Summary
Questa tecnica di instillare farmaci direttamente nella trachea dei roditori neonatali è importante per studiare l'impatto di farmaci o biologici somministrati localmente sulle malattie polmonari neonatali. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato anche per indurre lesioni polmonari in modelli animali.
Abstract
Il trattamento del roditore neonatale con farmaci instillati direttamente nella trachea potrebbe servire come strumento prezioso per studiare l'impatto di un farmaco somministrato localmente. Questo ha un impatto traslazionale diretto perché tensioattivi e farmaci vengono somministrati localmente nei polmoni. Sebbene la letteratura abbia molte pubblicazioni che descrivono l'intubazione transorale minimamente invasiva di topi e ratti adulti in esperimenti terapeutici, questo approccio nei cuccioli di ratto neonatale è carente. Le piccole dimensioni della regione orotracheale / faringe nei cuccioli rendono difficile la visualizzazione del lume laringeo (corde vocali), contribuendo al tasso di successo variabile della somministrazione intratracheale del farmaco. Con la presente dimostriamo un'efficace intubazione orale del cucciolo di ratto neonatale - una tecnica non traumatica e minimamente invasiva, in modo che possa essere utilizzata per la somministrazione seriale di farmaci. Abbiamo usato un otoscopio operativo con un sistema di illuminazione e una lente d'ingrandimento per visualizzare l'apertura tracheale dei neonati di ratto. Il farmaco viene quindi instillato utilizzando una siringa da 1 mL collegata a una punta della pipetta. L'accuratezza del metodo di consegna è stata dimostrata utilizzando la somministrazione di colorante blu Evans. Questo metodo è facile da addestrare e potrebbe servire come un modo efficace per instillare farmaci nella trachea. Questo metodo potrebbe anche essere utilizzato per la somministrazione di inoculo o agenti per simulare le condizioni di malattia negli animali e, inoltre, per strategie di trattamento basate su cellule per varie malattie polmonari.
Introduction
I neonati nati prematuramente hanno polmoni poco sviluppati che richiedono molte terapie interventistiche come la ventilazione a lungo termine. Questi interventi pongono i neonati sopravvissuti ad alto rischio di sequelesuccessive 1. I modelli animali sperimentali servono come strumento importante per simulare varie condizioni di malattia, studiare la patobiologia delle malattie e valutare gli interventi terapeutici. Anche se è disponibile una vasta gamma di modelli animali da topi, ratti e conigli ad agnelli e maiali pretermine, topi e ratti sono i più utilizzati.
Il vantaggio principale dell'utilizzo di topi e ratti è il periodo di gestazione relativamente breve e il costo ridotto. Sono anche facilmente reperibili, facili da mantenere in ambienti indenni da malattie, geneticamente omogenei e hanno relativamente meno preoccupazione etica 2,3. Un altro grande vantaggio del modello di roditore è che alla nascita il cucciolo neonatale si trova in fase canalicolare tardiva / sacculare precoce dello sviluppo polmonare, che è morfologicamente equivalente al polmone di un neonato umano pretermine di 24 settimane che sviluppa la displasia broncopolmonare4. Inoltre, poiché il loro sviluppo polmonare progredisce rapidamente verso il completamento entro le prime 4 settimane di vita, è possibile studiare la maturazione polmonare post-natale in un lasso di tempo ragionevole4. Nonostante questi vantaggi, le piccole dimensioni dei topi e dei cuccioli di ratto sono fonte di preoccupazione per vari interventi, che costringono la maggior parte dei ricercatori a utilizzare animali adulti piuttosto che cuccioli5. I polmoni neonatali sono in una fase di sviluppo e la risposta di un neonato a un agente di incitamento differisce da quella di un adulto. Ciò rende appropriato l'uso di modelli animali neonatali per studiare le condizioni della malattia neonatale umana.
Esistono diversi metodi per somministrare farmaci / agenti biologici al polmone. Ciò include l'instillazione intranasale 6,7 o intratracheale 8,9,10 e l'inalazione di aerosol 11,12. Ogni approccio ha le sue sfide tecniche, i suoi vantaggi e i suoi limiti13. La via intratracheale di somministrazione degli agenti terapeutici è preferita per studiare l'impatto terapeutico diretto nell'organo bypassando gli effetti sistemici. Questa via potrebbe anche essere utilizzata per studiare la patologia polmonare causata da agenti incitanti. Ci sono sia tecniche invasive che minimamente invasive per farlo ed è facile da eseguire negli adulti. Tuttavia, nei cuccioli, a causa delle piccole dimensioni dell'animale, ci sono sfide tecniche associate al processo di intubazione. Il presente studio presenta un metodo di instillazione intratracheale (ITI) semplice, coerente e non chirurgico nei cuccioli di ratto che potrebbe essere utilizzato per studiare l'efficacia di vari interventi terapeutici neonatali e per generare modelli animali che simulano le malattie respiratorie neonatali.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (protocollo # 2020-0035) presso la Case Western Reserve University. Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. Animali
- Ottenere commercialmente ratti Sprague Dawley gravidi.
- Mantenere gli animali in una struttura veterinaria riconosciuta con ciclo luce-buio di 14 ore / 10 ore e umidità relativa del 45-60%.
2. Preparazione del composto in esame
- Utilizzare il colorante blu Evans come composto di prova per valutare l'efficacia della procedura di instillazione intratracheale.
- Preparare una soluzione allo 0,25% (p/v) del colorante in soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7,2) e sterilizzare con filtro a siringa da 0,45 μm.
3. Somministrazione dell'anestesia
- Anestetizzare i cuccioli di ratto utilizzando l'anestesia gassosa (3% di isoflurano in ossigeno al 100%), utilizzando un sistema di somministrazione modificato adattato per i neonati di ratti di piccole dimensioni.
- Controllare la perdita dei riflessi della coda e del pedale e la respirazione superficiale per garantire la corretta profondità dell'anestesia per l'esecuzione della procedura.
4. Instillazione intratracheale (ITI)
- Utilizzare cuccioli di ratto al giorno 5 post-natale (PN 5) per l'ITI. Il peso medio di un cucciolo di ratto PN 5 è di 12 grammi.
- Trattenere il cucciolo di ratto anestetizzato su una piattaforma piatta inclinata usando del nastro adesivo da laboratorio. Il cucciolo è trattenuto con un angolo di circa 45° in posizione supina.
- Aprire la bocca del neonato e tirare delicatamente la lingua da un lato usando una pinza smussata.
- Utilizzare un piccolo speculum otoscopio di 2 mm di diametro collegato all'otoscopio per tenere delicatamente la lingua e per una corretta visualizzazione della laringe.
- Utilizzare il sistema di illuminazione della gola, cioè l'otoscopio operativo e la lente d'ingrandimento per una corretta visualizzazione delle corde vocali (Figura 1).
- Posizionare gli animali con un angolo di 45° su un piano inclinato. Vengono utilizzati i coperchi a barra cablata delle gabbie per topi (Figura 2).
NOTA: Il posizionamento dell'animale con un angolo di 45° fornisce una migliore visualizzazione dell'apertura tracheale senza l'interferenza dell'epiglottide. - Prendi una punta di pipetta ad angolo lungo che viene utilizzata per caricare gel western blot. Tagliare la base della punta della pipetta usando una lama chirurgica in modo che si adatti bene alla punta della siringa da 1 cc.
- Utilizzare la siringa sterile da 1 mL montata su una punta della pipetta ad angolo lungo per erogare 30-50 μL della sostanza nel polmone. Capovolgere la siringa e aspirare quasi 0,9 cc di aria nella siringa da 1 mL collegata alla punta della pipetta seguita dal colorante o dalla sostanza da somministrare. Ciò consente di spingere l'aria dietro il colorante nella trachea dopo la somministrazione del colorante, come mostrato nella Figura 3. La somministrazione intratracheale si ottiene visualizzando il lume laringeo (corde vocali) e inserendo la punta della pipetta montata su una siringa nel lume tracheale.
- Usa lo speculum dell'otoscopio per tenere la lingua ed esporre le corde vocali. Speculum svolge il ruolo della lama di un laringoscopio. Piegare la punta della pipetta ad un angolo di 30° per facilitare la facile introduzione dell'agente attraverso lo speculum a forma di cono nell'apertura tracheale.
- Introdurre la punta della pipetta nell'apertura tracheale fino al punto di circa 2 mm oltre le corde vocali. Spingere il pistone della siringa per somministrare il colorante o il farmaco attraverso lo speculum dell'otoscopio operativo, come mostrato nella Figura 3. L'introduzione di aria nel polmone subito dopo la somministrazione dell'agente impedisce alla sostanza di tornare nella cavità laringea.
- Dopo aver somministrato al cucciolo il colorante o la normale soluzione salina, posizionare i cuccioli su una piastra riscaldante a fluido circolante integrata (38 ° C) fino a quando i loro movimenti respiratori sono regolari. Dopo il completo recupero dall'anestesia, riunire i cuccioli con la diga.
5. Caratterizzazione dell'erogazione itI
- Dopo ITI, eutanasia dei cuccioli di ratto somministrando un'anestesia eccessiva (ketamina 100 mg / kg e xilazina 10 mg / kg) / tiopentone seguita da dissanguamento in un momento appropriato dopo la somministrazione. L'eutanasia è stata eseguita come parte dell'esperimento per raccogliere il tessuto polmonare per dimostrare l'efficacia.
- Fissare il cucciolo di ratto eutanasizzato su un pannello di dissezione e pulire il torace e l'addome con alcol etilico al 70%.
- Per valutare la distribuzione del colorante in tutto il polmone, rimuovere i polmoni dall'animale utilizzando una tecnica sterile e visualizzare i polmoni come appropriato per l'imaging (Figura 4A, B).
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Representative Results
L'instillazione del blu di Evans ha rivelato una distribuzione multifocale del colorante che coinvolge tutti i lobi polmonari (Figura 4A,B). Il nostro risultato, come mostrato nella Figura 4, dimostra l'efficacia della distribuzione a tutti i lobi. La foto viene scattata immediatamente dopo l'ITI del colorante nella trachea. L'efficacia al 100% è stata raggiunta instillando il colorante nella trachea seguita dalla sua diffusione in tutti i lobi su entrambi i lati. Si prevede che il colorante si diffonda ulteriormente all'interno del lobulo del polmone. Con la somministrazione ripetuta, siamo stati in grado di garantire il successo al 100% nel fornire questo al polmone a entrambi i lobi e a tutti i lobuli. Abbiamo assicurato che nessun colorante raggiunga lo stomaco o al di fuori dei polmoni. Ciò testimonia l'efficacia della tecnica come somministrazione al 100% nei polmoni. L'anestesia isoflurano ha permesso un recupero più rapido dei cuccioli dopo la procedura.
I cuccioli di ratto dal giorno 5 hanno tollerato questa procedura e hanno impiegato meno di 5 minuti per eseguire dopo l'anestesia. Alcuni animali, sebbene abbiano sviluppato apnea transitoria, hanno riacquistato il normale schema respiratorio in pochi minuti.
Figura 1: Componenti dell'otoscopio. (A) fonte di alimentazione 2,5 V (B) lente d'ingrandimento (C) transilluminatore (D) speculum. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il posizionamento dell'animale. Il posizionamento degli animali con un angolo di 45° ha fornito una migliore visualizzazione dell'apertura tracheale senza l'interferenza dell'epiglottide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Instillazione intratracheale. Visualizzazione dell'apertura tracheale utilizzando il sistema di illuminazione dell'otoscopio / gola per ottenere la consegna diretta ai polmoni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Instillazione ITI e colorazione blu Evans. (A) L'instillazione ITI fornisce il colorante in tutti i polmoni. Il colorante può essere visto distribuito su entrambi i lobi del polmone come indicato dalla freccia nera. L'assenza di colorante nello stomaco conferma il successo della tecnica (freccia rossa). (B) Polmoni di cuccioli di ratto instillati con 50 μL di colorante blu Evans allo 0,25%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'instillazione intratracheale è un metodo eccellente che offre diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti per gli interventi sulle malattie respiratorie e lo sviluppo di modelli di malattia. È un metodo rapido e con esperienza, può essere eseguito con una velocità media di 2-3 minuti per animale. Le considerazioni chiave per un'intubazione di successo sono la corretta sedazione dell'animale, il suo corretto posizionamento, in particolare la testa, così come l'accurata profondità di posizionamento / dimensione della specula nell'orofaringe. Una corretta sedazione consentirebbe un tempo di lavoro sufficiente per gli operatori, in particolare i principianti. Il posizionamento dell'animale con un angolo di 45° è importante per una corretta visualizzazione delle corde vocali. Il posizionamento dello speculum alla giusta profondità aiuta nella retrazione della lingua durante tutta la procedura che consente nuovamente una buona visualizzazione delle corde vocali. Un team di due persone può facilmente coordinare questo lavoro. Uno potrebbe coordinare l'anestesia e l'ingabbiamento degli animali mentre l'altro potrebbe occuparsi dell'instillazione. La parte tecnicamente più impegnativa dell'ITI è l'intubazione corretta nella trachea. Il successo della tecnica è confermato dalla somministrazione di colorante dopo intubazione. È molto importante confermare la fase iniziale della corretta intubazione, poiché vi è una buona probabilità che il tubo scivoli nell'esofago con conseguente consegna della sostanza nello stomaco, piuttosto che nel polmone.
L'unica parte a cui bisogna stare attenti è il potenziale trauma associato alla desintubazione. Bisogna anche essere molto delicati e attenti per evitare di penetrare attraverso la trachea o il tessuto che circonda le corde vocali. Si raccomanda inoltre di non condurre ITI se ci sono stati 2 o 3 mancati2.
Esistono diverse vie per la somministrazione di farmaci / agenti biologici con ognuno con i suoi vantaggi e svantaggi intrinseci. La scelta di un metodo si basa principalmente sugli obiettivi di studio e sulla natura dell'intervento. Sia l'instillazione intranasale che le tecniche di aerosolizzazione forniscono agenti al tratto respiratorio superiore e ai polmoni. Ciò avvantaggia gli studi che coinvolgono il tratto respiratorio superiore13,21 tuttavia, la somministrazione di una sostanza ai polmoni è inaffidabile. Inoltre, la deglutizione, gli starnuti e le diverse frequenze respiratorie possono portare a incongruenze nelle dosi erogate. Tuttavia, le proprietà fisico-chimiche di alcune sostanze influenzano la loro efficace aerosolizzazione15. I ricercatori usano l'inoculazione intratracheale per aggirare questo problema, che indipendentemente dalle dimensioni delle particelle e dalla viscosità, fornisce inoculo / farmaci direttamente nei polmoni23.
I due principali metodi di somministrazione intratracheale includono l'intratracheale transorale14,15 e l'instillazione transtracheale con o senza tracheotomia 16,17. ITI è una procedura in cui una vasta gamma di dosi di trattamento può essere somministrata rapidamente a un gran numero di animali, una volta addestrati18. Mentre l'instillazione intratracheale transorale è abitualmente utilizzata nei ratti adulti, la tecnica più invasiva come l'incisione chirurgica è stata richiesta nei neonati 16,19,20. I ricercatori evitano ancora l'uso di questa tecnica ITI transorale nei cuccioli a causa di diversi motivi. Le piccole dimensioni del roditore neonatale rendono difficile la visualizzazione del lume laringeo insieme allo scarso successo nell'intubazione. Inoltre, il tradizionale laringoscopio metallico utilizzato per l'ITI negli adulti non può essere utilizzato nei neonati a causa delle piccole dimensioni della cavità orale e dei fragili tessuti mucosi 16,18,10. Speculum e cateteri più piccoli sono necessari per visualizzare la cavità laringea e fornire le terapie / agenti nel polmone. L'operatore deve essere altamente qualificato per raggiungere questo obiettivo. Infine, il recupero da anestesia, ipotermia, rigetto materno e cannibalismo crea ulteriori problemi per il recupero e la sopravvivenza dei neonati di ratto21,22. Il nostro studio ha impiegato l'uso dell'anestesia a gas seguita dal recupero nelle piastre riscaldanti e dal ricongiungimento con le dighe in allattamento. Questo evita problemi associati a ipotermia, rifiuto materno o cannibalismo. Molti degli studi di intervento non chirurgico comportano un'intubazione cieca della trachea attraverso la cavità orale. Questo è particolarmente inaccettabile nel caso di farmaci in cui l'effetto può essere perso se viene erroneamente instillato nell'esofago. In questo studio, l'apertura tracheale viene visualizzata utilizzando un otoscopio e una punta della pipetta leggermente piegata viene inserita direttamente nella trachea per erogare la sostanza, il colorante in questo caso. La nostra tecnica dimostra un modo efficace di somministrare il farmaco nella trachea di un piccolo cucciolo di ratto.
Il processo di ITI, è un metodo affidabile se eseguito seguendo una formazione meticolosa. Una volta addestrato può essere fatto rapidamente ed efficacemente come nei roditori adulti 13,24,25. La corretta instillazione endotracheale può essere confermata da diversi metodi tra cui il movimento del colorante o del liquido in un tubo o una siringa 26,27,28. Poiché è possibile visualizzare l'apertura tracheale in questo metodo, i mancati sono molto meno. L'apnea è stata osservata in alcuni cuccioli subito dopo l'ITI che è stato recuperato spontaneamente18,29. L'uso dell'otoscopio insieme al più piccolo speculum è servito come perfetto per la piccola cavità orale del ratto neonatale18. I risultati di questo studio hanno indicato che la sostanza può essere costantemente consegnata a tutti i lobi del polmone come confermato dalla localizzazione del colorante. Questo metodo sarebbe di grande importanza negli studi sperimentali in cui i ratti neonatali sono tenuti a imitare in modo affidabile le condizioni polmonari neonatali 30,31,32. Questa tecnica potrebbe anche essere utilizzata per effettuare studi di funzionalità polmonare33 e studi di trapianto di cellule / cellule staminali 34,35,36 che attualmente impiegano interventi chirurgici e potrebbero essere angoscianti per i cuccioli.
Questa tecnica contribuisce anche ai principi di raffinamento e riduzione nella ricerca sugli animali. Questo metodo serve come alternativa all'iniezione intratracheale diretta con un ago che è una tecnica cieca ed è invasiva in quanto perfora la trachea causando dolore e sanguinamento. In completo contrasto questa tecnica serve a ridurre il dolore mentre affina l'introduzione di un farmaco nella trachea, ottenendo un'immediata riduzione del dolore e della sofferenza e il miglioramento del benessere degli animali coinvolti nella ricerca37. Inoltre, la somministrazione del farmaco in trachea viene visualizzata direttamente garantendo l'efficacia. Sebbene l'instillazione di farmaci nella trachea sia ampiamente praticata negli animali più grandi, la nostra raffinatezza per usarlo in un cucciolo di ratto di 5 giorni è l'innovazione che vorremmo sottolineare qui.
Questo articolo offre un metodo semplice, minimamente invasivo e riproducibile che potrebbe essere utilizzato per la somministrazione di agenti dannosi al fine di simulare condizioni patologiche e per la somministrazione locale di farmaci, antiossidanti, cellule / cellule staminali per terapie neonatali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato in parte da R01HD090887-01A1 da NICHD a AH. Gli autori riconoscono anche le strutture fornite dal laboratorio del Dr. Peter Mc Farlane come l'anestesia per inalazione / sistema di riscaldamento. La preziosa assistenza della signora Catherine Mayer nella configurazione del sistema è apprezzata. L'ente finanziatore non ha svolto alcun ruolo nella progettazione dello studio, della raccolta, dell'analisi e dell'interpretazione dei dati o nella stesura del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Evans Blue dye | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 314-13-6 | Confirmation of drug administration into lungs |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA | Dispensed from Animal care facility | For sedation |
| Operating Otoscope | Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA | 21770- 3.5V | For visualization of vocal cords |
| Otoscope Rechargeable Handle | Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA | 71050-C | |
| Pipette tip (Gel loading) | Fisherbrand | 02-707-139 | Administering the drug |
| Platform for restraining (inclined plane) | Animal care facility | Dispensed from Animal care facility | Wired roof of mice cage can be used |
| 3M Micropore Surgical White Paper (sticking tape) | 3M, St. Paul, MN, USA | 1530-2 | |
| Luer Lock SyringeSyringes (1 ml) | BD Franklin Lakes, NJ , USA | NBD2515 | Administering the drug |
| Xylazine | Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA | For sedation |
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