Vi præsenterer en enkel metode til at isolere meget levedygtige fedt stamceller fra mus epididymal fedt puder ved hjælp af fluorescens aktiveret celle sortering.
Fedme og metaboliske lidelser såsom diabetes, hjertesygdomme, og kræft, er alle forbundet med dramatiske fedtvæv remodeling. Vævsbeboende fedt progenitorceller (APC’er) spiller en central rolle i fedtvævshomøostase og kan bidrage til vævspatologien. Den stigende brug af enkeltcelleanalyseteknologier – herunder enkeltcellede RNA-sekventering og enkeltcelleproteomics – transformerer stamcellefeltet med en enkelt celle ved at tillade en hidtil uset opløsning af individuelle celleudtryksændringer i forbindelse med ændringer i hele befolkningen eller vævet. I denne artikel leverer vi detaljerede protokoller til dissekering af epididymalt fedtvæv til mus, isolerer enkelt fedtvævsafledte celler og udfører fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for at berige til levedygtig Sca1+/ CD31–/ CD45–/ Ter119– APC’er. Disse protokoller vil gøre det muligt for efterforskere at udarbejde apc’er af høj kvalitet, der er egnede til downstream-analyser såsom enkeltcellet RNA-sekventering.
Fedtvæv spiller en central rolle i energimetabolismen. Overskydende energi opbevares i form af lipider, og fedtvæv er i stand til betydelig ekspansion eller tilbagetrækning afhængigt af ernæringsstatus og energisk efterspørgsel. Udvidelse af fedtvæv kan skyldes en stigning i adipocyt størrelse (hypertrofi) og / eller fra en stigning i adipocyt nummer (hyperplasi); sidstnævnte proces er stramt reguleret af spredning og differentiering af fedtprovenatorceller1,2. Under fedme, fedtvæv overdrevent udvider, og væv dysfunktion – herunder hypoxi, inflammation, og insulinresistens – ofte udvikler3,4. Disse komplikationer er risikofaktorer for mange kroniske sygdomme, herunder hypertension, diabetes, hjerte-kar-sygdomme, slagtilfælde og kræft5. Derfor er begrænsning af ukontrolleret fedtvævsudvidelse og afbødning af fedtvævspatologier de bedste biomedicinske forskningsprioriteter. Under adipose væv ekspansion, hjemmehørende fedtvæv-afledte stamceller (ASCs) formere sig og differentiere sekventielt i præadipocytter (begået stamceller) og derefter i modne adipocytter6. Nylige enkeltcellede RNA-sekventeringsundersøgelser (scRNA-seq) viser , at disse adipose progenitorcellepopulationer (ASC’er og præadipocytter) udviser betydelig molekylær og funktionel heterogenitet7,8,9,10,11,12. For eksempel viser ASC’er en reduceret adipogen differentieringskapacitet, samtidig med at de udviser højere sprednings- og ekspansionskapacitet sammenlignet med præadipocytter7. Yderligere molekylære forskelle rapporteres inden for ASC- og præadipocytpopulationer, selv om den funktionelle relevans af disse forskelle fortsat er uklar7. Tilsammen fremhæver disse data kompleksiteten af den fedtvenlige stamfadercellepulje og understreger behovet for at udvikle og standardisere værktøjer til bedre at forstå og manipulere disse kritiske cellepopulationer.
Denne protokol beskriver isoleringen af høj levedygtighed Sca1+ fedt progenitor cellepopulationer fra mus epididymal fedt puder, der er egnede til følsomme downstream analyser, herunder enkelt-celle undersøgelser (scRNA-sekventering) og cellekultur. Isolering og dissociation af epididymale fedtpuder blev udført som tidligere beskrevet7,13 med mindre ændringer, der forbedrer levedygtigheden af isolerede APC’er. Kort sagt, dissociated celler fra epididymal fedt puder er plettet med antistoffer mod Sca1, en markør for både ASCs og præadipocytter6,7, og andre afstamning (Lin) markører: Ter119 (erythroid celler), CD31 (endotelceller), og CD45 (leukocytter). Levedygtig Sca1+/Ter119–/CD31–/CD45–/DAPI– celler sorteres derefter efter fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Det er vigtigt, at denne protokol blev valideret ved vellykket isolering og analyse af levedygtige Sca1+/ Lin– fedt progenitor celler rapporteret i en nylig enkelt celle RNA sekventering undersøgelse, der identificerede funktionelt heterogene delpopulationer i ASC’er og præadipocytter7.
Enkeltcellet RNA-sekventering (scRNA-seq) får hurtigt trækkraft som et kraftfuldt værktøj til samtidig at studere forskellige cellepopulationer på enkeltcelleniveau. På grund af høje omkostninger forbundet med prøveforberedelse og høj gennemløbssekvensering er det vigtigt at optimere cellulære indgange (høj levedygtighed og renhed) for at øge sandsynligheden for eksperimentel succes. Nogle celleforberedelsesprotokoller er afhængige af fjernelse af døde celler og snavs ved hjælp af lavspinvask og kolonneba…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility for at få hjælp til FACS-sortering.
1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |