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Chemistry

Detección cuantitativa de SERS de ácido úrico a través de la formación de nanouniones plasmónicas precisas dentro de agregados de nanopartículas de oro y cucurbitáceas

Published: October 3, 2020 doi: 10.3791/61682
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemistry, University College London (UCL), 2Institute for Materials Discovery, University College London (UCL)

Summary

Se formó un complejo huésped-huésped de cucurbitácea[7]uril y ácido úrico en una solución acuosa antes de agregar una pequeña cantidad a la solución Au NP para la detección cuantitativa de espectroscopia Raman mejorada en superficie (SERS) utilizando un espectrómetro modular.

Abstract

Este trabajo describe un método rápido y altamente sensible para la detección cuantitativa de un biomarcador importante, el ácido úrico (UA), a través de la espectroscopia Raman mejorada en superficie (SERS) con un límite de detección bajo de ~ 0.2 μM para múltiples picos característicos en la región de huellas dactilares, utilizando un espectrómetro modular. Este esquema de biodetección está mediado por la complejación huésped-huésped entre un macrociclo, cucurbitácea[7]uril (CB7) y UA, y la posterior formación de nanouniones plasmónicas precisas dentro de los nanoagregados Au NP: CB7 autoensamblados. También se ha realizado una síntesis fácil de Au NP de tamaños deseables para sustratos SERS basada en el enfoque clásico de reducción de citratos con una opción que se facilitará utilizando un sintetizador automatizado construido en laboratorio. Este protocolo se puede extender fácilmente a la detección multiplexada de biomarcadores en fluidos corporales para aplicaciones clínicas.

Introduction

El ácido úrico, que es el producto final del metabolismo de los nucleótidos de purina, es un biomarcador importante en el suero sanguíneo y la orina para el diagnóstico de enfermedades como la gota, la preeclampsia, las enfermedades renales, la hipertensión, las enfermedades cardiovasculares y la diabetes 1,2,3,4,5. Los métodos actuales para la detección de ácido úrico incluyen ensayos enzimáticos colorimétricos, cromatografía líquida de alto rendimiento y electroforesis capilar, que consumen mucho tiempo, son costosos y requieren una preparación sofisticada demuestras 6,7,8,9.

La espectroscopia Raman mejorada con superficie es una técnica prometedora para el diagnóstico rutinario en el punto de atención, ya que permite la detección selectiva de biomoléculas a través de sus huellas dactilares de vibración y ofrece numerosas ventajas, como alta sensibilidad, respuesta rápida, facilidad de uso y preparación de muestras nula o mínima. Los sustratos SERS basados en nanopartículas de metales nobles (por ejemplo, Au NP) pueden mejorar las señales Raman de las moléculas de analito de 4 a 10 órdenes de magnitud10 a través de una fuerte mejora electromagnética causada por la resonancia de plasmónde superficie 11. Au NPs de tamaños personalizados se pueden sintetizar fácilmente en lugar de la fabricación lenta de nanocompuestos metálicos complejos12, y por lo tanto son ampliamente utilizados en aplicaciones biomédicas debido a sus propiedades superiores 13,14,15,16. La unión de moléculas macrocíclicas, cucurbitáceas (CBn, donde n = 5-8, 10), en la superficie de Au NP puede mejorar aún más las señales SERS de las moléculas de analito, ya que las moléculas CB altamente simétricas y rígidas pueden controlar el espaciado preciso entre las Au NP y localizar las moléculas de analito en el centro o en las proximidades de los puntos calientes plasmónicos a través de la formación de complejos huésped-huésped (Figura 1) 17, 18,19,20. Ejemplos anteriores de estudios SERS utilizando Au NP: Los nanoagregados CBn incluyen nitroexplosivos, aromáticos policíclicos, diaminoestilbeno, neurotransmisores y creatinina 21,22,23,24,25, con las mediciones de SERS realizadas en una cubeta o cargando una pequeña gota en un portamuestras hecho a medida. Este esquema de detección es particularmente útil para cuantificar rápidamente biomarcadores en una matriz compleja con una alta reproducibilidad.

Aquí, se demostró un método fácil para formar complejos huésped-huésped de CB7 y un biomarcador importante UA, y para cuantificar UA con un límite de detección de 0.2 μM a través de agregaciones mediadas por CB7 de Au NP en medios acuosos utilizando un espectrómetro modular, que es prometedor para aplicaciones diagnósticas y clínicas.

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Protocol

1. Síntesis de au npn

  1. Síntesis de semillas de Au mediante el método convencional de Turkevich26
    1. Preparar 10 mL de solución de HAuCl4 de 25 mM disolviendo 98,5 mg de HAuCl4· Precursor de 3H2O con 10 ml de agua desionizada en un vial de vidrio.
      NOTA: Transfiera una pequeña cantidad de precursor de HAuCl4 a un bote de pesaje y use una espátula de plástico en lugar de una espátula metálica para pesar los cristales porque el precursor de HAuCl4 corroerá el material de laboratorio de metal. El paso de pesaje debe realizarse lo más rápido posible, ya que HAuCl4 es higroscópico y, por lo tanto, aumentará su peso con el tiempo al absorber agua de la atmósfera. HAuCl4 es altamente corrosivo y puede causar quemaduras graves en la piel y daños en los ojos. Tenga especial cuidado al manipularlo.
    2. Preparar 0,5 ml de solución de citrato de sodio de 500 mM disolviendo 64,5 mg de polvo de citrato de sodio con 0,5 ml de agua desionizada en un vial de vidrio.
    3. Diluya 1 ml de la solución HAuCl4 de 25 mM con 99 ml de agua en una botella de tapa azul de 250 ml para dar 100 ml de solución HAuCl4 de 0,25 ml.
    4. Agregue 99,5 ml de la solución HAuCl4 de 0,25 mM en un matraz de fondo redondo de tres cuellos de 250 ml equipado con un condensador. Calentar la solución a 90 °C bajo agitación vigorosa y mantener la temperatura durante 15 min.
    5. Inyecte 0,5 ml de la solución de citrato de sodio de 500 mM en la mezcla de reacción y mantenga la temperatura y la agitación hasta que el color de la solución se vuelva rojo rubí.
      NOTA: La reacción dura unos 30 min.
  2. Crecimiento sembrado de Au NPs mediante el método cinéticamente controlado13
    1. Enfríe la solución de semilla de Au sintetizada a 70 °C.
    2. Preparar 10 ml de solución de citrato de sodio de 60 mM disolviendo 154,8 mg de polvo de citrato de sodio con 10 ml de agua desionizada en un vial de vidrio.
    3. Inyecte 0,67 ml de la solución HAuCl4 de 25 mM y 0,67 ml de la solución de citrato de sodio de 60 mM a las semillas Au con un intervalo de tiempo de 2 min.
    4. Repita el paso 1.2.3 para aumentar gradualmente el tamaño de au nps a 40 nm.
      NOTA: Se necesitan unos 10 pasos de crecimiento para alcanzar los 40 nm. El número real de pasos necesarios puede depender de la configuración precisa.
  3. Crecimiento sembrado de AU NP usando sintetizador automatizado (Figura 2)
    1. Transfiera 25 ml de la solución de semillas au preparada en la sección 1 a un tubo de centrífuga cónica de 50 ml y enfríe a 70 °C en un termomezclador.
      NOTA: Controle la temperatura dentro del termomezclador utilizando un termómetro de termopar colocado en un tubo centrífugo de 50 ml que contiene 25 ml de agua.
    2. Llene una jeringa desechable luer lock de 3 ml con 2,5 ml de solución HAuCl4 de 25 ml. Llene otra jeringa desechable Luer lock de 3 ml con 2,5 ml de solución de citrato de sodio de 60 ml.
    3. Coloque las jeringas en las bombas de jeringa y utilice adaptadores Luer-to-MicroTight para conectar el tubo PEEK (diámetro interno de 150 μm) a las jeringas. Inserte el tubo en el tubo de la centrífuga que contiene la solución de semillas de Au en el termomezclador.
    4. Ajuste ambas bombas de jeringa para dispensar 0,1675 ml de solución durante 20 min (8,357 μL por minuto).
    5. Ajuste la velocidad de rotación del termomezclador a 700 rpm y pulse Start en la bomba de jeringa que contiene la solución HAuCl4 de 25 mM.
    6. Después de 2 min, presione Start en la bomba de la jeringa que contiene la solución de citrato de sodio de 60 mM.
    7. 30 min después de iniciar la inyección de solución de HAuCl4 , retire una alícuota de la solución au np para su análisis.
    8. Repita los pasos 1.3.5 – 1.3.7 para aumentar gradualmente el diámetro de los NP au hasta 40 nm.
      NOTA: Esta configuración se puede utilizar para aumentar au nps de hasta 40 nm en un solo paso aumentando el volumen de reactivos añadidos en el paso 1.3.4. Esto se logra aumentando el tiempo de dispensación mientras se mantiene la misma tasa de inyección.

2. Caracterización de los NP de Au

  1. Espectroscopia UV-Vis
    1. Agregue 1 ml de la solución Au NP a una cubeta de cuarzo semi-micro.
    2. Encienda el espectrómetro.
    3. Establezca el rango de longitud de onda en 400 - 800 nm.
    4. Adquirir el espectro UV-Vis para cada muestra.
  2. Dispersión dinámica de luz (DLS)
    1. Filtre la solución de muestra en una cubeta semi-micro de plástico con un filtro de 0,22 μm.
    2. Encienda el instrumento DLS.
    3. Ajuste la temperatura a 25 °C y equilibre durante 60 s.
    4. Medir el tamaño hidrodinámico de cada muestra.
  3. Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
    1. Vierta una gota de 5 μL de la solución de muestra sobre una rejilla de Cu de 300 mallas recubierta en C y séquela al aire.
      NOTA: La dilución es necesaria para muestras de solución de Au NP más concentradas para obtener NP de Au bien dispersas en una cuadrícula TEM.
    2. Adquiera múltiples imágenes TEM para cada muestra utilizando un TEM a un voltaje de aceleración de 200 kV.
    3. Mida el diámetro de 200 Au NP para cada muestra utilizando ImageJ para calcular el tamaño promedio y la desviación estándar.

3. Formación de complejos CB7-UA

  1. Preparación de la solución CB7 de 0,4 mM
    1. Añadir 4,65 mg de CB7 a un vial de vidrio de 15 ml.
      NOTA: La cantidad de CB7 se calcula en base a la fórmula de peso de CB7 (= 1163 Da) que ha sido empleada por la mayoría de los informes en la literatura. Sin embargo, las muestras sólidas CB7 generalmente contienen agua, HCl, metanol y otras sales que quedan de los pasos de síntesis y purificación, lo que contribuye a ~ 10 – 20% de peso muerto en la muestra. Los disolventes y sales atrapados no se podían eliminar calentando en un horno de vacío u otros medios. Sus cantidades varían entre diferentes lotes de muestras, pero se pueden cuantificar mediante análisis elementales. Sin embargo, el protocolo presentado no es sensible a la presencia de cantidad no cuantificada de disolventes y sales en las muestras de CB7.
    2. Agregue 10 ml de agua al vial y apriete la tapa.
    3. Sonicar la muestra a temperatura ambiente hasta que el sólido CB7 se disuelva por completo.
      NOTA: CB7 fue sintetizado de acuerdo con la literatura27 , pero también está disponible comercialmente.
  2. Preparación de la solución UA de 0,4 mM
    1. Añadir 2,69 mg de UA a un tubo centrífugo de 50 ml.
    2. Agregue 40 ml de agua al tubo y apriete la tapa.
    3. Utilice un termomezclador para girar la solución de muestra ajustando la temperatura a 70 °C, la velocidad a 800 rpm y el tiempo a 2 h. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente.
      NOTA: LA UA tiene una baja solubilidad en agua (0,40 mM)5. Girar durante más tiempo si el polvo de UA no se ha disuelto por completo. Alternativamente, la ultrasonicación se puede utilizar para facilitar la disolución.
  3. Diluciones secuenciales de la solución UA de 0,4 mM
    1. Diluya 5 ml de la solución de UA de 0,4 mM con 5 ml de agua en un vial de vidrio de 15 ml para dar 10 ml de solución de UA de 0,2 ml. Apriete la tapa y sonice durante 30 s.
    2. Repita el paso 3.3.1 utilizando una cantidad adecuada de AU y agua como se describe en la Tabla 1.
  4. Preparación de los complejos CB7-UA
    1. Añadir 0,75 ml de la solución CB7 de 0,4 mM y 0,75 ml de solución UA de 0,4 mM en un tubo de 1,5 ml. Asegure la tapa y sonice durante 30 s.
    2. Espere 30 minutos para garantizar la formación de complejos anfitrión-huésped.
    3. Repita el paso 3.4.1 – 3.4.2 utilizando una solución de UA de diferentes concentraciones.

4. Detección SERS de UA

  1. Configuración experimental del sistema Raman (Figura 3)
    1. Encienda el láser He-Ne de 633 nm (22,5 mW).
    2. Encienda el espectrómetro Raman modular.
    3. Encienda la computadora e inicie el software.
    4. Haga clic en el icono Asistentes de aplicación de espectroscopia y, a continuación, seleccione Raman.
    5. Iniciar una nueva adquisición. Establezca el tiempo de integración en 30 s, los escaneos en promedio en 5 y boxcar en 0.
    6. Almacene el espectro de fondo e ingrese la longitud de onda del láser (es decir, 633 nm).
      NOTA: El tiempo de integración es el tiempo para cada escaneo, los escaneos al promedio es el número de escaneos promediados para crear cada espectro y boxcar es el número de píxeles vecinos promediados28.
  2. Formación de los sustratos SERS
    1. Añadir 0,9 mL de la solución NP au de 40 nm y 0,1 ml de la solución compleja CB7-UA preformada en un tubo de 1,5 ml. Asegure la tapa y sonice hasta que la solución cambie de rojo rubí a púrpura.
      NOTA: También se pueden utilizar muestras comerciales de solución np de 40 nm au estabilizadas con citrato. Por lo general, la densidad óptica del pico de resonancia de plasmón de superficie localizada (LSPR) se ajusta a 1 a través de la dilución a partir de muestras de solución madre concentrada. La concentración de citrato en la muestra se mantiene típicamente como 2 mM.
    2. Transfiera la solución de muestra a una cubeta semi-micro. Coloque la cubeta en el portamuestras Raman y cierre la tapa.
    3. Inicie la medición.
    4. Configure el guardado automático para registrar cinco espectros SERS consecutivos.
    5. Detenga la medición y cambie la muestra.
    6. Repita el paso 4.2.1 – 4.2.5 usando una solución CB7-UA de diferentes concentraciones.
      NOTA: Se encuentra que el tiempo de agregación depende de la concentración de UA en los nanoagregados, que van desde 30 s para 0,1 μM UA hasta 30 min para 20 μM UA, debido a la diferencia en la concentración de CB7 vacío que tiene una contribución importante a la mediación de la agregación de Au NP. Para el complejo CB7-UA, un portal está bloqueado por la voluminosa molécula ua, lo que hace que no esté disponible para unirse a la superficie Au NP y, por lo tanto, no pueda mediar la agregación NP21. La muestra está lista para la medición cuando el color de la solución cambia de rojo rubí a púrpura.

5. Análisis de datos

  1. Procesamiento de datos
    1. Descargue e instale la línea de base con el complemento de mínimos cuadrados asimétricos (ALS) en Origin.
      NOTA: El plugin ALS requiere OriginPro.
    2. Inserte los datos sin procesar en Origin.
    3. Calcule un valor promedio a partir de los cinco espectros SERS de cada muestra. Divida el valor por la potencia del láser (es decir, 22,5 mW) y por el tiempo de integración (es decir, 30 s).
    4. Haga clic en el icono als para abrir el cuadro de diálogo. Establezca el factor asimétrico en 0,001, el umbral en 0,03 %, el factor de suavizado en 2 y el número de iteraciones en 20 para corregir la línea de base de cada espectro promediado.
    5. Grafique los espectros SERS de diferentes concentraciones de UA utilizando líneas apiladas por y compensaciones. La salida debe ser de intensidad (cuenta s-1 mW-1) contra el desplazamiento Raman (cm-1).

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Representative Results

En la síntesis au np presentada, los espectros UV-Vis muestran un cambio de los picos LSPR de 521 nm a 529 nm después de 10 pasos de crecimiento (Figura 4A, B), mientras que los datos DLS muestran una distribución de tamaño estrecha a medida que el tamaño de au NP aumenta de 25.9 nm a 42.8 nm (Figura 4C, D). Los tamaños promedio de G0, G5 y G10 medidos a partir de imágenes TEM (Figura 4E) son 20.1 ± 2.1 nm, 32.5 ± 2.3 nm y 40.0 ± 2.2 nm respectivamente, con 200 partículas contadas en cada caso. Estos resultados indican que este protocolo es eficaz en la síntesis de NP de Au uniformes y estrechamente dispersas.

En los estudios SERS presentados, se formaron complejos huésped-huésped de CB7 y UA con CB7 vacío mediando la formación de nanouniones plasmónicas precisas dentro de los nanoagregados Au NP: CB7, apoyados por las señales características de UA en el espectro SERS (Figura 5A).

Las asignaciones para los picos Raman de CB (marcado por +) y UA (marcado por *) se muestran en la Tabla 2. Por el contrario, no se pueden observar señales SERS de UA en ausencia de CB7, lo que ilustra el papel clave de CB7 en el desencadenamiento de la agregación de Au NP.

Se utilizó una concentración constante de CB7 de 20 μM en la titulación SERS de UA para asegurar la formación in situ de nanoestructuras plasmónicas reproducibles (es decir, sustratos SERS). La alta sensibilidad del esquema de detección presentado en este protocolo se demostró mediante la observación de señales SERS claras de los picos de UA a 640 cm-1 y 1130 cm-1 (atribuidas a la deformación del anillo esquelético y la vibración C-N respectivamente) hasta ~ 0.2 μM (Figura 5B−D), lo que se conoce como el límite de detección. Además, se obtuvieron correlaciones muy fuertes (R2 > 0,98) entre la intensidad serS y la concentración logarítmica de UA por ley de potencia para ambos picos, con regiones lineales encontradas en el rango de 0,2 a 2 μM (Figura 5E,F). Cabe señalar que las correlaciones lineales entre la intensidad del SERS y la concentración logarítmica pueden aproximarse para un rango estrecho de concentraciones de analitos, mientras que la señal SERS se acerca a 0 cuando la concentración logarítmica se acerca al infinito negativo (es decir, la concentración de analitos se acerca a 0), como se observa en nuestros datos. Las señales SERS también son altamente reproducibles, como lo demuestran las pequeñas barras de error que se muestran en la Figura 5E, F.

Figure 1
Figura 1: Ilustración esquemática de las nanouniones plasmónicas precisas dentro de Au NP autoensamblado: nanoagregados CB7. El recuadro muestra un zoom de las nanouniones plasmónicas donde la agregación está mediada por CB7 vacío, mientras que la UA se enriquece en la superficie de Au NP a través de la complejación huésped-huésped. Cabe señalar que el plan no se ajusta a escala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: (a) Ilustración esquemática y (b) fotografía del sintetizador Au NP automatizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Ilustración esquemática del sistema Raman. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Caracterización representativa de los NP de Au. (A) Espectros UV-Vis de Au NP y (B) espectros de zoom que muestran el desplazamiento de los picos LSPR a medida que el número de pasos de crecimiento aumenta a 10. (C) Tamaño hidrodinámico de Au NP y (D) diagrama correspondiente de tamaño de partícula en función del número de pasos de crecimiento. (E) Imágenes TEM de Au NP, que muestran tamaños de semillas Au y Au NP después de 5 y 10 pasos de crecimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Resultados SERS representativos de la detección de UA dentro de Au NP: nanoagregados CB7. (A) Espectros SERS de UA en presencia o ausencia de CB7. Los picos Raman de CB7 y UA están marcados por + y * respectivamente. (B) Rango completo, (C) 600 - 700 cm-1 zoom-in y (D) 1100 - 1180 cm-1 zoom-in espectros SERS de UA con concentraciones de 0 a 20 μM. Los principales picos Raman de UA están marcados por *. Los espectros se corrigieron de referencia y se desplazaron para mayor claridad. (E,F) Gráficos correspondientes de la intensidad máxima del SERS contra la concentración de UA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Conc. de solución madre ua (μM) Vol. de solución madre ua añadida (mL) Vol. de agua añadida (ml) Conc. de nueva solución madre de UA (μM)
400 5 5 200
200 5 5 100
100 4 6 40
40 5 5 20
20 5 5 10
10 4 6 4
4 5 5 2

Tabla 1: Diluciones secuenciales de solución de UA.

CB7 UA
Pico SERS (cm-1) Asignación máxima Pico SERS (cm-1) Asignación máxima
446 Modo de tijera de anillo 491 Vibración del anillo C-N-C
831 Deformación del anillo 640 Deformación del anillo esquelético
1375 Estiramiento simétrico de C-N 896 Flexión N-H
1420 Estiramiento asimétrico de C-N 1020 Vibración del anillo
- - 1130 Vibración C-N
- - 1202 Estiramiento y flexión N-C-C

Tabla 2: Asignaciones para los picos Raman de CB7 y UA 2,4,29.

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Discussion

El método de síntesis automatizada descrito en el protocolo permite sintetizar de forma reproducible Au NP de tamaños crecientes. Aunque hay algunos elementos que aún deben llevarse a cabo manualmente, como la adición rápida de citrato de sodio durante la síntesis de semillas y la verificación periódica para garantizar que el tubo PEEK sea seguro, este método permite Au NP de grandes tamaños (hasta 40 nm), que generalmente requerirían múltiples inyecciones manuales de HAuCl4 y citrato de sodio, para ser sintetizado a través de la adición continua durante un largo período de tiempo.

Se puede realizar una caracterización adicional para dilucidar la propiedad fundamental de los complejos CB. Por ejemplo, la formación de complejos huésped-huésped se puede confirmar típicamente utilizandola resonancia magnética nuclear (RMN) 1 H, que debería mostrar un desplazamiento hacia arriba y una ampliación de las señales en caso de complejación 21,22,25. Sin embargo, la RMN 1H no es aplicable a la AU debido a su falta de protones no intercambiables. También se podrían emplear técnicas alternativas como la RMN de 13C y la espectrometría de masas para caracterizar la complejación. Las constantes de unión entre CB7 y UA se pueden medir mediante técnicas de titulación, como la titulación por espectroscopia UV-Vis y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC)21,22,25. Mientras tanto, se puede calcular el modelado molecular basado en modelos de teoría funcional de fuerza-campo y densidad (DFT) para obtener información teórica sobre la geometría de unión de los complejos huésped-huésped 21,22,25,29. Además, los espectros IR y Raman se pueden calcular mediante cálculos de frecuencias 21,25,29.

SERS es una técnica analítica altamente sensible y selectiva que permite la identificación de analitos traza a través de sus huellas dactilares vibratorias específicas de la molécula. SERS está ganando interés en diferentes disciplinas científicas, en particular estudios biomédicos, debido a sus señales muy mejoradas, tiempo de adquisición mucho más corto y alta tolerancia al agua líquida (adecuada para la detección en biofluidos)30,31,32,33,34,35. A diferencia de informes anteriores sobre la detecciónde UA 1,2,3,4,36,37, la estructura rígida de CB7 define un espaciado preciso de 0,9 nm entre Au NP a través de la unión al portal de carbonilo, mientras que el CB7 unido a la superficie puede atrapar moléculas de UA dentro de su cavidad (Figura 1 ), dando lugar a puntos calientes plasmónicos fuertes y localizados, y por lo tanto a las señales SERS altamente sensibles (hasta ~ 0,2 μM) y reproducibles (dentro del 2% de error) de UA con correlaciones muy fuertes (R2 > 0,98) entre la intensidad SERS y la concentración logarítmica (Figura 5).

En un intento de optimizar la concentración de CB7, observamos que se utilizó 20 μM CB7 para asegurar la formación de sustratos SERS reproducibles. En particular, la concentración absoluta de CB7 utilizada depende del sistema global (es decir, Au NP, analitos y moléculas de fondo, si las hubiera)18,22. Se debe utilizar una concentración más alta de CB7 si la agregación de Au NP es demasiado lenta. Por el contrario, se debe utilizar una concentración más baja de CB7 si la solución de muestra precipita rápidamente y conduce a ventanas de medición más cortas. Se espera que la agregación de Au NPs mediada por CB7 en nuestro entorno experimental siga la cinética de agregación coloidal limitada por difusión (DLCA)19, en la que las estructuras abiertas y alargadas en forma de cadena se formaron rápidamente inicialmente antes de unirse como red cuasi-fractal. La cinética DLCA generalmente ocurre en una alta relación CB: Au NP (por número), que es igual a 106: 1 en nuestro caso. Cabe señalar que el ácido úrico está presente en los fluidos corporales (por ejemplo, suero sanguíneo, orina) a una concentración más alta. Por ejemplo, la concentración normal de ácido úrico es de 3,5 – 7,0 mg/dL en suero sanguíneo38 y 16 – 100 mg/dL en orina2 respectivamente (la concentración por encima o por debajo de la concentración normal se conoce como hiperuricemia e hipouricemia)39. Por lo tanto, solo se necesita una cantidad muy pequeña de muestra para la detección de biomarcadores en este esquema altamente sensible donde se utiliza un alto factor de dilución para reducir la concentración de la muestra a un rango adecuado. Esto es particularmente importante para el monitoreo en el punto de atención de pacientes con enfermedades terminales cuya excreción de orina es muy baja. Las muestras altamente diluidas dan como resultado mayores volúmenes de muestra y, por lo tanto, reducen los errores en la cuantificación de biomarcadores debido a la evaporación del agua y la pérdida de muestras debido a la transferencia de líquidos, al tiempo que brindan otras ventajas, incluida la minimización de los efectos de la matriz25. Debido a la naturaleza selectiva de este método de sondeo, se limita a moléculas de analito que pueden formar complejos huésped-huésped con CB. Cabe señalar que es posible observar interferencias de otras moléculas porque cb puede unirse a diferentes moléculas invitadas. Sin embargo, la purificación de muestras, como la electroforesis en gel y la HPLC, se puede realizar antes de la medición de SERS.

El esquema de detección demostrado en este protocolo tiene el potencial de detección multiplexada de biomarcadores en una matriz compleja para aplicaciones clínicas cuando se acopla a técnicas avanzadas de análisis de datos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

TCL agradece el apoyo de la Royal Society Research Grant 2016 R1 (RG150551) y el UCL BEAMS Future Leader Award financiado a través del premio de Patrocinio Institucional por el EPSRC (EP/P511262/1). WIKC, TCL e IPP agradecen la beca financiada por el Programa de Vinculación a la Investigación A*STAR-UCL a través del EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1). GD y TJ desean agradecer al EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1) por patrocinar su beca. TJ y TCL reconocen a Camtech Innovations por su contribución a la matrícula estudiantil de TJ. Todos los autores están agradecidos con el Fondo de Acceso Abierto de UCL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40 nm gold nanoparticles NanoComposix AUCN40-100M NanoXact, 0.05 mg/ mL, bare (citrate)
Centrifuge tube Corning Falcon 14-432-22 50 mL volume
Cucurbit[7]uril Lab-made see ref. 19
Gold(III) chloride trihydrate Sigma aldrich 520918 ≥99.9% trace metals basis
Luer lock disposable syringe Cole-Parmer WZ-07945-15 3 mL volume
Luer-to-MicroTight adapter LuerTight P-662 360 μm outer diameter Tubing to Luer Syringe
PEEK tubing IDEX 1572 360 μm outer diameter, 150 μm inner diameter
PEEK tubing cutter IDEX WZ-02013-30 Capillary Polymer Chromatography Tubing Cutter For 360 µm to 1/32" OD tubing
Raman spectrometer Ocean Optics QE pro
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma aldrich S4641 ACS reagent, ≥99.0%
Sonicator
Standard Probe Digi-Sense WZ-08516-55 Type-K
Syringe pump Aladdin ALADDIN2-220 2 syringes, maximum syringe volume 60 mL
Thermocouple thermometer Digi-Sense WZ-20250-91 Single-Input Thermocouple Thermometer with NIST-Traceable Calibration
ThermoMixer Eppendorf 5382000031 With an Eppendorf SmartBlock for 50 mL tubes
Uric acid Sigma aldrich U2625 ≥99%, crystalline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Química Número 164 Nanopartículas de oro sintetizador automatizado cucurbitácea, complejación huésped-huésped autoensamblaje espectroscopia Raman mejorada en superficie sensor biomarcadores diagnóstico de enfermedades
Detección cuantitativa de SERS de ácido úrico a través de la formación de nanouniones plasmónicas precisas dentro de agregados de nanopartículas de oro y cucurbitáceas<em></em>
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Chio, W. I. K., Davison, G., Jones,… More

Chio, W. I. K., Davison, G., Jones, T., Liu, J., Parkin, I. P., Lee, T. C. Quantitative SERS Detection of Uric Acid via Formation of Precise Plasmonic Nanojunctions within Aggregates of Gold Nanoparticles and Cucurbit[n]uril. J. Vis. Exp. (164), e61682, doi:10.3791/61682 (2020).

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