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Biology

Visualización de encuentros con replisoma con una lesión bloqueadora etiquetada con antígeno

Published: July 27, 2021 doi: 10.3791/61689
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1, 4, 5, 6, 1, 1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, 5Horizon Discovery, 6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Si bien las colisiones de horquilla de replicación con aductos de ADN pueden inducir roturas de doble cadena, se sabe menos sobre la interacción entre los replisomas y las lesiones de bloqueo. Hemos empleado el ensayo de ligadura de proximidad para visualizar estos encuentros y caracterizar las consecuencias para la composición replisómica.

Abstract

Existe una visión considerable de la respuesta celular a las roturas de doble cadena (DSB), inducidas por nucleasas, radiación y otros rompedores de ADN. En parte, esto refleja la disponibilidad de métodos para la identificación de los lugares de ruptura y la caracterización de los factores reclutados por los OSD en esas secuencias. Sin embargo, los DSB también aparecen como intermediarios durante el procesamiento de aductos de ADN formados por compuestos que no causan roturas directamente y no reaccionan en sitios de secuencia específicos. En consecuencia, para la mayoría de estos agentes, se desconocen las tecnologías que permiten el análisis de las interacciones de unión con factores de respuesta y proteínas de reparación. Por ejemplo, los enlaces cruzados entre cadenas de ADN (ICL) pueden provocar interrupciones después de los encuentros con la bifurcación de replicación. Aunque se forman por fármacos ampliamente utilizados como quimioterápicos del cáncer, no ha habido una metodología para monitorear sus interacciones con proteínas de replicación.

Aquí, describimos nuestra estrategia para seguir la respuesta celular a las colisiones de horquillas con estos aductos desafiantes. Vinculamos un antígeno esteroide al psoraleno, que forma ICL dependientes de fotoactivación en núcleos de células vivas. Las ICLs fueron visualizadas por inmunofluorescencia contra la etiqueta de antígeno. La etiqueta también puede ser un socio en el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) que informa la asociación cercana de dos antígenos. El PLA se explotó para distinguir las proteínas que estaban estrechamente asociadas con las ICL marcadas de las que no lo estaban. Fue posible definir proteínas replisomas que fueron retenidas después de encuentros con ICLs e identificar otras que se perdieron. Este enfoque es aplicable a cualquier estructura o aducto de ADN que pueda detectarse inmunológicamente.

Introduction

La respuesta celular a las roturas de doble cadena está bien documentada debido a una sucesión de métodos cada vez más potentes para dirigir las roturas a sitios genómicos específicos 1,2,3. La certeza de la ubicación permite una caracterización inequívoca de las proteínas y otros factores que se acumulan en el sitio y participan en la respuesta al daño del ADN (DDR), impulsando así las vías de unión final no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR) que reparan las roturas. Por supuesto, muchas roturas son introducidas por agentes como la radiación y las especies químicas que no atacan secuencias específicas4. Sin embargo, para estos hay procedimientos disponibles que pueden convertir los extremos en estructuras susceptibles de etiquetado y localización 5,6. Las roturas también son introducidas por procesos biológicos, como el reordenamiento de inmunoglobulinas,y la tecnología reciente también permite su localización7. La relación entre los factores que responden y esos sitios se puede determinar.

Las roturas también aparecen como una consecuencia indirecta de los aductos formados por compuestos que no son rompedores inherentes pero que interrumpen las transacciones de ADN, como la transcripción y la replicación. Pueden formarse como una característica de la respuesta celular a estas obstrucciones, tal vez durante la reparación o porque provocan una estructura que es vulnerable al ataque de nucleasas. Típicamente, la relación física entre el aducto, la ruptura y la asociación con los factores que responden es inferencial. Por ejemplo, las ICLs están formadas por quimioterápicos como cisplatino y mitomicina C8 y como producto de reacción de sitios abásicos9. Las ICL son bien conocidas como bloques potentes para las horquillas de replicación10, deteniendo así las horquillas que pueden ser escindidas por las nucleasas11. El enlace covalente entre hebras a menudo se alivia por vías que tienen rupturas obligadas como intermedias 12,13, lo que requiere una recombinación homóloga para reconstruir la horquilla de replicación14. En la mayoría de los experimentos, el investigador sigue la respuesta de los factores de interés a las roturas que se forman aguas abajo de la colisión de una horquilla de replicación con una ICL. Sin embargo, debido a que no ha habido tecnología para la localización de una lesión provocativa, la proximidad del replisoma y sus partes componentes a la ICL solo se puede asumir.

Hemos desarrollado una estrategia para permitir el análisis de asociaciones de proteínas con aductos covalentes no específicos de secuencia, ilustrados aquí por ICLs. En nuestro sistema, estos son introducidos por el psoraleno, un producto natural fotoactivo utilizado durante miles de años como terapéutico para los trastornos de la piel15. Nuestro enfoque se basa en dos características importantes de los psoralenos. El primero es su alta frecuencia de formación de reticulación, que puede superar el 90% de los aductos, en contraste con el menos del 10% formado por compuestos populares como el cisplatino o la mitomicina C 8,16. El segundo es la accesibilidad del compuesto a la conjugación sin pérdida de capacidad de reticulación. Hemos vinculado covalentemente el trimetilpsoraleno a la digoxigenina (Dig), un inmunotag establecido desde hace mucho tiempo. Esto permite la detección de los aductos de psoraleno en el ADN genómico por inmunotinción de la etiqueta Dig, y la visualización por inmunofluorescencia convencional17.

Este reactivo fue aplicado, en nuestro trabajo previo, al análisis de encuentros de horquilla de replicación con ICLs utilizando un ensayo basado en fibra de ADN16. En ese trabajo encontramos que la replicación podría continuar más allá de una ICL intacta. Esto dependía de la quinasa ATR, que se activa por estrés de replicación. El reinicio de la replicación fue inesperado dada la estructura de la helicasa replicativa CMG. Esto consiste en el heterohexámero MCM (M) que forma un anillo separado de desplazamiento alrededor de la hebra plantilla para la síntesis de la cadena principal que está bloqueada por las proteínas del complejo GINS (G, que consiste en PSF1, 2, 3 y SLD5) y CDC45 (C) 18. La propuesta de que la replicación podría reiniciarse en el lado de la ICL distal al lado de la colisión del replisoma abogaba por un cambio en la estructura del replisoma. Para abordar la cuestión de qué componentes estaban en el replisoma en el momento del encuentro con una CIT, desarrollamos el enfoque descrito aquí. Explotamos la etiqueta Dig como socio en Ensayos de Ligadura de Proximidad (PLA)19 para interrogar la estrecha asociación de la ICL con proteínas del replisoma20.

