Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering af gentagne møder med en antigenmærket blokerende læsion

Published: July 27, 2021 doi: 10.3791/61689
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1, 4, 5, 6, 1, 1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, 5Horizon Discovery, 6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Mens replikationsgaffelkollisioner med DNA-addukter kan fremkalde dobbeltstrengsbrud, er der mindre kendt om interaktionen mellem replisomer og blokerende læsioner. Vi har anvendt nærhedsligationsanalysen til at visualisere disse møder og til at karakterisere konsekvenserne for replikerende sammensætning.

Abstract

Der er betydelig indsigt i det cellulære respons på dobbeltstrengsbrud (DSB'er), induceret af nukleaser, stråling og andre DNA-brydere. Dette afspejler til dels tilgængeligheden af metoder til identifikation af pausesteder og karakterisering af faktorer, der rekrutteres til DSB'er ved disse sekvenser. DSB'er fremstår imidlertid også som mellemprodukter under behandlingen af DNA-addukter dannet af forbindelser, der ikke direkte forårsager brud og ikke reagerer på bestemte sekvenssteder. For de fleste af disse midler er teknologier, der tillader analyse af bindende interaktioner med responsfaktorer og reparationsproteiner, derfor ukendte. For eksempel kan DNA-interstrengede tværbindinger (ICL'er) fremkalde brud efter replikationsgaffelmøder. Selvom de er dannet af lægemidler, der i vid udstrækning anvendes som kræftkemoterapeutika, har der ikke været nogen metode til overvågning af deres interaktioner med replikationsproteiner.

Her beskriver vi vores strategi for at følge den cellulære reaktion på gaffelkollisioner med disse udfordrende addukter. Vi forbandt et steroidantigen til psoralen, som danner fotoaktiveringsafhængige ICL'er i kerner i levende celler. ICL'erne blev visualiseret ved immunofluorescens mod antigenmærket. Mærket kan også være en partner i Proximity Ligation Assay (PLA), som rapporterer den tætte tilknytning af to antigener. PLA blev udnyttet til at skelne proteiner, der var tæt forbundet med de mærkede ICL'er fra dem, der ikke var. Det var muligt at definere replisome proteiner, der blev tilbageholdt efter møder med ICL'er og identificere andre, der gik tabt. Denne tilgang gælder for enhver struktur eller DNA-addukt, der kan detekteres immunologisk.

Introduction

Det cellulære respons på dobbeltstrengsbrud er veldokumenteret på grund af en række stadig kraftigere metoder til at dirigere brud til specifikke genomiske steder 1,2,3. Sikkerheden for placering muliggør entydig karakterisering af proteiner og andre faktorer, der akkumuleres på stedet og deltager i DNA Damage Response (DDR) og derved driver de ikke-homologe endesammenføjning (NHEJ) og homologe rekombinationsveje (HR), der reparerer brud. Selvfølgelig introduceres mange pauser af stoffer som stråling og kemiske arter, der ikke angriber specifikke sekvenser4. For disse er der dog tilgængelige procedurer, der kan konvertere enderne til strukturer, der kan mærkes og lokaliseres 5,6. Pauser introduceres også ved biologiske processer, såsom immunoglobulinomlægning, og nyere teknologi tillader også deres lokalisering7. Forholdet mellem responsfaktorer og disse steder kan derefter bestemmes.

Brud vises også som en indirekte konsekvens af addukter dannet af forbindelser, der ikke er iboende brydere, men forstyrrer DNA-transaktioner såsom transkription og replikation. De kan dannes som et træk ved det cellulære respons på disse forhindringer, måske under reparation eller fordi de fremkalder en struktur, der er sårbar over for nukleaseangreb. Typisk er det fysiske forhold mellem addukten, pausen og sammenhængen med responsfaktorer inferentiel. For eksempel dannes ICL'er af kemoterapeutika, såsom cisplatin og mitomycinC8 og som et reaktionsprodukt af abasiske steder9. ICL'er er velkendte som potente blokke til replikationsgafler10, hvorved gafler, der kan spaltes af nukleaser11, standses. Den kovalente forbindelse mellem tråde lettes ofte af veje, der har obligatoriske brud som mellemprodukter 12,13, hvilket nødvendiggør homolog rekombination for at genopbygge replikationsgaflen14. I de fleste eksperimenter følger forskeren reaktionen af faktorer af interesse på de brud, der dannes nedstrøms for kollisionen af en replikationsgaffel med en ICL. Men fordi der ikke har været nogen teknologi til lokalisering af en provokerende læsion, kan nærheden af replisomet og dets komponenter til ICL kun antages.

Vi har udviklet en strategi for at muliggøre analyse af proteinforbindelser med ikke-sekvensspecifikke kovalente addukter, illustreret her af ICL'er. I vores system introduceres disse af psoralen, et fotoaktivt naturprodukt, der har været brugt i tusinder af år som terapeutisk behandling af hudlidelser15. Vores tilgang er baseret på to vigtige træk ved psoralens. Den første er deres høje frekvens af tværbindingsdannelse, som kan overstige 90% addukter, i modsætning til de mindre end 10% dannet af populære forbindelser som cisplatin eller Mitomycin C 8,16. Den anden er forbindelsens tilgængelighed til konjugering uden tab af tværbindingskapacitet. Vi har kovalent forbundet trimethylpsoralen med Digoxigenin (Dig), et længe etableret immunmærke. Dette muliggør påvisning af psoralen-addukterne i genomisk DNA ved immunfarvning af Dig-mærket og visualisering ved konventionel immunfluorescens17.

Dette reagens blev anvendt i vores tidligere arbejde til analyse af replikationsgaffelmøder med ICL'er ved hjælp af et DNA-fiberbaseret assay16. I dette arbejde fandt vi, at replikation kunne fortsætte forbi en intakt ICL. Dette var afhængigt af ATR-kinasen, som aktiveres af replikationsstress. Replikationsgenstarten var uventet i betragtning af strukturen af CMG-replikativ helicase. Dette består af MCM hetero-hexamer (M), der danner en forskudt gapped ring omkring skabelonstrengen til førende strengsyntese, som er låst af proteinerne i GINS-komplekset (G, bestående af PSF1, 2, 3 og SLD5) og CDC45 (C) 18. Forslaget om, at replikation kunne genstarte på siden af ICL-distalen til siden af den replikomiske kollision, argumenterede for en ændring i replisomets struktur. For at løse spørgsmålet om, hvilke komponenter der var i replisome på tidspunktet for mødet med en ICL, udviklede vi den tilgang, der er beskrevet her. Vi udnyttede Dig-tagget som partner i Proximity Ligation Assays (PLA)19 til at forhøre ICL's tætte tilknytning til proteiner fra replisome20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Celle forberedelse

  1. Dag 1
    1. Forbehandle 35 mm glasbundede kulturskåle med en celleklæbemiddelopløsning.
    2. Plade celler i de forbehandlede retter en dag før behandlingen. Cellen skal være aktivt dividere og 50-70% sammenflydende på forsøgsdagen.
      BEMÆRK: HeLa-celler blev brugt i dette forsøg med Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1x penicillin / streptomycin. Der er ingen begrænsning for klæbende cellelinjer. Ikke-klæbende celler skal dog centrifugeres på dias og fastgøres inden analysen af PLA.
  2. Dag 2
    1. Der fremstilles en stamopløsning af Digoxigenin-trimethylpsoralen (Dig-TMP) ved at resuspendere en frossen prøve af tidligere syntetiseret Dig-TMP i 1:1 EtOH:H2O. Koncentrationen af en 100x fortynding (iH2O) af den opløste Dig-TMP bestemmes ved måling af OD ved 250 nm. Udryddelseskoefficienten for Dig-TMP er 25.000. Koncentrationen kontrolleres ved måling af OD ved 250 nm før hver brug, og stamkoncentrationen beregnes: Abs x 100 x 106/25.000 = Koncentration (i μM). Generelt er stamopløsningen omkring 3 mM. Opløsningen kan opbevares i –20 °C i ca. en måned.
      BEMÆRK: Dig-TMP skal syntetiseres kemisk på forhånd efter proceduren beskrevet her. Refluks 4'-chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen med 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amin i toluen under nitrogen i 12 timer. Opløsningsmidlet fjernes, og 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)]-aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralenproduktet genvindes ved silicagelkromatografi. Produktet konjugeres med digoxigenin NHS-ester i dimethylformamid og triethylamin ved 50 °C i 18 timer. Fjern opløsningsmidlet og oprens resten ved præparativ tyndlags silicagelkromatografi. Eluer produktbåndet chloroform: methanol: 28% ammoniumhydroxid (8:1:0.1) blanding. Opløsningsmidlerne inddampes og pelleten opløses i 50% EtOH:H2O.
    2. Der tilsættes Dig-TMP-materiale i 50 % EtOH:H2O til cellekulturmediet til en slutkoncentration på 5 μM. Substratet bringes op på 37 °C. Opsug mediet fra pladerne, tilsæt det forvarmede Dig-TMP-holdige medie, og læg pladerne i en inkubator (37 °C, 5% CO2) i 30 minutter for at lade Dig-TMP ekvilibrere.
    3. Mens cellerne inkuberer, forvarmes UV-boksen (se materialetabellen) til 37 °C.
    4. Placer pladerne i den forvarmede UV-boks og udsæt cellerne for en dosis på 3 J /cm 2 UVA-lys i 5 minutter til dette eksperiment. Pladerne blev anbragt oven på en termoblok, der blev holdt på 37 °C under bestrålingen. Beregn tiden ved hjælp af formlen:
      Equation 1
    5. Substratet suges til ved hjælp af en pipette, tilsættes friskt forvarmet substrat, og pladerne anbringes tilbage i inkubatoren ved 37 °C, 5 % CO2 i 1 time.
    6. Fjern mediet og vask opvasken en gang forsigtigt med fosfatbufret saltvand (PBS).
    7. PBS fjernes og tilsættes 0,1% formaldehyd (FA) i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Dette forhindrer cellefrigørelse under CSK-R (cytoskeletekstraktionsbuffer indeholdende RNase, beskrevet i 1.2.9.) forbehandling, der kræves for at ekstrahere de cytoplasmatiske elementer og reducere PLA-baggrund.
    8. Opsug FA og vask op med PBS én gang.
    9. Tilsæt CSK-R-buffer og inkuber i 5 minutter ved RT for at fjerne cytoplasma [CSK-R-buffer: 10 mM PIPES, pH 7,0, 100 mM NaCl, 300 mM saccharose, 3 mM MgCl2, 0,5% Triton X-100, 300 μg / ml RNase A]. Opsug bufferen, tilsæt frisk CSK-R, og inkuber i 5 minutter ved RT.
      BEMÆRK: Et lager af CSK-buffer kan opbevares ved 4 °C, og Triton X og RNaseA tilføjes lige før brug.
    10. Vask med PBS tre gange.
    11. Fix celler med 4% formaldehyd i PBS i 10 min ved RT.
    12. Vask celler med PBS. Udfør dette trin tre gange.
    13. Tilsæt kold 100% methanol og inkuber i 20 minutter ved -20 °C.
    14. Vask celler med PBS tre gange. På dette tidspunkt kan celler opbevares i PBS i et fugtigt kammer ved 4 °C i op til en uge.
    15. Inkuber celler i 80 μL 5 mM TritonX-100 i 10 minutter ved 4 °C.
    16. Inkubere celler med 100 μL 5 mM EDTA i PBS suppleret med 1 μL 100 mg/ml RNase A i 30 minutter ved 37 °C.
    17. Vask celler med PBS tre gange.
    18. Opbevar celler i blokerende buffer (5% BSA og 10% gedeserum i PBS) i et fugtigt kammer natten over ved 4 °C.

2. Analyse af nærhedsligering

BEMÆRK: Udfør nærhedsligeringsanalyse på dag 3.

  1. Antistof farvning
    1. Der fremstilles 40 μL af den primære antistofopløsning pr. plade: Der tilsættes den passende mængde primære antistoffer for at opnå den ønskede fortynding (museanti-digoxigenin og kaninantistof mod en replisom komponent såsom MCM5, CDC45, PSF1 eller pMCM2, fortyndinger specificeret i materialetabellen) i blokerende buffer (for at nå et slutvolumen på 24 μL). Bland ved at tappe og lad det stå i 20 minutter ved RT. Forbered en masterblanding til flere prøver og bland ved at banke, før du påfører brøndene.
    2. Der tilsættes 40 μL primær antistofopløsning til midten af brønden og inkuberes i et fugtigt kammer i 1 time ved 37 °C. Lad PLA-sonderne og blokeringsbufferen varme op til stuetemperatur under farvning.
    3. Vask celler med PBS-T [PBS-T: 0,05% Tween-20 i 1X PBS] ved RT. Udfør dette trin tre gange.
    4. Under vask skal du forberede 40 μL PLA-sondeopløsning pr. Skål (PLA-sonder består af et sekundært antistof, der genkender enten kanin eller mus IgG, kovalent bundet til et PLUS- eller MINUS oligonukleotid): 8 μL PLA-sondeantimus-PLUS + 8 μL PLA-sondeantikanin-MINUS-antistof + 24 μL blokerende buffer. Bland og lad det stå i 20 minutter ved RT. Forbered en masterblanding til flere prøver og bland godt, inden den påføres hullerne. Placer opløsningen midt i brønden i pladen.
    5. Den sidste vask fjernes, der tilsættes 40 μL PLA-sondeopløsning til midten af brønden, og der inkuberes i et fugtigt kammer i 1 time ved 37 °C.
    6. Vask i buffer A tre gange i 10 minutter hver på en vippeplatform på RT. Under vask bringes ligeringsblandingen til RT.
  2. Ligering og forstærkning
    1. Forbered 40 μL ligeringsblanding pr. plade: 8 μL (5x) ligeringsmateriale + 31 μL destilleret vand + 1 μL ligase. Forbered masterblandingen til flere plader og bland godt, inden den påføres brøndene.
    2. Der tilsættes 40 μL ligeringsopløsning til hver plade og inkuberes i et fugtigt kammer i 30 minutter ved 37 °C.
    3. Vask cellerne 3x med buffer A, hver i 2 min, på en vippeplatform ved RT.
    4. Forbered 40 μL amplifikationsopløsning pr. skål: 8 μL (5x) amplifikationsmateriale + 31,5 μL destilleret vand + 0,5 μL DNA-polymerase. Forbered en masterblanding til flere prøver og bland godt, inden den påføres brøndene.
    5. Der tilsættes 40 μL amplifikationsopløsning til hver plade, og der inkuberes i et fugtigt kammer ved 37 °C i 100 minutter.
    6. Opsug forstærkningsopløsningen og vask med buffer B. Udfør 6 vaske hver i 10 minutter på en vippeplatform ved RT.
    7. Vask én gang med 0,01x buffer B i 1 min ved RT.
    8. Aspiratbuffer B og inkuber plader med sekundære antistoffer, Alexa Fluor 488 anti-mus IgG og Alexa Fluor 568 antikanin IgG i blokerende opløsning ved passende fortyndinger i blokerende buffer i et fugtigt kammer i 30 minutter ved 37 °C eller natten over ved 4 °C.
    9. Vask celler tre gange med PBS-T, i 10 minutter hver på en vippeplatform på RT.
    10. Aspirer PBS-T og monteres i monteringsmedium med DAPI. De monterede plader kan fotograferes med det samme eller opbevares ved 4 °C i mørke i højst 4 dage før billeddannelse.

3. Billeddannelse og kvantificering

  1. Udfør billeddannelse i et epifluorescerende eller konfokalmikroskop (hvis 3D-billeddannelse er ønskelig, skal du dække mindst 3 μm i 15 stakke). Udfør eksperimenter i tre eksemplarer og billede nok antal felter til at foretage mindst 100 observationer pr. prøve eller tilstand. Afbild alle felter og eksempler, herunder kontrolelementer, med de samme eksponeringsindstillinger.
  2. Kvantificer med en passende billedanalysesoftware (se materialefortegnelse for open source og kommerciel software, der er i stand til at udføre denne analyse i enkelt- eller flerplanbilleder).
    1. Segmenter cellekerner baseret på DAPI-farvning. Udfør detektion af nukleare PLA-prikker. Tildel PLA-prikker til deres tilsvarende kerne. Eksportér PLA-punkter pr. kerne som en csv-fil (se Supplerende fil 1 og Supplerende fil 2).
  3. Statistisk analyse (se Materialetabel for foreslået open source og kommerciel software).
    1. Kontroller, om prøverne følger en normalfordeling med en Shapiro-Wilk-test.
    2. Find ud af, om der er en signifikant forskel mellem to stikprøver ved hjælp af en Student-t-test (hvis antagelsen om normalfordeling er opfyldt) eller en Wilcoxon-Rank Sum-test (hvis antagelsen om normalfordeling ikke overholdes for en stikprøve).
  4. Datavisualisering: Generer prikplots kombineret med boksplots for at visualisere datadistribution, median (Q2), 25. (Q1) og 75. percentil for de forskelligeprøver (Se materialetabel for foreslået open source og kommerciel software).

4.3D visning af pMCM2: ICL-interaktioner

  1. Billede PLA plader på en roterende disk konfokal mikroskop, ved hjælp af en Plan Fluor 60x / 1.25 numerisk blænde olie mål. Anskaf 16 stakke, der dækker 1,6 mm, og generer 3D-rekonstruktionen med den relevante billedanalysesoftware (se materialetabel).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PLA af Dig-TMP med replisomproteiner
Strukturen af Dig-TMP er vist i figur 1. Detaljerne i syntesen, hvor trimethylpsoralen blev konjugeret gennem en glycollinker til digoxigenin, er tidligere blevet diskuteret17,21. Inkubation af celler med forbindelsen efterfulgt af eksponering for 365 nm lys (UVA) fotoaktiverer forbindelsen og driver tværbindingsreaktionen. Lidt over 90% af addukterne er ICLs16. Dig-mærket kan visualiseres ved immunofluorescens, som afslører tilstedeværelsen af ICL'er i hele kernen (figur 2). Immunofluorescens af et replisom protein såsom MCM2 indikerer også en fordeling gennem kernen, en fordeling, der ikke påvirkes af introduktionen af ICL'er. Disse resultater viste, at det fokale udseende af responderende proteiner, som det ses i DNA Damage Response (DDR) til DSB'er, ikke er et træk ved replisome: ICL-interaktioner.

For at visualisere interaktionen mellem replisomer og ICL'er i eksperimentet vist i fig. 2 anvendte vi PLA, som rapporterer nærheden af to antigener (figur 3a). Vi målte hyppigheden af association af MCM5 og Dig-mærket 1 time efter introduktionen af ICL'erne (figur 3b). PLA-signalerne demonstrerede nærheden af replisomer til ICL'er.

Replikationsstress, herunder den, der præsenteres af ICL'er, aktiverer ATR-kinase22. Blandt de mange substrater af ATR er MCM-proteiner, herunder MCM2 ved serin 10823. Et genlignende møde med ICL forventes at resultere i phosphorylering af MCM2, blandt mange andre substrater. I overensstemmelse med denne forventning var PLA mellem pMCM2Ser108 og Dig-tagget positivt (figur 3c). I andre eksperimenter fandt vi, at plateaufrekvensen blev nået ved 1 h20. Vi fortolkede disse resultater som tegn på, at replisomer forskelligt placeret i hele genomet og variabelt fjernt fra en ICL til sidst støder på blokken, hvilket udløser ATR-aktivering og MCM2-phosphorylering.

PLA-resultaterne i de foregående figurer præsenteres som en komprimeret summering af flere optiske planer. Resultaterne fra individuelle kerner kan dog også præsenteres i en tredimensionel rekonstruktion, som vist for pMCM2: Dig-TMP PLA i video 1. Denne analyse viste, at gentagne møder med ICL'erne kunne observeres i hele kernen.

Vores undersøgelse af replikationsgaffel viste, at ICL-møder afslørede et uventet replikationsgenstartsfænomen16. I betragtning af den låste ringstruktur af et funktionelt replosom, var det af betydelig interesse at spørge, om replikationsapparatets sammensætning ændrede sig ved kollision med en ICL. Da mindre end 10% af replikationsgafler kommer i kontakt med en ICL, ville det ikke have været produktivt blot at analysere proteinsammensætningen af alle replikosomer. PLA mellem Dig og forskellige komponenter tillod os imidlertid at løse dette spørgsmål. I modsætning til de positive resultater med pMCM2 fandt vi, at proteinerne i GINS-komplekset ikke kunne give PLA-signal med ICL'erne. På den anden side var analysen med CDC45 positiv, hvilket indikerer, at det andet låseprotein blev bevaret (figur 4a, b). Når celler blev inkuberet med en hæmmer af ATR, blev genstarten fuldstændig undertrykt, og GINS: Dig PLA var stærkt positiv (figur 4c). Vores fortolkning af disse resultater var, at i mangel af ATR-aktivitet blev GINS-proteinerne bevaret, CMG-helicasen forblev i en låst konfiguration, og der var ingen replikationsgenstart forbi ICL20.

Figure 1
Figur 1: Struktur af trimethylpsoralen knyttet til digoxigeninantigenmærket. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Immunofluorescens af replisome protein MCM5 og DIG TMP viser ikke diskrete foci. Celler blev behandlet med Dig-TMP og UVA og efter 1 time immunfarvet for MCM5 og Dig. Den hvide bjælke repræsenterer 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: PLA mellem Dig-TMP og MCM5. a) Skematisk oversigt over nærhedsligationsanalysen anvendt på interaktionen mellem MCM5-proteinet og Dig-mærket på ICL. Ordningen er forenklet. I praksis var primære antistoffer bundet af sekundære antistoffer kovalent koblet til oligonukleotiderne. b) PLA mellem MCM5 og Dig-TMP. Bemærk de diskrete signaler, der angiver interaktionssteder. Prik- og boksplot, der viser signalfordelingen (punktplottet) samt medianen (boksplottets røde bjælke), 25. og 75. percentilen (boksender) og de højeste og laveste værdier eksklusive afvigende værdier (ekstreme linjer). Wilcoxon-Rank Sum test bekræftede, at der er en signifikant forskel mellem de to betingelser (p<0,001). De hvide søjler repræsenterer 5 μm. (c) PLA mellem pMCM2 og Dig-TMP. Disse signaler repræsenterer mødet mellem replisomet og ICL, som udløser en ATR-afhængig phosphorylering af MCM2. PLA rapporterer variabiliteten af mødefrekvensen i forskellige celler. Den hvide bjælke repræsenterer 5 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: PLA mellem Dig-TMP og de replisom låseproteiner. a) CDC45: Dig-TMP. Den hvide bjælke repræsenterer 5 μm. (b) PSF1: Dig-TMP. Den minimale signalfrekvens øges kraftigt ved behandling med en ATR-hæmmer, som blokerer traversvejen og frigivelsen af GINS-komplekset, som inkluderer PSF1. De hvide søjler repræsenterer 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 1: Tredimensionel rekonstruktion af pMCM2: Dig PLA-signaler demonstrerer fordelingen i hele kernen. PCNA er farvet i grønt, PLA i rødt, DAPI i blåt. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende fil 1: Cellprofiler-pipeline til PLA-kvantificering. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: IMARIS cellemodul batchparametre til PLA kvantificering. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selvom PLA er en meget kraftfuld teknik, er der tekniske problemer, der skal løses for at opnå klare og reproducerbare resultater. Antistofferne skal have høj affinitet og specificitet. Desuden er det vigtigt at reducere de ikke-specifikke baggrundssignaler så meget som muligt. Vi har fundet ud af, at membraner og celleaffald bidrager til baggrunden, og vi har fjernet dem så meget som muligt. Vasken med vaskemiddelholdige buffere inden fiksering og vasken med methanol efter fiksering hjælper med at reducere den uspecifikke binding. Advarslen er, at vaskemiddelbehandling før fiksering kan resultere i celleløsning. Vi finder ud af, at behandling af pladerne med et celleklæbemiddel og præfiks med 0,1% FA før CSK-behandlingen lindrer dette problem.

Det er også nyttigt at identificere ikke-S-faseceller, når der overvåges S-fasespecifikke hændelser. Dette kan gøres ved post-PLA-farvning med cellecyklusmarkører såsom PCNA eller NPAT24,25. Disse markører bekræfter ikke kun S-fasefænomener, men de giver også en intern biologisk kontrol for ikke-specifikke interaktioner. Positive signaler i G1-faseceller i assays, der måler hændelser, der bør være eksklusive for S-fasen, er en indikation af, at der kræves en yderligere indsats for at reducere ikke-specifikke interaktioner.

Enkeltcellebilleddannelsesstrategier har fordele, der ikke er tilgængelige med andre tilgange til overvågning af molekylære interaktioner. Homogeniseringsteknikker, såsom anvendt i immunudfældningseksperimenter, eliminerer enhver forbindelse til begivenheder i individuelle celler. Derfor går indsigt i indflydelsen af cellecyklusstatus eller variabiliteten på tværs af en cellepopulation tabt. Men da PLA rapporterer hændelsesfrekvenser i individuelle celler, kan disse indsigter gendannes.

En hyppig begrænsning af PLA er manglen på immunologiske detektionsreagenser til mål af interesse. Dette er en bekymring, når man behandler spørgsmål vedrørende det cellulære respons på DNA-forstyrrelser introduceret af andre midler end direkte brydere. Vi har overvundet denne begrænsning ved hjælp af et immunmærket DNA-reaktivt reagens. Selvom vi har fokuseret vores undersøgelser på interstrand tværbindinger, er der mange genotoksiske forbindelser, herunder kemoterapi lægemidler, der ville egne sig til denne tilgang. Derudover kunne interaktioner mellem proteiner og DNA-strukturer, såsom G-quadruplexer, også undersøges med denne strategi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev delvist støttet af Intramural Research Program fra NIH, National Institute on Aging, USA (Z01-AG000746–08). J.H. er støttet af National Natural Science Foundations of China (21708007 og 31871365).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10011 1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip MatTek P35-1.5-14-C Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10001 1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA) SeraCare 1900-0012 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit) Abcam ab126762 1 in 200
Cell adhesive Life Science 354240 for cell-TAK solution
Confocal microscope Nikkon Nikon TE2000 spinning disk microscope equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) Abcam ab420 1 in 200
Dig-TMP synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×) Sigma-Aldrich DUO82010 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents Sigma-Aldrich DUO92007 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS Sigma-Aldrich DUO92004 anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS Sigma-Aldrich DUO92002 anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 200M microscope Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16% Fisher Scientific PI28906 for fix solution
Goat serum Thermo 31873 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software open source Cell profiler works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required Bitplane Imaris Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82029 reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×) Sigma-Aldrich DUO82009 reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit) Abcam ab4461 1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal) Abcam Ab75975 1 in 1000
Methanol Lab ALLEY A2076 pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) Abcam ab109271 1 in 200
Polymerase (10 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82030 reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI ThermoFisher Scientific P36935
PSF1 antibody (rabbit) Abcam ab181112 1 in 200
RNAse A 100 mg/ml Qiagen 19101 reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software open source R studio ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required Systat Software Sigmaplot V13
TMP (trioxalen) Sigma-Aldrich T6137_1G
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787_250ML
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416_100ML
UV box Southern New England Ultraviolet Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber Opsytec UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821 Selleckchem S8007 final concentrtion is 1µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
  2. Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
  3. Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
  4. Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
  5. Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
  6. Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
  7. Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
  8. Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
  9. Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
  10. Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
  11. Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
  12. Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
  13. Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
  14. Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
  15. Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
  16. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  17. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  18. O'Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
  19. Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
  20. Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
  21. Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
  22. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
  23. Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
  24. Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, Pt 2 617-624 (2009).
  25. Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).

Tags

Biologi udgave 173 replisome blokerende læsion PLA nærhedsligationsanalyse DNA-interstreng tværbinding antigen-tagged tværbindinger

Erratum

Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 01/09/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.

The Authors section was updated from:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

to:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

Visualisering af gentagne møder med en antigenmærket blokerende læsion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I.,… More

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I., James, R. C., Gichimu, J., Paramasivam, M., Pokharel, D., Gali, H., Bellani, M. A., Seidman, M. M. Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion. J. Vis. Exp. (173), e61689, doi:10.3791/61689 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter