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Biochemistry

मुर्गी के अंडों से बाहरी और इनर पेरिविटेललाइन सबलेयर्स का मैकेनिकल सेपरेशन और प्रोटीन घुलनीयकरण

Published: January 27, 2021 doi: 10.3791/61739
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut National de Recherche pour l'Agriculture, l'Alimentation et l'Environnement, Université de Tours, Biologie des Oiseaux et Aviculture, 37380, Nouzilly, France

Summary

यह लेख संरचनात्मक परिवर्तन को कम करते हुए और प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए प्रत्येक उपलेयर के प्रोटीन घुलनशीलता को अनुकूलित करने के लिए चिकन अंडे के बाहरी और आंतरिक पेरिविटेललाइन सबलेयर को अलग करने के लिए एक सरल विधि की रिपोर्ट करता है।

Abstract

अंडे की जर्दी को घेरे हुए पेरिविटेललाइन परत निषेचन में, अंडे की रक्षा में, और एवियन भ्रूण के विकास में एक मौलिक भूमिका निभाती है। यह दो प्रोटीनसियस सबलेयर द्वारा बनता है जो कसकर जुड़े होते हैं और अलग-अलग महिला प्रजनन अंगों द्वारा बनते हैं। दोनों संरचनाओं को अपनी कार्यात्मक विशिष्टताएं माना जाता है, जिन्हें परिभाषित किया जाना बाकी है। प्रत्येक सबलेयर रचना प्रोटीन के कार्य की विशेषता के लिए, पहली चुनौती उन स्थितियों को स्थापित करना है जो किसी भी संरचनात्मक क्षति को सीमित करते हुए इन दो जटिल परतों के यांत्रिक पृथक्करण के लिए अनुमति देंगे। दूसरा कदम बाद के जैव रासायनिक विश्लेषणों के लिए इन दो उपलेयरों से प्रोटीन घुलनशीलता की सुविधा के लिए प्रायोगिक स्थितियों का अनुकूलन करना है । सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉली-एक्रिलमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) द्वारा प्रत्येक उपलेयर के प्रोटीन प्रोफाइल का विश्लेषण करके इस दृष्टिकोण की दक्षता का आकलन किया जाता है, जो दोनों संरचनाओं के बीच अलग होने की उम्मीद है। यह दो कदम की प्रक्रिया सरल बनी हुई है; इसके लिए शास्त्रीय जैव रासायनिक उपकरण और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है; और आगे में गहराई से प्रोटेओमिक्स के साथ संगत है। यह तुलनात्मक जीव विज्ञान के लिए अन्य एवियन अंडों में भी स्थानांतरित किया जा सकता है, यह जानते हुए कि पेरिविटेललाइन परत की संरचना और संरचना में प्रजातियों की विशिष्ट विशेषताएं दिखाई गई हैं। इसके अलावा, सबलेयर्स सेपरेशन (स्टेप 1) के लिए विकसित गैर-डेनाचरिंग स्थितियां स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा उनके संरचनात्मक विश्लेषणों की अनुमति देती हैं। यह बाद में प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए प्रारंभिक कदम भी अपनी संबंधित जैविक गतिविधियों और 3 डी संरचना का विश्लेषण करने के लिए, या आगे इम्यूनोहिस्टोकेमिकल या कार्यात्मक विश्लेषण करने के लिए गठन कर सकता है। इस तरह के अध्ययनों से इन दो उपलेयरों के शारीरिक कार्य को समझने में मदद मिलेगी, जिनकी संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता प्रजनन सफलता के निर्धारक मानदंड हैं।

Introduction

इस विधि का उद्देश्य एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है जो पेरिविटेललाइन परत (पीएल) के बाद के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, जो अंडे की जर्दी को घेरने वाली एक पतली प्रोटीनसियस परत है और एवियन प्रजातियों के प्रजनन में एक मौलिक भूमिका निभा रहा है। पीएल, जिसे साहित्य में "विटेललाइन झिल्ली" भी कहा जाता है, कई प्रकार के ग्लाइकोप्रोटीन से बने मोटे फाइबर का एक त्रि-आयामी नेटवर्क है। इसमें एक आंतरिक पेरिविटेललाइन परत (आईपीएल) (जर्दी के संपर्क में) होती है जो अंडाशय में इकट्ठा होती है, और एक बाहरी पेरिविटेललाइन परत (ओपीएल, सफेद के संपर्क में), आईपीएल(चित्रा 1)पर झूठ बोल रही है और इनफंडीबुलम द्वारा उत्पादित होती है। यह उत्तरार्द्ध ऊतक ओव्यूलेशन के बाद परिपक्व जर्दी कूप प्राप्त करने वाले अंडाशय के कीप की तरह ऊपरी खंड है, और वह साइट जहां निषेचन होता है। ओपीएल का स्राव इन दो घटनाओं के बाद होता है और इसके बाद अंडाशय के अन्य विशिष्ट खंडों में अंडे के सफेद और अंडे के ढलने का लगातार जमा होता है। पीएल के शारीरिक कार्य न केवल निषेचन और भ्रूण के प्रारंभिक चरणों से संबंधित हैं, बल्कि भ्रूण के शारीरिक और आणविक संरक्षण के लिए भी हैं। पूरे पीएल पर किए गए चिकन अंडे के प्रोटेओमिक विश्लेषण से १३७ विभिन्न प्रोटीन1की उपस्थिति का पता चला, लेकिन आईपीएल और ओपीएल के बीच इनमें से अधिकांश प्रोटीन का वितरण स्पष्ट होना बाकी है । साहित्य रिपोर्ट में उपलब्ध डेटा की न्यूनतम मात्रा कि आईपीएल और ओपीएल बहुतअलग प्रोटीन प्रोफाइल2,3,4प्रदर्शित करते हैं, जो विभिन्न संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों का सुझाव देता है। ओपीएल और आईपीएल के बीच प्रोटीन के वितरण के बारे में डेटा की सापेक्ष कमी पतली और एम्बेडेड दोनों उपलेयरों को अलग करने की कठिनाई के कारण होने की संभावना है ।

यहां प्रस्तुत की गई विधि उन स्थितियों का वर्णन करती है जो उनकी प्रोटीन सामग्री को संरक्षित करते हुए अपने संबंधित हिस्टोलॉजिकल संरचना पर सीमित प्रभाव के साथ दो उपलेयरों को अलग करने के लिए उपयोग की जाने वाली हैं, और प्रोटेओमिक्स द्वारा बाद के विश्लेषण के लिए प्रोटीन के पूर्ण घुलनशीलता की अनुमति देने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करती हैं। इसमें दो मुख्य चरण शामिल हैं- 1) पीएल सैंपलिंग और ओपीएल/आईपीएल सेपरेशन और 2) पीएल, ओपीएल, और आईपीएल ट्रीटमेंट फॉर प्रोटीन घुलनशीलता और इलेक्ट्रोफोरेसिस मास स्पेक्ट्रोमेट्री एनालिसिस के लिए। वर्कफ्लो को चित्र 2में प्रस्तुत किया गया है । उल्लेखनीय है, हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल को प्रोटेओमिक विश्लेषण (चरण 2.2) के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन इसे हिस्टोलॉजिकल (जैसे, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी), इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण, कार्यात्मक अध्ययन (चरण 1) और नमक-घुलनशील प्रोटीन के शुद्धिकरण के लिए कुछ चरणों में रोका जा सकता है ताकि उनकी संरचना और जैविक गतिविधि (चरण 2.1)(चित्रा 2) कीविशेषता हो सके।

पहला कदम अंडे की जर्दी(चित्रा 2, चरण 1.1)से कुल पीएल को हटाना है। सभी प्रकाशित तरीके अंडे के सफेद को मैन्युअल रूप से जर्दी से अलग करने या अंडे के विभाजक का उपयोग करने के साथ शुरू करते हैं। इसके बाद शेष अंडे के सफेद और मोटी चालाज़ी को संदंश का उपयोग करके या फिल्टर पेपर 5(चित्रा 2 ए)पर सोखने के द्वारा हटायाजाता है। इसके बाद, नमूना पीएल के लिए चयनित तकनीकें प्रकाशित लेखों के आधार पर परिवर्तनशील हैं। कुछ कागजात में जर्दी के कई वॉश शामिल हैं, डिओनाइज्ड या आसुत पानी में1,5,6,0.85 से 1% खारा समाधान2,7,8,बफरिंग समाधानों में जैसे 0.15 एम एनएसीएल/एन-[ट्रिस (हाइड्रोक्सीमिथाइल) मिथाइल]-2-अमीनोएथेन्सुएल्फियोल, एसिडफ्फ, पीएच 7.44,या 0.01N एचसीएल (पीएच 2)3में। इन प्रक्रियाओं को चिकन, बतख, अंगूठी गर्दन वाले तीतर, ग्रे तीतर, कॉकटील तोता, घरेलू कबूतर, या रैटीज अंडे2,6,9पर लागू किया गया था। पीएल को हटाने जबकि अंडे की जर्दी जलीय समाधान के बिना एक पेट्री डिश में बनाए रखा जाता है बहुत श्रमसाध्य हो सकता है के रूप में पीएल नाजुक है और अंडे की जर्दी पीएल1, 5के लिएछड़ी की आदत है और इसलिए बाद में खत्म करने के लिए मुश्किल रहता है । 37 डिग्री सेल्सियस 3 पर एक घंटे के लिए अम्लीय बफर या समाधान का उपयोग भी पसंद नहीं कियाजाता है क्योंकि ऐसी स्थितियों से पीएल संरचना में परिवर्तन हो सकता है और प्रोटीन की हानि हो सकती है। अंकुरित डिस्क वाले क्षेत्र को हटाना भी महत्वपूर्ण है क्योंकि इस क्षेत्र में एक अलग संरचनात्मक और आणविक पैटर्न होने की संभावना है, जो पूरेपीएल 4,6,10 (चित्रा 2B) कोप्रतिबिंबित नहीं करता है। यह विधि कुछ प्रकाशित लेखों द्वारा हाइलाइट किए गए विचारों का लाभ उठाती है और इसकी अखंडता(चित्रा 2 सी)को संरक्षित करते हुए पीएल नमूने की सुविधा के लिए कुछ सुधारों का प्रस्ताव करती है।

दूसरे चरण में दो उपलेयरों(चित्रा 2,चरण 1.2) को अलग करना शामिल है। यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि ओपीएल और आईपीएल एक दूसरे से कसकर बंधे हुए हैं । यह कदम दूरबीन विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे संदंश के साथ सावधानी से आयोजित किया जाना चाहिए। ओपीएल/आईपीएल पृथक्करण की रिपोर्ट करने वाले प्रकाशन काफी सीमित हैं2,3,7,11 और उनमें से कुछ विशिष्ट शर्तों (1 घंटे2,3 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अम्लीयबफर)का उपयोग करते हैं जो उपलेरियों की हिस्टोलॉजिकल संरचना को प्रभावित करने की संभावना है और/या प्रोटीन हानि या जर्दी या सफेद संदूषण में योगदान देते हैं । आईपीएल से ओपीएल को बेहतर ढंग से अलग करने के लिए, कुछ लेखकों ने ओपीएल (आंतरिक परत बेरंग रहती है)11को थोड़ा रंग करने के लिए टोलुइडीन नीले रंग के उपयोग की सूचना दी । विकसित विधि में, हमने शर्तों को अनुकूलित किया ताकि अलगाव आसानी से प्राप्त हो सके और किसी भी डाई(चित्रा 2डी)के उपयोग की आवश्यकता न हो।

दूसरा मुख्य चरण प्रत्येक सबलेयर की रचना करने वाले प्रोटीन का घुलनशीलता है। शास्त्रीय रूप से, यह इलेक्ट्रोफोरेसिस के लिए उपयोग किए जाने वाले लेमलीबफर के साथ सीधे तैयार किए गए3, 4,11 पीएल/उपलेयरों को स्वच्छ लिओफिलाइज्ड1,सूखे2,6,या ताजा तैयार करके प्राप्त कियाजाता है। अन्य लेखकों ने 1% एसडीएस बफरिंग समाधान2,3,11 या कमरे के तापमान पर प्रोटीज अवरोधकों और एसडीएस 6 वाले समाधान में1% एनएसीएल में परतों के प्रारंभिक घुलनशीलीकरण को प्राथमिकता दी, जिसके बाद लगातार जोरदार सरगर्मी के तहत 45 डिग्री सेल्सियस12पर इनक्यूबेशन। कुछ लेखकों ने एक प्रोटोकॉल का भी वर्णन किया जहां पीएल को फॉस्फेट बफर नमकीन या यूरिया में इनक्यूबेटेड किया गया था और13को सोनिकेशन के अधीन किया गया था । इन उपचारों के बाद लाममली बफर में एक अपकेंद्रित्र और कमजोर पड़ने और सभी परतों से अधूरे प्रोटीन घुलनशीलता के नुकसान को साझा करते हैं क्योंकि अघुलनशील पदार्थ (अपकेंद्री के बाद प्राप्त गोली) का विश्लेषण करने के लिए नमूने से त्याग दिया जाता है।

इसके अलावा, प्रोटीन घुलनशीलता के लिए कुछ लेखकों द्वारा विकृत स्थितियों (यूरिया, डिटर्जेंट, उच्च तापमान, आदि) का उपयोग लक्षण वर्णन के लिए बाद में प्रोटीन शुद्धिकरण के साथ संगत नहीं है क्योंकि वे अपरिवर्तनीय रूप से प्रोटीन को निष्क्रिय करने, उनकी जैविक गतिविधियों में हस्तक्षेप करने और उनकी 3 डी संरचना को भी ख़राब करने की संभावना है। इस विशिष्ट चरण 2 के लिए, प्रोटोकॉल में पीएल/ओपीएल/आईपीएल मैकेनिकल डी-स्ट्रक्चरिंग के बाद गैर-denaturing स्थितियों के तहत सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन के घुलनशीलता के लिए अनुमति देने वाला पहला उपस्तर शामिल है, जो आगे प्रोटीन अध्ययन के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा, अगर जरूरत है(चित्रा 2,चरण 2.1), और एक दूसरा उप कदम है कि इलेक्ट्रोफोरेसिस और गहराई से प्रोटेओमिक्स(चित्रा 2,चरण 2.2) के लिए प्रोटीन के पूर्ण घुलनशीलता के लिए अनुमति देता है । यह प्रायोगिक अध्ययनों द्वारा मान्य नए विचारों के परिणामस्वरूप विभिन्न प्रकाशित पत्रों और समायोजनों से लिए गए सुझावों को जोड़ती है ।

Protocol

1.PL, आईपीएल, और OPL नमूने

  1. पीएल नमूना
    1. ताजा रखे अनिषेखीय अंडे को मैन्युअल रूप से तोड़ें और जर्दी को सफेद से अलग करने के लिए एक ग्लास बीकर पर लेटे हुए अंडे के विभाजक का उपयोग करें। छोटी कैंची के साथ चालाज़ी निकालें और एक पारदर्शी और दृश्यमान संरचना(चित्रा 2 ए)के रूप में दिखाई देने वाले अनुयायी एल्बुमन को हटाने के लिए एक फिल्टर पेपर पर जर्दी रोल करें।
      सावधानी: कैंची से पीएल पंचर न हो इसका ध्यान रखें। चालाज को हटाने के लिए कैंची के बजाय चिमटी का इस्तेमाल पीएल टूटना और बाद में जर्दी रिसाव को भड़का सकता है। फ़िल्टर पेपर पर रोलिंग चरण महत्वपूर्ण है और पेपर फ़िल्टर के शोषक गुणों के कारण बहुत जल्दी किया जाना चाहिए जो पीएल ब्रेकेज को ट्रिगर कर सकता है। इस पहले कदम की सफलता और बाद के सभी चरणों को अनुकूलित करने के लिए, वट के दिन से एक अनिषेचित अंडे का उपयोग करना भी बहुत महत्वपूर्ण है। वैकल्पिक रूप से, एक ठंडा वातावरण में 10 दिनों से कम संग्रहीत किए गए अंडे का उपयोग किया जा सकता है लेकिन प्रयोगकर्ताओं को पीएल परिवर्तन के संभावित जोखिमों पर विचार करना चाहिए।
    2. जर्दी को 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8 युक्त क्रिस्टलाइजर में विसर्जित कर दिया गया है जिसे पहले 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा कर दिया गया है और कुंद कैंची(चित्रा 2B)का उपयोग करके 1 सेमी क्षेत्र के भीतर अंकुरित डिस्क पर पीएल क्षेत्र को हटा दें।
      नोट: शुरू में, पीएल deionized पानी में डूब गया था, लेकिन इस दृष्टिकोण ऐसे पीएच नियंत्रण की कमी और कठिनाइयों के लिए उपलेयरों को अलग करने के लिए बाद में (कदम १.२) के रूप में कुछ नुकसान है । इसलिए, ट्रिस एकाग्रता(चित्रा 3 ए)और पीएच(चित्रा 3बी)सहित कई शर्तों का परीक्षण किया गया। पीएच 8 पर एक बफर का उपयोग, डिएकोनाइज्ड या डिमिनरलाइज्ड पानी के बजाय, अंडे के शरीर विज्ञान के अनुसार है (अंडे के सफेद का पीएच रखना के दिन लगभग 7.8 है)14 और प्रोटीन हानि को कम करता है। इसके विपरीत, अम्लीय या बहुत क्षारीय पीएच को पीएल डी-स्ट्रक्चरिंग और अर्ली प्रोटीन घुलनशीलता(चित्रा 3B)को ट्रिगर करने का संदेह है। 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8 से बना बफर इष्टतम पाया गया, क्योंकि यह अंडे के शरीर विज्ञान का सम्मान करता है और महत्वपूर्ण प्रोटीन घुलनशीलता का कारण नहीं बनता है (काम करने वाले बफर में प्रोटीन एकाग्रता न्यूनतम रहती है, चित्रा 3 ए,बी)।
    3. बफर में छोटी कैंची के साथ पीएल टूटना। उठी पीएल के दो किनारों को संदंश के साथ पकड़ें और जर्दी से पीएल छील लें।
    4. पीएल को संदंश के साथ बनाए रखें और 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8 के कई स्नानों में कई बार पीएल को कुल्ला करें जब तक कि जर्दी का कोई निशान दिखाई न दे। इस स्तर पर, यह सुनिश्चित करें कि पीएल साफ, सफेद और बफर में तैर रहा है। इसे उपलेयर पृथक्करण के लिए चरण 1.2 में या सीधे जैव रासायनिक विश्लेषणों के लिए 2.1 चरण में संसाधित किया जा सकता है।
  2. ओपीएल और आईपीएल सैंपलिंग
    1. एक प्लास्टिक पेट्री डिश में ऊपर की ओर ओपीएल डाल और यह संभव के रूप में कम झुर्रियों के साथ फ्लैट बनाए रखने के द्वारा पूरे पीएल नमूना बाहर फैला । 10 एमएम ट्राइस-एचसीएल पीएच 8, 50 एमएम एनएसीएल के साथ सैंपल को कवर करें। पीएल आंदोलनों को सीमित करने के लिए प्लास्टिक पेट्री डिश (और ग्लास नहीं) का उपयोग करें, क्योंकि पीएल प्लास्टिक के लिए बेहतर चिपक जाता है।
      1. ओपीएल की ओर से पता लगाने के लिए देखिए कि ओपीएल से जुड़ी बाकी चालॅ की लोकेशन कहां है न कि आईपीएल से । इस कदम के लिए सबलेयर जुदाई की सुविधा के लिए छोटे एनएसीएल एकाग्रता (50 mM) की आवश्यकता होती है।
        नोट: चित्रा 3C और साहित्य11में प्रस्तुत ग्राफ के आधार पर, इस एकाग्रता से प्रोटीन की बड़ी हानि नहीं होनी चाहिए। प्रारंभ में, उपलेयरियों को अलग करने के लिए डिएकाइज्ड पानी का उपयोग किया जाता था, जैसा कि पहले1,5,6वर्णित था, लेकिन यह तकनीक बहुत श्रमसाध्य पाई गई थी और इसके परिणामस्वरूप संरचनात्मक पीएल अखंडता में परिवर्तन हुआ था। इसलिए, अलग-अलग एनएसीएल सांद्रता(चित्रा 3 सी) कापरीक्षण किया गया क्योंकि नमक ने दो सबलेयर को अलग करने में मदद की। हालांकि, यह उल्लेखनीय है कि एनएसीएल एकाग्रता और जीटी;100 एमएम के उपयोग से पीएल से प्रोटीन घुलनशीलता/रिलीज बढ़ जाती है, जो यहां उद्देश्य नहीं है (यह चरण 2 में उद्देश्य होगा)(चित्रा 3 सी)। 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8 बफर में 50 एमएमएम एनएसीएल जोड़ने से दो सबलेयर को अलग करने की सुविधा होती है और प्रोटीन हानि कम होती है।
    2. कुल पीएल को छोटी कैंची से लगभग 2 सेमी x 3 सेमी के टुकड़ों में काट लें। यांत्रिक रूप से प्रत्येक पीएल टुकड़े की दो परतों को दूरबीन विच्छेदन माइक्रोस्कोप(चित्रा 4)के तहत अल्ट्रा-सटीक टिप संदंश के साथ अलग करें। परिणामी आईपीएल और ओपीएल नमूनों को माइक्रोट्यूब में व्यक्तिगत रूप से -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, जब तक कि आगे का उपयोग न हो जाए।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि दो परतों की दक्षता और पृथक्करण की सुविधा अंडे की ताजगी पर निर्भर करती है। दरअसल, संग्रहीत अंडे अंडे सफेद पीएच में तेजी से वृद्धि और पीएल ढीला (और कमजोर) के कारण जर्दी सूचकांक के बाद परिवर्तन के कारण कठोर आंतरिक संशोधनों को दिखाते हैं । आईपीएल की तुलना में आईपीएल ज्यादा नाजुक है। इसलिए ओपीएल के चेहरे को ऊपर रखना और ओपल पर पुलिंग कर दोनों सबलेयर्स को फोर्स्प के साथ अलग करना बेहतर है। दोनों उपलेरियों को कीमती देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए ।

2. प्रोटीन घुलनशीलता और एसडीएस-पेज विश्लेषण के लिए नमूना उपचार

  1. प्राथमिक प्रोटीन घुलनशीलता
    1. फ्रीज-ड्राई आईपीएल और ओपीएल नमूने व्यक्तिगत रूप से । एक बार फ्रीज सुखाने पूरा हो गया है, एक रिसाव सबूत पेंच टोपी रखने स्वच्छ माइक्रोट्यूब में प्रत्येक नमूने से लगभग 1 मिलीग्राम कटौती । शेष नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबे भंडारण के लिए कसकर बंद ट्यूबों में रखें।
      नोट: एक रिसाव सबूत पेंच टोपी के साथ माइक्रोट्यूब का उपयोग नमूना रिहाइड्रेशन को रोकने के लिए हर्मेटिकल और रिसाव प्रूफ बंद सुनिश्चित करता है और वह नमूनों को सुरक्षित करेगा ।
    2. प्रत्येक लियोफिलाइज्ड सबलेयर में से 1 मिलीग्राम 50 एमएम ट्रिस पीएच 7, 500 एमएमएल एनएसीएल के 400 माइक्रोन के साथ मिलाएं। सूक्ष्मकणों में ओपीएल और ओपीएल संरचनाओं को विखंडित करने और प्रोटीन घुलनशीलता की सुविधा प्रदान करने के लिए 30 हर्ट्ज पर 5 मिनट के लिए 2 बार मिक्सर-मिल का उपयोग करें। दो स्वच्छ माइक्रोट्यूब में ओपीएल और आईपीएल वाले नमूनों के 400 माइक्रोल एकत्र करें।
      नोट: यहां इस्तेमाल बफर प्रोटीन घुलनशीलता बढ़ाने के लिए चुना गया है (चरण 1 के विपरीत) । यह बफर चित्रा 3में प्रस्तुत परिणामों पर आधारित था, जो पीएच 7(चित्रा 3बी)में प्रोटीन घुलनशीलता में वृद्धि दिखाता है और 0.5 एम एनएसीएल(चित्रा 3 सी)का उपयोग कर रहा है। यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है। इस स्तर पर, नमूनों का उपयोग मुख्य पीएल प्रोटीन के प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए किया जा सकता है या 2.2 चरण के लिए संसाधित किया जा सकता है।
  2. इलेक्ट्रोफोरेसिस के लिए प्रोटीन घुलनशीलता
    1. 5x SDS-पेज नमूना बफर (100 माइक्रोन, 0.25 एम ट्राइस-एचसीएल, 0.05% ब्रोमोफेनॉल ब्लू, 50% ग्लाइसेरोल, 5% एसडीएस, 5% बीटा-मर्केप्टोएथेन, पीएच 6.8) को प्रत्येक 400 एसएल के नमूने और 100 सी पर गर्मी के लिए जोड़ें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है, और नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। प्रोटोकॉल के इस चरण में ओपीएल और आईपीएल पूरी तरह से भंग हो जाते हैं। नमूने के घुलनशीलीकरण की दक्षता का आकलन 10,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए नमूनों को अपकेंद्री करके किया जा सकता है। पूर्ण घुलनशीलता अपकेंद्रित्र के बाद दिखाई देने वाली गोली की अनुपस्थिति की विशेषता है। इस प्रकार, पूर्ण घुलनशीलता के बाद, यहां यह माना जाता है कि 1 मिलीग्राम लियोफिलाइज्ड सबलेयर 1 मिलीग्राम प्रोटीन से मेल खाता है (500 माइक्रोन नमूने में प्रोटीन एकाग्रता 2 मिलीग्राम/एमएल है)। दरअसल , पीएल 80% से अधिक प्रोटीन2,15से बना है। 5x नमूना बफर का उपयोग नमूना कमजोर पड़ने को सीमित करता है लेकिन 1x या 2x नमूना बफर का भी उपयोग किया जा सकता है।
    2. एसडीएस पॉलीएक्रेलैमाइड जेल (4%-20% रेडिएंट जेल) पर अधिकतम 20 माइक्रोग्राम प्रोटीन/लेन लोड करें और वर्टिकल इलेक्ट्रोफोरेसिस सिस्टम का उपयोग करके 120 वी पर इलेक्ट्रोफोरेसिस करें।
      नोट: 4%-20% ढाल जेल का उपयोग अनिवार्य नहीं है, लेकिन यहां बेहतर है क्योंकि ओपीएल और आईपीएल में आणविक वजन के साथ प्रोटीन का प्रदर्शन किया जाता है और & 10 केडीए से लेकर जीटी;250 केडीए तक । स्टैकिंग जेल (जिसे आमतौर पर हटाया जाता है) रखने के लिए भी उपयोगी हो सकता है, क्योंकि कुओं के तल पर अघुलनशील प्रोटीन या प्रोटीन समुच्चय की उपस्थिति खराब घुलनशीलता और नमूना तैयारी के दौरान संभावित लापता कदम का संकेत देगी।
    3. इलेक्ट्रोफोरेसिस के बाद, ग्लास प्लेटों से जैल निकालें और 30 मिनट के लिए कूमासी ब्रिलियंट ब्लू सॉल्यूशन (50% एच2ओ, 40% एटोह, 10% एसिटिक एसिड, और R250 कूमासी ब्रिलियंट ब्लू) के साथ दाग दें।
    4. 50% एच2ओ, 40% एटोह, 10% एसिटिक एसिड समाधान से मिलकर एक समाधान के साथ डी-दाग जब तक जेल पृष्ठभूमि हल्के नीले रंग की दिखाई देती है।
    5. अंत में पॉलीएक्रेमाइड जैल के डी-धुंधला और रिहाइड्रेशन को प्राप्त करने के लिए, डिएक्रिड पानी युक्त पेट्री व्यंजनों में जेल स्थानांतरित करें। प्रोटीन एक पारदर्शी पृष्ठभूमि के नीले बैंड के रूप में दिखाई देना चाहिए।

Representative Results

ओपीएल और आईपीएल को एसडीएस-पेज द्वारा अपने प्रोटीन प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए एक हौसले से रखे गए अनिषेतीय अंडे के पीएल से अलग कर दिया गया था । पूरे प्रोटोकॉल का प्रायोगिक कार्यप्रवाह चित्र 2में दर्शाया गया है । चित्रा 3 विभिन्न ट्रिस सांद्रता(चित्रा 3 ए),विभिन्न पीएच(चित्रा 3B)और विभिन्न एनएसीएल सांद्रता(चित्रा 3 सी)पर प्रोटीन रिलीज दिखाता है। जिसके परिणामस्वरूप दो उपलेयर दूरबीन विच्छेदन माइक्रोस्कोप के प्रकाश में देखे गए और चित्रा 4 में दिखाए गए हैं जहां आईपीएल पारदर्शी है जबकि ओपीएल घना, बादल और सफ़ेद है । ये विशेषताएं आंशिक रूप से सबलेयर सेपरेशन की दक्षता के लिए गवाही दे सकती हैं।

अलगाव के बाद, ओपीएल और आईपीएल को स्वतंत्र रूप से lyophilized किया गया था, और उनकी प्रोटीन सामग्री को यांत्रिक पीसने, एनियोनिक डिटर्जेंट (एसडीएस) के उपयोग और एक कम करने वाले एजेंट (बीटा-मर्केप्टोथेनॉल) के संयोजन के लिए पूरी तरह से भंग कर दिया गया था, जिसके बाद उबलते थे। पॉलीएक्रिलैमाइड जेल (एसडीएस-पेज इलेक्ट्रोफोरेसिस) में माइग्रेशन के बाद, ओपीएल और आईपीएल के नमूने अपेक्षा के अनुसार अलग-अलग इलेक्ट्रोफोरेटिक प्रोफाइल(चित्रा 5)प्रदर्शित करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एक हौसले से रखी अनिषेषित अंडे के पीएल की संरचना। पार अनुभाग में पूरे पीएल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी माइक्रोस्कोपी माइक्रोस्कोपी माइक्रोग्राफ (व्यक्तिगत डेटा, ©प्लेटफॉर्म IBiSA de माइक्रोस्कोपी इलेक्ट्रॉनिक, विश्वविद्यालय और पर्यटन, फ्रांस, एस जॉर्जॉल्ट के CHRU) । ध्यान दें कि इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत के रूप में तैयार पीएल से यह तस्वीर प्राप्त की गई थी। ओपीएल, बाहरी पेरिविटेललाइन परत; आईपीएल, इनर पेरिविटेलाइन लेयर। काला तीर सिर दो उपलेयरों को अलग करने वाली निरंतर झिल्ली को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: प्रोटोकॉल के दो मुख्य चरणों और अनुप्रयोगों के उदाहरणों का सारांश देने का वर्कफ़्लो करें। प्रोटोकॉल को पीएल परतों के प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन इसे अन्य अनुप्रयोगों के लिए कुछ चरणों में रोका जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: पीएल नमूने के लिए बफर संरचना का अनुकूलन। संक्षेप में, स्वच्छ पीएल (एन = 4) को 2 एच के लिए विभिन्न बफरिंग समाधानों की एक ही मात्रा में इनक्यूबेटेड किया गया था.PL को हटा दिया गया था, और शेष बफर में 280 एनएम पर अवशोषण को मापकर प्रोटीन एकाग्रता का अनुमान लगाया गया था। }पीएच 8 पर ट्राइस-एचसीएल एकाग्रता का प्रभाव। (ख)पीएच का प्रभाव (7 से 9) । (ग)नैक एकाग्रता का प्रभाव। इन परिणामों से, हमने निष्कर्ष निकाला कि 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8, 50 एमएमएम एनएसीएल से बना बफर सबसे उपयुक्त है क्योंकि यह प्रोटीन हानि को सीमित करता है। परिणाम चार अलग-अलग पीएल नमूनों के मानक विचलन ± मतलब के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण एक तरह से ANOVA का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया एक Tukey कई तुलना परीक्षण के बाद । पी-वैल्यू & 0.05 को महत्वपूर्ण माना जाता था (एनएस, महत्वपूर्ण नहीं; * पीएंड एलटी;0.05, *** पीएंड एलटी;0.001, **** पीएंडटी;0001)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ओपीएल और आईपीएल में दूरबीन विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत सुविधाएं हैं। अलगाव के बाद आईपीएल (दाईं ओर) पारदर्शी दिखाई दिया और ओपीएल (बाईं ओर) अपारदर्शी था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एसडीएस-पेज विश्लेषण अलग ओपीएल और आईपीएल के हौसले से रखे गए अनिषेषित अंडे से । 4%-20% एक्रिलामाइड जेल के बाद कूमासी शानदार ब्लू स्टेनिंग। केडीए में आणविक वजन मानक बैंड का द्रव्यमान दर्शाया गया है। ओपीएल प्रोफाइल मुख्य रूप से आणविक द्रव्यमान और जीटी;30 केडीए के साथ प्रोटीन से बना है जबकि आईपीएल प्रोफाइल पर पाए गए प्रमुख बैंडों में आणविक जनता और लेफ्टिनेंट;30 केडीए है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल की सफलता दो महत्वपूर्ण चरणों पर निर्भर करती है जो स्वतंत्र रूप से अनुकूलित थे: ओपीएल और आईपीएल का यांत्रिक पृथक्करण जिसे यथासंभव कम डी-स्ट्रक्चरिंग करने की आवश्यकता होती है, जिसके बाद प्रत्येक सबलेयर का पूर्ण प्रोटीन घुलनशीलता होता है, जो इसके विपरीत, डी-स्ट्रक्चरिंग और डेन्चरिंग होता है। इसमें कुछ विशिष्ट बिंदुओं पर भी प्रकाश डाला गया है जिन पर प्रत्येक चरण की सफल उपलब्धि सुनिश्चित करने के लिए विचार किए जाने की आवश्यकता है ।

प्रोटोकॉल अंडे के रंग, अंडे के वजन, उत्पादन के प्रकार, या मुर्गी के आनुवंशिक तनाव पर निर्भर नहीं करता है। हालांकि यह अंडे की ताजगी पर निर्भर करता है। दरअसल, अंडे में रखे जाने के बाद जल्दी ही गहन आंतरिक भौतिक रसायन संशोधनों से गुजरना पड़ता है, हालांकि इन परिवर्तनों को देरी हो सकती है जब भंडारण14, 15के रेफ्रिजरेटेड परिस्थितियों में कियाजाताहै। भंडारण के दौरान अंडे के छिद्रों के माध्यम से कार्बन डाइऑक्साइड की हानि अंडे सफेद पीएच (७.८ से ९.५) की वृद्धि हुई है जबकि कुछ पानी के आदान-प्रदान जर्दी और सफेद के बीच होते हैं, पीएल भर में । दोनों संशोधन पीएल की आणविक और हिस्टोलॉजिकल संरचना को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं जो कमजोर होजाता है और14,15कम तनावपूर्ण हो जाता है , इसकी प्रोटीन सामग्री 16 ,17,18के भौतिक रसायन संशोधनों के कारण होने की संभावना है । यह माना जाता है कि संग्रहीत अंडों के साथ सबलेयर का पृथक्करण बहुत मुश्किल हो जाएगा, खासकर यदि भंडारण कमरे के तापमान पर लंबी अवधि के लिए आयोजित किया जाता है। आज तक, प्रोटोकॉल 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों से कम समय के लिए संग्रहीत अंडों का उपयोग करके किया गया है और अंडे के लिए कुशलतापूर्वक नमूना पीएल सबलेयर के लिए भंडारण की अधिकतम अवधि अभी तक ज्ञात नहीं है। इसके अलावा, यदि उद्देश्य प्रत्येक उपलेयर का विश्लेषण है, तो अनिषेचित अंडों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। वट के दिन, एक निषेचित अंडे का भ्रूण 23 घंटे पुराना है और इसके विकास के बाद बहुत तेजी से है, अगर अंडा इनक्यूबेटेड है । दरअसल, भ्रूणीय विकास और कुछ असाधारण संरचनाओं का विकास एक उप-कलाकार के रूप में पीएल का उपयोग करके विस्तारित होता है, जो इस प्रकार तेजी से अपमानित होता है, और19को एक्स्ट्रामब्रियोनिक जर्दी सैक द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है।

जर्दी और अंडे के सफेद के मैनुअल जुदाई के बाद, जर्दी को अंडे के सफेद निशान से और चालाज़ी से साफ करने की आवश्यकता होती है जो पीएल से कसकर जुड़ी हुई थी। टिप एक फिल्टर पेपर पर सावधानी से जर्दी रोल करने के लिए और बफर समाधान (10 mM Tris-HCl पीएच 8) में जर्दी के व्यापक वॉश प्रदर्शन करने के लिए है । बफर के लिए उपयोग किया जाने वाला पीएच अंडे के सफेद14 के शारीरिक पीएच के अनुरूप है और इसे प्रोटीन हानि(चित्र 3)को कम करने के लिए दिखाया गया है। एक रेफ्रिजरेटेड बफर का उपयोग तब जर्दी से पीएल को हटाने में मदद करेगा क्योंकि 4 डिग्री सेल्सियस पर, बफर पीएल हटाने की सुविधा देगा क्योंकि लिपिडिक जर्दी वापस ले लेता है और इस तापमान पर कम तरल पदार्थ बन जाता है। अतिरिक्त वॉश पीएल से जर्दी अवशेषों को हटाने के लिए अनुमति देगा। अंकुरित डिस्क के अनुरूप क्षेत्र को काटना भी महत्वपूर्ण है क्योंकि इस संरचना में महिला प्रोन्यूक्लियस शामिल है, पीएल का प्रतिनिधि नहीं हो सकता है। यह निषेचन और भ्रूण कोशिकाओं के गुणा की साइट है जब अंडा निषेचित है । यह एक विशेष संरचना है कि पूरे PL के प्रतिनिधि नहीं हो सकता है माना जाता है, जो कारण है कि यह हटा दिया गया था । इस विशिष्ट कदम को दृढ़ता से सुविधा होती है जब जर्दी ठंडे बफर में डूब जाती है। यद्यपि इस अंकुरित डिस्क संरचना को वर्तमान प्रोटोकॉल (उद्देश्यों में से) में छोड़ दिया जाता है, लेकिन निषेचित अंडों में इस क्षेत्र के विशिष्ट विश्लेषण पीएल सामग्री (प्रोटेओमिक्स और गतिविधि) और संरचना (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) के विकास का अध्ययन करने में रुचि रखने वाले वैज्ञानिकों केलिए भ्रूणजीन19,20,21के प्रारंभिक चरणों के दौरान बहुत उपयोगी हो सकते हैं। इस स्तर पर, पूरे पीएल संरचनात्मक रूप से बरकरार है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2)द्वारा आगे संरचनात्मक विश्लेषण के लिए संसाधित किया जा सकता है, 1.2 कदम या चरण 2.1 (यदि उद्देश्य पूरे पीएल का विश्लेषण करना है)।

चरण 1.2 को दूरबीन विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत आयोजित करने की आवश्यकता है, क्योंकि पीएल बहुत पतला और नाजुक (लगभग 10 माइक्रोन मोटी) है। सबलेयर्स का पृथक्करण पानी में या न्यूनतम नमक की कमी वाले बफर में लगभग असंभव है, और इन विकल्पों का उपयोग करने के प्रारंभिक प्रयासों के परिणामस्वरूप गंभीर पीएल क्षति हुई है। इस प्रकार, इस चरण के लिए चयनित बफर शारीरिक पीएच (पीएच 8) पर रहता है और इसमें 50 mm NaCl होते हैं। यह कदम दुरूह है और पीएल फाड़ को रोकने के लिए ध्यान से और धीरे से प्रदर्शन किया जाना चाहिए । एक बार अलग होने के बाद, दो उपलेयरों को आसानी से पहचाना जा सकता है क्योंकि वे विशिष्ट भौतिक विशेषताओं (अपारदर्शी बनाम पारदर्शी) का प्रदर्शन करते हैं। माइक्रोस्कोप के आलोक में आईपीएल की एकरूपता की कमी एक अधूरी जुदाई को प्रतिबिंबित करना चाहिए और इस तरह आईपीएल पर मौजूद ओपीएल के शेष स्थानों की उपस्थिति । इसके अलावा, पूरी झिल्ली का इलाज करना बहुत मुश्किल है और 2 सेमी x 3 सेमी टुकड़ों का उपयोग सफलता की संभावना को बहुत बढ़ाता है। परिणामस्वरूप प्राप्त सबलेयर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी(चित्र 1)द्वारा हिस्टोलॉजिकल अध्ययन के लिए उपयुक्त है। यह उल्लेखनीय है कि एक विशिष्ट रैखिक संरचना (0.05 से 1 माइक्रोम मोटी) जिसका नाम निरंतर झिल्ली (सीएम) माइक्रोग्राफ(चित्रा 1)पर दिखाई देता है और आमतौर पर अलगाव की प्रक्रिया के दौरान एक या अन्य उपलेयर से जुड़ा रहता है। यह पहले प्रकाशित किया गया है कि जब जुदाई (५०० mm) के लिए एक अपेक्षाकृत उच्च नमक मोलेरिटी का उपयोग कर, मुख्यमंत्री OPL7 से जुड़े रहे, जबकि पानी5 का उपयोग आईपीएल के लिए सीएम के लगाव एहसान होगा । इस प्रोटोकॉल में, विशिष्ट उद्देश्यों (पीएल सबलेयर संरचनात्मक रूप से अक्षुण्ण और प्रोटीन की न्यूनतम हानि) को प्राप्त करने के लिए कम नमक मोलेरिटी का उपयोग किया जाता है, जिसका अर्थ है कि यह सीएम आईपीएल से जुड़े होने की संभावना है। हालांकि, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा आईपीएल और ओपीएल का अतिरिक्त विश्लेषण इस परिकल्पना पर स्पष्ट रूप से राज्य करेगा । पीएल, ओपीएल, या आईपीएल की परतों को चरण 1 के अंत में प्राप्त शुक्राणु-अंडा बाध्यकारी विश्लेषण22 के लिए इन विट्रो परख के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है या भ्रूण विकास23,24के शुरुआती चरणों का विश्लेषण करने के लिए।

चरण 2 प्रोटीन सामग्री के घुलनशीलता को संदर्भित करता है, आंशिक रूप से (चरण 2.1) या पूरी तरह से (चरण 2.2)। पीएल और/या ओपीएल को सबसे पहले पानी के अणुओं को हटाने और सटीक वजन मापन के लिए अनुमति देने के लिए lyophilized किया जाता है । दरअसल, पीएल मुख्य रूप से पानी (88%)7से बना है, जबकि शुष्क पदार्थ में अनिवार्य रूप से प्रोटीन (अध्ययन के आधार पर 80% से 90%), कार्बोहाइड्रेट, वसा और खनिज2,7,25होते हैं। यह देखते हुए कि पीएल में निहित पानी को फ्रीज-सुखाने से हटा दिया जाता है, कि कार्बोहाइड्रेट अनिवार्य रूप से पीएल ग्लाइकोप्रोटीन में बरामद होते हैं, और जर्दी से उत्पन्न वसा और खनिजों को अनिवार्य रूप से व्यापक वॉश द्वारा खारिज कर दिया जाता है, यह माना जाता है कि परिणामस्वरूप पीएल लगभग विशेष रूप से प्रोटीन से बना है। इस प्रकार, पूर्ण रूप से लियोफिलाइजेशन के बाद प्राप्त वजन मूल्य मुख्य रूप से प्रोटीन के अनुरूप होना चाहिए। इसके बाद 0.5 एम एनएसीएल वाले बफर में पीएल, ओपीएल और/या आईपीएल की समान मात्रा को पतला कर दिया जाता है । उच्च नमक मोलेरिटी को बहुत पीसकर रेशेदार नेटवर्क के यांत्रिक विनाश के लिए संयुक्त रूप से गैर-विकृत स्थितियों के तहत प्रोटीन घुलनशीलता की सुविधा प्रदान करता है। इस चरण के बाद उबलते, एसडीएस डिटर्जेंट और कम करने वाले एजेंट बीटा-मर्केप्टोथेन (चरण 2.2) का उपयोग करके पूर्ण घुलनशीलता होती है। दरअसल, आईपीएल के कुछ प्रोटीन एसडीएस-घुलनशील ग्लाइकोप्रोटीन25,26,27 हैं और ओपीएल के प्रमुख घटक एनएसीएल-घुलनशील1, 11हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हमने अपकेंद्रण के बाद अघुलनशील प्रोटीन का कोई शेष गोली नहीं देखा, जो इंगित करता है कि घुलनशीलता की संभावना पूरी हो गई थी। पीएल, ओपीएल और/या आईपीएल से प्रोटीन का विश्लेषण एसडीएस-पेज द्वारा किया गया । परिणामस्वरूप प्रोटीन प्रोफाइल प्रकाशित साहित्य2,4,11, 16के अनुरूप हैं, लेकिन सिग्नल के संकल्प और तीव्रता में अत्यधिक सुधार हुआ है और विभिन्न आईपीएल और ओपीएल स्वतंत्र नमूनों के बीच बहुत अधिक समरूप है।

इसके अलावा, ओपीएल और आईपीएल के बीच मात्रात्मक तुलना उस वजन की सटीकता के लिए संभव है जिसे हमने संबंधित उपलेयर्स2,7के लिए अनुमानित किया था। इसके अलावा, ओपीएल और आईपीएल प्रोफाइल दोनों बहुत अलग हैं और 14 केडीए और 75 केडीए में एक बेहोश बैंड को छोड़कर, दोनों पीएल सबलेयर एक ही आणविक वजन प्रदर्शित करने वाले बैंड साझा नहीं करते हैं। यह अवलोकन कोई महत्वपूर्ण क्रॉस-संदूषण के साथ उपलेयरों के अलगाव की दक्षता की पुष्टि करता है। 1प्रकाशित एकमात्र पीएल प्रोटेओमिक विश्लेषण के अनुसार, ओपीएल (एंड एलटी;30 केडीए) में सबसे तीव्र बैंड को लिसोजाइम (14 केडीए), विटेललाइन झिल्ली बाहरी परत प्रोटीन 1 (17 केडीए), एवियन बीटा-डेफ के अनुरूप होना चाहिए एन्सिन 11 (12 केडीए का स्पष्ट आणविक वजन), जबकि आईपीएल के तीव्र बैंड (>30 केडीए) की संभावना है जोना-पेलुसिडा प्रोटीन 1 (१०२ केडीए) और जोना-पेलुसिडा प्रोटीन 3 (४७ केडीए) । सबलेयर्स के बीच बहुत प्रचुर मात्रा में पीएल प्रोटीन ओवोट्रांसफेरिन (78 केडीए), अंडाकार से संबंधित प्रोटीन एक्स (45 केडीए), ओवलबुमिन (43 केडीए)1 का वितरण स्पष्ट होना बाकी है। दरअसल, इन प्रोटीनों के उच्च आणविक वजन (>30 kDa) से पता चलता है कि वे एसडीएस-पेज प्रोफाइल के आधार पर आईपीएल प्रोटीन हैं, लेकिन उनकी ऊतक-विशिष्टता (ओविडक्ट-व्यक्त प्रोटीन) इन प्रोटीनों को ओपीएल28, 29से संबद्ध करेगी । इसके अलावा, कुछ ने अपर्याप्त धुलाई 1 के कारण अंडे के सफेद और अंडे की जर्दी प्रोटीन द्वारापीएलनमूनों के संभावित संदूषण का सुझाव दिया है । यह जानकारी की कमी वर्तमान प्रोटोकॉल के विकास का आधार है, जिसका उपयोग पीएल, ओपीएल और आईपीएल के गहन मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स के लिए आगे किया जाएगा ।

वैकल्पिक रूप से, कदम 2.1 से और अपकेंद्री के बाद अघुलनशील पदार्थ को दूर करने के लिए, आगे जैव रासायनिक और जैविक लक्षण वर्णन के लिए कुछ विशिष्ट प्रोटीन निकालना संभव है। इस तरह के एक दृष्टिकोण हाल ही में जैविक गतिविधियों और/या OPL के दो मुख्य घटकों की 3 डी संरचना, vitelline झिल्ली बाहरी परत प्रोटीन 1 (VMO1) और एवियन बीटा-defensin 11 (AvBD11)30, 31की विशेषता के लिए लागू किया गया है । शुद्ध अणुओं के रूप में इन प्रोटीनों की उपलब्धता इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैसे अतिरिक्त प्रयोगों के लिए या एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख सहित मात्रात्मक परख के विकास के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उत्पादन करने में भी मदद कर सकती है।

इस प्रोटोकॉल की दो प्रमुख सीमाएं हैं (1) सबलेयर्स जुदाई के साथ चुनौती, खासकर यदि अंडे 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों से अधिक संग्रहीत किए गए हैं और (2) तथ्य यह है कि पूर्ण प्रोटीन घुलनशीलता को कम करने और बफर को विकृत करने की आवश्यकता होती है, जो परिणामस्वरूप नमूनों की आंतरिक जैविक गतिविधि को ख़राब करते हैं। पहली सीमा के बारे में, यांत्रिक जुदाई तकनीकी कौशल की आवश्यकता है, लेकिन आसानी से 2 या 3 प्रयोगात्मक प्रशिक्षण के बाद प्राप्त किया जाता है । आईपीएल के कुछ छोटे टुकड़े ओपीएल से जुड़े रह सकते हैं और इसके विपरीत दोनों सबलेयर्स कसकर जुड़े हुए हैं । हालांकि, यदि यांत्रिक पृथक्करण सावधानी से किया जाता है तो दूसरे के द्वारा एक उपलेयर का संदूषण कम होना चाहिए। इष्टतम सबलेयर जुदाई के बाद विशिष्ट आईपीएल और ओपीएल एसडीएस-पेज प्रोफाइल चित्र 5में सचित्र हैं । दूसरी सीमा के बारे में, इस लेख में प्रस्तुत प्रयोगात्मक चरणों को प्रोटेओमिक विश्लेषणों के लिए अनुकूलित किया गया है, ताकि प्रत्येक सबलेयर की रचना करने वाले प्रोटीन की एक विस्तृत सूची प्रदान की जा सके। प्रत्येक प्रोटीन की जैविक गतिविधियों के आगे लक्षण वर्णन के लिए, डेनैचिंग स्थितियों (चरण 2.2.1, उबलते द्वारा पीछा किए जाने वाले एसडीएस और बीटा-मर्केप्टोथेन के साथ बफर का उपयोग करने से पहले, चरण 2.1.2 पर रोकना आवश्यक है)। हालांकि, यह उल्लेखनीय है कि चरण 2.1.2 के परिणामस्वरूप प्रोटीन केवल नमक में घुलनशील प्रोटीन होते हैं जबकि नमक-अघुलनशील प्रोटीन एकत्र होते हैं। उनकी संबंधित गतिविधि का आगे आकलन करने का एक विकल्प यह हो सकता है कि हेट्रोलॉगस सिस्टम(ई कोलाई,बाकुलोवायरस, खमीर आदि) का उपयोग करके पुनर्संयोजन प्रोटीन के रूप में नमक-अघुलनशील प्रोटीन का उत्पादन किया जाए।

प्रत्येक प्रजाति की मौलिकता की बेहतर सराहना करने के लिए तुलनात्मक अध्ययन के लिए इस प्रोटोकॉल को अन्य एवियन अंडों के अनुकूल बनाया जा सकता है। वास्तव में, पीएल संरचनात्मक रूप से और प्रोटीन संरचना दोनों के संदर्भ में कुछ पक्षी-विशिष्टताओं को प्रदर्शित करता है, जो नए वातावरण के अनुकूलन के कारण होने की संभावना है, लेकिन विकासात्मक विशिष्टताओं2,6,9,32के लिए भी। इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए मध्यम तकनीकीता और शास्त्रीय उपकरण/सामग्री की आवश्यकता होती है, पक्षी प्रजनन और विशिष्टता अध्ययन के क्षेत्र में नए अनुसंधान के रास्ते खोलता है ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम बिना निषेचित ईसा-भूरे अंडे प्रदान करने के लिए फिलिप डिडिएर और करीन क्रोध (INRAE, पीट, 37380, Nouzilly, फ्रांस, https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12) के लिए आभारी हैं। हम एम ब्रेजॉन की पीएचडी के वित्तपोषण के लिए यूनिवर्सिटी ऑफ टूर्स, फ्रांस को भी धन्यवाद देते हैं। इस काम को फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (EQLIPSE, ANR-19-CE21-0006) से वित्तीय सहायता मिली ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binocular dissecting microscope Vision Engineering, France Model Mantis Elite
Lyophilizer Cryotec, France Model Cosmos 80
Mini-Protean II electrophoresis cell Biorad, Hercules, USA 1652960 Any apparatus adapted for protein electrophoresis
Mixer Mill MM400 Retsch, Hann, Germany 20.745.0001 Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample
Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm Dutscher, Brumath 5066
Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm Dutscher, Brumath 327005

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बायोकेमिस्ट्री अंक 167 मुर्गी का अंडा पेरिविटेललाइन परत यांत्रिक पृथक्करण हिस्टोलॉजिकल संरचना प्रोटीन घुलनशीलता प्रोटेओमिक्स
मुर्गी के अंडों से बाहरी और इनर पेरिविटेललाइन सबलेयर्स का मैकेनिकल सेपरेशन और प्रोटीन घुलनीयकरण
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Bregeon, M., Guyot, N., Réhault-Godbert, S. Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs. J. Vis. Exp. (167), e61739, doi:10.3791/61739 (2021).

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