 (2019).
  32. Bantz, K. C., et al. Recent progress in SERS biosensing. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (24), 11551-11567 (2011).
  33. Moore, T. J., et al. In Vitro and In Vivo SERS Biosensing for Disease Diagnosis. Biosensors. 8 (2), 46 (2018).
  34. Bonifacio, A., Cervo, S., Sergo, V. Label-free surface-enhanced Raman spectroscopy of biofluids: fundamental aspects and diagnostic applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (27), 8265-8277 (2015).
  35. Jeong, H. H., Choi, E., Ellis, E., Lee, T. C. Recent advances in gold nanoparticles for biomedical applications: from hybrid structures to multi-functionality. Journal of Materials Chemistry B. 7 (22), 3480-3496 (2019).
  36. Premasiri, W. R., Clarke, R. H., Womble, M. E. Urine Analysis by Laser Raman Spectroscopy. Lasers in Surgery and Medicine. 28 (4), 330-334 (2001).
  37. Lu, Y., et al. Superhydrophobic silver film as a SERS substrate for the detection of uric acid and creatinine. Biomedical Optics Express. 9 (10), 4988-4997 (2018).
  38. Feig, D. I., et al. Serum Uric Acid: A Risk Factor and a Target for Treatment. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (4), 69-73 (2006).
  39. Maiuolo, J., Oppedisano, F., Gratteri, S., Muscoli, C., Mollace, V. Regulation of uric acid metabolism and excretion. International Journal of Cardiology. 213, 8-14 (2016).

Tags

Chemie Gouden nanodeeltjes geautomatiseerde synthesizer cucurbit[n]uril host-guest complexatie zelfassemblage oppervlakte-verbeterde Raman spectroscopie sensor biomarkers ziektediagnose
Kwantitatieve SERS-detectie van urinezuur via de vorming van nauwkeurige plasmonische nanojunctionen in aggregaten van gouden nanodeeltjes en cucurbit[<em>n</em>]uril
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chio, W. I. K., Davison, G., Jones,… More

Chio, W. I. K., Davison, G., Jones, T., Liu, J., Parkin, I. P., Lee, T. C. Quantitative SERS Detection of Uric Acid via Formation of Precise Plasmonic Nanojunctions within Aggregates of Gold Nanoparticles and Cucurbit[n]uril. J. Vis. Exp. (164), e61682, doi:10.3791/61682 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter