Summary
新生児げっ歯類の気管に直接薬物を点滴するこの技術は、局所投与された薬物または生物学的製剤が新生児肺疾患に及ぼす影響を研究する上で重要である。さらに、この方法は、動物モデルにおける肺損傷を誘発するためにも使用され得る。
Abstract
気管に直接点滴された薬物による新生児げっ歯類の治療は、局所投与された薬物の影響を研究するための貴重なツールとして役立つ可能性がある。界面活性剤と薬物は肺に局所的に投与されるため、これは直接的な翻訳に影響を与えます。文献には、治療実験における成体マウスおよびラットの低侵襲経口腔挿管を記載した多くの出版物があるが、新生児ラットの仔におけるこのアプローチは欠けている。仔犬の口腔気管領域・咽頭の大きさが小さいため、喉頭内腔(声帯)の可視化が難しくなり、気管内薬物送達の成功率の変動に寄与しています。我々はここに、新生児ラット仔の効果的な経口挿管を実証する - 非外傷性および低侵襲性である技術であり、薬物の連続投与に使用することができる。照明システムと拡大レンズを備えた手術用耳鏡を使用して、ラット新生児の気管開口部を視覚化しました。次いで、薬物をピペットチップに接続された1mLシリンジを用いて点滴する。送達方法の精度を、エバンスブルー染料投与を用いて実証した。この方法は訓練を受けやすく、気管に薬物を注入する効果的な方法として役立つ可能性があります。この方法はまた、動物における疾患状態をシミュレートするための接種剤または薬剤の投与、および、また、様々な肺疾患に対する細胞ベースの治療戦略にも使用され得る。
Introduction
早産で生まれた新生児は、肺の発達が悪く、長期換気などの多くの介入療法が必要です。これらの介入は、生存している新生児をその後の後遺症1のリスクが高い状態に置く。実験動物モデルは、さまざまな疾患状態をシミュレートし、疾患の病態生物学を研究し、治療介入を評価する上で重要なツールとして役立つ。マウス、ラット、ウサギから早産の子羊やブタまで、幅広い動物モデルが利用可能ですが、マウスとラットが最も使用されています。
マウスおよびラットを使用する主な利点は、妊娠期間が比較的短く、コストが削減されることです。それらはまた、容易に入手でき、無病な環境で維持しやすく、遺伝的に均質であり、倫理的懸念が比較的少ない2,3。げっ歯類モデルのもう一つの大きな利点は、出生時に新生児の子犬が肺発達の後期小管状/早期嚢状段階にあり、形態学的に24週間の早産新生児ヒト乳児の肺と同等であり、気管支肺異形成を発症する4。さらに、彼らの肺の発達は生後4週間以内に完了まで急速に進行するので、合理的な時間枠で出生後の肺成熟を研究することは実行可能である4。これらの利点にもかかわらず、マウスおよびラットの仔のサイズが小さいことは、様々な介入の懸念の源であり、ほとんどの研究者は仔犬ではなく成体動物を使用することを余儀なくされる5。新生児肺は発達段階にあり、扇動剤に対する新生児の反応は成人の反応とは異なる。これにより、ヒトの新生児疾患状態を研究するために新生児動物モデルを使用することが適切である。
肺に薬物/生物学的薬剤を投与するには、さまざまな方法があります。これには、鼻腔内6、7または気管内8、9、10点眼ならびにエアロゾル吸入11、12が含まれる。各アプローチには、独自の技術的課題、利点、および制限事項があります 13.治療剤の気管内投与経路は、全身作用を迂回する器官における直接的な治療的影響を研究するのに好ましい。この経路は、扇動剤によって引き起こされる肺病理を研究するためにも使用することができる。これを行うには、侵襲的および低侵襲的な技術の両方があり、成人で実行するのは簡単です。しかし、子犬では、動物のサイズが小さいため、挿管プロセスに関連する技術的な課題があります。今回の研究は、ラット仔における単純で一貫性のある非外科的気管内点滴(ITI)法を提示しており、これは様々な新生児治療介入の有効性を研究し、新生児呼吸器疾患をシミュレートする動物モデルを生成するために使用することができる。
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Protocol
すべての実験は、ケースウェスタンリザーブ大学の施設動物ケアおよび使用委員会(プロトコル#2020-0035)によって承認されました。全ての動物を、実験動物のケアおよび使用に関するNIHガイドラインに従って処置した。
1. 動物
- 妊娠中のスプレイグ・ドーリーラットを商業的に入手する。
- 14時間/ 10時間の明暗サイクルと45〜60%の相対湿度で承認された獣医施設で動物を飼育してください。
2. 試験化合物の調製
- 試験化合物としてエバンスブルー染料を使用して、気管内点眼手順の有効性を評価します。
- リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.2)中の色素の0.25%(w/v)溶液を調製し、0.45μmシリンジフィルターを使用してフィルター滅菌する。
3. 麻酔の投与
- ガス麻酔(100%酸素中の3%イソフルラン)を用いてラットの仔を麻酔し、小型ラット新生児に適合した改変送達システムを使用する。
- 尾とペダルの反射と浅い呼吸が失われていないか確認し、手順を実行するための麻酔の適切な深さを確認してください。
4. 気管内点滴(ITI)
- 出生後5日目(PN 5)にラットの子犬をITIに使用してください。PN 5ラットの子犬の平均体重は12グラムです。
- 麻酔をかけたラットの子犬を、実験室のラベリングテープを使用して傾斜した平らなプラットフォーム上で拘束する。子犬は仰臥位で約45°の角度で拘束されます。
- 新生児の口を開き、鈍い鉗子を使って舌を片側にそっと引き抜きます。
- 耳鏡に接続された直径2mmの小さな耳鏡鏡を使用して、舌を優しく保持し、喉頭を適切に視覚化します。
- 喉の照明システム、すなわち手術用耳鏡、および拡大レンズを使用して、声帯を適切に視覚化します(図1)。
- 動物を傾斜面で45°の角度で配置します。マウスケージの有線棒蓋を使用しています(図2)。
注:動物を45°の角度で配置すると、喉頭蓋の干渉なしに気管開口部をよりよく視覚化できます。 - ウェスタンブロットゲルの装填に使用される長い角度のピペットチップを取ります。手術用ブレードを使用してピペットチップのベースを、1ccシリンジの先端によく収まるように切断します。
- 長角度のピペットチップに取り付けた滅菌 1 mL シリンジを使用して、30 ~ 50 μL の物質を肺に送ります。シリンジを反転させ、ピペットチップに接続された1 mLシリンジに約0.9 ccの空気を吸引し、その後に送達される染料または物質を吸引します。これにより、 図3に示すように、色素が投与された後、色素の背後にある空気を気管内に押し込むことができる。気管内投与は、喉頭管腔(声帯)を可視化し、シリンジに嵌め込んだピペットチップを気管内腔に挿入することによって達成される。
- 耳鏡の鏡を使って舌を持ち、声帯を露出させます。スペキュラムは喉頭鏡の刃の役割を果たします。ピペットチップを30°の角度に曲げて、円錐形の鏡面から気管開口部への薬剤の導入を容易にします。
- ピペットチップを気管開口部に声帯を越えて約2mmのところまで導入する。シリンジのピストンを押して、 図3に示すように、手術用耳鏡の鏡を通して色素または薬物を投与する。薬剤の投与直後に肺に空気を導入すると、物質が喉頭腔に戻るのを防ぐ。
- 色素または通常の生理食塩水で子犬を投与した後、子犬の呼吸運動が規則的になるまで、統合された循環液加熱パッド(38°C)の上に置きます。麻酔から完全に回復した後、子犬をダムと再会させる。
5. ITI配信の特性評価
- ITIの後、ラットの仔を安楽死させ、過剰な麻酔(ケタミン100mg / kgおよびキシラジン10mg / kg)/チオペントンを与え、続いて投与後の適切な時期に放血する。安楽死は、有効性を実証するために肺組織を採取する実験の一部として行った。
- 安楽死させたラットの子犬を解剖ボードに固定し、胸部と腹部を70%エチルアルコールで拭きます。
- 肺全体にわたる色素の分布を評価するために、滅菌技術を用いて動物から肺を除去し、画像化のために適切に肺を表示する(図4A、B)。
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Representative Results
エバンスブルーの点眼は、すべての肺葉を含む色素の多焦点分布を明らかにした(図4A、B)。 図4 に示すような我々の結果は、すべてのローブへの分布の有効性を実証している。写真は、気管への染料のITIの直後に撮影されます。100%の有効性は、色素を気管に点滴し、続いて両側のすべての葉に広がることで達成された。色素は肺小葉内にさらに広がることが予想されます。反復投与により、これを肺に葉とすべての小葉の両方に届けることに100%成功することができました。私たちは、染料が胃や肺の外側に届かないようにしました。これは、肺への100%投与としての技術の有効性を証明している。イソフルラン麻酔は、処置後の子犬のより速い回復を可能にした。
5日目のラットの子犬はこの手順を許容し、麻酔後に行うのに5分もかかりませんでした。一部の動物は一過性無呼吸を発症しましたが、数分で正常な呼吸パターンを取り戻しました。
図1:耳鏡コンポーネント、 (A)電源2.5V(B)拡大レンズ(C)トランスイルミネーター(D)鏡。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:動物の配置。 45°の角度での動物の位置決めは、喉頭蓋の干渉なしに気管開口部のより良い視覚化を提供しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:気管内点眼 耳鏡/喉の照明システムを使用して気管開口部を可視化し、肺への直接送達を実現します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ITI点眼およびエバンスブルー染色(A)ITI点眼は、肺全体に色素を送達する。色素は、黒い矢印で示すように肺の両葉に分布しているのが分かる。胃に染料がないことは、この技術の成功を確認する(赤い矢印)。(B)ラットの仔犬の肺に50 μLの0.25%エバンスブルー色素を点眼する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
気管内点滴は、呼吸器疾患介入および疾患モデル開発のための既存の方法よりもいくつかの利点を提供する優れた方法である。それは迅速な方法であり、経験があれば、動物1匹あたり2〜3分の平均速度で行うことができます。挿管を成功させるための重要な考慮事項は、動物の適切な鎮静、特に頭部の正しい位置決め、および中咽頭のスペキュラの正確な配置/サイズです。適切な鎮静は、オペレータ、特に初心者にとって十分な作業時間を可能にするであろう。45°の角度での動物の位置決めは、声帯を適切に視覚化するために重要です。適切な深さでの鏡面鏡の配置は、手順全体を通して舌の収縮を助け、再び声帯の良好な視覚化を可能にする。2 人のチームでこの作業を簡単に調整できます。一方は動物の麻酔とケージを調整し、もう一方は点滴を扱うことができます。ITIの最も技術的に困難な部分は、気管への正しい挿管です。この技術の成功は、挿管後の色素の投与によって確認される。チューブが食道に滑り込み、肺ではなく胃に物質が送達される可能性が高いため、正しい挿管の最初のステップを確認することは非常に重要です。
注意しなければならない唯一の部分は、誤挿管に関連する潜在的な外傷です。1つはまた、気管や声帯を囲む組織を貫通することを避けるために、非常に穏やかで慎重でなければなりません。また、2 つまたは 3 つのミス 2 があった場合は、ITI を実行しないこともお勧めします。
薬物/生物学的薬剤の投与にはさまざまな経路があり、それぞれに固有の長所と短所があります。方法の選択は、主に研究目的および介入の性質に基づいている。鼻腔内点眼およびエアロゾル化技術の両方が、肺だけでなく上気道にも薬剤を送達する。これは、上気道13,21を含む研究に利益をもたらすが、肺への物質の送達は信頼できない。さらに、嚥下、くしゃみおよび呼吸速度の変化は、送達される用量の不整合につながる可能性がある。しかしながら、いくつかの物質の物理化学的性質は、それらの効率的なエアロゾル化15に影響を及ぼす。研究者らは、この問題を回避するために気管内接種を使用し、粒径および粘度にかかわらず、接種剤/薬物を肺に直接送達する23。
2つの主要な気管内送達方法には、経経口気管内14、15および気管切開の有無にかかわらず経気管点眼16、17が含まれる。ITIは、広範囲の治療用量を、一度訓練すれば、多数の動物に迅速に投与することができる手順である18。経経口気管内点眼は成体ラットにおいて日常的に使用されているが、新生児において外科的切開などのより侵襲的な技術が必要であった16、19、20。研究者は、いくつかの理由から、子犬におけるこの経口腔ITI技術の使用を依然として避けている。新生児げっ歯類のサイズが小さいため、喉頭内腔の視覚化が困難になり、挿管の成功が不十分です。また、成人のITIに使用される伝統的な金属喉頭鏡は、口腔のサイズが小さく、粘膜組織が壊れやすいため、新生児では使用できない16,18,10。喉頭腔を視認し、治療薬/薬剤を肺に送達するためには、より小さな鏡およびカテーテルが必要である。オペレータは、これを達成するために高度に熟練していなければなりません。最後に、麻酔からの回復、低体温、母親の拒絶反応、および共食いは、ラットの新生児の回復および生存にさらなる問題を引き起こす21,22。私たちの研究は、ガス麻酔の使用に続いて、加熱パッドでの回収と授乳ダムとの再会を採用しました。これにより、低体温症、母親の拒絶反応、または共食いに関連する問題を回避できます。非外科的介入研究の多くは、口腔を通る気管の盲検挿管を含む。これは、誤って食道に点眼されると効果が見逃される可能性のある薬物の場合、特に受け入れられない。この研究では、耳鏡を用いて気管開口部を視覚化し、わずかに曲がったピペットチップを気管に直接挿入して、物質、この場合は色素を送達する。我々の技術は、小さなラットの子犬の気管に薬物を投与する効果的な方法を実証する。
ITIのプロセスは、細心の注意を払ったトレーニングの後に行われる場合に信頼できる方法である。一度訓練されると、成体のげっ歯類のように迅速かつ効果的に行うことができる13、24、25。正しい気管内点眼は、チューブまたはシリンジ26、27、28における染料または液体移動を含むいくつかの方法によって確認することができる。この方法で気管開口部を視覚化することができるので、ミスは非常に少ない。無呼吸は、ITIの直後に数匹の仔犬で観察され、18,29匹が自発的に回復した。最小の鏡と共に耳鏡を使用することは、新生児ラット18の小さな口腔に完璧に適合するものとして役立った。この研究の結果は、色素局在化によって確認されるように、物質が肺のすべての葉に一貫して送達され得ることを示した。この方法は、新生児ラットが新生児肺状態を確実に模倣する必要がある実験的研究において非常に重要であるであろう30,31,32。この技術は、肺機能研究33および細胞/幹細胞移植研究34,35,36(現在外科的介入を採用しており、仔犬にとって苦痛である可能性がある)を実施するためにも使用することができる。
この技術は、動物研究における洗練と削減の原則にも貢献しています。この方法は、盲目的な技術であり、気管を突き刺して痛みや出血を引き起こすので侵襲的である針による直接気管内注射の代替として役立つ。完全に対照的に、この技術は、気管への薬物の導入を洗練させながら痛みを軽減し、痛みおよび苦痛の即時軽減を達成し、研究37に関与する動物の福祉を改善するのに役立つ。さらに、気管への薬物の投与は、有効性を確実に直接視覚化される。気管への薬物の点滴は大型動物で広く実践されていますが、5日齢のラットの子犬にこれを使用するための私たちの洗練は、ここで強調したい革新です。
この記事では、病理学的状態をシミュレートするための有害な薬剤の投与、ならびに新生児治療のための薬物、抗酸化剤、細胞/幹細胞の局所投与に使用できる、単純で低侵襲で再現可能な方法を提供する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この作業は、NICHDからAHまでのR01HD090887-01A1によって部分的にサポートされました。著者らはまた、吸入麻酔/加熱パッドシステムなど、Peter Mc Farlane博士の研究室によって提供された施設を認めている。キャサリン・メイヤー氏のシステム構築における貴重な支援は高く評価されています。資金提供機関は、研究、収集、分析、データの解釈、または原稿の作成において、いかなる役割も果たしませんでした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Evans Blue dye | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 314-13-6 | Confirmation of drug administration into lungs |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA | Dispensed from Animal care facility | For sedation |
| Operating Otoscope | Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA | 21770- 3.5V | For visualization of vocal cords |
| Otoscope Rechargeable Handle | Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA | 71050-C | |
| Pipette tip (Gel loading) | Fisherbrand | 02-707-139 | Administering the drug |
| Platform for restraining (inclined plane) | Animal care facility | Dispensed from Animal care facility | Wired roof of mice cage can be used |
| 3M Micropore Surgical White Paper (sticking tape) | 3M, St. Paul, MN, USA | 1530-2 | |
| Luer Lock SyringeSyringes (1 ml) | BD Franklin Lakes, NJ , USA | NBD2515 | Administering the drug |
| Xylazine | Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA | For sedation |
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