Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Mekanisk separation och proteinlöslighet av de yttre och inre perivitellinunderskikten från hönsägg

Published: January 27, 2021 doi: 10.3791/61739
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut National de Recherche pour l'Agriculture, l'Alimentation et l'Environnement, Université de Tours, Biologie des Oiseaux et Aviculture, 37380, Nouzilly, France

Summary

Denna artikel rapporterar en enkel metod för att isolera de yttre och inre perivitelline underlag av kyckling ägg samtidigt minimera strukturella förändringar och optimera protein löslighet av varje underlag för proteomic analyser.

Abstract

Det perivitellinskikt som omger äggulan spelar en grundläggande roll i befruktning, i äggförsvar och i utvecklingen av fågelembryon. Det bildas av två proteinhaltiga underlag som är tätt associerade och bildas av distinkta kvinnliga reproduktionsorgan. Båda strukturerna antas ha sina egna funktionella särdrag, som återstår att definiera. För att karakterisera funktionen hos proteiner som komponerar varje underlager är den första utmaningen att fastställa de förhållanden som skulle möjliggöra mekanisk separation av dessa två invecklade lager, samtidigt som eventuella strukturella skador begränsades. Det andra steget är att optimera de experimentella förhållandena för att underlätta proteinlöslighet från dessa två underlag, för efterföljande biokemiska analyser. Effektiviteten av detta tillvägagångssätt bedöms genom att analysera proteinprofilen för varje underskikt av natrium dodecyl sulfat-poly-akrylamid gel elektrofores (SDS-PAGE), som förväntas vara distinkt mellan de två strukturerna. Detta tvåstegsförfarande är fortfarande enkelt. Det kräver klassisk biokemisk utrustning och reagenser. och är kompatibel med ytterligare djupgående proteomik. Det kan också överföras till andra fågelägg för jämförande biologi, med vetskap om att strukturen och sammansättningen av det perivitellinskiktet har visat sig ha artspecifika egenskaper. Dessutom tillåter de icke-denatureringsförhållanden som utvecklats för sublayers separation (steg 1) sina strukturella analyser genom skanning och överföringselektronmikroskopi. Det kan också utgöra det första steget för efterföljande proteinrening att analysera sina respektive biologiska aktiviteter och 3D-struktur, eller att utföra ytterligare immunohistokemiska eller funktionella analyser. Sådana studier skulle bidra till att dechiffrera den fysiologiska funktionen hos dessa två underlag, vars strukturella och funktionellaintegriteter är avgörande kriterier för reproduktiv framgång.

Introduction

Syftet med denna metod är att tillhandahålla ett protokoll som möjliggör efterföljande biokemisk karakterisering av det perivitellinskiktet (PL), ett tunt proteinhaltigt skikt som omsluter äggulan och spelar en grundläggande roll i reproduktionen av fågelarter. PL, även kallat "vitelline membran" i litteraturen, är ett tredimensionellt nätverk av tjocka fibrer som består av flera typer av glykoproteiner. Den består av ett inre perivitellinskikt (IPL) (i kontakt med äggulan) som är monterat i äggstocken och av ett yttre perivitellinskikt (OPL, i kontakt med det vita), som ligger på IPL (figur 1) och produceras av infundibulum. Denna senare vävnad är det trattliknande övre segmentet av äggledaren som får den mogna äggulan follikeln efter ägglossningen och platsen där befruktningen äger rum. Utsöndring av OPL sker efter dessa två händelser och följs av den successiva deponeringen av äggvitan och äggskalet i andra specifika segment av äggledaren. PL: s fysiologiska funktioner är inte bara relaterade till befruktning och tidiga stadier av embryogenes, men också till embryots fysiska och molekylära skydd. Den proteomiska analysen av kycklingägg som utfördes på hela PL visade närvaron av 137 olikaproteiner 1, men fördelningen av de flesta av dessa proteiner mellan IPL och OPL återstår att klargöra. Den minimala mängden data som finns tillgängliga i litteraturrapporten som IPL och OPL uppvisar mycket distinktaproteinprofiler 2,3,4, vilket föreslår olika strukturella och funktionella egenskaper. Den relativa bristen på data om fördelningen av proteiner mellan OPL och IPL beror sannolikt på svårigheten att separera båda underlagren som är tunna och inbäddade.

Metoden som presenteras här beskriver de villkor som ska användas för att separera de två underlagarna med begränsad inverkan på deras respektive histologiska struktur samtidigt som deras proteininnehåll bevaras och protokollet möjliggör fullständig löslighet av proteiner för efterföljande analys av proteomik. Den innehåller två huvudsteg: 1) PL-provtagning och OPL/IPL-separation och 2) PL-, OPL- och IPL-behandling för proteinlöslighet och elektrofores för masspektrometrianalys. Arbetsflödet presenteras i figur 2. Även om det nuvarande protokollet har optimerats för proteomiska analyser (steg 2.2), kan det stoppas i vissa steg för histologisk (t.ex. elektronmikroskopi), immunohistokemiska analyser, funktionella studier (steg 1) och för rening av saltlösliga proteiner för att karakterisera deras struktur och biologiska aktivitet (steg 2.1) (figur 2).

Det första steget är avlägsnandet av totalt PL från äggulan(figur 2, steg 1.1). Alla publicerade metoder börjar med separationen av äggvitorna från äggulan manuellt eller med hjälp av en äggavskiljare. Den följs av avlägsnandet av den återstående äggvitan och den tjocka chalazaen med tång eller adsorption på ett filterpapper5 (figur 2A). Därefter varierar de tekniker som valts för att ta prov på PL beroende på de publicerade artiklarna. Vissa papper inkluderar flera tvättar av äggulan, i avjoniserat eller destilleratvatten 1,5,6, i 0,85 till 1% saltlösning2,7,8, i buffringslösningar som 0,15 M NaCl / N-[Tris (hydroxymethyl) metyl]-2-aminoetanesulfonsyra, pH 7.44, eller i 0.01N HCl (pH 2)3. Dessa förfaranden tillämpades på kyckling, anka, ringhalsad fasan, grå rapphöna, cockatiel papegoja, inhemsk duva eller ratiter ägg2,6,9. Avlägsnandet av PL medan äggulan underhålls i en Petri-maträtt utan vattenlösningar kan vara mycket mödosam eftersom PL är bräcklig och äggula tenderar att hålla sig till PL1,5 och är därför fortfarande svår att eliminera efteråt. Användning av sur buffert eller lösning under en timme vid 37 °C3 är inte heller att föredra eftersom sådana förhållanden kan förändra PL-strukturen och leda till proteinförlust. Det är också viktigt att ta bort det område som innehåller germinalskivan eftersom denna zon sannolikt har ett distinkt strukturellt och molekylärt mönster, vilket inte återspeglar hela PL4,6,10 ( Figur2B). Denna metod drar nytta av idéer som lyfts fram i vissa publicerade artiklar och föreslår vissa förbättringar för att underlätta PL-provtagning samtidigt som dess integritet bevaras (figur 2C).

Det andra steget består i att separera de två underlagarna(figur 2, steg 1.2). Detta steg är kritiskt eftersom OPL och IPL är tätt bundna till varandra. Detta steg bör utföras noggrant med tång under ett binokulärt dissekerande mikroskop. Publikationer som rapporterar OPL/IPL separation ärganska begränsade 2,3,7,11 och några av dem använder specifika villkor (sur buffert vid 37 °C för 1 h2,3) som sannolikt kommer att påverka underlagens histologiska struktur och/eller bidra till proteinförlust eller äggula eller vita föroreningar. För att bättre skilja OPL från IPL rapporterade vissa författare användningen av toluidinblått för att färga OPL (det inre lagret förblir färglöst)11. I den metod som utvecklats optimerade vi förutsättningarna så att separationen lätt uppnås och inte kräver användning av något färgämne (figur 2D).

Det andra huvudsteget är lösligheten av proteiner som komponerar varje underlager. Klassiskt uppnås det genom att blanda renafrystorkade 1,torkade2,6, eller nyberedda3,4,11 PL / underlag direkt med Laemmli-bufferten som används för elektrofores. Andra författare föredrog en preliminär löslighet av lager i 1% NaCl, i en 1% SDS buffring lösning2,3,11 eller i en lösning som innehåller proteashämmare och SDS6 vid rumstemperatur eller Triton följt av inkubation vid 45 °C12, under konstant kraftig omrörning. Vissa författare beskrev också ett protokoll där PL inkuberades i fosfatbuffert saltlösning eller urea och utsätts för ultraljudsbehandling13. Dessa behandlingar följdes alla av en centrifugation och utspädning i Laemmli buffert och alla delar nackdelen med ofullständig protein löslighet från lager som olöslig fråga (pelleten erhålls efter centrifugation) kasseras från provet som ska analyseras.

Dessutom är användningen av denatureringsförhållanden (urea, tvättmedel, hög temperatur etc.) av vissa författare för proteinlöslighet inte förenlig med efterföljande proteinrening för karakterisering eftersom de sannolikt kommer att irreversibelt inaktivera proteiner, störa deras biologiska aktiviteter och också försämra deras 3D-struktur. För detta specifika steg 2 innehåller protokollet ett första delsteg som möjliggör löslighet av de mest rikliga proteinerna under icke-denatureringsförhållanden efter PL/OPL/IPL mekanisk de-structuration, som vid behov inte kommer att störa ytterligare proteinstudier(figur 2,steg 2.1) och ett andra delsteg som möjliggör fullständig löslighet av proteiner för elektrofores och djupgående proteomik(figur 2,steg 2.2). Den kombinerar förslag från olika publicerade artiklar och justeringar till följd av nya idéer som validerats av experimentella studier.

Protocol

1.PL-, IPL- och OPL-provtagningar

  1. PL-provtagning
    1. Bryt det nylagda obefruktade ägget manuellt och använd en äggavskiljare som ligger på en glasbägare för att skilja äggulan från den vita. Ta bort chalazae med liten sax och rulla äggulan över ett filterpapper för att ta bort vidhäftande albumen som visas som en genomskinlig och synlig struktur (Figur 2A).
      VARNING: Var försiktig så att du inte punkterar PL med sax. Användning av pincett istället för sax för att ta bort chalazas kan provocera PL-brott och efterföljande äggula läckage. Det rullande steget på filterpapperet är kritiskt och bör utföras mycket snabbt på grund av pappersfiltrets absorberande egenskaper som kan utlösa PL-brott. Det är också mycket viktigt att använda ett obefruktat ägg från lekdagen, för att optimera framgången för detta första steg och alla efterföljande steg. Alternativt kan ägg som har lagrats mindre än 10 dagar i en kyld miljö användas, men experimenterare måste ta hänsyn till potentiella risker för PL-ändringar.
    2. Sänk ner äggulan i ett kristalliserare som innehåller 10 mM Tris-HCl pH 8 som tidigare har kylts ned till 4 °C och ta bort PL-området över germinalskivan inom en 1 cm-zon med trubbig sax (figur 2B).
      OBS: Ursprungligen var PL nedsänkt i avjoniserat vatten, men detta tillvägagångssätt har vissa nackdelar, såsom bristen på pH-kontroll och svårigheterna att separera underlag efteråt (steg 1.2). Därför testades flera villkor, bland annat Tris-koncentrationen(figur 3A)och pH(figur 3B). Användningen av en buffert vid pH 8, istället för avjoniserat eller demineraliserat vatten, är i enlighet med äggfysiologi (pH av äggvita är ca 7,8 på lekdagen)14 och minimerar proteinförlust. Däremot misstänks surt eller mycket alkaliskt pH-kort utlösa PL-de-structuration och tidig proteinlöslighet (figur 3B). Bufferten bestående av 10 mM Tris-HCl pH 8 befanns vara optimal, eftersom den respekterar äggfysiologin och inte orsakar betydande proteinlöslighet (proteinkoncentrationen i arbetsbufferten förblir minimal, figur 3A,B).
    3. Spräck PL med liten sax i bufferten. Håll de två kanterna på den brustna PL med tång och skala PL av äggulan.
    4. Håll PL med tång och skölj PL flera gånger i flera bad på 10 mM Tris-HCl, pH 8 tills inga spår av äggula är synliga. Se i detta skede till att PL är rent, vitt och flytande i bufferten. Det kan bearbetas i steg 1.2 för underlagringsseparation eller direkt till steg 2.1 för biokemiska analyser.
  2. OPL- och IPL-sampling
    1. Sprid ut hela PL-provet genom att lägga OPL uppåt i en petriskål av plast och hålla den platt med så mindre rynkor som möjligt. Täck provet med 10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl. Använd en petriskål av plast (och inte glas) för att begränsa PL-rörelser, eftersom PL fastnar bättre på plast.
      1. För att hitta OPL-sidan, titta på var platsen för den återstående chalazae som är ansluten till OPL och inte IPL. Detta steg kräver liten NaCl-koncentration (50 mM) för att underlätta separation av underlag.
        OBS: Baserat på grafen som presenteras i figur 3C och litteratur11bör denna koncentration inte leda till större proteinförlust. Ursprungligen användes avjoniserat vatten för att separera underlagarna, som beskrivitstidigare 1, 5,6, men denna teknik befanns vara mycketmödosamoch resulterade i förändringen av den strukturella PL-integriteten. Därför testades olika NaCl-koncentrationer (figur 3C) eftersom salt underlättade separationen av de två underlagren. Det är dock anmärkningsvärt att användningen av NaCl-koncentrationen >100 mM ökar proteinlösligheten/frisättningen från PL, vilket inte är målet här (detta kommer att vara målet i steg 2) (figur 3C). Att lägga till 50 mM NaCl till 10 mM Tris-HCl pH 8-bufferten underlättar separationen av de två underlagringarna och minimerar proteinförlusten.
    2. Skär den totala PL i bitar på ca 2 cm x 3 cm med liten sax. Separera mekaniskt de två lagren av varje PL-bit med ultra-exakta spetstångar under ett binokulärt dissekerande mikroskop (figur 4). Förvara de resulterande IPL- och OPL-proverna individuellt i mikrorör vid -80 °C tills de används vidare.
      Protokollet kan pausas här. Det bör noteras att effektiviteten och anläggningen för separation av de två lagren i hög grad beror på äggets friskhet. Lagrade ägg visar faktiskt drastiska interna modifieringar på grund av den snabba ökningen av äggvita pH och efterföljande förändring av äggulaindexet på grund av PL-lossningen (och försvagningen). IPL är bräckligare jämfört med OPL. Det är därför att föredra att placera OPL:s ansikte ovanför och att separera de två underlagarna genom att dra i OPL med tången. Båda underlagarna bör hanteras med dyrbar omsorg.

2. Provbehandling för proteinlöslighet och SDS-PAGE-analyser

  1. Primär proteinlöslighet
    1. Frystorra IPL- och OPL-prover individuellt. När frystorkningen är klar, skär ca 1 mg från varje prov i rena mikrorör med ett läckagesäkert skruvlock. Förvara de återstående proverna i tätt slutna rör för långvarig förvaring vid -80 °C.
      OBS: Användning av mikrorör med ett läckagesäkert skruvlock säkerställer hermetisk och läckagesäker förslutning för att förhindra provrehydrering och som säkrar proverna.
    2. Blanda 1 mg av varje lyofiliiserad underlag med 400 μL 50 mM Tris pH 7, 500 mM NaCl. Använd en mixerkvarn i 2 gånger i 5 minuter vid 30 Hz för att desintegrera OPL- och OPL-strukturer i mikropartiklar och underlätta proteinlöslighet. Samla in 400 μL av proverna som innehåller OPL och IPL i två rena mikrorör.
      OBS: Bufferten som används här har valts för att öka proteinlösligheten (till skillnad från steg 1). Denna buffert baserades på resultaten i figur 3, som visar en ökning av proteinlöslighet vid pH 7 (figur 3B) och med 0,5 M NaCl (Figur 3C). Protokollet kan pausas här. I detta skede kan prover användas för proteinrening av huvudsakliga PL-proteiner eller bearbetas till steg 2.2.
  2. Proteinlöslighet för elektrofores
    1. Tillsätt 5x SDS-PAGE provbuffert (100 μL, 0,25 M Tris-HCl, 0,05% bromofenolblå, 50% glycerol, 5% SDS, 5% beta-mercaptoethanol, pH 6,8) till varje 400 μL av provet och värme vid 100 °C i 5 min.
      OBS: Protokollet kan pausas här, och prover kan lagras vid -80 °C. I detta skede av protokollet är OPL och IPL helt upplösta. Provlöslighetens effektivitet kan bedömas genom centrifugering av prover i 5 minuter vid 10 000 x g. Fullständig löslighet kännetecknas av frånvaro av synlig pellet efter centrifugation. Således, efter fullständig löslighet, Det anses här att 1 mg lyofiliserad underlag motsvarar 1 mg proteiner (proteinkoncentrationen i 500 μL-provet är 2 mg/ml). Faktum är att PL består av mer än 80% protein2,15. Användningen av en 5x provbuffert begränsar provutspädningen, men en 1x eller 2x provbuffert kan också användas.
    2. Ladda maximalt 20 μg proteiner/körfält på en SDS-polyakrylamidgel (4–20 % gradientgel) och utför elektrofores vid 120 V med hjälp av ett vertikalt elektroforessystem.
      OBS: Användning av en 4%-20% gradient gel är inte obligatoriskt men är att föredra här som OPL och IPL uppvisar proteiner med molekylvikter som sträcker sig från <10 kDa till >250 kDa. Det kan också vara användbart att hålla staplingsgelen (som vanligtvis avlägsnas), eftersom närvaron av olösliga proteiner eller proteinaggregat längst ner i brunnar skulle indikera dålig löslighet och ett eventuellt saknat steg under provberedningen.
    3. Efter elektrofores, ta bort geler från glasplattorna och måla med Coomassie Brilliant Blue-lösning (50% H2O, 40% EtOH, 10% ättiksyra och R250 Coomassie Brilliant Blue) i 30 minuter.
    4. Avfläckning med en lösning bestående av 50% H2O, 40% EtOH, 10% ättiksyralösning tills gelbakgrunden verkar ljusblå.
    5. Överför slutligen gelén i petriskålar som innehåller avjoniserat vatten för att uppnå avfärgning och rehydrering av polyakrylamidgeler. Proteiner bör visas som blå band med en transparent bakgrund.

Representative Results

OPL och IPL separerades från PL av ett nylagt obefruktat ägg för att analysera sina proteinprofiler av SDS-PAGE. Hela protokollets experimentella arbetsflöde illustreras i figur 2. Figur 3 visar proteinfrisättning vid olika Tris-koncentrationer(figur 3A),olika pH-koncentrationer(figur 3B)och olika NaCl-koncentrationer(figur 3C). De resulterande två underlagringarna observerades mot bakgrund av kikarmikroskopet och visas i figur 4 där IPL är genomskinligt medan OPL är tätt, grumligt och vitaktigt. Dessa funktioner kan delvis vittna om effektiviteten i underlagringsseparationen.

Efter separationen var OPL och IPL lyophilized självständigt, och deras proteininnehåll var helt upplöst tack vare en kombination av mekanisk slipning, användning av ett anjoniskt tvättmedel (SDS) och ett reducerande medel (beta-mercaptoethanol), följt av kokning. Efter migrering i en polyakrylamidgel (SDS-PAGE-elektrofores) uppvisar OPL- och IPL-prover som förväntat distinkta elektroforetiska profiler (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Pl:s struktur för ett nylagt obefruktat ägg. Schematisk representation och överföringselektronmikroskopimikroskopimikrografi av hela PL i tvärsnitt (personuppgifter, ©Plateforme IBiSA de Microscopie Electronique, University och CHRU of Tours, Frankrike, S. Georgeault). Observera att denna bild erhölls från PL som utarbetats enligt detta protokoll. OPL, yttre perivitellinskikt; IPL, inre perivitelline lager. Svart pilspets anger det kontinuerliga membranet som separerar de två underlagarna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Arbetsflöde som sammanfattar de två huvudstegen i protokollet och exempel på program. Protokollet har optimerats för proteomisk analys av PL-lager, men det kan stoppas i vissa steg för andra applikationer. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Optimering av buffertsammansättningen för PL-provtagning. Kortfattat, ren PL (n = 4) inkuberades i samma volym av de olika buffring lösningarna för 2 h.PL togs bort och protein koncentrationen uppskattades genom att mäta absorbans vid 280 nm i den återstående bufferten. a)Effekten av Tris-HCl-koncentrationen vid pH 8. B)Effekten av pH (7–9). C)Effekten av NaCl-koncentrationen. Av dessa resultat drog vi slutsatsen att bufferten som består av 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM NaCl är den lämpligaste eftersom den begränsar proteinförlusten. Resultaten uttrycks som ett medelvärde ± standardavvikelse för fyra olika PL-prover. Statistiska analyser utfördes med hjälp av enkelvägs-ANOVA följt av en Tukeys multipla jämförelsetest. P-värde <0,05 ansågs signifikant (ns, inte signifikant; * p<0,05, *** p<0,001, **** p<0,0001). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: OPL- och IPL-funktioner under ett kikarekterande mikroskop. Efter separationen verkade IPL (till höger) genomskinligt och OPL (till vänster) var ogenomskinligt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: SDS-PAGE-analys av separerade OPL och IPL från nylagt obefruktat ägg. 4–20% akrylamidgel följt av Coomassie briljant blå färgning. Massan av standardband med molekylvikt anges i kDa. OPL-profilen består huvudsakligen av proteiner med en molekylär massa >30 kDa medan de stora banden som detekteras på IPL-profilen har molekylära massor <30 kDa. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Discussion

Framgången för det nuvarande protokollet bygger på två kritiska steg som var oberoende optimerade: den mekaniska separationen av OPL och IPL som måste vara så mindre destrukturerande som möjligt, följt av fullständig proteinlöslighet av varje underlager, vilket omvänt är destrukturering och denaturering. Det belyser också några specifika punkter som måste beaktas för att säkerställa ett framgångsrikt uppnående av varje steg.

Protokollet beror inte på äggskalsfärgen, äggvikten, typen av produktion eller den genetiska stammen hos n. Det beror dock på äggets friskhet. Faktum är att ägget genomgår djupgående inre fysikaliskkemiska modifieringar snabbt efter att ha lagts, även om dessa förändringar kan försenas när lagring utförs under kylförhållanden14,15. Förlusten av koldioxid genom äggskalsporerna under lagringen resulterar i en ökning av äggvita pH (från 7,8 till 9,5) medan vissa vattenutbyten sker mellan äggulan och det vita, över PL. Båda modifieringarna påverkar PL: s molekylära och histologiska struktur negativt som blir försvagad och mindrespänd 14,15, sannolikt på grund av fysikaliskkemiska modifieringar av dess proteininnehåll16,17,18. Det antas att separationen av underlag blir mycket svår med lagrade ägg, särskilt om lagringen utförs under en lång period vid rumstemperatur. Hittills har protokollet utförts med ägg som lagrats i mindre än 4 dagar vid 4 °C och den maximala lagringstiden för ett ägg för att effektivt provta PL-underlag är ännu inte känd. Dessutom, om målet är analys av varje underlag, är det viktigt att använda obefruktade ägg. På lekdagen är embryot till ett befruktat ägg 23 timmar gammalt och dess utveckling är mycket snabb efteråt, om ägget inkuberas. Faktum är att embryonal utveckling och tillväxten av vissa extraembryoniska strukturer expanderar med PL som substratum, som därmed snabbt försämras och ersätts av den extraembryonic äggulasäcken 19.

Efter manuell separation av äggulan och äggvitan måste äggulan rengöras från äggvita spår och från chalazae som förblev tätt fastsatt på PL. Spetsen är att rulla äggulan försiktigt på ett filterpapper och utföra omfattande tvättar av äggulan i buffrade lösningar (10 mM Tris-HCl pH 8). Det pH som används för bufferten överensstämmer med äggvitens fysiologiskapH-fel 14 och har visat sig minimera proteinförlusten (figur 3). Användningen av en kyld buffert hjälper sedan till att ta bort PL från äggulan eftersom bufferten vid 4 °C kommer att underlätta PL-borttagning när lipidulan dras tillbaka och blir mindre vätska vid denna temperatur. Ytterligare tvättar gör det möjligt att avlägsna äggularester från PL. Det är också viktigt att skära ut zonen som motsvarar germinalskivan eftersom denna struktur som innehåller kvinnlig pronukleus kanske inte är representativ för PL. Det är platsen för befruktning och multiplikation av embryonala celler när ägget befruktas. Det är tänkt att ha en särskild sammansättning som kanske inte är representativ för hela PL, vilket är anledningen till att den togs bort. Detta specifika steg underlättas starkt när äggulan är nedsänkt i en kall buffert. Även om denna germinala skivstruktur kasseras i det nuvarande protokollet (av målen), kan specifika analyser av detta område i befruktade ägg vara mycket användbara för forskare som är intresserade av att studera utvecklingen av PL-innehållet (proteomik och aktivitet) och struktur (elektronmikroskopi), under de tidiga stadierna av embryogenes19,20,21. I detta skede är hela PL strukturellt intakt och kan bearbetas för ytterligare strukturell analys genom elektronmikroskopi (figur 2), till steg 1.2 eller till steg 2.1 (om målet är att analysera hela PL).

Steg 1.2 måste utföras under ett binokulärt dissekerande mikroskop, eftersom PL är mycket tunn och bräcklig (ca 10 μm tjock). Separationen av underlag är nästan omöjlig i vatten eller i buffert som saknar minimalt salt, och inledande försök att använda dessa alternativ har resulterat i allvarliga PL-skador. Således förblir bufferten som valts för detta steg vid fysiologiskt pH (pH 8) och innehåller 50 mM NaCl. Detta steg är mödosamt och måste utföras noggrant och försiktigt för att förhindra PL-rivning. När de har separerats kan de två underlagarna lätt identifieras eftersom de uppvisar speciella fysiska egenskaper (ogenomskinliga kontra genomskinliga). En brist på homogenitet hos IPL mot bakgrund av mikroskopet bör återspegla en ofullständig separation och därmed förekomsten av de återstående fläckarna av OPL som finns på IPL. Dessutom är det mycket svårt att behandla hela membranet och användningen av 2 cm x 3 cm bitar ökar kraftigt chanserna att lyckas. Det resulterande underlag som erhålls är lämpligt för histologisk undersökning genom elektronmikroskopi (figur 1). Det är anmärkningsvärt att en specifik linjär struktur (0,05 till 1 μm tjock) som heter det kontinuerliga membranet (CM) är synlig på mikrografen (figur 1) och förblir vanligtvis fäst vid det ena eller det andra underlaget under separationsprocessen. Det har tidigare publicerats att när man använder en relativt hög salt molaritet för separation (500 mM), förblev CM fäst vid OPL7 medan användningen av vatten5 kommer att gynna fastsättningen av CM till IPL. I detta protokoll används en låg salt molaritet för att uppnå de specifika målen (PL-underlag strukturellt intakt och minimal förlust av proteiner), vilket innebär att denna CM sannolikt är associerad med IPL. Ytterligare analys av IPL och OPL genom överföringselektronmikroskopi skulle dock tydligt ange på denna hypotes. PL-, OPL- eller IPL-skikt som erhålls i slutet av steg 1 kan också användas för in vitro-analyser för sperma-äggbindningsanalyser22 eller för att analysera de tidiga stegen för embryonal utveckling23,24.

Steg 2 avser löslighet av proteininnehåll, delvis (steg 2.1) eller helt (steg 2.2). PL och/eller OPL är först lyofiliserade för att avlägsna vattenmolekyler och för att möjliggöra exakta viktmätningar. Faktum är att PL huvudsakligen består av vatten (88%)7, medan torrsubstansen innehåller i huvudsak proteiner (80% till 90% beroende på studier), kolhydrater, fetter och mineraler2,7,25. Med tanke på att vattnet i PL avlägsnas genom frystorkning, att kolhydrater i huvudsak återvinns i PL-glykoproteiner och att fett och mineraler kommer från äggula i huvudsak kasseras genom omfattande tvättar, antas det att den resulterande PL består nästan uteslutande av proteiner. Således bör det viktvärde som erhålls efter fullständig lyofilisering huvudsakligen motsvara proteiner. Lika mycket PL, OPL och/eller IPL späds sedan ut i bufferten som innehåller 0,5 M NaCl. Den höga salt molariteten i kombination med mekanisk förstörelse av fibrösa nätverket genom slipning underlättar kraftigt proteinlöslighet under icke-denatureringsförhållanden. Detta steg följs av fullständig löslighet med kokning, SDS-tvättmedel och reducerande medel beta-mercaptoethanol (steg 2.2). Faktum är att vissa IPL-proteiner är SDS-lösliga glykoproteiner25,26,27 och de viktigaste beståndsdelarna i OPL är NaCl-lösliga1,11. Med hjälp av detta protokoll såg vi inte någon återstående pellet av olösliga proteiner efter centrifugation, vilket indikerar att lösligheten sannolikt var fullständig. Proteiner från PL, OPL och/eller IPL analyserades sedan av SDS-PAGE. Resulterande proteinprofiler överensstämmer med publiceradlitteratur 2,4,11,16, men signalens upplösning och intensitet är mycket förbättrad och mycket mer homogen mellan olika IPL- och OPL-oberoende provtagningar.

Dessutom görs kvantitativ jämförelse mellan OPL och IPL möjlig tack vare noggrannheten i den vikt som vi härledde för respektive underlag2,7. Dessutom är både OPL- och IPL-profiler mycket distinkta och förutom ett svagt band vid 14 kDa och 75 kDa delar båda PL-underlag inte synligt band som visar samma molekylvikt. Denna iakttagelse bekräftar effektiviteten hos underlagsseparation utan någon betydande korskontaminering. Enligt den enda PL proteomiska analysenpublicerad 1, bör de mest intensiva banden i OPL (<30 kDa) motsvara lysozyme (14 kDa), vitelline membran yttre skiktprotein 1 (17 kDa), fågel beta-defensin 11 (skenbar molekylvikt på 12 kDa), medan de intensiva banden av IPL (>30 kDa) sannolikt Zona-Pellucida protein 1 (102 kDa) och Zona-Pellucida protein 3 (47 kDa). Fördelningen av de mycket rikliga PL-proteinerna ovotransferrin (78 kDa), ovalbuminrelaterat protein X (45 kDa), ovalbumin (43 kDa)1 mellan underlag återstår att klargöra. Faktum är att den höga molekylvikten hos dessa proteiner (>30 kDa) tyder på att de är IPL-proteiner baserade på SDS-PAGE-profilen, men deras vävnadsspecifikitet (oviduct-uttryckta proteiner) skulle hellre associera dessa proteiner till OPL28,29. Dessutom har vissa föreslagit en potentiell förorening av PL-prover av äggvita och äggulaproteiner på grund av otillräckliga tvättningar1. Denna brist på information ligger till grund för utvecklingen av det nuvarande protokollet, som kommer att användas ytterligare för djupgående kvantitativa proteomiker av PL, OPL och IPL.

Alternativt, från steg 2.1 och efter centrifugation för att ta bort den olösliga frågan, är det möjligt att extrahera vissa specifika proteiner för ytterligare biokemisk och biologisk karakterisering. Ett sådant tillvägagångssätt har nyligen tillämpats för att karakterisera de biologiska aktiviteterna och/eller 3D-strukturen hos de två huvudkomponenterna i OPL, det vitelina membranets yttre skiktprotein 1 (VMO1) och avian beta-defensin 11 (AvBD11)30,31. Tillgången till dessa proteiner som renade molekyler kan också bidra till att producera specifika antikroppar för ytterligare experiment som immunohistokemi eller för utveckling av kvantitativa analyser, inklusive enzymkopplade immunsorbenta analyser.

De två viktigaste begränsningarna i detta protokoll är (1) utmaningen med separation av underlag, särskilt om ägg har lagrats mer än 4 dagar vid 4 °C och (2) det faktum att den fullständiga proteinlösligheten kräver att man minskar och nedgradering av buffertar, vilket försämrar de resulterande provens inneboende biologiska aktivitet. När det gäller den första begränsningen kräver mekanisk separation tekniska färdigheter men uppnås enkelt efter 2 eller 3 experimentella utbildningar. Vissa IPL små bitar kan förbli fästa på OPL och vice versa eftersom båda underlag är tätt associerade. Kontaminering av det ena underlaget av det andra bör dock vara minimal om den mekaniska separationen utförs försiktigt. Typiska IPL- och OPL SDS-PAGE-profiler efter optimal underlagringsseparation illustreras i figur 5. När det gäller den andra begränsningen har experimentella steg som presenteras i den här artikeln optimerats för proteomiska analyser, för att ge en uttömmande lista över proteiner som komponerar varje underlager. För ytterligare karakterisering av de biologiska aktiviteterna hos varje protein är det nödvändigt att stanna vid steg 2.1.2, innan du använder denatureringsförhållanden (steg 2.2.1, användning av buffert med SDS och beta-mercaptoethanol följt av kokning). Det är dock anmärkningsvärt att proteiner som härrör från steg 2.1.2 endast är saltlösliga proteiner medan saltolösliga proteiner bildar aggregat. Ett alternativ för att ytterligare bedöma deras respektive aktivitet kan vara att producera saltolösliga proteiner som rekombinanta proteiner med hjälp av heterologa system(E. coli,baculovirus, jäst, etc.).

Detta protokoll kan anpassas till andra fågelägg för jämförande studier för att bättre uppskatta originaliteten hos varje art. Faktum är att PL visar vissa fågelspecifika egenskaper både strukturellt och när det gäller proteinsammansättning, sannolikt på grund av anpassning till nya miljöer men också till utvecklingsspecifikaegenskaper 2,6,9,32. Utvecklingen av detta protokoll som kräver måttlig teknikalitet och klassisk utrustning/material öppnar nya forskningsvägar inom området fågelreproduktion och speciation studier.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot Philippe Didier och Karine Anger (INRAE, PEAT, 37380, Nouzilly, Frankrike, https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12) för att de tillhandahåller obefruktade Isa-bruna ägg. Vi tackar också University of Tours, Frankrike för att ha finansierat M. Bregeons doktorsexamen. Detta arbete fick ekonomiskt stöd från Franska nationella forskningsbyrån (EQLIPSE, ANR-19-CE21-0006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binocular dissecting microscope Vision Engineering, France Model Mantis Elite
Lyophilizer Cryotec, France Model Cosmos 80
Mini-Protean II electrophoresis cell Biorad, Hercules, USA 1652960 Any apparatus adapted for protein electrophoresis
Mixer Mill MM400 Retsch, Hann, Germany 20.745.0001 Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample
Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm Dutscher, Brumath 5066
Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm Dutscher, Brumath 327005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mann, K. Proteomic analysis of the chicken egg vitelline membrane. Proteomics. 8 (11), 2322-2332 (2008).
  2. Chung, W. H., Lai, K. M., Hsu, K. -C. Comparative study on histological structures of the vitelline membrane of hen and duck egg observed by cryo-scanning electron microscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (3), 1794-1799 (2010).
  3. Kido, S., Doi, Y. Separation and Properties of the Inner and Outer Layers of the Vitelline Membrane of Hen's Eggs. Poultry Science. 67 (3), 476-486 (1988).
  4. Steele, M. G., Meldrum, W., Brillard, J. P., Wishart, G. J. The interaction of avian spermatozoa with the perivitelline layer in-vitro and in-vivo. Journal of Reproduction and Fertility. 101 (3), 599-603 (1994).
  5. Bain, J. M., Hall, J. M. Observations on the development and structure of the vitelline membrane of the hen's egg: an electron microscope study. Australian Journal of Biological Sciences. 22 (3), 653-665 (1969).
  6. Damaziak, K., Kieliszek, M., Buclaw, M. Characterization of structure and protein of vitelline membranes of precocial (ring-necked pheasant, gray partridge) and superaltricial (cockatiel parrot, domestic pigeon) birds. PLoS One. 15 (1), 0228310 (2020).
  7. Bellairs, R., Harkness, M., Harkness, R. D. The vitelline membrane of the hen's egg: a chemical and electron microscopical study. Journal of Ultrastructure Research. 8 (3-4), 339-359 (1963).
  8. Kido, S., et al. Characterization of vitelline membrane outer layer protein I, VMO-I: amino acid sequence and structural stability. Journal of Biochemistry. 117 (6), 1183-1191 (1995).
  9. Damaziak, K., et al. Comparative analysis of structure and strength of vitelline membrane and physical parameters of yolk of ostrich, emu, and greater rhea eggs. Poultry Science. 97 (3), 1032-1040 (2018).
  10. Kirunda, D. F., McKee, S. R. Relating quality characteristics of aged eggs and fresh eggs to vitelline membrane strength as determined by a texture analyzer. Poultry Science. 79 (8), 1189-1193 (2000).
  11. Back, J. F., Bain, J. M., Vadehra, D. V., Burley, R. W. Proteins of the outer layer of the vitelline membrane of hen's eggs. Biochimica Et Biophysica Acta. 705 (1), 12-19 (1982).
  12. Waclawek, M., Foisner, R., Nimpf, J., Schneider, W. J. The chicken homologue of zona pellucida protein-3 is synthesized by granulosa cells. Biology of Reproduction. 59 (5), 1230-1239 (1998).
  13. Okumura, H., et al. A newly identified zona pellucida glycoprotein, ZPD, and dimeric ZP1 of chicken egg envelope are involved in sperm activation on sperm-egg interaction. Biochemical Journal. 384, Pt 1 191-199 (2004).
  14. Guyot, N., Rehault-Godbert, S., Nys, Y., Baron, F. Understanding the natural antibacterial defences of egg white and their regulation. Achieving Sustainable Production of Eggs Volume 1. Roberts, J. 1, Burleigh Dodds Science Publishing Limited. Cambridge, UK. 161-193 (2016).
  15. Trziszka, T., Smolinska, T. Chemical Characterization of the Vitelline Membrane of Hens Eggs. Food Chemistry. 8 (1), 61-70 (1982).
  16. Berardinelli, A., Ragni, L., Giunchi, A., Gradari, P., Guarnieri, A. Physical-mechanical modifications of eggs for food-processing during storage. Poultry Science. 87 (10), 2117-2125 (2008).
  17. Kelley, A. J. The effects of storage time on vitelline membrane protein banding patterns and interior egg quality of eggs from nonmolted and molted hens. Texas A&M University. , Master of Science Thesis (2003).
  18. Schafer, A., Drewes, W., Schwagele, F. Analysis of vitelline membrane proteins of fresh and stored eggs via HPLC. Zeitschrift Für LebensmittelUntersuchung Und-Forschung A. Food Research and Technology. 206 (5), 329-332 (1998).
  19. Romanoff, A. L. The avian embryo: Structural and functional development. , The Macmillan Company. New York, NY. (1960).
  20. Haas, H. J., Spratt, N. T. Contributions to an analysis of the avian vitelline membrane's potential to promote outgrowth of the yolk sac-serosal membrane. The Anatomical Record. 184 (2), 227-231 (1976).
  21. Jensen, C. Ultrastructural changes in the avian vitelline membrane during embryonic development. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 21 (3), 467-484 (1969).
  22. Barbato, G. F., Cramer, P. G., Hammerstedt, R. H. A practical in vitro sperm-egg binding assay that detects subfertile males. Biology of Reproduction. 58 (3), 686-699 (1998).
  23. New, D. A. T. The Adhesive Properties and Expansion of the Chick Blastoderm. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 7 (2), 146-164 (1959).
  24. New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3 (4), 326-331 (1955).
  25. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. I. Membrane structure and its deterioration with age. Journal of Biochemistry. 78 (2), 261-268 (1975).
  26. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. II. Physicochemical properties of glycoprotein I. Journal of Biochemistry. 79 (6), 1351-1356 (1976).
  27. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. III. Physicochemical properties of glycoprotein II. Journal of Biochemistry. 81 (5), 1543-1548 (1977).
  28. Réhault-Godbert, S., et al. Ovalbumin-related protein X is a heparin-binding ov-serpin exhibiting antimicrobial activities. Journal of Biological Chemistry. 288 (24), 17285-17295 (2013).
  29. Gautron, J., et al. Ovotransferrin is a matrix protein of the hen eggshell membranes and basal calcified layer. Connective Tissue Research. 42 (4), 255-267 (2001).
  30. Guyot, N., et al. Proteomic analysis of egg white heparin-binding proteins: towards the identification of natural antibacterial molecules. Scientific Reports. 6, 27974 (2016).
  31. Guyot, N., et al. function, and evolution of Gga-AvBD11, the archetype of the structural avian-double-beta-defensin family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 337-345 (2020).
  32. Mori, M., Masuda, N. Proteins of the vitelline membrane of quail (Coturnix coturnix japonica) eggs. Poultry Science. 72 (8), 1566-1572 (1993).

Tags

Biokemi Utgåva 167 klackägg perivitellinskikt mekanisk separation histologisk struktur proteinlöslighet proteomik
Mekanisk separation och proteinlöslighet av de yttre och inre perivitellinunderskikten från hönsägg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bregeon, M., Guyot, N.,… More

Bregeon, M., Guyot, N., Réhault-Godbert, S. Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs. J. Vis. Exp. (167), e61739, doi:10.3791/61739 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter