Summary
这种将药物直接滴入新生儿啮齿动物气管的技术对于研究局部施用的药物或生物制剂对新生儿肺部疾病的影响非常重要。此外，该方法还可用于在动物模型中诱导肺损伤。
Abstract
用直接滴入气管的药物治疗新生儿啮齿动物可以作为研究局部施用药物影响的宝贵工具。这具有直接的转化作用，因为表面活性剂和药物是局部施用于肺部的。虽然文献中有许多出版物描述了成年小鼠和大鼠在治疗实验中的微创经口插管，但新生儿大鼠幼崽缺乏这种方法。幼崽中口气管区域/咽部的小尺寸使得喉腔（声带）的可视化变得困难，导致气管内药物递送的成功率参差不齐。我们在此证明对新生大鼠幼崽的有效口服插管 - 一种非创伤性和微创的技术，因此可用于连续给药。我们使用带有照明系统和放大镜的手术耳镜来可视化大鼠新生儿的气管开口。然后使用连接到移液器尖端的1mL注射器滴注药物。使用Evans蓝色染料施用证明了递送方法的准确性。这种方法很容易接受培训，可以作为将药物灌输到气管的有效方法。该方法还可用于施用接种物或药剂以模拟动物的疾病状况，也可用于各种肺部疾病的基于细胞的治疗策略。
Introduction
早产儿的肺发育不良，需要许多介入治疗，如长期通气。这些干预措施使存活的新生儿面临随后后遗症1的高风险。实验动物模型是模拟各种疾病状况，研究疾病的病理生物学和评估治疗干预措施的重要工具。尽管从小鼠，大鼠和兔子到早产羔羊和猪的广泛动物模型可用，但小鼠和大鼠是最常用的。
使用小鼠和大鼠的主要优点是相对较短的妊娠期和降低成本。它们也很容易获得，易于在无病环境中维护，遗传上是同质的，并且伦理问题相对较少2，3。啮齿动物模型的另一个主要优点是，出生时，新生儿幼崽处于肺发育的晚期运河/早期囊骨阶段，这在形态上相当于24周早产新生儿的肺继续发展支气管肺发育不良4。此外，由于他们的肺发育在生命的前4周内迅速进展到完成，因此在合理的时间范围内研究产后肺成熟是可行的4。尽管有这些优点，但小鼠和大鼠幼崽的小尺寸是各种干预措施的关注点，这迫使大多数研究人员使用成年动物而不是幼崽5。新生儿肺处于发育阶段，新生儿对刺激剂的反应与成人不同。这使得使用新生儿动物模型来研究人类新生儿疾病状况变得合适。
有不同的方法可以给肺部施用药物/生物制剂。这包括鼻内6，7 或气管内8，9，10 滴注以及气溶胶吸入11，12。每种方法都有自己的技术挑战、优点和局限性13.气管内给药途径优选治疗剂以研究在绕过全身效应的器官中的直接治疗影响。该途径也可用于研究由刺激剂引起的肺部病理学。有侵入性和微创技术可以做到这一点，并且很容易在成人中执行。然而，在幼崽中，由于动物的体型小，插管过程存在技术挑战。目前的研究提出了一种简单，一致，非手术气管内滴注（ITI）方法，可用于研究各种新生儿治疗干预措施的疗效以及生成模拟新生儿呼吸道疾病的动物模型。
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Protocol
所有实验均由凯斯西储大学的机构动物护理和使用委员会（协议#2020-0035）批准。所有动物均按照NIH关于实验室动物护理和使用指南进行治疗。
1. 动物
- 商业上获得怀孕的Sprague Dawley大鼠。
- 将动物保持在批准的兽医设施中，光暗循环为14小时/ 10小时，相对湿度为45-60%。
2. 测试化合物的制备
- 使用Evans蓝染料作为测试化合物来评估气管内滴注程序的疗效。
- 在磷酸盐缓冲盐水（pH 7.2）中制备0.25%（w / v）染料溶液，并使用0.45μm注射器过滤器灭菌。
3. 麻醉管理
- 使用气体麻醉（3%异氟醚在100%氧气中）麻醉大鼠幼崽，使用适用于小鼠新生儿的改良递送系统。
- 检查尾巴和踏板反射的丧失以及浅呼吸，以确保进行手术的适当麻醉深度。
4. 气管内滴注
- 在产后第5天（PN 5）使用大鼠幼崽进行ITI。PN 5大鼠幼崽的平均重量为12克。
- 使用实验室标签胶带将麻醉的大鼠幼崽限制在倾斜的平坦平台上。幼崽在仰卧位以约45°的角度被约束。
- 张开新生儿的嘴，用钝镊子轻轻地将舌头拉出一侧。
- 使用连接到耳镜的直径为2 mm的小耳镜窥镜轻轻握住舌头并正确观察喉部。
- 使用喉咙照明器系统，即手术耳镜和放大镜，以正确显示声带（图1）。
- 在倾斜平面上以45°的角度定位动物。使用鼠标固定架的有线杆盖（图2）。
注意：将动物定位在45°的角度可以更好地可视化气管开口，而不会受到会厌的干扰。 - 取一个长角度移液器吸头，用于上样蛋白质印迹凝胶。使用手术刀片切割移液器尖端的底部，使其很好地适合1 cc注射器的尖端。
- 使用安装在长角度移液器吸头中的无菌1 mL注射器将30-50μL物质输送到肺中。倒置注射器，将近0.9 cc的空气吸入连接到移液器尖端的1 mL注射器中，然后吸出染料或要输送的物质。这允许在施用染料后将染料后面的空气推入气管中，如图 3所示。气管内给药是通过可视化喉腔（声带）并将安装在注射器上的移液器尖端插入气管腔来实现的。
- 使用耳镜的窥器握住舌头并暴露声带。窥器起着喉镜叶片的作用。将移液器尖端弯曲至30°角，以便于将移液剂通过锥形窥器轻松引入气管开口。
- 将移液器尖端引入气管开口至声带外约2毫米处。推动注射器的活塞通过操作耳镜的窥器施用染料或药物，如图 3所示。在施用药物后不久将空气引入肺部可防止该物质回到喉腔。
- 用染料或生理盐水给幼犬后，将幼崽放在集成的循环液体加热垫（38°C）上，直到它们的呼吸运动有规律。从麻醉中完全恢复后，将幼崽与大坝团聚。
5. ITI交付的表征
- 在ITI之后，通过给予过度麻醉（氯胺酮100mg / kg和赛拉嗪10mg / kg）/硫喷酮，然后在给药后的适当时间放血，对大鼠幼崽实施安乐死。安乐死是实验的一部分，以收集肺组织以证明其疗效。
- 将安乐死的大鼠幼崽固定在解剖板上，并用70%的乙醇擦拭胸部和腹部。
- 为了评估染料在整个肺部的分布，使用无菌技术从动物身上取出肺部，并根据需要显示肺部以进行成像（图4A，B）。
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Representative Results
Evans Blue的滴注揭示了涉及所有肺叶的染料的多灶分布（图4A，B）。如图 4 所示的结果证明了分布到所有波瓣的功效。这张照片是在染料进入气管的ITI后立即拍摄的。将染料滴入气管，然后将其扩散到两侧的所有肺叶中，实现了100%的功效。预计染料将在肺小叶内进一步扩散。通过反复给药，我们已经能够确保100%成功地将其传递到肺叶和所有小叶。我们确保没有染料到达胃部或肺部外。这证明了该技术作为100%施用到肺部的功效。异氟醚麻醉使幼崽在手术后恢复得更快。
从第5天开始的大鼠幼崽耐受了这种手术，并且在麻醉后花了不到5分钟的时间进行。一些动物虽然发展了短暂性呼吸暂停，但在几分钟内恢复了正常的呼吸模式。
图 1：耳镜组件。 （A） 电源 2.5 V （B） 放大镜 （C） 透射仪 （D） 窥镜。 请点击此处查看此图的大图。
图2：动物的位置。 动物以45°角的定位提供了更好的气管开口可视化，而没有会厌的干扰。 请点击此处查看此图的大图。
图3：气管内滴注。 使用耳镜/喉咙照明器系统可视化气管开口，以实现直接输送到肺部。 请点击此处查看此图的大图。
图4：ITI滴注和埃文斯蓝染色。 （A）ITI滴注将染料输送到整个肺部。可以看到染料分布在肺的两个裂片上，如黑色箭头所示。胃中没有染料证实了该技术的成功（红色箭头）。（B）从大鼠幼崽滴注50μL0.25%埃文斯蓝染料的肺。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
气管内滴注是一种极好的方法，与现有的呼吸系统疾病干预方法以及疾病模型开发相比，它具有多种优势。这是一种快速的方法，并且经验丰富，可以以每只动物的平均速度2-3分钟进行。成功插管的关键考虑因素是动物的正确镇静，正确的位置，特别是头部，以及口咽部窥器的准确位置深度/大小。适当的镇静剂将为操作员，特别是初学者提供足够的工作时间。动物以45°角定位对于声带的正确可视化非常重要。将窥器放置在正确的深度有助于在整个过程中回缩舌头，这再次允许声带的良好可视化。一个由两个人组成的团队可以轻松协调这项工作。一个可以协调动物的麻醉和笼子，而另一个可以处理滴注。ITI在技术上最具挑战性的部分是正确的气管插管。该技术的成功通过插管后给予染料来证实。确认正确插管的初始步骤非常重要，因为管子很有可能滑入食道，导致物质输送到胃中，而不是肺部。
唯一必须小心的部分是与插管不当相关的潜在创伤。一个人也必须非常温柔和小心，以避免穿透气管或声带周围的组织。如果出现 2 次或 3 次漏诊 2 次，也建议不要进行 ITI。
药物/生物制剂的给药途径不同，每种途径都有其固有的优点和缺点。方法的选择主要基于研究目标和干预的性质。鼻内滴注和雾化技术都将药物输送到上呼吸道和肺部。这有利于涉及上呼吸道的研究13，21 ，然而，将物质输送到肺部是不可靠的。此外，吞咽，打喷嚏和不同的呼吸频率可能导致剂量不一致。然而，某些物质的物理化学性质影响其气雾化15的效率。研究人员使用气管内接种来解决这个问题，无论颗粒大小和粘度如何，都将接种物/药物直接输送到肺部23。
两种主要的气管内分娩方法包括经口气管内输液14，15 和经气管滴注联合或不联合气管切开术16，17。ITI是一种程序，一旦训练18，就可以快速对大量动物施用各种治疗剂量。虽然经口气管内滴注常规用于成年大鼠，但新生儿需要更具侵入性的技术，例如手术切口16，19，20。由于几个原因，研究人员仍然避免在幼崽中使用这种经口ITI技术。新生儿啮齿动物的小尺寸使得喉腔的可视化变得困难，并且插管效果不佳。此外，用于成人ITI的传统金属喉镜不能用于新生儿，因为口腔尺寸小且粘膜组织脆弱16，18，10。需要较小的窥器和导管来观察喉腔并将治疗剂/药物输送到肺部。操作员必须技术娴熟才能实现这一目标。最后，从麻醉，体温过低，母体排斥和食人行为中恢复给大鼠新生儿的恢复和生存带来了额外的问题21，22。我们的研究采用了气体麻醉，然后在加热垫中恢复并与哺乳期大坝团聚。这避免了与体温过低、母亲排斥或自相残杀相关的问题。许多非手术干预研究涉及通过口腔对气管进行盲插管。这在药物的情况下尤其不可接受，如果药物被错误地灌输到食道中，则可能会错过效果。在这项研究中，使用耳镜可视化气管开口，并将略微弯曲的移液器尖端直接插入气管中以输送物质，在这种情况下是染料。我们的技术展示了将药物施用于小老鼠幼崽气管的有效方法。
ITI的过程，是经过细致训练后执行的可靠方法。一旦训练，它可以像成年啮齿动物13，24，25一样快速有效地完成。正确的气管内滴注可以通过几种方法确认，包括染料或液体在管或注射器中的运动26，27，28。由于可以通过这种方法可视化气管开口，因此未命中非常少。在ITI后立即在几只幼崽中观察到呼吸暂停，该幼崽自发恢复18，29。使用耳镜和最小的窥器作为新生儿大鼠小口腔的完美契合18。这项研究的结果表明，该物质可以始终如一地输送到肺的所有肺叶，正如染料定位所证实的那样。该方法在需要新生大鼠可靠地模拟新生儿肺部状况30，31，32的实验研究中具有重要意义。该技术还可用于进行肺功能研究33以及细胞/干细胞移植研究34，35，36，该研究目前采用手术干预，可能对幼崽造成痛苦。
这种技术也有助于动物研究中的改进和减少原则。这种方法可以替代用针头直接气管内注射，这是一种盲法，并且具有侵入性，因为它会刺穿气管引起疼痛和出血。与此形成鲜明对比的是，这种技术有助于减轻疼痛，同时完善将药物引入气管，立即减轻疼痛和痛苦，并改善参与研究的动物的福利37。此外，将药物施用到气管中直接可视化，确保疗效。虽然将药物滴入气管在大型动物中被广泛实践，但我们在5天大的老鼠幼崽中使用它的改进是我们想在这里强调的创新。
本文提供了一种简单，微创且可重复的方法，可用于施用有害物质，以模拟病理状况以及局部施用药物，抗氧化剂，细胞/干细胞用于新生儿治疗。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了从NICHD到AH的R01HD090887-01A1的部分支持。作者还承认Peter Mc Farlane博士的实验室提供的设施，如吸入麻醉/加热垫系统。凯瑟琳·梅耶尔女士在建立该系统方面提供的宝贵协助值得赞赏。资助机构在研究、收集、分析和解释数据或撰写手稿方面没有发挥任何作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Evans Blue dye | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 314-13-6 | Confirmation of drug administration into lungs |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA | Dispensed from Animal care facility | For sedation |
| Operating Otoscope | Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA | 21770- 3.5V | For visualization of vocal cords |
| Otoscope Rechargeable Handle | Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA | 71050-C | |
| Pipette tip (Gel loading) | Fisherbrand | 02-707-139 | Administering the drug |
| Platform for restraining (inclined plane) | Animal care facility | Dispensed from Animal care facility | Wired roof of mice cage can be used |
| 3M Micropore Surgical White Paper (sticking tape) | 3M, St. Paul, MN, USA | 1530-2 | |
| Luer Lock SyringeSyringes (1 ml) | BD Franklin Lakes, NJ , USA | NBD2515 | Administering the drug |
| Xylazine | Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA | For sedation |
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