Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering av replisome møter med et antigen merket blokkerende lesjon

Published: July 27, 2021 doi: 10.3791/61689
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1, 4, 5, 6, 1, 1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, 5Horizon Discovery, 6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Mens replikasjonsgaffelkollisjoner med DNA-addukter kan indusere dobbeltstrengbrudd, er mindre kjent om samspillet mellom replisomes og blokkerende lesjoner. Vi har benyttet nærhetsligeringsanalysen for å visualisere disse møtene og for å karakterisere konsekvensene for replisome sammensetning.

Abstract

Betydelig innsikt er til stede i den cellulære responsen på dobbeltstrengbrudd (DSB), indusert av nukleaser, stråling og andre DNA-brytere. Dette reflekterer blant annet tilgjengeligheten av metoder for identifisering av bruddsteder, og karakterisering av faktorer som rekrutteres til DSB ved disse sekvensene. DSB opptrer imidlertid også som mellomprodukter under behandlingen av DNA-addukter dannet av forbindelser som ikke direkte forårsaker brudd, og ikke reagerer på bestemte sekvenssteder. Følgelig er teknologier som tillater analyse av bindingsinteraksjoner med responsfaktorer og reparasjonsproteiner ukjente for de fleste av disse midlene. For eksempel kan DNA interstrand crosslinks (ICL) provosere pauser etter replikasjonsgaffelmøter. Selv om det dannes av legemidler som er mye brukt som kreftkjemoterapeutika, har det ikke vært noen metodikk for å overvåke deres interaksjoner med replikasjonsproteiner.

Her beskriver vi vår strategi for å følge den cellulære responsen på gaffelkollisjoner med disse utfordrende adduktene. Vi koblet et steroidantigen til psoralen, som danner fotoaktiveringsavhengige ICL i kjerner av levende celler. ICLene ble visualisert ved immunfluorescens mot antigenkoden. Taggen kan også være en partner i Proximity Ligation Assay (PLA) som rapporterer nær tilknytning av to antigener. PLA ble utnyttet til å skille proteiner som var nært forbundet med de merkede ICLene fra de som ikke var det. Det var mulig å definere replisome proteiner som ble beholdt etter møter med ICL og identifisere andre som gikk tapt. Denne tilnærmingen gjelder for enhver struktur eller DNA-addukt som kan detekteres immunologisk.

Introduction

Den cellulære responsen på dobbeltstrengbrudd er godt dokumentert på grunn av en rekke stadig kraftigere metoder for å lede brudd til spesifikke genomiske steder 1,2,3. Lokaliseringssikkerheten muliggjør entydig karakterisering av proteiner og andre faktorer som akkumuleres på stedet og deltar i DNA-skaderesponsen (DDR), og derved driver de ikke-homologe endeforbindelsesveiene (NHEJ) og homologe rekombinasjonsveier (HR) som reparerer brudd. Selvfølgelig introduseres mange pauser av midler som stråling og kjemiske arter som ikke angriper bestemte sekvenser4. For disse er det imidlertid prosedyrer tilgjengelig som kan konvertere endene til strukturer som er egnet for merking og lokalisering 5,6. Pauser blir også introdusert av biologiske prosesser, for eksempel immunoglobulinomlegging, og nyere teknologi tillater lokalisering, samt7. Forholdet mellom responderende faktorer og disse nettstedene kan da bestemmes.

Pauser vises også som en indirekte konsekvens av addukter dannet av forbindelser som ikke er iboende brytere, men forstyrrer DNA-transaksjoner som transkripsjon og replikasjon. De kan dannes som en funksjon av den cellulære responsen på disse hindringene, kanskje under reparasjon eller fordi de provoserer en struktur som er sårbar for nukleaseangrep. Vanligvis er det fysiske forholdet mellom addukten, pausen og foreningen med responderende faktorer inferensiell. For eksempel dannes ICL av kjemoterapeutika som cisplatin og mitomycinC8 og som et reaksjonsprodukt av abasiske steder9. ICL er velkjent som potente blokker til replikasjonsgafler10, og stopper dermed gafler som kan spaltes av nukleaser11. Den kovalente koblingen mellom tråder avlastes ofte av veier som har obligatoriske brudd som mellomprodukter12,13, noe som nødvendiggjør homolog rekombinasjon for å gjenoppbygge replikasjonsgaffelen 14. I de fleste eksperimenter følger etterforskeren responsen av faktorer av interesse for bruddene som dannes nedstrøms for kollisjonen av en replikasjonsgaffel med en ICL. Men fordi det ikke har vært noen teknologi for lokalisering av en provoserende lesjon, kan nærheten til replisome, og dens bestanddeler, til ICL bare antas.

Vi har utviklet en strategi for å muliggjøre analyse av proteinassosiasjoner med ikke-sekvensspesifikke kovalente addukter, her illustrert ved ICL. I vårt system blir disse introdusert av psoralen, et fotoaktivt naturlig produkt som brukes i tusenvis av år som terapeutisk for hudsykdommer15. Vår tilnærming er basert på to viktige trekk ved psoralener. Den første er deres høye frekvens av tverrbindingsdannelse, som kan overstige 90% av addukter, i motsetning til mindre enn 10% dannet av populære forbindelser som cisplatin eller Mitomycin C 8,16. Den andre er tilgjengeligheten av forbindelsen til konjugering uten tap av tverrbindingskapasitet. Vi har kovalent koblet trimetylpsoralen til Digoxigenin (Dig), en lenge etablert immunotag. Dette muliggjør påvisning av psoralenadduktene i genomisk DNA ved immunfarging av Dig-taggen, og visualisering ved konvensjonell immunfluorescens17.

Dette reagenset ble brukt i vårt tidligere arbeid til analyse av replikasjonsgaffelmøter med ICL ved bruk av en DNA-fiberbasert analyse16. I det arbeidet fant vi at replikering kunne fortsette forbi en intakt ICL. Dette var avhengig av ATR-kinasen, som aktiveres ved replikasjonsstress. Replikasjonsstarten var uventet gitt strukturen til CMG-replikerende helikase. Dette består av MCM hetero-hexamer (M) som danner en offset gapped ring rundt malstrengen for ledende strengsyntese som er låst av proteinene i GINS-komplekset (G, bestående av PSF1, 2, 3 og SLD5) og CDC45 (C) 18. Forslaget om at replikasjon kunne starte på siden av ICL distalt til siden av den replikative kollisjonen argumenterte for en endring i strukturen til replisome. For å ta opp spørsmålet om hvilke komponenter som var i svaret på tidspunktet for møtet med en ICL, utviklet vi tilnærmingen beskrevet her. Vi utnyttet Dig-taggen som partner i Proximity Ligation Assays (PLA)19 for å undersøke ICLs nære tilknytning til proteiner i replisome20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell forberedelse

  1. Dag 1
    1. Forbehandle 35 mm glassbunnede kulturretter med en celleklebende løsning.
    2. Tallerkenceller i de ferdigbehandlede rettene en dag før behandling. Cellen skal være aktivt delende og 50-70% sammenflytende på forsøksdagen.
      MERK: HeLa-celler ble brukt i dette eksperimentet med Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, supplert med 10% føtal bovint serum, 1x penicillin / streptomycin. Det er ingen begrensning for adherente cellelinjer. Imidlertid må ikke-adherente celler sentrifugeres på lysbilder og festes før analysen av PLA.
  2. Dag 2
    1. Forbered en stamløsning av Digoxigenin Trimetylpsoralen (Dig-TMP) ved å resuspendere en frossen alikot av tidligere syntetisert Dig-TMP i 1: 1 EtOH: H 2 O.Bestem konsentrasjonen ved å måle OD ved 250 nm av en 100x fortynning (i H2O) av den oppløste Dig-TMP. Utryddelseskoeffisienten til Dig-TMP er 25.000. Verifiser konsentrasjonen ved å måle OD ved 250 nm før hver bruk og beregne stamkonsentrasjon: Abs x 100 x 106/25 000 = Konsentrasjon (i μM). Vanligvis er stamløsningen rundt 3 mM. Oppløsningen kan oppbevares ved –20 °C i ca. en måned.
      MERK: Dig-TMP må syntetiseres kjemisk på forhånd, etter prosedyren beskrevet her. Refluks 4'-klormetyl-4,5',8-trimetylpsoralen med 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amin i toluen under nitrogen i 12 timer. Fjern løsningsmidlet og gjenopprett 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometyl-4,5',8-trimetylpsoralenproduktet ved silikagelkromatografi. Konjugere produktet til digoksigenin NHS-ester i dimetylformamid og trietylamin ved 50 °C i 18 timer. Fjern oppløsningsvæsken og rens resten ved hjelp av preparativ tynnlags silikagelkromatografi. Elute produktbåndet kloroform: metanol: 28% ammoniumhydroksid (8: 1: 0.1) blanding. Fordamp løsningsmidlene og løs opp pelleten i 50 % EtOH:H2O.
    2. Tilsett Dig-TMP-lager i 50% EtOH: H2O til cellekulturmediet til en endelig konsentrasjon på 5 μM. Bring mediet til 37 °C. Aspirer mediet fra platene, tilsett det forvarmede Dig-TMP-holdige mediet, og plasser platene i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 30 minutter for å tillate Dig-TMP å balansere.
    3. Mens cellene ruger, forvarm UV-boksen (se materialfortegnelse) til 37 °C.
    4. Plasser platene i den forvarmede UV-boksen og utsett cellene for en dose på 3 J / cm2 UVA-lys i 5 minutter for dette eksperimentet. Platene ble plassert oppå en termoblokk som ble holdt ved 37 °C under bestrålingen. Beregn tiden ved hjelp av formelen:
      Equation 1
    5. Aspirer mediet med en pipette, tilsett friskt forvarmet medium og legg platene tilbake i inkubatoren ved 37 °C, 5% CO2 i 1 time.
    6. Fjern media og vask opp en gang forsiktig med fosfatbufret saltvann (PBS).
    7. Fjern PBS og tilsett 0,1% formaldehyd (FA) i PBS i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Dette forhindrer celleavløsning under CSK-R (cytoskelettekstraksjonsbuffer inneholdende RNase, beskrevet i 1.2.9.) forbehandling som kreves for å ekstrahere de cytoplasmatiske elementene og redusere PLA-bakgrunnen.
    8. Aspirer av FA og vask opp med PBS en gang.
    9. Legg til CSK-R-buffer og inkuber i 5 minutter ved RT for å fjerne cytoplasma [CSK-R-buffer: 10 mM RØR, pH 7,0, 100 mM NaCl, 300 mM sukrose, 3 mM MgCl2, 0,5%Triton X-100, 300 μg/ml RNase A]. Aspirer bufferen, tilsett frisk CSK-R og inkuber i 5 minutter ved RT.
      MERK: Et lager av CSK buffer kan lagres ved 4 ° C, og Triton X og RNaseA tilsettes rett før bruk.
    10. Vask med PBS tre ganger.
    11. Fest celler med 4% formaldehyd i PBS i 10 minutter ved RT.
    12. Vask celler med PBS. Utfør dette trinnet tre ganger.
    13. Tilsett kald 100 % metanol og rug i 20 minutter ved -20 °C.
    14. Vask celler med PBS tre ganger. På dette tidspunktet kan celler lagres i PBS i et fuktig kammer ved 4 °C i opptil en uke.
    15. Inkuber celler i 80 μL 5 mM TritonX-100 i 10 minutter ved 4 °C.
    16. Inkuber celler med 100 μL 5 mM EDTA i PBS supplert med 1 μL 100 mg/ml RNase A i 30 minutter ved 37 °C.
    17. Vask celler med PBS tre ganger.
    18. Oppbevar celler i blokkbuffer (5 % BSA og 10 % geiteserum i PBS) i et fuktig kammer over natten ved 4 °C.

2. Nærhetsligeringsanalyse

MERK: Utfør nærhetsligeringsanalyse på dag 3.

  1. Antistofffarging
    1. Klargjør 40 mikrol av den primære antistoffoppløsningen per plate: Tilsett passende volum primære antistoffer for å oppnå ønsket fortynning (mus anti digoxigenin og kaninantistoff mot en replisome komponent som MCM5, CDC45, PSF1 eller pMCM2, fortynninger spesifisert i materialfortegnelsen) til blokkerende buffer (for å nå et endelig volum på 24 μL). Bland ved å tappe og la den stå i 20 min ved RT. Forbered en masterblanding for flere prøver og bland ved å banke før du påfører brønnene.
    2. Tilsett 40 μL primær antistoffoppløsning til midten av brønnen og inkuber i et fuktig kammer i 1 time ved 37 °C. Under farging, la PLA-sonder og blokkeringsbuffer varme til romtemperaturen.
    3. Vask celler med PBS-T [PBS-T: 0,05% Tween-20 i 1X PBS] ved RT. Utfør dette trinnet tre ganger.
    4. Mens du vasker, tilbered 40 μL PLA sondeoppløsning per tallerken (PLA-sonder består av et sekundært antistoff som gjenkjenner enten kanin eller mus IgG, kovalent knyttet til et PLUS- eller MINUS-oligonukleotid): 8 μL PLA-sonde anti-mus-PLUS + 8 μL PLA-sonde anti kanin-MINUS antistoff + 24 μL blokkeringsbuffer. Bland og la det stå i 20 min ved RT. Forbered en masterblanding for flere prøver og bland godt før påføring på brønnene. Plasser løsningen midt i brønnen i platen.
    5. Fjern siste vask, tilsett 40 μL PLA-sondeoppløsning i midten av brønnen, og inkuber i et fuktig kammer i 1 time ved 37 °C.
    6. Vask i buffer A tre ganger, i 10 min hver, på en vippeplattform på RT. Under vask, ta ligeringsblandingen til RT.
  2. Ligering og forsterkning
    1. Forbered 40 μL ligeringsblanding per plate: 8 μL (5x) ligeringslager + 31 μL destillert vann + 1 μL ligase. Forbered mastermiks for flere plater og bland godt før påføring på brønnene.
    2. Tilsett 40 μL ligeringsoppløsning til hver plate og inkuber i et fuktig kammer i 30 minutter ved 37 °C.
    3. Vask cellene 3x med buffer A, hver i 2 min, på en vippeplattform ved RT.
    4. Forbered 40 μL amplifikasjonsoppløsning per tallerken: 8 μL (5x) amplifikasjonsmateriale + 31,5 μL destillert vann + 0,5 μL DNA-polymerase. Forbered en masterblanding for flere prøver og bland godt før påføring på brønnene.
    5. Tilsett 40 μL forsterkningsløsning til hver plate og inkuber i et fuktig kammer ved 37 °C i 100 minutter.
    6. Aspirer av forsterkningsløsningen og vask med buffer B. Utfør 6 vasker hver i 10 min, på en vippeplattform ved RT.
    7. Vask en gang med 0,01x buffer B i 1 min ved RT.
    8. Aspiratbuffer B og inkubasjonsplater med sekundære antistoffer, Alexa Fluor 488 anti-mus IgG og Alexa Fluor 568 antikanin IgG i blokkeringsoppløsning ved passende fortynninger i blokkeringsbuffer, i et fuktig kammer, i 30 minutter ved 37 °C eller over natten ved 4 °C.
    9. Vask cellene tre ganger med PBS-T, i 10 min hver på en vippeplattform på RT.
    10. Aspirer PBS-T og monter i monteringsmedium med DAPI. De monterte platene kan avbildes umiddelbart eller oppbevares ved 4 °C i mørket i maksimalt 4 dager før avbildning.

3. Avbildning og kvantifisering

  1. Utfør avbildning i et epifluorescerende eller konfokalmikroskop (hvis 3D-avbildning er ønskelig, dekk minst 3 μm i 15 stabler). Utfør eksperimenter i triplikat og bilde nok antall felt til å gjøre minst 100 observasjoner per prøve eller tilstand. Vis alle felt og utvalg, inkludert kontroller, med de samme eksponeringsinnstillingene.
  2. Kvantifiser med en passende bildeanalyseprogramvare (se Materialfortegnelse for åpen kildekode og kommersiell programvare som kan utføre denne analysen i enkelt- eller flerplanbilder).
    1. Segmentcellekjerner basert på DAPI-farging. Utfør deteksjon av kjernefysiske PLA-prikker. Tilordne PLA-prikker til deres tilsvarende kjerne. Eksporter PLA-prikker per kjerneresultater som en csv-fil (se tilleggsfil 1 og tilleggsfil 2).
  3. Statistisk analyse (se Materialfortegnelse for foreslått åpen kildekode og kommersiell programvare).
    1. Kontroller om prøvene følger en normalfordeling med en Shapiro-Wilk-test.
    2. Finn ut om det er en signifikant forskjell mellom to utvalg ved hjelp av en Student-t-test (hvis normalfordelingsforutsetningen oppfylt) eller en Wilcoxon-Rank Sum-test (hvis normalfordelingsforutsetningen brytes for et utvalg).
  4. Datavisualisering: Generer punktdiagrammer kombinert med boksplott for å visualisere datadistribusjon, median (Q2), 25 th (Q1) og 75th percentil for de forskjellige prøvene (Se materialfortegnelse for foreslått åpen kildekode og kommersiell programvare).

4.3D visning av pMCM2: ICL-interaksjoner

  1. Image PLA-plater på et spinnende disk konfokalmikroskop, ved hjelp av et Plan Fluor 60x/1.25 numerisk blenderoljemål. Skaff 16 stabler som dekker 1,6 mm og generer 3D-rekonstruksjonen med riktig bildeanalyseprogramvare (se Materialfortegnelse).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PLA av Dig-TMP med replisome proteiner
Strukturen til Dig-TMP er vist i figur 1. Detaljene i syntesen, der trimetylpsoralen ble konjugert gjennom en glykolbinder til digoksigenin, har blitt diskutert tidligere17,21. Inkubasjon av celler med forbindelsen etterfulgt av eksponering for 365 nm lys (UVA) fotoaktiverer forbindelsen og driver tverrbindingsreaksjonen. I overkant av 90 % av adduktene er ICL16. Dig-taggen kan visualiseres ved immunfluorescens som avslører tilstedeværelsen av ICL i hele kjernen (figur 2). Immunfluorescens av et replisomeprotein som MCM2 indikerer også en fordeling gjennom kjernen, en fordeling som er upåvirket av introduksjonen av ICL. Disse resultatene viste at fokal forekomst av responderende proteiner, slik som sett i DNA Damage Response (DDR) til DSB, ikke er et trekk ved besvarende: ICL-interaksjoner.

For å visualisere interaksjonen mellom replisomes og ICL i forsøket vist i figur 2 brukte vi PLA, som rapporterer nærheten til to antigener (figur 3a). Vi målte assosiasjonsfrekvensen til MCM5 og Dig-taggen 1 time etter innføring av ICL (figur 3b). PLA-signalene demonstrerte nærheten til replikatorer til ICL.

Replikasjonsstress, inkludert det som presenteres av ICL, aktiverer ATR-kinasen22. Blant de mange substratene til ATR er MCM-proteiner, inkludert MCM2 ved serin 10823. Et svar med ICL forventes å resultere i fosforylering av MCM2, blant mange andre substrater. I samsvar med denne forventningen var PLA mellom pMCM2Ser108 og Dig-taggen positiv (figur 3c). I andre eksperimenter fant vi at platåfrekvensen ble nådd ved 1 time20. Vi tolket disse resultatene som en indikasjon på at replisomer som er forskjellig lokalisert i hele genomet, og varierende fjernt fra en ICL, til slutt møter blokken, utløser ATR-aktivering og MCM2-fosforylering.

PLA-resultatene i de foregående tallene er presentert som en komprimert summering av flere optiske plan. Resultatene fra individuelle kjerner kan imidlertid også presenteres i en tredimensjonal rekonstruksjon, som vist for pMCM2: Dig-TMP PLA i Video 1. Denne analysen indikerte at replisome-møter med ICLene kunne observeres gjennom hele kjernen.

Vår studie av replikasjonsgaffel viste at ICL-møter avslørte et uventet replikasjonsfenomen16. Tatt i betraktning den låste ringstrukturen til et funksjonelt svar, var det av stor interesse å spørre om sammensetningen av replikasjonsapparatet endret seg ved kollisjon med en ICL. Siden mindre enn 10% av replikasjonsgaflene kommer i kontakt med en ICL, ville det ikke vært produktivt å bare analysere proteinsammensetningen til alle replisomes. PLA mellom Dig og ulike komponenter tillot oss imidlertid å ta opp dette spørsmålet. I motsetning til de positive resultatene med pMCM2, fant vi at proteinene i GINS-komplekset ikke klarte å gi PLA-signal med ICLene. Analysen med CDC45 var derimot positiv, noe som indikerte at det andre låseproteinet ble beholdt (figur 4a,b). Når celler ble inkubert med en ATR-hemmer, ble omstarten fullstendig undertrykt og GINS: Dig PLA var sterkt positiv (figur 4c). Vår tolkning av disse resultatene var at i fravær av ATR-aktivitet ble GINS-proteinene beholdt, CMG-helikasen forble i en låst konfigurasjon, og det var ingen replikasjonsstart forbi ICL20.

Figure 1
Figur 1 Struktur av trimetylpsoralen koblet til digoksigeninantigenkoden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Immunfluorescens av replisomeprotein MCM5 og DIG TMP viser ikke diskrete foci. Cellene ble behandlet med Dig-TMP og UVA og etter 1 time immunfarget for MCM5 og Dig. Den hvite linjen representerer 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: PLA mellom Dig-TMP og MCM5. (a) Skjematisk fremstilling av Proximity Ligation Assay anvendt på interaksjonen mellom MCM5 replisome protein og Dig tag på ICL. Ordningen er forenklet. I praksis var primære antistoffer bundet av sekundære antistoffer kovalent koblet til oligonukleotidene. (b) PLA mellom MCM5 og Dig-TMP. Legg merke til de diskrete signalene som indikerer interaksjonssteder. Punkt- og boksplott som viser signalfordeling (punktplott) samt median (boksplott rød søyle), 25. og 75. persentiler (boksender) oghøyeste og laveste verdier eksklusive uteliggere (ekstreme linjer). Wilcoxon-Rank Sum test bekreftet at det er en signifikant forskjell mellom de to forholdene (s<0,001). De hvite stolpene representerer 5 μm. (c) PLA mellom pMCM2 og Dig-TMP. Disse signalene representerer møtet mellom svaret med ICL, som utløser en ATR-avhengig fosforylering av MCM2. PLA rapporterer variabiliteten av møtefrekvensen i forskjellige celler. Den hvite linjen representerer 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: PLA mellom Dig-TMP og de repliksomlåsende proteinene. (a) CDC45: Dig-TMP. Den hvite linjen representerer 5 μm. (b) PSF1: Dig-TMP. Den minimale signalfrekvensen økes kraftig ved behandling med en ATR-hemmer, som blokkerer traversveien og frigjøringen av GINS-komplekset som inkluderer PSF1. De hvite stolpene representerer 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Tredimensjonal rekonstruksjon av pMCM2: Dig PLA-signaler demonstrerer fordelingen gjennom kjernen. PCNA er farget i grønt, PLA i rødt, DAPI i blått. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsfil 1: Cellprofiler pipeline for PLA-kvantifisering. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: IMARIS cellemodulbatchparametere for PLA-kvantifisering. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om PLA er en veldig kraftig teknikk, er det tekniske problemer som må løses for å oppnå klare og reproduserbare resultater. Antistoffene må ha høy affinitet og spesifisitet. Videre er det viktig å redusere de uspesifikke bakgrunnssignalene så mye som mulig. Vi har funnet ut at membraner og cellulært rusk bidrar til bakgrunnen, og vi har fjernet dem så mye som mulig. Vask med vaskemiddel som inneholder buffere før fiksering, og vask med metanol etter festing bidrar til å redusere den uspesifikke bindingen. Forbeholdet er at vaskemiddelbehandling før fiksering kan resultere i celleløsning. Vi finner at behandling av platene med et cellelim og prefiks med 0.1% FA før CSK-behandlingen lindrer dette problemet.

Det er også nyttig å identifisere ikke-S-faseceller ved overvåking av S-fasespesifikke hendelser. Dette kan gjøres ved post PLA-farging med cellesyklusmarkører som PCNA eller NPAT24,25. Ikke bare bekrefter disse markørene S-fasefenomener, men de gir også en intern biologisk kontroll for ikke-spesifikke interaksjoner. Positive signaler i G1-faseceller, i analyser som måler hendelser som skal være eksklusive for S-fasen, er en indikasjon på at ytterligere innsats for å redusere ikke-spesifikke interaksjoner er nødvendig.

Enkeltcelleavbildningsstrategier har fordeler som ikke er tilgjengelige med andre tilnærminger for overvåking av molekylære interaksjoner. Homogeniseringsteknikker, for eksempel ansatt i immunutfellingseksperimenter, eliminerer enhver forbindelse til hendelser i individuelle celler. Følgelig går innsikt i påvirkning av cellesyklusstatus, eller variabiliteten over en cellepopulasjon, tapt. Men siden PLA rapporterer hendelsesfrekvenser i individuelle celler, kan denne innsikten gjenopprettes.

En hyppig begrensning av PLA er mangelen på immunologiske deteksjonsreagenser for mål av interesse. Dette er en bekymring når man tar opp spørsmål angående den cellulære responsen på DNA-forstyrrelser introdusert av andre midler enn direkte brytere. Vi har overvunnet denne begrensningen ved bruk av et immunomerket DNA-reaktivt reagens. Selv om vi har fokusert våre studier på interstrand-tverrbindinger, er det mange genotoksiske forbindelser, inkludert kjemoterapimedisiner, som vil gi seg til denne tilnærmingen. I tillegg kan interaksjoner mellom proteiner og DNA-strukturer, som G quadruplexes, også undersøkes med denne strategien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble delvis støttet av NIHs intramurale forskningsprogram, National Institute on Aging, USA (Z01-AG000746-08). JH støttes av National Natural Science Foundations of China (21708007 og 31871365).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10011 1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip MatTek P35-1.5-14-C Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10001 1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA) SeraCare 1900-0012 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit) Abcam ab126762 1 in 200
Cell adhesive Life Science 354240 for cell-TAK solution
Confocal microscope Nikkon Nikon TE2000 spinning disk microscope equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) Abcam ab420 1 in 200
Dig-TMP synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×) Sigma-Aldrich DUO82010 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents Sigma-Aldrich DUO92007 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS Sigma-Aldrich DUO92004 anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS Sigma-Aldrich DUO92002 anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 200M microscope Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16% Fisher Scientific PI28906 for fix solution
Goat serum Thermo 31873 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software open source Cell profiler works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required Bitplane Imaris Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82029 reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×) Sigma-Aldrich DUO82009 reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit) Abcam ab4461 1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal) Abcam Ab75975 1 in 1000
Methanol Lab ALLEY A2076 pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) Abcam ab109271 1 in 200
Polymerase (10 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82030 reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI ThermoFisher Scientific P36935
PSF1 antibody (rabbit) Abcam ab181112 1 in 200
RNAse A 100 mg/ml Qiagen 19101 reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software open source R studio ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required Systat Software Sigmaplot V13
TMP (trioxalen) Sigma-Aldrich T6137_1G
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787_250ML
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416_100ML
UV box Southern New England Ultraviolet Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber Opsytec UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821 Selleckchem S8007 final concentrtion is 1µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
  2. Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
  3. Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
  4. Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
  5. Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
  6. Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
  7. Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
  8. Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
  9. Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
  10. Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
  11. Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
  12. Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
  13. Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
  14. Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
  15. Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
  16. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  17. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  18. O'Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
  19. Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
  20. Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
  21. Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
  22. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
  23. Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
  24. Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, Pt 2 617-624 (2009).
  25. Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).

Tags

Biologi utgave 173 replisome blokkerende lesjon PLA nærhetsligeringsanalyse DNA interstrand tverrbindinger antigenmerkede tverrbindinger

Erratum

Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 01/09/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.

The Authors section was updated from:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

to:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

Visualisering av replisome møter med et antigen merket blokkerende lesjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I.,… More

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I., James, R. C., Gichimu, J., Paramasivam, M., Pokharel, D., Gali, H., Bellani, M. A., Seidman, M. M. Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion. J. Vis. Exp. (173), e61689, doi:10.3791/61689 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter