Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Mekanisk separasjon og proteinslukbilisering av de ytre og indre perivitelline underlag fra hønseegg

Published: January 27, 2021 doi: 10.3791/61739
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut National de Recherche pour l'Agriculture, l'Alimentation et l'Environnement, Université de Tours, Biologie des Oiseaux et Aviculture, 37380, Nouzilly, France

Summary

Denne artikkelen rapporterer en enkel metode for å isolere de ytre og indre perivitelline underlag av kyllingegg samtidig som strukturell endring minimeres og for å optimalisere proteinoppløselse av hvert underlag for proteomiske analyser.

Abstract

Det perivitelliniske laget som omgir eggeplommen spiller en grunnleggende rolle i befruktning, i eggforsvar og i utviklingen av det fugleembryo. Det er dannet av to proteinakende underlag som er tett forbundet og dannet av distinkte kvinnelige reproduktive organer. Begge strukturene antas å ha sine egne funksjonelle spesifisiteter, som gjenstår å definere. For å karakterisere funksjonen til proteiner som komponerer hvert underlag, er den første utfordringen å etablere forholdene som ville tillate mekanisk separasjon av disse to intrikate lagene, samtidig som det begrenser eventuelle strukturelle skader. Det andre trinnet er å optimalisere de eksperimentelle forholdene for å lette proteinslukbilisering fra disse to underlagene, for påfølgende biokjemiske analyser. Effektiviteten av denne tilnærmingen vurderes ved å analysere proteinprofilen til hvert underlag av Natrium dodecylsulfat-poly-akrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE), som forventes å være forskjellig mellom de to strukturene. Denne to-trinns prosedyren forblir enkel; det krever klassisk biokjemisk utstyr og reagenser; og er kompatibel med ytterligere inngående proteomics. Det kan også transponeres til andre fugleegg for komparativ biologi, vel vitende om at strukturen og sammensetningen av perivitellinlaget har vist seg å ha artsspesifikke egenskaper. I tillegg tillater de ikke-denaturing forholdene utviklet for sublayers separasjon (trinn 1) sine strukturelle analyser ved skanning og overføring elektron mikroskopi. Det kan også utgjøre det første trinnet for påfølgende proteinrensing for å analysere sine respektive biologiske aktiviteter og 3D-struktur, eller å utføre ytterligere immunohistokjemiske eller funksjonelle analyser. Slike studier vil bidra til å tyde den fysiologiske funksjonen til disse to underlagene, hvis strukturelle og funksjonelle integrities er determinante kriterier for reproduktiv suksess.

Introduction

Formålet med denne metoden er å gi en protokoll som tillater etterfølgende biokjemisk karakterisering av perivitelline laget (PL), et tynt proteinamisk lag som omslutter eggeplommen og spiller en grunnleggende rolle i reproduksjon av fuglearter. PL, også kalt "vitelline membran" i litteraturen, er et tredimensjonalt nettverk av tykke fibre som består av flere typer glykoproteiner. Den består av et indre perivitelline lag (IPL) (i kontakt med eggeplommen) som er montert i eggstokken, og av et ytre perivitelline lag (OPL, i kontakt med den hvite), liggende på IPL (Figur 1) og produsert av infundibulum. Dette sistnevnte vevet er det traktlignende øvre segmentet av ovidukten som mottar den modne eggeplommefollikelen etter eggløsning, og stedet der befruktningen finner sted. Utskillelsen av OPL oppstår etter disse to hendelsene og etterfølges av det påfølgende innskuddet av eggehviten og eggeskallet i andre spesifikke segmenter av oviducten. De fysiologiske funksjonene til PL er ikke bare relatert til befruktning og tidlige stadier av embryogenese, men også til embryoets fysiske og molekylære beskyttelse. Proteomisk analyse av kyllingegg utført på hele PL avslørte tilstedeværelsen av 137 forskjelligeproteiner 1, men fordelingen av de fleste av disse proteinene mellom IPL og OPL gjenstår å bli belyst. Den minimale mengden data som er tilgjengelige i litteraturrapporten om at IPL og OPL viser svært forskjelligeproteinprofiler 2,3,4, noe som tyder på ulike strukturelle og funksjonelle egenskaper. Den relative mangelen på data om fordelingen av proteiner mellom OPL og IPL skyldes sannsynligvis vanskeligheten med å skille mellom mellomlag som er tynne og innebygde.

Metoden som presenteres her beskriver betingelsene som skal brukes til å skille de to underlagene med begrenset innvirkning på deres respektive histologiske struktur samtidig som proteininnholdet bevares, og for å gi protokollen som tillater fullstendig oppløselighet av proteiner for senere analyse av proteomics. Det inkluderer to hovedtrinn: 1) PL prøvetaking og OPL / IPL separasjon og 2) PL, OPL, og IPL behandling for protein solubilisering og elektroforese for massespektrometri analyse. Arbeidsflyten presenteres i figur 2. Merkbart, selv om den nåværende protokollen er optimalisert for proteomiske analyser (trinn 2.2), kan den stoppes på noen trinn for histologisk (f.eks elektronmikroskopi), immunohistokjemiske analyser, funksjonelle studier (trinn 1), og for rensing av saltløselige proteiner for å karakterisere deres struktur og biologiske aktivitet (trinn 2.1) (figur 2).

Det første trinnet er fjerning av total PL fra eggeplommen (Figur 2, trinn 1.1). Alle publiserte metoder starter med separasjon av eggehviten fra eggeplommen manuelt eller ved hjelp av en eggseparator. Det etterfølges av fjerning av gjenværende eggehvite og den tykke chalazae ved hjelp av tang eller ved adsorpsjon på et filterpapir5 (Figur 2A). Deretter er teknikkene som er valgt for å prøve PL, variable, avhengig av de publiserte artiklene. Noen papirer inkluderer flere vasker av eggeplommen, i deionisert eller destillertvann 1,5,6,i 0,85 til 1% saltløsning2,7,8, i bufringsløsninger som 0,15 M NaCl / N-[Tris (hydroksymetyl) metyl] -2-aminoethanesulfonic acid, pH 7.44, eller i 0.01N HCl (pH 2)3. Disse prosedyrene ble brukt på kylling, and, ringhalset fasan, grå partridge, cockatiel papegøye, innenlandsk due, eller ratitesegg 2,6,9. Fjerning av PL mens eggeplommen opprettholdes i en petriskål uten vandige løsninger kan være svært arbeidskrevende da PL er skjør og eggeplomme har en tendens til å holde seg til PL1,5 og derfor fortsatt vanskelig å eliminere etterpå. Bruk av sur buffer eller oppløsning i en time ved 37 °C3 foretrekkes heller ikke, da slike forhold kan endre PL-strukturen og kan føre til proteintap. Det er også viktig å fjerne området som inneholder bakterieskiven, da denne sonen sannsynligvis vil ha et distinkt strukturelt og molekylært mønster, som ikke gjenspeiler hele PL4,6,10 ( figur2B). Denne metoden utnytter ideer fremhevet av noen publiserte artikler og foreslår noen forbedringer for å lette PL-prøvetaking samtidig som den beholder integriteten (Figur 2C).

Det andre trinnet består av å skille de to underlagene (figur 2, trinn 1.2). Dette trinnet er kritisk som OPL og IPL er tett bundet til hverandre. Dette trinnet bør utføres nøye med tang under et kikkert dissekeremikroskop. Publikasjoner som rapporterer OPL/IPL-separasjon er ganskebegrenset 2,3,7,11, og noen av dem bruker spesifikke forhold (sur buffer ved 37 °C i 1 t2,3) som sannsynligvis vil påvirke den histologiske strukturen til underlagene og/eller bidra til proteintap eller eggeplomme eller hvit forurensning. For bedre å skille OPL fra IPL, rapporterte noen forfattere bruken av toluidenblå for å farge OPL litt (det indre laget forblir fargeløst)11. I metoden som er utviklet, optimaliserte vi forholdene slik at separasjonen enkelt oppnås og ikke krever bruk av fargestoff (figur 2D).

Det andre hovedtrinnet er oppløseligheten av proteiner som komponerer hvert underlag. Klassisk oppnås det ved å blande rene lyofiliserte1,tørket2,6eller nylaget3,4,11 PL / underlag direkte med Laemmli-bufferen som brukes til elektroforese. Andre forfattere foretrakk en foreløpig solubilisering av lag i 1% NaCl, i en 1% SDS buffering løsning2,3,11 eller i en løsning som inneholder proteasehemmere og SDS6 ved romtemperatur eller Triton etterfulgt av inkubasjon ved 45 ° C12, under konstant kraftig omrøring. Noen forfattere beskrev også en protokoll der PL ble inkubert i fosfatbuffer saltvann eller urea og utsatt for sonikering13. Disse behandlingene ble alle etterfulgt av en sentrifugering og fortynning i Laemmli buffer og alle deler ulempen med ufullstendig proteinslukbilisering fra lag som uoppløselig materiale (pellet oppnådd etter sentrifugering) kastes fra prøven som skal analyseres.

I tillegg er bruk av denaturing forhold (urea, vaskemiddel, høy temperatur, etc.) av visse forfattere for protein solubilisering ikke kompatibel med påfølgende protein rensing for karakterisering som de er sannsynlig å irreversibel inaktivere proteiner, forstyrre deres biologiske aktiviteter og også svekke deres 3D struktur. For dette spesifikke trinn 2, protokollen inkluderer en første substep som tillater solubilisering av de mest rikelige proteiner under ikke-denaturing forhold etter PL / OPL / IPL mekanisk de-strukturering, som ikke vil forstyrre ytterligere proteinstudier, om nødvendig (Figur 2, trinn 2.1), og en andre undertrinn som muliggjør fullstendig solubilisering av proteiner for elektroforese og dybde proteomics (Figur 2, trinn 2.2). Den kombinerer forslag hentet fra ulike publiserte artikler og justeringer som følge av nye ideer validert av eksperimentelle studier.

Protocol

1.PL, IPL og OPL prøvetakinger

  1. PL prøvetaking
    1. Bryt det nylagte ubefruktede egget manuelt og bruk en eggseparator som ligger på et glassbeger for å skille eggeplommen fra det hvite. Fjern chalazae med liten saks og rull eggeplommen over et filterpapir for å fjerne tilhengeralbumen som vises som en gjennomsiktig og synlig struktur (figur 2A).
      FORSIKTIG: Vær forsiktig så du ikke punkterer PL med saks. Bruken av pinsett i stedet for saks for å fjerne chalazas kan provosere PL brudd og påfølgende eggeplomme lekkasje. Det rullende trinnet på filterpapiret er kritisk og bør utføres svært raskt på grunn av de absorberende egenskapene til papirfilteret som kan utløse PL-brudd. Det er også svært viktig å bruke et ubefruktet egg fra lådagen, for å optimalisere suksessen til dette første trinnet og alle de påfølgende trinnene. Alternativt kan egg som har blitt lagret mindre enn 10 dager i et avkjølt miljø brukes, men eksperimenterere må vurdere potensiell risiko for PL-endringer.
    2. Dypp eggeplommen i en krystallisator som inneholder 10 mM Tris-HCl pH 8 som tidligere er avkjølt til 4 °C og fjern PL-området over bakterieskiven innenfor en 1 cm sone ved hjelp av sløv saks (figur 2B).
      MERK: I utgangspunktet ble PL nedsenket i deionisert vann, men denne tilnærmingen har noen ulemper, for eksempel mangel på pH-kontroll og vanskelighetene med å skille underlag etterpå (trinn 1.2). Derfor ble flere forhold testet, inkludert Tris konsentrasjon (figur 3A) og pH (figur 3B). Bruken av en buffer ved pH 8, i stedet for deionisert eller demineralisert vann, er i samsvar med eggfysiologi (pH av eggehvite er ca 7,8 på lay-dagen)14 og minimerer proteintap. I motsetning mistenkes sur eller svært alkalisk pH for å utløse PL-de-strukturering og tidlig proteinoppløselighet (figur 3B). Bufferen består av 10 mM Tris-HCl pH 8 ble funnet å være optimal, da den respekterer eggfysiologien og forårsaker ikke betydelig proteinoppløselighet (proteinkonsentrasjon i arbeidsbufferen forblir minimal, figur 3A,B).
    3. Ruptur PL med liten saks i bufferen. Hold de to kantene på sprukket PL med tang og skrell PL av eggeplommen.
    4. Opprettholde PL med tang og skyll PL flere ganger i flere bad på 10 mM Tris-HCl, pH 8 til ingen spor av eggeplomme er synlig. På dette stadiet må du sørge for at PL er ren, hvit og flytende i bufferen. Det kan behandles i trinn 1.2 for underlagsseparasjon eller direkte til trinn 2.1 for biokjemiske analyser.
  2. OPL- og IPL-prøvetaking
    1. Spre hele PL prøven ved å sette OPL oppover i en plast Petri parabolen og opprettholde den flat med så mindre rynker som mulig. Dekk prøven med 10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl. Bruk en plast Petri parabolen (og ikke glass) for å begrense PL bevegelser, fordi PL stikker bedre til plast.
      1. For å finne OPL-siden, se på hvor plasseringen av de gjenværende chalazae som er festet til OPL og ikke IPL. Dette trinnet krever liten NaCl-konsentrasjon (50 mM) for å lette separasjonen av underlaget.
        MERK: Basert på grafen presentert i figur 3C og litteratur 11,bør denne konsentrasjonen ikke føre til store proteintap. I utgangspunktet ble avionisert vann brukt til å skille underlagene, som beskrevet tidligere1,5,6, men denne teknikken ble funnet å være svært arbeidskrevende og resulterte i endring av den strukturelle PL integritet. Derfor ble forskjellige NaCl-konsentrasjoner (figur 3C) testet som salt tilrettelagt separasjon av de to underlagene. Det er imidlertid bemerkelsesverdig at bruken av NaCl konsentrasjon > 100 mM øker protein solubilisering / frigjøring fra PL, som ikke er målet her (dette vil være målet i trinn 2) (Figur 3C). Hvis du legger til 50 mM NaCl i 10 mM Tris-HCl pH 8-bufferen, forenkler separasjonen av de to underlagene og minimerer proteintap.
    2. Skjær den totale PL i biter på ca 2 cm x 3 cm med liten saks. Mekanisk skille de to lagene av hvert PL stykke med ultra-presise spissen tang under en kikkert dissekere mikroskop (Figur 4). Oppbevar de resulterende IPL- og OPL-prøvene individuelt i mikrorør ved -80 °C, inntil videre bruk.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her. Det bør bemerkes at effektiviteten og anlegget for separasjon av de to lagene i stor grad avhenger av eggets friskhet. Faktisk viser lagrede egg drastiske interne modifikasjoner på grunn av den raske økningen i eggehvit pH og påfølgende endring av eggeplommeindeksen på grunn av PL-løsningen (og svekkelse). IPL er mer skjør sammenlignet med OPL. Det er derfor å foretrekke å plassere ansiktet til OPL ovenfor og å skille de to underlagene ved å trekke på OPL med tangene. Begge underlagne bør håndteres med dyrebar forsiktighet.

2. Prøvebehandling for proteinslukbilisering og SDS-PAGE-analyser

  1. Primær proteinslukbilisering
    1. Frysetørre IPL- og OPL-prøver individuelt. Når frysetørkingen er fullført, kutt tilnærmet 1 mg fra hver prøve i rene mikrorør med en lekkasjesikker skrulokk. Oppbevar de resterende prøvene i tett lukkede rør for langvarig lagring ved -80 °C.
      MERK: Bruk av mikrorør med en lekkasjesikker skruehette sikrer hermetisk og lekkasjesikker lukking for å forhindre prøverehydrering, og det vil sikre prøvene.
    2. Bland 1 mg av hvert lyofiliserte underlag med 400 μL på 50 mM Tris pH 7, 500 mM NaCl. Bruk en miksermølle i 2 ganger i 5 min ved 30 Hz for å gå i oppløsning av OPL- og OPL-strukturer i mikropartikler og lette proteinsluktlighet. Samle 400 μL av prøvene som inneholder OPL og IPL i to rene mikrorør.
      MERK: Bufferen som brukes her er valgt for å øke proteinslukbilisering (i motsetning til trinn 1). Denne bufferen var basert på resultatene som ble presentert i figur 3, som viser en økning i proteinslukbilisering ved pH 7 (figur 3B) og bruk av 0,5 M NaCl (figur 3C). Protokollen kan settes på pause her. På dette stadiet kan prøver brukes til proteinrensing av hoved PL-proteiner eller behandlet til trinn 2.2.
  2. Proteinslukbilisering for elektroforese
    1. Tilsett 5x SDS-PAGE prøvebuffer (100 μL, 0,25 M Tris-HCl, 0,05% bromofenolblå, 50% glyserol, 5% SDS, 5% beta-mercaptoetanol, pH 6,8) til hver 400 μL av prøven og varmen ved 100 ° C i 5 min.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her, og prøver kan lagres ved -80 °C. På dette stadiet av protokollen er OPL og IPL fullstendig oppløst. Effektiviteten av prøveslukbiliseringen kan vurderes ved sentrifugeringsprøver i 5 min ved 10.000 x g. Fullstendig solubilisering er preget av fravær av synlig pellet etter sentrifugering. Således, etter fullstendig solubilisering, anses det her at 1 mg lyofilisert underlag tilsvarer 1 mg proteiner (proteinkonsentrasjonen i 500 μL-prøven er 2 mg / ml). Faktisk er PL består av mer enn 80% protein2,15. Bruken av en 5x prøvebuffer begrenser prøvefortynning, men en 1x eller 2x prøvebuffer kan også brukes.
    2. Legg maksimalt 20 μg proteiner/kjørefelt på en SDS polyakrylamidgel (4 %–20 % gradientgel) og utfør elektroforese ved 120 V ved hjelp av et vertikalt elektroforesesystem.
      MERK: Bruken av en 4%–20 % gradientgel er ikke obligatorisk, men er å foretrekke her, da OPL og IPL viser proteiner med molekylvekter fra <10 kDa til >250 kDa. Det kan også være nyttig å holde stabling gel (som vanligvis fjernes), som tilstedeværelsen av uoppløselige proteiner eller proteinaggregater på bunnen av brønner ville indikere dårlig løselighet og et mulig manglende trinn under prøvepreparatet.
    3. Etter elektroforese fjerner du geler fra glassplatene og flekken med Coomassie Brilliant Blue-oppløsning (50 % H2O, 40 % EtOH, 10 % eddiksyre og R250 Coomassie Brilliant Blue) i 30 min.
    4. De-flekk med en løsning bestående av 50% H2O, 40% EtOH, 10% eddiksyre løsning til gel bakgrunnen vises lyseblå.
    5. Til slutt overføre gelen i Petri retter som inneholder deionisert vann, for å oppnå de-farging og rehydrering av polyakrylamid geler. Proteiner skal vises som blå bånd av gjennomsiktig bakgrunn.

Representative Results

OPL og IPL ble skilt fra PL av et nylagt ufruktbar egg for å analysere sine proteinprofiler av SDS-PAGE. Den eksperimentelle arbeidsflyten til hele protokollen er illustrert i figur 2. Figur 3 viser proteinutløsning ved forskjellige Tris-konsentrasjoner (figur 3A), ulike pH (figur 3B) og forskjellige NaCl-konsentrasjoner (figur 3C). De resulterende to underlagene ble observert under lys av det kikkert dissekeringsmikroskopet og er vist i figur 4 hvor IPL er gjennomskinnelig mens OPL er tett, overskyet og hvitaktig. Disse funksjonene kan delvis vitne om effektiviteten av underlaget separasjon.

Etter separasjonen ble OPL og IPL lyofilisert uavhengig, og proteininnholdet ble fullstendig oppløst takket være en kombinasjon av mekanisk sliping, bruk av et anionisk vaskemiddel (SDS) og et reduksjonsmiddel (beta-mercaptoetanol), etterfulgt av koking. Etter migrering i en polyakrylamidgel (SDS-PAGE elektroforese), viser OPL- og IPL-prøver forskjellige elektroforetiske profiler (figur 5), som forventet.

Figure 1
Figur 1: Struktur av PL av et nylagt ufruktbar egg. Skjematisk representasjon og overføring elektron mikroskopi mikroskopi av hele PL i tverrsnitt (personlige data, ©Plateforme IBiSA de Microscopie Electronique, Universitet og CHRU av Tours, Frankrike, S. Georgeault). Merk at dette bildet ble hentet fra PL utarbeidet som presentert i denne protokollen. OPL, ytre perivitelline lag; IPL, indre perivitelline lag. Svart pilhode indikerer den kontinuerlige membranen som skiller de to underlagene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Arbeidsflyt som oppsummerer de to hovedtrinnene i protokollen og eksempler på programmer. Protokollen er optimalisert for proteomisk analyse av PL-lag, men den kan stoppes på noen trinn for andre programmer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Optimalisering av buffersammensetningen for PL-prøvetaking. Kort sagt ble ren PL (n = 4) inkubert i samme volum av de ulike bufferløsningene i 2 t.PL fjernet, og proteinkonsentrasjonen ble estimert ved å måle absorbans ved 280 nm i den gjenværende bufferen. (A)Effekt av Tris-HCl konsentrasjon ved pH 8. (B) Effekt av pH (7 til 9). (C) Effekt av NaCl konsentrasjon. Fra disse resultatene konkluderte vi med at bufferen består av 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM NaCl er den mest hensiktsmessige da den begrenser proteintap. Resultatene uttrykkes som et gjennomsnitt ± standardavvik for fire forskjellige PL-prøver. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av en Tukeys test for flere sammenligninger. P-verdi <0,05 ble ansett som signifikant (ns, ikke signifikant; * p<0,05, *** p<0,001, **** p<0,0001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: OPL og IPL-funksjoner under et kikkert dissekeringsmikroskop. Etter separasjon, IPL (til høyre) dukket opp gjennomskinnelig og OPL (til venstre) var ugjennomsiktig. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: SDS-PAGE analyse av separert OPL og IPL fra nylagt ufruktbar egg. 4%-20% akrylamid gel etterfulgt av Coomassie strålende blå flekker. Massen av molekylvektsstandardbånd er angitt i kDa. OPL-profilen består hovedsakelig av proteiner med en molekylær masse > 30 kDa mens de store båndene som oppdages på IPL-profilen, har molekylære masser < 30 kDa. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Suksessen til den nåværende protokollen er avhengig av to kritiske trinn som ble uavhengig optimalisert: den mekaniske separasjonen av OPL og IPL som må være så mindre destrukturering som mulig, etterfulgt av den komplette proteinsluktiseringen av hver underlag, som omvendt er destrukturering og denaturing. Det fremhever også noen spesifikke punkter som må tas i betraktning for å sikre vellykket oppnåelse av hvert trinn.

Protokollen er ikke avhengig av eggeskallfargen, eggvekten, produksjonstypen eller hønsegens genetiske stamme. Det avhenger imidlertid av eggets friskhet. Faktisk gjennomgår egget dype interne fysikalske modifikasjoner raskt etter å ha blitt lagt, selv om disse endringene kan forsinkes når lagring utføres under nedkjølteforhold 14,15. Tap av karbondioksid gjennom eggeskallporene under lagring resulterer i økningen av eggehvit pH (fra 7,8 til 9,5), mens noen vannutvekslinger oppstår mellom eggeplommen og den hvite, over PL. Begge modifikasjoner negativt påvirke molekylær og histologisk struktur av PL som blir svekket og mindre spent14,15, sannsynligvis på grunn av fysikalske modifikasjoner av proteininnholdet16,17,18. Det antas at separasjonen av underlag vil bli svært vanskelig med lagrede egg, spesielt hvis lagringen utføres i lang tid ved romtemperatur. Oppdatert har protokollen blitt utført ved hjelp av egg lagret i mindre enn 4 dager ved 4 °C, og maksimal oppbevaringstid for et egg for effektivt å prøve PL-underlag er ennå ikke kjent. I tillegg, hvis målet er analysen av hvert underlag, er det avgjørende å bruke ubefruktede egg. På lådagen er embryoet til et befruktet egg 23 timer gammelt og utviklingen er svært rask etterpå, hvis egget inkuberes. Faktisk ekspanderer embryonal utvikling og veksten av noen ekstraembryoniske strukturer ved hjelp av PL som et substratum, som dermed raskt brytes ned, og erstattes av den ekstraembryoniske eggeplommen19.

Etter manuell separasjon av eggeplommen og eggehviten, må eggeplommen rengjøres fra eggehvite spor og fra chalazae som forble tett festet til PL. Spissen er å rulle eggeplommen forsiktig på et filterpapir og utføre omfattende vasker av eggeplommen i bufrede løsninger (10 mM Tris-HCl pH 8). PH-en som brukes til bufferen er i samsvar med den fysiologiske pH-en til eggehviten14 og har vist seg å minimere proteintap (figur 3). Bruken av en nedkjølt buffer vil da bidra til å fjerne PL fra eggeplommen fordi ved 4 ° C, vil bufferen lette PL fjerning som lipidisk eggeplomme trekker tilbake og blir mindre væske ved denne temperaturen. Ytterligere vasker vil tillate fjerning av eggeplommerester fra PL. Det er også viktig å kutte ut sonen som tilsvarer bakterieplaten fordi denne strukturen som inneholder kvinnelig pronukleus kanskje ikke er representativ for PL. Det er stedet for befruktning og multiplikasjon av embryonale celler når egget befruktes. Det er ment å ha en bestemt sammensetning som kanskje ikke er representativ for hele PL, som er grunnen til at den ble fjernet. Dette spesifikke trinnet er sterkt tilrettelagt når eggeplommen er nedsenket i en kald buffer. Selv om denne bakterieplatestrukturen kastes i den nåværende protokollen (ut av målene), kan spesifikke analyser av dette området i befruktede egg være svært nyttige for forskere som er interessert i å studere utviklingen av PL-innholdet (proteomikk og aktivitet) og struktur (elektronmikroskopi), i de tidlige stadiene av embryogenese19,20,21. På dette stadiet er hele PL strukturelt intakt og kan behandles for ytterligere strukturell analyse av elektronmikroskopi (figur 2), til trinn 1.2 eller til trinn 2.1 (hvis målet er å analysere hele PL).

Trinn 1.2 må utføres under et kikkert dissekeringsmikroskop, da PL er veldig tynn og skjør (ca. 10 μm tykk). Separasjonen av underlag er nesten umulig i vann eller i buffer mangler minimalt salt, og innledende forsøk på å bruke disse alternativene har resultert i alvorlig PL skade. Dermed forblir bufferen som er valgt for dette trinnet ved fysiologisk pH (pH 8) og inneholder 50 mM NaCl. Dette trinnet er vanskelig og må utføres forsiktig og forsiktig for å forhindre PL rive. Når de er separert, kan de to underlagene enkelt identifiseres som de viser særegne fysiske egenskaper (ugjennomsiktig versus gjennomskinnelig). Mangel på homogenitet av IPL under lys av mikroskopet bør gjenspeile en ufullstendig separasjon og dermed tilstedeværelsen av de gjenværende flekkene av OPL tilstede på IPL. I tillegg er det svært vanskelig å behandle hele membranen og bruk av 2 cm x 3 cm stykker øker sjansene for suksess. Det resulterende underlaget er egnet for histologisk studie ved elektronmikroskopi (figur 1). Det er bemerkelsesverdig at en bestemt lineær struktur (0,05 til 1 μm tykk) kalt den kontinuerlige membranen (CM) er synlig på mikrografen (figur 1) og forblir vanligvis festet til det ene eller det andre underlaget under separasjonsprosessen. Det har tidligere blitt publisert at ved bruk av en relativt høy salt molaritet for separasjon (500 mM), CM forble festet til OPL7 mens bruk av vann5 vil favorisere vedlegg av CM til IPL. I denne protokollen brukes en lav salt molaritet for å oppnå de spesifikke målene (PL-underlaget strukturelt intakt og minimalt tap av proteiner), noe som betyr at denne CM sannsynligvis er forbundet med IPL. Imidlertid vil ytterligere analyse av IPL og OPL ved overføring elektronmikroskopi tydelig angi denne hypotesen. PL-, OPL- eller IPL-lag oppnådd på slutten av trinn 1 kan også brukes til in vitro-analyser for sperm-eggbindingsanalyser22 eller for å analysere de tidlige trinnene i embryonal utvikling23,24.

Trinn 2 refererer til oppløselsen av proteininnhold, delvis (trinn 2.1) eller helt (trinn 2.2). PL og/eller OPL er først lyofilisert for å fjerne vannmolekyler og for å tillate nøyaktige vektmålinger. Faktisk er PL hovedsakelig sammensatt av vann (88%)7,mens det tørrestoffetinneholder i hovedsak proteiner (80% til 90% avhengig av studier), karbohydrater, fett og mineraler2,7,25. Tatt i tanke på at vannet i PL fjernes ved frysetørking, at karbohydrater i hovedsak gjenvinnes i PL glykoproteiner, og at fett og mineraler stammer fra eggeplomme i hovedsak kastes av omfattende vasker, antas det at det resulterende PL består nesten utelukkende av proteiner. Dermed bør vektverdien oppnådd etter fullstendig lyofilisering hovedsakelig tilsvare proteiner. Like mye PL, OPL og/eller IPL fortynnes deretter i bufferen som inneholder 0,5 M NaCl. Den høye salt molariteten kombinert til mekanisk ødeleggelse av det fibrøse nettverket ved å slipe forenkler proteinslukbilisering under ikke-denaturingsforhold. Dette trinnet etterfølges av fullstendig solubilisering ved hjelp av kokende, SDS vaskemiddel og det reduserende middelet beta-mercaptoetanol (trinn 2.2). Faktisk er noen IPL-proteiner SDS-løselige glykoproteiner25,26,27 ogde viktigste bestanddelene av OPL er NaCl-løselige1,11. Ved hjelp av denne protokollen så vi ingen gjenværende pellet av uoppløselige proteiner etter sentrifugering, noe som indikerer at solubiliseringen sannsynligvis var fullført. Proteiner fra PL, OPL og/eller IPL ble deretter analysert av SDS-PAGE. Resulterende proteinprofiler er konsistente med publisert litteratur2,4,11,16,men oppløsningen og intensiteten av signalet er svært forbedret og mye mer homogen mellom ulike IPL og OPL uavhengige prøvetakinger.

I tillegg er kvantitativ sammenligning mellom OPL og IPL mulig takket være nøyaktigheten av vekten som vi utledet for de respektiveunderlagene 2,7. Videre er både OPL- og IPL-profiler svært forskjellige og bortsett fra et svakt bånd på 14 kDa og 75 kDa, deler begge PL-underlagene ikke synlig bånd som viser samme molekylvekt. Denne observasjonen bekrefter effektiviteten av sublayers separasjon uten signifikant krysskontaminering. Ifølge den eneste PL proteomiske analysenpublisert 1,bør de mest intense båndene i OPL (<30 kDa) tilsvare lysozym (14 kDa), vitellin membran ytre lag protein 1 (17 kDa), avian beta-defensin 11 (tilsynelatende molekylvekt på 12 kDa), mens de intense båndene av IPL (> 30 kDa) sannsynligvis er Zona-Pellucida protein 1 (102 kDa) og Zona-Pellucida protein 3 (47 kDa). Fordelingen av svært rikelig PL proteiner ovotransferrin (78 kDa), ovalbumin-relatert protein X (45 kDa), ovalbumin (43 kDa)1 mellom underlag gjenstår å bli belyst. Faktisk antyder den høye molekylvekten av disse proteinene (> 30 kDa) at de er IPL-proteiner basert på SDS-PAGE-profilen, men deres vevspesifisitet (oviduct-uttrykte proteiner) vil heller knytte disse proteinene til OPL28,29. Videre har noen foreslått en potensiell forurensning av PL-prøver av eggehvite og eggeplommeproteiner på grunn av utilstrekkelig vask1. Denne manglende informasjonen er grunnlaget for utviklingen av den nåværende protokollen, som vil bli ytterligere brukt til dyptgående kvantitative proteomikk av PL, OPL og IPL.

Alternativt, fra trinn 2.1 og etter sentrifugering for å fjerne uoppløselig materiale, er det mulig å trekke ut noen spesifikke proteiner for ytterligere biokjemisk og biologisk karakterisering. En slik tilnærming har nylig blitt brukt til å karakterisere biologiske aktiviteter og / eller 3D-strukturen til de to hovedkomponentene i OPL, vitellinmembranens ytre lagprotein 1 (VMO1) og avian beta-defensin 11 (AvBD11)30,31. Tilgjengeligheten av disse proteinene som rensede molekyler kan også bidra til å produsere spesifikke antistoffer for ytterligere eksperimenter som immunohistokjemi eller for utvikling av kvantitative analyser, inkludert enzym-koblede immunosorbentanalyser.

De to viktigste begrensningene i denne protokollen er (1) utfordringen med underlagsseparasjon, spesielt hvis egg har blitt lagret mer enn 4 dager ved 4 ° C og (2) det faktum at den komplette proteinslukbiliseringen krever reduksjon og denaturing buffere, noe som svekker den iboende biologiske aktiviteten til de resulterende prøvene. Når det gjelder den første begrensningen, krever mekanisk separasjon tekniske ferdigheter, men oppnås lett etter 2 eller 3 eksperimentelle treninger. Noen IPL små stykker kan forbli festet til OPL og vice versa som begge underlagene er tett forbundet. Kontaminering av det ene underlaget av det andre bør imidlertid være minimal hvis den mekaniske separasjonen utføres forsiktig. Typiske IPL- og OPL SDS-PAGE-profiler etter optimal separasjon av underlag er illustrert i figur 5. Når det gjelder den andre begrensningen, har eksperimentelle skritt som presenteres i denne artikkelen blitt optimalisert for proteomiske analyser, for å gi en uttømmende liste over proteiner som komponerer hvert underlag. For videre karakterisering av de biologiske aktivitetene til hvert protein, er det nødvendig å stoppe i trinn 2.1.2, før du bruker denaturing forhold (trinn 2.2.1, bruk av buffer med SDS og beta-mercaptoethanol etterfulgt av koking). Det er imidlertid bemerkelsesverdig at proteiner som følge av trinn 2.1.2 bare er saltløselige proteiner mens saltinsoluble proteiner dannes aggregater. Et alternativ for å vurdere deres respektive aktivitet kan være å produsere saltinsoluble proteiner som rekombinante proteiner ved hjelp av heterologe systemer (E. coli, baculovirus, gjær, etc.).

Denne protokollen kan tilpasses andre fugleegg for komparative studier for å bedre sette pris på originaliteten til hver art. Faktisk viser PL noen fuglespesifisiteter både strukturelt og når det gjelder proteinsammensetning, sannsynligvis på grunn av tilpasning til nye miljøer, men også til utviklingsspesifisiteter2,6,9,32. Utviklingen av denne protokollen som krever moderat teknikk og klassisk utstyr / materialer åpner nye forskningsveier innen fuglegjengivelse og spesiasjonsstudier.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige til Philippe Didier og Karine Anger (INRAE, PEAT, 37380, Nouzilly, Frankrike, https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12) for å gi ubefruktede Isa-brune egg. Vi takker også University of Tours, Frankrike for finansiering av M. Bregeons doktorgrad. Dette arbeidet fikk økonomisk støtte fra The French National Research Agency (EQLIPSE, ANR-19-CE21-0006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binocular dissecting microscope Vision Engineering, France Model Mantis Elite
Lyophilizer Cryotec, France Model Cosmos 80
Mini-Protean II electrophoresis cell Biorad, Hercules, USA 1652960 Any apparatus adapted for protein electrophoresis
Mixer Mill MM400 Retsch, Hann, Germany 20.745.0001 Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample
Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm Dutscher, Brumath 5066
Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm Dutscher, Brumath 327005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mann, K. Proteomic analysis of the chicken egg vitelline membrane. Proteomics. 8 (11), 2322-2332 (2008).
  2. Chung, W. H., Lai, K. M., Hsu, K. -C. Comparative study on histological structures of the vitelline membrane of hen and duck egg observed by cryo-scanning electron microscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (3), 1794-1799 (2010).
  3. Kido, S., Doi, Y. Separation and Properties of the Inner and Outer Layers of the Vitelline Membrane of Hen's Eggs. Poultry Science. 67 (3), 476-486 (1988).
  4. Steele, M. G., Meldrum, W., Brillard, J. P., Wishart, G. J. The interaction of avian spermatozoa with the perivitelline layer in-vitro and in-vivo. Journal of Reproduction and Fertility. 101 (3), 599-603 (1994).
  5. Bain, J. M., Hall, J. M. Observations on the development and structure of the vitelline membrane of the hen's egg: an electron microscope study. Australian Journal of Biological Sciences. 22 (3), 653-665 (1969).
  6. Damaziak, K., Kieliszek, M., Buclaw, M. Characterization of structure and protein of vitelline membranes of precocial (ring-necked pheasant, gray partridge) and superaltricial (cockatiel parrot, domestic pigeon) birds. PLoS One. 15 (1), 0228310 (2020).
  7. Bellairs, R., Harkness, M., Harkness, R. D. The vitelline membrane of the hen's egg: a chemical and electron microscopical study. Journal of Ultrastructure Research. 8 (3-4), 339-359 (1963).
  8. Kido, S., et al. Characterization of vitelline membrane outer layer protein I, VMO-I: amino acid sequence and structural stability. Journal of Biochemistry. 117 (6), 1183-1191 (1995).
  9. Damaziak, K., et al. Comparative analysis of structure and strength of vitelline membrane and physical parameters of yolk of ostrich, emu, and greater rhea eggs. Poultry Science. 97 (3), 1032-1040 (2018).
  10. Kirunda, D. F., McKee, S. R. Relating quality characteristics of aged eggs and fresh eggs to vitelline membrane strength as determined by a texture analyzer. Poultry Science. 79 (8), 1189-1193 (2000).
  11. Back, J. F., Bain, J. M., Vadehra, D. V., Burley, R. W. Proteins of the outer layer of the vitelline membrane of hen's eggs. Biochimica Et Biophysica Acta. 705 (1), 12-19 (1982).
  12. Waclawek, M., Foisner, R., Nimpf, J., Schneider, W. J. The chicken homologue of zona pellucida protein-3 is synthesized by granulosa cells. Biology of Reproduction. 59 (5), 1230-1239 (1998).
  13. Okumura, H., et al. A newly identified zona pellucida glycoprotein, ZPD, and dimeric ZP1 of chicken egg envelope are involved in sperm activation on sperm-egg interaction. Biochemical Journal. 384, Pt 1 191-199 (2004).
  14. Guyot, N., Rehault-Godbert, S., Nys, Y., Baron, F. Understanding the natural antibacterial defences of egg white and their regulation. Achieving Sustainable Production of Eggs Volume 1. Roberts, J. 1, Burleigh Dodds Science Publishing Limited. Cambridge, UK. 161-193 (2016).
  15. Trziszka, T., Smolinska, T. Chemical Characterization of the Vitelline Membrane of Hens Eggs. Food Chemistry. 8 (1), 61-70 (1982).
  16. Berardinelli, A., Ragni, L., Giunchi, A., Gradari, P., Guarnieri, A. Physical-mechanical modifications of eggs for food-processing during storage. Poultry Science. 87 (10), 2117-2125 (2008).
  17. Kelley, A. J. The effects of storage time on vitelline membrane protein banding patterns and interior egg quality of eggs from nonmolted and molted hens. Texas A&M University. , Master of Science Thesis (2003).
  18. Schafer, A., Drewes, W., Schwagele, F. Analysis of vitelline membrane proteins of fresh and stored eggs via HPLC. Zeitschrift Für LebensmittelUntersuchung Und-Forschung A. Food Research and Technology. 206 (5), 329-332 (1998).
  19. Romanoff, A. L. The avian embryo: Structural and functional development. , The Macmillan Company. New York, NY. (1960).
  20. Haas, H. J., Spratt, N. T. Contributions to an analysis of the avian vitelline membrane's potential to promote outgrowth of the yolk sac-serosal membrane. The Anatomical Record. 184 (2), 227-231 (1976).
  21. Jensen, C. Ultrastructural changes in the avian vitelline membrane during embryonic development. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 21 (3), 467-484 (1969).
  22. Barbato, G. F., Cramer, P. G., Hammerstedt, R. H. A practical in vitro sperm-egg binding assay that detects subfertile males. Biology of Reproduction. 58 (3), 686-699 (1998).
  23. New, D. A. T. The Adhesive Properties and Expansion of the Chick Blastoderm. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 7 (2), 146-164 (1959).
  24. New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3 (4), 326-331 (1955).
  25. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. I. Membrane structure and its deterioration with age. Journal of Biochemistry. 78 (2), 261-268 (1975).
  26. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. II. Physicochemical properties of glycoprotein I. Journal of Biochemistry. 79 (6), 1351-1356 (1976).
  27. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. III. Physicochemical properties of glycoprotein II. Journal of Biochemistry. 81 (5), 1543-1548 (1977).
  28. Réhault-Godbert, S., et al. Ovalbumin-related protein X is a heparin-binding ov-serpin exhibiting antimicrobial activities. Journal of Biological Chemistry. 288 (24), 17285-17295 (2013).
  29. Gautron, J., et al. Ovotransferrin is a matrix protein of the hen eggshell membranes and basal calcified layer. Connective Tissue Research. 42 (4), 255-267 (2001).
  30. Guyot, N., et al. Proteomic analysis of egg white heparin-binding proteins: towards the identification of natural antibacterial molecules. Scientific Reports. 6, 27974 (2016).
  31. Guyot, N., et al. function, and evolution of Gga-AvBD11, the archetype of the structural avian-double-beta-defensin family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 337-345 (2020).
  32. Mori, M., Masuda, N. Proteins of the vitelline membrane of quail (Coturnix coturnix japonica) eggs. Poultry Science. 72 (8), 1566-1572 (1993).

Tags

Biokjemi Utgave 167 hønseegg perivitellin lag mekanisk separasjon histoologisk struktur protein solubilisering proteomics
Mekanisk separasjon og proteinslukbilisering av de ytre og indre perivitelline underlag fra hønseegg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bregeon, M., Guyot, N.,… More

Bregeon, M., Guyot, N., Réhault-Godbert, S. Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs. J. Vis. Exp. (167), e61739, doi:10.3791/61739 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter