Summary
Vi presenterar en enkel metod för att isolera mycket livskraftiga fett stamceller från mus epididymal fettkuddar med fluorescens aktiverad cell sortering.
Abstract
Fetma och metabola störningar som diabetes, hjärtsjukdomar och cancer är alla förknippade med dramatisk fettvävnadsrenovering. Vävnad-bosatta fett stamceller (APCs) spelar en nyckelroll i fettvävnad homeostas och kan bidra till vävnad patologi. Den ökande användningen av encellsanalysteknik – inklusive encellig RNA-sekvensering och encellig proteomik – förändrar stam-/stamcellsfältet genom att tillåta oöverträffad upplösning av individuella celluttrycksförändringar inom ramen för förändringar i populationen eller vävnaden. I den här artikeln tillhandahåller vi detaljerade protokoll för att dissekera mus epididymal fettvävnad, isolera enstaka fettvävnad-härledda celler och utföra fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att berika för livskraftig Sca1+/ CD31-/ CD45-/ Ter119- APCs. Dessa protokoll kommer att göra det möjligt för utredare att förbereda högkvalitativa API: er som är lämpliga för nedströmsanalyser som RNA-sekvensering med en cell.
Introduction
Fettvävnad spelar en nyckelroll i energimetabolismen. Överskott av energi lagras i form av lipider, och fettvävnad kan betydande expansion eller upprullning beroende på näringsstatus och energisk efterfrågan. Expansion av fettvävnad kan bero på en ökning av fettstorleken (hypertrofi) och/eller av en ökning av adipocytnumret (hyperplasi); den senare processen regleras tätt genom spridning och differentiering av fettavkompitorceller1,2. Under fetma expanderar fettvävnad överdrivet, och vävnadsdysfunktion – inklusive hypoxi, inflammation och insulinresistens – utvecklasofta 3,4. Dessa komplikationer är riskfaktorer för många kroniska sjukdomar inklusive högt blodtryck, diabetes, hjärt-kärlsjukdomar, stroke och cancer5. Att begränsa okontrollerad fettvävnadsexpansion och mildra fettvävnadspatologier är därför högsta biomedicinska forskningsprioriteringar. Under fettvävnad expansion, bosatta fettvävnad-härledda stamceller (ASCs) proliferate och differentiera sekventiellt i preadipocytes (engagerade stamceller) och sedan i mogna adipocyter6. Nyligen genomförda encelliga RNA-sekvensering (scRNA-seq) studier visar att dessa fett stamceller (APC) populationer (ASCs och preadipocytes) uppvisar betydande molekylär och funktionell heterogenitet7,8,9,10,11,12. Till exempel visar ASCs en minskad adipogenic differentieringskapacitet, samtidigt som de uppvisar högre spridnings- och expansionskapacitet, jämfört med preadipocyter7. Ytterligare molekylära skillnader rapporteras inom ASC och preadipocyte populationer, även om funktionell relevans av dessa skillnader är fortfarande oklart7. Tillsammans belyser dessa data komplexiteten i fett stamcellspoolen och understryker behovet av att utveckla och standardisera verktyg för att bättre förstå och manipulera dessa kritiska cellpopulationer.
Detta protokoll beskriver isoleringen av hög lönsamhet Sca1+ fett stamceller populationer från mus epididymal fettkuddar som är lämpliga för känsliga nedströms analyser, inklusive encelliga studier (scRNA-sekvensering) och cell kultur. Isolering och dissociation av epididymala fettkuddar utfördes som tidigarebeskrivits 7,13 med små modifieringar som förbättrar livskraften hos isolerade API: er. I korthet färgas dissocierade celler från epididymala fettkuddar med antikroppar mot Sca1, en markör för både ASCs och preadipocyter6,7och andra härstamningsmarkörer (Lin) : Ter119 (erytroida celler), CD31 (endotelceller) och CD45 (leukocyter). Livskraftiga Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- celler sorteras sedan efter fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Viktigt, detta protokoll validerades genom framgångsrik isolering och analys av livskraftiga Sca1+/ Lin- fett stamceller rapporteras i en nyligen encellig RNA sekvensering studie som identifierade funktionellt heterogena subpopulationer inom ASCs och preadipocytes7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsöksprocedurer utfördes under godkännande av Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Lösningsberedning
- Förbered kollagenas 2% (w/v) lösning genom att lösa upp kollagenas II 2 g i 100 mL Hanks balanserade saltlösning (HBSS). Aliquot 200 μL vardera för varje användning.
- Förbered neutraliseringsmediet genom att blanda 84 ml F-12 medium, 15 ml hästserum och 1 ml penicillin/streptomycin.
- Förbered flödescytometribufferten genom att lösa upp 500 mg bovint serumalbumin (BSA) och 400 μL 0,5 M EDTA i 100 ml av Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS).
2. Dissekering av epididymal fettdyna och vävnadsdissociation
- Humant avliva (isofluran/massundersökning förskjutning) en manlig mus. I det här protokollet användes en fyra månader gammal FVB-mus.
- Applicera/spraya 70% etanol på buken och exponera nedre bukhålan med ren sax och tång.
- Leta reda på epididymal fettdyna (proximal/fäst vid testikörer). Håll korsningen mellan testikörtlar och epididymal fettdyna med trubbiga tångar och dra försiktigt för att frigöra den epididymala fettdynan.
- Ta bort testikel genom att skära med sax och inkubera epididymal fettdyna i 5 ml HBSS kompletterad med 3% BSA i ett 50 ml koniskt rör vid rumstemperatur i 15 min.
- Centrifugera vid 150 x g i 7 min vid 4 °C.
- Ta flytande epididymal fettdyna från 50 ml koniskt rör och finhacka vävnaden med ren sax.
- Tillsätt 200 μL kollagenas 2% lösning i 3,8 ml HBSS i ett 13 ml odlingsrör. Tillsätt den malda vävnaden och inkubera i en roterande inkubator vid 5 varv/min i 1 timme vid 37 °C. I stället för en roterande inkubator kan cellkulturinkubator vid 37 °C alternativt användas med tillfälliga omrörningar.
- Överför hela innehållet till ett 50 ml koniskt rör och tillsätt 10 ml neutraliseringsmedium. Blanda försiktigt genom att vända röret 2-3 gånger.
- Förbered ytterligare 50 ml koniskt rör utrustat med en 70 μm cellsil. Filtrera den smälta vävnaden i det nya röret med cellsilen.
- Överför genomflödet till ett koniskt rör på 15 ml och centrifugera vid 350 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Ta försiktigt bort supernaten och återanvänd cellpellets med 5 ml DPBS. Centrifugera vid 350 x g i 10 min vid 4 °C.
- Ta försiktigt bort supernatanten och tillsätt 50 μL flödescytometribuffert. Blanda väl genom att pipetting försiktigt och håll celler på is. På grund av volymen av cellpellets och liten mängd kvarvarande supernatant kommer den totala volymen celler i flödescytometribufferten att vara större än 50 μL (cirka 100 μL).
3. Antikroppsmärkning och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)
- Efter att ha blandat cellerna väl med skonsam pipetting, överför 54 μL av cellfjädringen till ett 1,7 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 6 μL FCR-blockerande reagens och blanda väl genom att pipetting försiktigt. Inkubera vid 4 °C i 10 min. Spara eventuella överblivna celler efter att ha tagit 54 μL och förvara dem i isen för att använda dem som en obehindad kontroll i steg 3.5 och steg 3.6.
- Under inkubationen i steg 3.1, förbered en antikroppscocktail genom att kombinera 11 μL vardera av anti-Sca1-APC-, anti-Ter119-FITC-, anti-CD31-FITC- och anti-CD45-FITC-antikroppar i ett mikrocentrifugrör. Blanda väl genom skonsam pipetting och håll på isen skyddad mot ljus.
- Efter inkubation med FcR-blockerande reagens i 10 min, tillsätt 40 μL av antikroppscocktailen och blanda väl genom mild pipetting. Inkubera vid 4 °C i 10 min.
- Tillsätt 500 μL flödescytometribuffert kompletterad med 1 μg/ml DAPI i de färgade cellerna. Blanda väl genom skonsam pipetting och filtrera celler med hjälp av ett 5 ml provrör med cellsil snap cap. Håll cellerna på is.
- Tillsätt 500 μL flödescytometribuffert till återstående celler i steg 3.1 och blanda väl genom skonsam pipettning. Filtrera celler med hjälp av ett 5 ml provrör med cellsil snap lock. Håll dessa celler på is och använd som en obehindad kontroll i följande steg.
- Ta de färgade cellerna och den obefläckade kontrollen till FACS analys- eller sorteringsinstrument.
- Identifiera och isolera populationen APC+/FITC-/DAPI- med gatingstrategier som visas i figur 1. Dessa celler representerar livskraftiga Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- celler. Skräp och cellaggregat töms med hjälp av FSC-tomter (Forward) och SSC (Side Scatter). Sedan, DAPI- befolkningen är gated, följt av gating av APC+/ FITC- befolkning. Otillsagd kontroll bör användas för att hjälpa till att fastställa gatingparametrar.
- Samla cellerna i 500 μL flödescytometribuffert i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Framöver bör alla förfaranden utföras under sterila förhållanden för att minimera kontaminering. Cirka 50 000 – 100 000 celler samlas in från en mus.
- Räkna celler med hjälp av en hemocytometer för att utvärdera cellens livskraft. Eftersom cellaggregat kan störa ytterligare nedströmsanalyser utvärderas också förekomsten av cellaggregat för att säkerställa en minimal närvaro (<5% av livskraftigt cellnummer) av dessa aggregat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fyra månader gamla manliga FVB möss användes i detta experiment. Efter uteslutning av skräp och dubblettar med hjälp av FSC/SSC-tomter, var livskraftiga celler (DAPI- population) gated, följt av valet av APC+/ FITC- population (Figur 1). DAPI-, APC- och FITC-portarna ritades baserat på den obekarna kontrollen. Gatingstrategier visas i figur 1.
Efter 1 h sortering utvärderades isoleringens kvalitet kvantitativt genom flödescytometrianalys (figurerna 2,3). Cellerna var färgade med propidium iodide lösning (1:100) för livskraft färgning. Med samma gating för sortering behöll cellerna hög livskraft och renhet: 92,6 ± 2,2% enstaka celler (tredje panelen i figur 2),86,4 ± 3,0% livskraft (PI- celler) och 86,0 ± 2,8% APC+/ FITC- celler (n= 4, genomsnittlig ± standardavvikelse). Dessa procentsatser definierades som procentsatser för varje gated population (enstaka celler, PI- celler och PI-/APC+/FITC- population, respektive i figur 2) i förhållande till totalt cellnummer.
Figur 1: Isolering av livskraftiga Sca1+ fettavkomma enstaka celler av FACS. Gating strategier visas i både färgade celler och i en obefläckad kontroll. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativ flödescytometrianalys för att bedöma cellens livskraft efter isolering. Livsduglighet färgning utfördes med propidium iodide. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Kvantifiering av procentandelen celler 1 timme efter isolering i flödescytometrianalys. Procentandelar av enstaka celler, livskraftiga celler och APC+/FITC- celler kvantifierades för att utvärdera renhet och livskraft efter isolering av celler. Data som visas representerar den genomsnittliga ± standardavvikelsen. n=4. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enkelcellig RNA-sekvensering (scRNA-seq) får snabbt dragkraft som ett kraftfullt verktyg för att samtidigt studera olika cellpopulationer på encellsnivå. På grund av höga kostnader i samband med provberedning och hög genomströmningssekvensering är det absolut nödvändigt att optimera cellulära ingångar (hög livskraft och renhet) för att öka sannolikheten för experimentell framgång. Vissa cellberedningsprotokoll förlitar sig på avlägsnande av döda celler och skräp med lågspinntvättar och kolumnbaserad separation utan FACS-sortering14. Många av dessa metoder minskar dock avsevärt antalet livskraftiga återställda celler, och i många fall avlägsnas döda celler inte helt14. Detta protokoll beskriver en enkel metod för att isolera mycket livskraftiga Sca1+ fett stamceller som innehåller minimala cellulära skräp, celldubbar och döda celler. Även om celler isolerade med detta protokoll uppvisade hög livskraft, rekommenderar vi fortfarande att minimera tiden mellan cell isolering och ytterligare nedströms analys för att upprätthålla hög livskraft. Dessutom är framgångsrik antikroppsmärkning avgörande för att isolera Sca1+ fettavkompitorceller med hög renhet. Bestämning av optimal koncentration av antikroppar rekommenderas därför starkt för varje antikropp, och utspädning av antikropparna i steg 3.2 kan justeras i enlighet därmed.
Detta flöde cytometry-baserade protokoll är mottagliga för anpassning beroende på individuellt intresse för specifika fett stamceller subpopulationer. Här kan alternativa antikroppskombinationer användas för att identifiera och isolera den eller de populationer som är av intresse. På grund av omfattande APC-markör mångfald, flera laboratorier studerar APCs med hjälp av scRNA-seq rapport isolera celler med andra ytmarkörer. Till exempel har PDGFRA+/ CD44+ celler, CD31-/ CD45-/ Ter119-/ CD29+/ CD34+/ Sca1+ celler och Pdgfrb+ celler isolerats av FACS för nedströms APC scRNA-seq-analyser8,9,11. CD142+ subpopulationer har också karakteriserats och visas uppvisa begränsad adipogenic differentiering kapacitet och en förmåga att undertrycka adipogenesis10,11. Förutom Sca1 användes nyligen kombinationer av antikroppar mot SUBPOPULATIONER CD55, CD81 och CD9 för att prospektivt isolera SUBPOPULATIONER AV ASC och preadipocyte (med hjälp av detta protokoll) och studera subpopulation molekylär och funktionell heterogenitet7. Eftersom fettavkompitorceller från andra fettkuddar, inklusive inguinala fettkuddar och bruna fettvävnader, har isolerats med kollagenasavledning som det nuvarandeprotokollet 15,16,17,kan det nuvarande protokollet vara tillämpligt på isolering av stamceller från fett från andra fettvävnader.
Ett förbehåll för det nuvarande tillvägagångssättet är att det är skräddarsytt för isolering av omogna APC: er. Även om det nuvarande protokollet ger hög livskraft APCs, är effektiviteten och effektiviteten av isolering av andra fettvävnad bosatta celltyper (dvs. immunceller, fibroblaster, endotelceller, etc.) oklart. Viktigt är att detta protokoll inte är lämpligt för isolering av mogna adipocyter. Adipocyter har varit extremt svåra att isolera med FACS på grund av deras stora cellstorlek och bräcklighet. Nyligen rapporterades isolering av mogna adipocyter av FACS med hjälp av en stor munstycksstorlek (150 μm) och lågt manteltryck (6 psi) med en specifik FSC/ SSC gating strategi18. Framtida studier kan kanske slå samman detta adipocyte isolering protokoll med protokollet beskrivs här för att upprätta en mer omfattande pipeline för att isolera och studera olika celltyper inom fettvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi bekräftar Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility för hjälp med FACS sortering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
- Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
- Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C.
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
- Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
- Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
- De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
- Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219 (2020).
- Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057 (2018).
- Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).