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Protocol

1. Preparación celular

  1. Día 1
    1. Pretrate las placas de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm con una solución adhesiva celular.
    2. Células en placa en los platos pretratados un día antes del tratamiento. La célula debe dividirse activamente y 50-70% confluente el día del experimento.
      NOTA: Las células HeLa se utilizaron en este experimento con Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, suplementado con 10% de suero bovino fetal, 1x penicilina / estreptomicina. No hay restricción para las líneas celulares adherentes. Sin embargo, las células no adherentes deben centrifugarse en portaobjetos y fijarse antes del análisis por PLA.
  2. Día 2
    1. Preparar una solución madre de digoxigenina trimetilpsoraleno (Dig-TMP) resuspendiendo una alícuota congelada de Dig-TMP previamente sintetizado en 1:1 EtOH:H2O. Determinar la concentración midiendo OD a 250 nm de una dilución 100x (enH2O) del Dig-TMP disuelto. El coeficiente de extinción de Dig-TMP es de 25.000. Verifique la concentración midiendo OD a 250 nm antes de cada uso y calcule la concentración madre: Abs x 100 x 106/25,000 = Concentración (en μM). Generalmente, la solución madre es de alrededor de 3 mM. La solución puede almacenarse a –20 °C durante aproximadamente un mes.
      NOTA: Dig-TMP debe sintetizarse químicamente por adelantado, siguiendo el procedimiento descrito aquí. Reflujo 4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno con 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amina en tolueno bajo nitrógeno durante 12 h. Retirar el disolvente y recuperar el producto 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno mediante cromatografía en gel de sílice. Conjugar el producto con éster NHS de digoxigenina en dimetilformamida y trietilamina a 50 °C durante 18 h. Eliminar el disolvente y purificar el residuo mediante cromatografía preparativa en gel de sílice de capa fina. Eluya la banda del producto cloroformo: metanol: mezcla de hidróxido de amonio al 28% (8:1:0.1). Evaporar los disolventes y disolver el pellet en 50% EtOH:H2O.
    2. Añadir el material de Dig-TMP en EtOH:H2Oal 50% al medio de cultivo celular hasta una concentración final de 5 μM. Llevar el medio a 37 °C. Aspirar el medio de las placas, añadir el medio que contiene Dig-TMP precalentado y colocar las placas en una incubadora (37 °C, 5% deCO2) durante 30 min para permitir que el Dig-TMP se equilibre.
    3. Mientras las células se están incubando, precaliente la caja UV (consulte la Tabla de materiales) a 37 °C.
    4. Coloque las placas en la caja UV precalentada y exponga las células a una dosis de 3 J / cm2 de luz UVA durante 5 minutos para este experimento. Las placas se colocaron encima de un termobloque mantenido a 37 °C, durante la irradiación. Calcula el tiempo usando la fórmula:
      Equation 1
    5. Aspirar el medio con una pipeta, añadir el medio fresco precalentado y volver a colocar las placas en la incubadora a 37 °C, 5% deCO2 durante 1 h.
    6. Retire los medios y lave los platos una vez suavemente con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    7. Retire PBS y agregue formaldehído (FA) al 0,1% en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Esto evita el desprendimiento celular durante el pretratamiento CSK-R (tampón de extracción del citoesqueleto que contiene RNasa, descrito en 1.2.9.) necesario para extraer los elementos citoplasmáticos y reducir el fondo de PLA.
    8. Aspire FA y lave los platos con PBS una vez.
    9. Añadir tampón CSK-R e incubar durante 5 min en RT para eliminar el citoplasma [tampón CSK-R: 10 mM PIPES, pH 7,0, 100 mM NaCl, 300 mM sacarosa, 3 mM MgCl2, 0,5% Triton X-100, 300 μg/mL RNasa A]. Aspire el tampón, agregue CSK-R fresco e incube durante 5 minutos en RT.
      NOTA: Se puede almacenar un stock de tampón CSK a 4 °C, y se pueden agregar Triton X y RNaseA justo antes de su uso.
    10. Lavar con PBS tres veces.
    11. Fijar las células con formaldehído al 4% en PBS durante 10 min en RT.
    12. Lave las celdas con PBS. Realice este paso tres veces.
    13. Añadir metanol frío al 100% e incubar durante 20 min a -20 °C.
    14. Lave las celdas con PBS tres veces. En este punto, las células pueden almacenarse en PBS en una cámara húmeda a 4 °C durante un máximo de una semana.
    15. Incubar células en 80 μL de 5 mM TritonX-100 durante 10 min a 4 °C.
    16. Incubar células con 100 μL de 5 mM EDTA en PBS suplementado con 1 μL de 100 mg/ml de RNasa A durante 30 min a 37 °C.
    17. Lave las celdas con PBS tres veces.
    18. Almacenar las células en tampón de bloqueo (5% BSA y 10% de suero de cabra en PBS) en una cámara húmeda durante la noche a 4 °C.

2. Ensayo de ligadura de proximidad

NOTA: Realice el ensayo de ligadura de proximidad el día 3.

  1. Tinción de anticuerpos
    1. Preparar 40 μL de la solución de anticuerpos primarios por placa: Añadir el volumen adecuado de anticuerpos primarios para lograr la dilución deseada (antidigoxigenina de ratón y anticuerpos de conejo contra un componente replisoma como MCM5, CDC45, PSF1 o pMCM2, diluciones especificadas en la Tabla de materiales) en el tampón de bloqueo (para alcanzar un volumen final de 24 μL). Mezcle dando un toque y déjelo reposar durante 20 minutos en RT. Prepare una mezcla maestra para múltiples muestras y mezcle golpeando antes de aplicar a los pocillos.
    2. Añadir 40 μL de solución de anticuerpos primarios al centro del pocillo e incubar en una cámara húmeda durante 1 h a 37 °C. Durante la tinción, permita que las sondas de PLA y el amortiguador de bloqueo se calienten a la temperatura ambiente.
    3. Lave las células con PBS-T [PBS-T: 0.05% Tween-20 en 1X PBS] en RT. Realice este paso tres veces.
    4. Durante el lavado, prepare 40 μL de solución de sonda de PLA por plato (las sondas de PLA consisten en un anticuerpo secundario que reconoce IgG de conejo o ratón, unido covalentemente a un oligonucleótido PLUS o MINUS): 8 μL de sonda de PLA anti ratón-PLUS + 8 μL de sonda de PLA anticuerpo anti conejo-MINUS + 24 μL de tampón de bloqueo. Mezcle y deje reposar durante 20 minutos en RT. Prepare una mezcla maestra para múltiples muestras y mezcle bien antes de aplicarla a los pocillos. Coloque la solución en el centro del pocillo en la placa.
    5. Retire el último lavado, agregue 40 μL de solución de sonda de PLA al centro del pocillo e incube en una cámara húmeda durante 1 h a 37 °C.
    6. Lavar en el tampón A tres veces, durante 10 minutos cada una, en una plataforma basculante en RT. Durante el lavado, lleve la mezcla de ligadura a RT.
  2. Ligadura y amplificación
    1. Preparar 40 μL de mezcla de ligadura por placa: 8 μL (5x) de caldo de ligadura + 31 μL de agua destilada + 1 μL de ligasa. Prepare la mezcla maestra para múltiples platos y mezcle bien antes de aplicarla en los pocillos.
    2. Añadir 40 μL de solución de ligadura a cada placa e incubar en una cámara húmeda durante 30 min. a 37 °C.
    3. Lave las celdas 3 veces con tampón A, cada una durante 2 minutos, en una plataforma basculante en RT.
    4. Preparar 40 μL de solución de amplificación por plato: 8 μL (5x) de material de amplificación + 31,5 μL de agua destilada + 0,5 μL de ADN polimerasa. Prepare una mezcla maestra para múltiples muestras y mezcle bien antes de aplicarla a los pocillos.
    5. Añadir 40 μL de solución de amplificación a cada placa e incubar en una cámara húmeda a 37 °C durante 100 min.
    6. Aspirar la solución de amplificación y lavar con tampón B. Realizar 6 lavados cada uno durante 10 min, en una plataforma basculante en RT.
    7. Lavar una vez con 0.01x buffer B durante 1 min en RT.
    8. Aspirar tampón B e incubar placas con anticuerpos secundarios, Alexa Fluor 488 IgG anti-ratón y Alexa Fluor 568 IgG anti-conejo en solución de bloqueo a diluciones apropiadas en tampón de bloqueo, en una cámara húmeda, durante 30 min a 37 °C o durante la noche a 4 °C.
    9. Lave las celdas tres veces con PBS-T, durante 10 minutos cada una en una plataforma basculante en RT.
    10. Aspirar PBS-T y montar en medio de montaje con DAPI. Las placas montadas pueden visualizarse inmediatamente o almacenarse a 4 °C en la oscuridad durante no más de 4 días antes de la obtención de imágenes.

3. Imagen y cuantificación

  1. Realice imágenes en un microscopio epifluorescente o confocal (si es deseable obtener imágenes 3D, cubra al menos 3 μm en 15 pilas). Realizar experimentos por triplicado e imaginar un número suficiente de campos para realizar al menos 100 observaciones por muestra o condición. Imagen de todos los campos y muestras, incluidos los controles, utilizando la misma configuración de exposición.
  2. Cuantificar con un software de análisis de imágenes apropiado (consulte la Tabla de materiales para software comercial y de código abierto capaz de realizar este análisis en imágenes planas únicas o múltiples).
    1. Segmentar núcleos celulares basados en la tinción DAPI. Realizar la detección de puntos PLA nucleares. Asigne puntos PLA a su núcleo correspondiente. Exporte los puntos PLA por núcleo como un archivo csv (consulte Archivo complementario 1 y Archivo complementario 2).
  3. Análisis estadístico (consulte la Tabla de materiales para obtener información sugerida de código abierto y software comercial).
    1. Verifique si las muestras siguen una distribución normal con una prueba de Shapiro-Wilk.
    2. Determine si hay una diferencia significativa entre dos muestras utilizando una prueba de Student-t (si se cumple la suposición de distribución normal) o una prueba de suma de Wilcoxon-Rank (si se viola la suposición de distribución normal para una muestra).
  4. Visualización de datos: Genere diagramas de puntos combinados con diagramas de caja para visualizar la distribución de datos, mediana (Q2), percentil 25 (Q1) y 75 para las diferentesmuestras (consulte la Tabla de materiales para obtener software comercial y de código abierto sugerido).

4.3D visualización de pMCM2: interacciones ICL

  1. Placas de PLA de imagen en un microscopio confocal de disco giratorio, utilizando un objetivo de aceite de apertura numérica Plan Fluor 60x/1.25. Adquiera 16 pilas que cubren 1,6 mm y genere la reconstrucción 3D con el software de análisis de imágenes adecuado (ver Tabla de materiales).

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Representative Results

PLA de Dig-TMP con proteínas replisómicas
La estructura del Dig-TMP se muestra en la Figura 1. Los detalles de la síntesis, en la que el trimetilpsoraleno se conjugó a través de un ligador de glicol a digoxigenina, se han discutido previamente17,21. La incubación de células con el compuesto seguida de la exposición a la luz de 365 nm (UVA) fotoactiva el compuesto e impulsa la reacción de reticulación. Algo más del 90% de los aductos son ICLs16. La etiqueta Dig se puede visualizar por inmunofluorescencia que revela la presencia de ICL en todo el núcleo (Figura 2). La inmunofluorescencia de una proteína replisoma como MCM2 también indica una distribución en todo el núcleo, una distribución que no se ve afectada por la introducción de ICL. Estos resultados demostraron que la apariencia focal de las proteínas que responden, como se ve en la respuesta al daño del ADN (DDR) a los DSB, no es una característica de las interacciones replisoma: ICL.

Para visualizar la interacción de los replisomas con las ICLs en el experimento mostrado en la Fig. 2 aplicamos el PLA, que informa de la proximidad de dos antígenos (Figura 3a). Medimos la frecuencia de asociación de MCM5 y la etiqueta Dig 1 h después de la introducción de las ICLs (Figura 3b). Las señales de PLA demostraron la proximidad de los replisomas a las ICL.

El estrés de replicación, incluido el que presentan las ICL, activa la quinasa ATR22. Entre los muchos sustratos de ATR se encuentran las proteínas MCM, incluyendo MCM2 en serina 10823. Se esperaría que un encuentro replisónico con la ICL resultara en la fosforilación de MCM2, entre muchos otros sustratos. De acuerdo con esta expectativa, el PLA entre pMCM2Ser108 y la etiqueta Dig fue positivo (Figura 3c). En otros experimentos encontramos que la frecuencia de meseta se alcanzó a 1 h20. Interpretamos que estos resultados indican que los replisomas ubicados de diversas maneras a lo largo del genoma, y distantes de forma variable de una ICL, eventualmente encuentran el bloqueo, desencadenando la activación de ATR y la fosforilación de MCM2.

Los resultados de PLA en las figuras anteriores se presentan como una suma comprimida de múltiples planos ópticos. Sin embargo, los resultados de núcleos individuales también se pueden presentar en una reconstrucción tridimensional, como se muestra para el pMCM2: Dig-TMP PLA en Video 1. Este análisis indicó que se podían observar encuentros replisomáticos con las ICLs en todo el núcleo.

Nuestro estudio de la bifurcación de replicación mostró que los encuentros con ICL revelaron un fenómeno de reinicio de replicación inesperado16. Teniendo en cuenta la estructura de anillo bloqueado de un replisoma funcional, fue de considerable interés preguntar si la composición del aparato de replicación cambió al colisionar con una ICL. Dado que menos del 10% de las horquillas de replicación entran en contacto con una ICL, simplemente analizar la composición proteica de todos los replisomas no habría sido productivo. Sin embargo, el PLA entre Dig y varios componentes nos permitió abordar esta cuestión. En contraste con los resultados positivos con pMCM2, encontramos que las proteínas del complejo GINS no pudieron dar señal PLA con las ICL. Por otro lado, el ensayo con CDC45 fue positivo, lo que indica que la otra proteína de bloqueo fue retenida (Figura 4a,b). Cuando las células se incubaron con un inhibidor de ATR, el reinicio se suprimió por completo y el GINS: Dig PLA fue fuertemente positivo (Figura 4c). Nuestra interpretación de estos resultados fue que en ausencia de actividad ATR, las proteínas GINS se mantuvieron, la helicasa CMG permaneció en una configuración bloqueada y no hubo reinicio de replicación después de la ICL20.

Figure 1
Figura 1: Estructura del trimetilpsoraleno ligado a la etiqueta del antígeno de digoxigenina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: La inmunofluorescencia de la proteína replisoma MCM5 y DIG TMP no muestra focos discretos. Las células fueron tratadas con Dig-TMP y UVA y después de 1 h inmunoteñidas para MCM5 y Dig. La barra blanca representa 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: PLA entre Dig-TMP y MCM5. (a) Esquema del ensayo de ligadura de proximidad aplicado a la interacción entre la proteína replisoma MCM5 y la etiqueta Dig en la ICL. El esquema está simplificado. En la práctica, los anticuerpos primarios estaban unidos por anticuerpos secundarios acoplados covalentemente a los oligonucleótidos. b) PLA entre MCM5 y Dig-TMP. Tenga en cuenta las señales discretas que indican los sitios de interacción. Diagramas de puntos y cajas que muestran la distribución de la señal (diagrama de puntos), así como la mediana (barra roja del gráfico de caja), los percentiles 25 y 75(extremos de caja) y los valores másaltos y más bajos excluyendo valores atípicos (líneas extremas). La prueba de Wilcoxon-Rank Sum confirmó que hay una diferencia significativa entre las dos condiciones (p<0,001). Las barras blancas representan 5 μm. (c) PLA entre pMCM2 y Dig-TMP. Estas señales representan el encuentro del replisoma con la ICL, lo que desencadena una fosforilación dependiente de ATR de MCM2. El PLA informa de la variabilidad de la frecuencia de encuentro en diferentes células. La barra blanca representa 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: PLA entre Dig-TMP y las proteínas de bloqueo del replisoma. (a) CDC45: Dig-TMP. La barra blanca representa 5 μm. (b) PSF1: Dig-TMP. La frecuencia mínima de la señal aumenta considerablemente con el tratamiento con un inhibidor de ATR, que bloquea la vía transversal y la liberación del complejo GINS que incluye PSF1. Las barras blancas representan 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Reconstrucción tridimensional de pMCM2: Dig PLA signals demuestra la distribución en todo el núcleo. PCNA está teñido en verde, PLA en rojo, DAPI en azul. Haga clic aquí para descargar este video.

Archivo complementario 1: Canalización de Cellprofiler para cuantificación de PLA. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Parámetros de lote del módulo celular IMARIS para la cuantificación de PLA. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Aunque el PLA es una técnica muy potente, existen inquietudes técnicas que deben resolverse para obtener resultados claros y reproducibles. Los anticuerpos deben ser de alta afinidad y especificidad. Además, es importante reducir las señales de fondo no específicas tanto como sea posible. Hemos encontrado que las membranas y los desechos celulares contribuyen al fondo, y los hemos eliminado tanto como sea posible. Los lavados con detergente que contiene tampones antes de la fijación, y el lavado con metanol después de la fijación ayudan a reducir la unión no específica. La advertencia es que el tratamiento con detergente antes de la fijación puede provocar el desprendimiento celular. Encontramos que tratar las placas con un adhesivo celular y prefijar con FA al 0,1% antes del tratamiento CSK alivia este problema.

También es útil identificar celdas de fase S cuando se monitorean eventos específicos de fase S. Esto se puede hacer mediante tinción post PLA con marcadores del ciclo celular como PCNA o NPAT24,25. Estos marcadores no solo confirman los fenómenos de fase S, sino que también proporcionan un control biológico interno para interacciones no específicas. Las señales positivas en las células de fase G1, en ensayos que miden eventos que deberían ser exclusivos de la fase S, son una indicación de que se requiere un esfuerzo adicional para reducir las interacciones no específicas.

Las estrategias de imágenes de células individuales tienen ventajas que no están disponibles con otros enfoques para monitorear las interacciones moleculares. Las técnicas de homogeneización, como las empleadas en experimentos de inmunoprecipitación, eliminan cualquier conexión con eventos en células individuales. En consecuencia, se pierde información sobre la influencia del estado del ciclo celular o la variabilidad entre una población celular. Sin embargo, dado que el PLA informa frecuencias de eventos en células individuales, estos conocimientos se pueden recuperar.

Una limitación frecuente del PLA es la falta de reactivos de detección inmunológica para objetivos de interés. Esta es una preocupación cuando se abordan preguntas relacionadas con la respuesta celular a las perturbaciones del ADN introducidas por agentes distintos de los interruptores directos. Hemos superado esa limitación mediante el uso de un reactivo de ADN inmunomarcado. Aunque hemos centrado nuestros estudios en los enlaces cruzados entre hebras, hay muchos compuestos genotóxicos, incluidos los medicamentos de quimioterapia, que se prestarían a este enfoque. Además, las interacciones entre proteínas y estructuras de ADN, como los cuádruples G, también podrían examinarse con esta estrategia.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada, en parte, por el Programa de Investigación Intramuros de los NIH, Instituto Nacional sobre el Envejecimiento, Estados Unidos (Z01-AG000746-08). J.H. cuenta con el apoyo de las Fundaciones Nacionales de Ciencias Naturales de China (21708007 y 31871365).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10011 1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip MatTek P35-1.5-14-C Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10001 1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA) SeraCare 1900-0012 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit) Abcam ab126762 1 in 200
Cell adhesive Life Science 354240 for cell-TAK solution
Confocal microscope Nikkon Nikon TE2000 spinning disk microscope equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) Abcam ab420 1 in 200
Dig-TMP synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×) Sigma-Aldrich DUO82010 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents Sigma-Aldrich DUO92007 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS Sigma-Aldrich DUO92004 anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS Sigma-Aldrich DUO92002 anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 200M microscope Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16% Fisher Scientific PI28906 for fix solution
Goat serum Thermo 31873 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software open source Cell profiler works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required Bitplane Imaris Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82029 reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×) Sigma-Aldrich DUO82009 reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit) Abcam ab4461 1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal) Abcam Ab75975 1 in 1000
Methanol Lab ALLEY A2076 pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) Abcam ab109271 1 in 200
Polymerase (10 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82030 reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI ThermoFisher Scientific P36935
PSF1 antibody (rabbit) Abcam ab181112 1 in 200
RNAse A 100 mg/ml Qiagen 19101 reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software open source R studio ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required Systat Software Sigmaplot V13
TMP (trioxalen) Sigma-Aldrich T6137_1G
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787_250ML
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416_100ML
UV box Southern New England Ultraviolet Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber Opsytec UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821 Selleckchem S8007 final concentrtion is 1µM

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References

  1. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
  2. Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
  3. Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
  4. Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
  5. Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
  6. Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
  7. Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
  8. Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
  9. Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
  10. Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
  11. Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
  12. Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
  13. Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
  14. Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
  15. Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
  16. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  17. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  18. O'Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
  19. Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
  20. Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
  21. Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
  22. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
  23. Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
  24. Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, Pt 2 617-624 (2009).
  25. Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).

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Biología Número 173 replisoma lesión de bloqueo PLA ensayo de ligadura de proximidad enlaces cruzados de cadena de ADN enlaces cruzados marcados con antígeno

Erratum

Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 01/09/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.

The Authors section was updated from:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

to:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

Visualización de encuentros con replisoma con una lesión bloqueadora etiquetada con antígeno
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Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I.,… More

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I., James, R. C., Gichimu, J., Paramasivam, M., Pokharel, D., Gali, H., Bellani, M. A., Seidman, M. M. Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion. J. Vis. Exp. (173), e61689, doi:10.3791/61689 (2021).

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