Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Mekanisk adskillelse og proteinopløselighed af de ydre og indre perivitellineunderlag fra hønseæg

Published: January 27, 2021 doi: 10.3791/61739
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut National de Recherche pour l'Agriculture, l'Alimentation et l'Environnement, Université de Tours, Biologie des Oiseaux et Aviculture, 37380, Nouzilly, France

Summary

Denne artikel rapporterer en enkel metode til at isolere de ydre og indre perivitelline underlag af kyllingæg og samtidig minimere strukturelle ændringer og for at optimere proteinopløseligheden af hvert underlag til proteomiske analyser.

Abstract

Perivitellinelaget, der omgiver æggeblommen, spiller en grundlæggende rolle i befrugtning, i ægforsvaret og i udviklingen af fugleembryoet. Det er dannet af to proteinholdige underlag, der er tæt forbundet og dannet af forskellige kvindelige reproduktive organer. Begge strukturer antages at have deres egne funktionelle særheder, som endnu ikke er defineret. For at karakterisere funktionen af proteiner, der udgør hvert underlag, er den første udfordring at etablere de betingelser, der ville give mulighed for mekanisk adskillelse af disse to indviklede lag, samtidig med at eventuelle strukturelle skader begrænses. Det andet skridt er at optimere de eksperimentelle tilstande for at lette proteinopløseligheden fra disse to underlag til efterfølgende biokemiske analyser. Effektiviteten af denne tilgang vurderes ved at analysere proteinprofilen for hvert underlag af Natrium Dodecyl Sulfat-Poly-Acrylamid Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), som forventes at være adskilt mellem de to strukturer. Denne totrinsprocedure er fortsat enkel. det kræver klassisk biokemisk udstyr og reagenser og er kompatibel med yderligere dybdegående proteomics. Det kan også overføres til andre fugleæg til komparativ biologi, vel vidende at perivitellinelagets struktur og sammensætning har vist sig at have artsspecifikke egenskaber. Desuden tillader de ikke-denaturerende betingelser, der er udviklet til adskillelse af underlag (trin 1), deres strukturelle analyser ved scanning og transmission af elektronmikroskopi. Det kan også udgøre det første skridt for efterfølgende proteinrensning for at analysere deres respektive biologiske aktiviteter og 3D-struktur eller for at udføre yderligere immunohistokemiske eller funktionelle analyser. Sådanne undersøgelser ville bidrage til at dechifrere den fysiologiske funktion af disse to underlag, hvis strukturelle og funktionelle integrities er afgørende kriterier for den reproduktive succes.

Introduction

Formålet med denne metode er at give en protokol, der tillader efterfølgende biokemisk karakterisering af perivitellinelaget (PL), et tyndt proteinholdigt lag, der omslutter æggeblommen og spiller en grundlæggende rolle i reproduktionen af fuglearter. PL, også kaldet "vitelline membrane" i litteraturen, er et tredimensionelt netværk af tykke fibre, der består af flere typer glycoproteiner. Den består af et indre perivitellinelag (IPL) (i kontakt med æggeblommen), der er samlet i æggestokken, og af et ydre perivitellinelag (OPL, i kontakt med det hvide), der ligger på IPL (Figur 1) og produceres af infundibulum. Sidstnævnte væv er det tragtlignende øverste segment af ovidukten, der modtager den modne æggeblommesække efter ægløsning, og det sted, hvor befrugtningen finder sted. Udskillelsen af OPL sker efter disse to begivenheder og efterfølges af den successive deponering af æggehvide og æggeskallen i andre specifikke segmenter af ovidukten. PL's fysiologiske funktioner er ikke kun relateret til befrugtning og tidlige stadier af embryogenese, men også til embryoets fysiske og molekylære beskyttelse. Den proteomic analyse af kylling æg udført på hele PL afslørede tilstedeværelsen af 137 forskellige proteiner1, men fordelingen af de fleste af disse proteiner mellem IPL og OPL er endnu ikke belyst. Den minimale mængde data, der er tilgængelige i litteraturen, rapporterer, at IPL og OPL udviser meget forskellige proteinprofiler2,3,4, hvilket tyder på forskellige strukturelle og funktionelle egenskaber. Den relative knaphed på data om fordelingen af proteiner mellem OPL og IPL skyldes sandsynligvis vanskeligheden ved at adskille både underlag, der er tynde og indlejrede.

Den her beskrevne metode beskriver de betingelser, der skal anvendes til at adskille de to underlag med begrænset indvirkning på deres respektive histologiske struktur, samtidig med at deres proteinindhold bevares, og til at tilvejebringe den protokol, der muliggør fuldstændig opløselighed af proteiner til efterfølgende analyse ved proteomik. Det omfatter to hovedtrin: 1) PL-prøvetagning og OPL/IPL-adskillelse og 2) PL-, OPL- og IPL-behandling for proteinopløselighed og elektroforese til massespektrometrianalyse. Arbejdsprocessen præsenteres i figur 2. Selv om denne protokol er optimeret til proteomiske analyser (trin 2.2), kan den standses på nogle trin for histologisk (f.eks. elektronmikroskopi), immunrotokemiske analyser, funktionelle undersøgelser (trin 1) og for rensning af saltopløselige proteiner for at karakterisere deres struktur og biologiske aktivitet (trin 2.1) (Figur 2).

Det første skridt er fjernelsen af pl'en i alt fra æggeblommen (figur 2, trin 1.1). Alle offentliggjorte metoder starter med adskillelsen af æggehvide fra æggeblommen manuelt eller ved hjælp af en ægseparator. Den efterfølges af fjernelse af den resterende æggehvide og den tykke chalazae ved hjælp af tang eller adsorption på et filterpapir5 (Figur 2A). Dernæst er de teknikker, der er valgt til at prøve PL, variable afhængigt af de offentliggjorte artikler. Nogle papirer omfatter flere vaske af æggeblommen, i deioniseret eller destilleret vand1,5,6, i 0,85 til 1% saltvandsopløsning2,7,8, i bufferopløsninger som 0,15 M NaCl/N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethanesulfonsyre, pH 7,44eller i 0,01N HCl (pH 2)3. Disse procedurer blev anvendt på kylling, and, ringhalset fasan, grå agerhøne, cockatiel papegøje, tamdue eller strudsefugle æg2,6,9. Fjernelsen af PL, mens æggeblommen opretholdes i en petriskål uden vandige opløsninger, kan være meget besværlig, da PL er skrøbelig, og æggeblommen har tendens til at holde sig til PL1,5 og derfor fortsat er vanskelig at eliminere bagefter. Brugen af sur buffer eller opløsning i en time ved 37 °C3 foretrækkes heller ikke, da sådanne forhold kan ændre PL-strukturen og kan resultere i proteintab. Det er også vigtigt at fjerne det område, der indeholder germinalskiven, da denne zone sandsynligvis vil have et særskilt strukturelt og molekylært mønster, som ikke afspejler hele PL4,6,10 ( Figur2B). Denne metode udnytter de idéer, der fremhæves i nogle offentliggjorte artikler, og foreslår nogle forbedringer for at lette PL-prøvetagning, samtidig med at dens integritet bevares (Figur 2C).

Det andet trin består i at adskille de to underlag (Figur 2, trin 1.2). Dette trin er kritisk, da OPL og IPL er tæt bundet til hinanden. Dette trin skal udføres omhyggeligt med pincet under et kikkert dissekerende mikroskop. Publikationer, der rapporterer om OPL/IPL-adskillelse, er ret begrænsede2,3,7,11, og nogle af dem anvender særlige betingelser (sur buffer ved 37 °C i 1 h2,3), som kan påvirke underlagets histologiske struktur og/eller bidrage til proteintab eller æggeblomme eller hvid kontaminering. For bedre at skelne OPL fra IPL, nogle forfattere rapporterede brugen af toluidin blå til lidt farve OPL (det indre lag forbliver farveløs)11. I den udviklede metode optimerede vi betingelserne, så adskillelsen let opnås og ikke kræver brug af farvestof (Figur 2D).

Det andet hovedtrin er opløseligheden af proteiner, der udgør hvert underlag. Klassisk opnås det ved at blande ren lyofiliseret1,tørret2,6eller frisklavet3,4,11 PL /sublayers direkte med Laemmli buffer, der anvendes til elektroforese. Andre forfattere foretrak en foreløbig opløselighed af lag i 1% NaCl, i en 1% SDS bufferingopløsning2,3,11 eller i en opløsning, der indeholder proteasehæmmere og SDS6 ved stuetemperatur eller Triton efterfulgt af inkubation ved 45 °C12under konstant kraftig omrøring. Nogle forfattere beskrev også en protokol, hvor PL blev inkuberet i fosfatbuffer saltvand eller urinstof og udsat for sonikering13. Disse behandlinger blev alle efterfulgt af en centrifugering og fortynding i Laemmli buffer og deler alle ulempen ved ufuldstændig proteinopløselighed fra lag, da det uopløselige stof (pellet opnået efter centrifugering) kasseres fra den prøve, der skal analyseres.

Desuden er visse forfatteres brug af denatureringsbetingelser (urinstof, vaskemiddel, høj temperatur osv.) ikke forenelig med efterfølgende proteinrensning til karakterisering, da de sandsynligvis uigenkaldeligt inaktiverer proteiner, forstyrrer deres biologiske aktiviteter og også forringer deres 3D-struktur. For dette specifikke trin 2 indeholder protokollen et første undertrin, der giver mulighed for opløselighed af de mest rigelige proteiner under ikke-denatureringsforhold efter PL/OPL/IPL mekanisk destrukturering, som ikke vil forstyrre yderligere proteinundersøgelser, hvis det er nødvendigt (figur 2, trin 2.1) og et andet undertrin, der giver mulighed for fuldstændig opløselighed af proteiner til elektroforese og dybdegående proteomics (Figur 2, trin 2.2). Det kombinerer forslag taget fra forskellige offentliggjorte papirer og justeringer som følge af nye ideer valideret af eksperimentelle undersøgelser.

Protocol

1.PL-, IPL- og OPL-stikprøver

  1. PL-prøvetagning
    1. Bryd det frisklagte ubefrugtede æg manuelt og brug en æggeseparator liggende på et glasbæger for at adskille æggeblommen fra det hvide. Fjern chalazaen med en lille saks, og rul æggeblommen over et filterpapir for at fjerne vedhængende albumen, der vises som en gennemsigtig og synlig struktur (Figur 2A).
      ADVARSEL: Pas på ikke at punktere PL med en saks. Brugen af pincet i stedet for saks til at fjerne chalazas kan provokere PL brud og efterfølgende æggeblomme lækage. Det rullende trin på filterpapiret er kritisk og bør udføres meget hurtigt på grund af papirfilterets absorberende egenskaber, der kan udløse PL-brud. Det er også meget vigtigt at bruge et ubefrugtet æg fra lægdagen for at optimere succesen med dette første skridt og alle de efterfølgende trin. Alternativt kan æg, der er blevet opbevaret mindre end 10 dage i et afkølet miljø, anvendes, men forsøgsfolk skal overveje potentielle risici for PL-ændringer.
    2. Æggeblommen nedsænkes i en krystallisator, der indeholder 10 mM Tris-HCl pH 8, og som tidligere er afkølet til 4 °C, og tag PL-arealet over germinalskiven inden for en zone på 1 cm med stump saks (Figur 2B).
      BEMÆRK: I første omgang blev PL nedsænket i deioniseret vand, men denne tilgang har nogle ulemper, såsom manglen på pH-kontrol og vanskelighederne med at adskille underlag bagefter (trin 1.2). Derfor blev der testet flere betingelser, herunder Tris-koncentration (figur 3A) og pH (figur 3B). Brugen af en buffer ved pH 8, i stedet for deioniseret eller demineraliseret vand, er i overensstemmelse med ægfysiologi (æggehvide pH er ca. 7,8 på lådagen)14 og minimerer proteintab. I modsætning hertil mistænkes sur eller meget alkalisk pH for at udløse PL-destrukturering og tidlig proteinopløselighed (figur 3B). Bufferen bestående af 10 mM Tris-HCl pH 8 viste sig at være optimal, da den respekterer ægfysiologien og ikke forårsager signifikant proteinopløselighed (proteinkoncentrationen i arbejdsbufferen forbliver minimal, figur 3A,B).
    3. Brud PL med en lille saks i bufferen. Hold de to kanter af den bristede PL med pincet og skræl PL fra æggeblommen.
    4. Hold PL med pincet og skyl PL flere gange i flere bade på 10 mM Tris-HCl, pH 8, indtil der ikke er spor af æggeblomme synlige. På dette tidspunkt skal du sikre dig, at PL'en er ren, hvid og flydende i bufferen. Det kan behandles i trin 1.2 for sublayer separation eller direkte til trin 2.1 for biokemiske analyser.
  2. OPL- og IPL-prøvetagning
    1. Spred hele PL prøve ved at sætte OPL opad i en plastik Petri parabol og vedligeholde det fladt med så mindre rynker som muligt. Dæk prøven med 10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl. Brug en plast petriskål (og ikke glas) til at begrænse PL bevægelser, fordi PL sticks bedre til plast.
      1. For at finde OPL-siden skal du se på, hvor placeringen af den resterende chalazae, der er knyttet til OPL og ikke IPL. Dette trin kræver lille NaCl-koncentration (50 mM) for at lette adskillelsen af underlaget.
        BEMÆRK: På grundlag af grafen i figur 3C og litteratur11bør denne koncentration ikke føre til større proteintab. Oprindeligt blev deioniseret vand brugt til at adskille underlagene, som beskrevet tidligere1,5,6, men denne teknik viste sig at være meget besværlig og resulterede i ændringen af den strukturelle PL-integritet. Derfor blev forskellige NaCl-koncentrationer (figur 3C) testet, da salt lettede adskillelsen af de to underlag. Det er imidlertid værd at bemærke, at brugen af NaCl-koncentrationen >100 mM øger proteinopløseligheden/udslippet fra PL, hvilket ikke er målet her (dette vil være målet i trin 2) (Figur 3C). Tilføjelse af 50 mM NaCl til 10 mM Tris-HCl pH 8 buffer letter adskillelsen af de to underlag og minimerer proteintab.
    2. Skær den samlede PL i stykker på ca. 2 cm x 3 cm med en lille saks. Mekanisk adskille de to lag af hver PL stykke med ultra-præcise spids pincet under en kikkert dissekere mikroskop(Figur 4). De resulterende IPL- og OPL-prøver opbevares enkeltvis i mikrorør ved -80 °C, indtil de anvendes yderligere.
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Det skal bemærkes, at effektiviteten og muligheden for adskillelse af de to lag i høj grad afhænger af æggets friskhed. Faktisk viser lagrede æg drastiske interne ændringer på grund af den hurtige stigning i æggehvide pH og efterfølgende ændring af æggeblommeindekset på grund af PL-løsnelsen (og svækkelsen). IPL er mere skrøbelig sammenlignet med OPL. Det er derfor at foretrække at placere OPL'ens ansigt over og adskille de to underlag ved at trække i OPL med tangen. Begge underlag skal håndteres med dyrebar omhu.

2. Prøvebehandling for proteinopløselighed og SDS-PAGE-analyser

  1. Primær proteinopløselighed
    1. Frysetørre IPL- og OPL-prøver individuelt. Når frysetørringen er afsluttet, skæres ca. 1 mg fra hver prøve i rene mikrorør med en lækagesikker skruehætte. De resterende prøver opbevares i tæt lukkede rør med henblik på langvarig opbevaring ved -80 °C.
      BEMÆRK: Brugen af mikrorør med en lækagesikker skruehætte sikrer hermetisk og lækagesikker lukning for at forhindre prøverehydrering, og det vil sikre prøverne.
    2. Der blandes 1 mg af hvert lyofiliseret underlag med 400 μL på 50 mM Tris pH 7, 500 mM NaCl. Brug en mixer-mølle i 2 gange i 5 minutter ved 30 Hz til at opløse OPL- og OPL-strukturer i mikropartikler og lette proteinopløselighed. 400 μL af de prøver, der indeholder OPL og IPL, opsamles i to rene mikrorør.
      BEMÆRK: Den buffer, der bruges her, er valgt til at øge proteinopløseligheden (i modsætning til trin 1). Denne buffer var baseret på resultaterne i figur 3, som viser en stigning i proteinopløseligheden ved pH 7 (Figur 3B) og ved hjælp af 0,5 M NaCl (Figur 3C). Protokollen kan sættes på pause her. På dette stadium kan prøver anvendes til proteinrensning af de vigtigste PL-proteiner eller forarbejdes til trin 2.2.
  2. Proteinopløselighed til elektroforese
    1. Der tilsættes 5x SDS-PAGE prøvebuffer (100 μL, 0,25 M Tris-HCl, 0,05% bromophenolblå, 50% glycerol, 5% SDS, 5% beta-mercaptoethanol, pH 6,8) til hver 400 μL af prøven og varme ved 100 °C i 5 min.
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her, og prøver kan opbevares ved -80 °C. På dette stadium af protokollen er OPL og IPL fuldstændig opløst. Prøveopløselighedens effektivitet kan vurderes ved at centrifugere prøver i 5 min ved 10.000 x g. Komplet opløselighed er kendetegnet ved fravær af synlig pellet efter centrifugering. Efter fuldstændig opløselighed anses det således her for, at 1 mg lyofiliseret underlag svarer til 1 mg proteiner (proteinkoncentrationen i 500 μL-prøven er 2 mg/mL). PL består faktisk af mere end 80% protein2,15. Brugen af en 5x prøvebuffer begrænser prøvefortynding, men der kan også anvendes en 1x eller 2x prøvebuffer.
    2. Der må maksimalt indlæses 20 μg proteiner/baner på en SDS-polyacrylamidgel (4%-20% gradientgel) og elektroforese ved 120 V ved hjælp af et lodret elektroforesesystem.
      BEMÆRK: Brugen af en 4%-20% gradientgel er ikke obligatorisk, men er at foretrække her, da OPL og IPL udviser proteiner med molekylvægte fra <10 kDa til >250 kDa. Det kan også være nyttigt at holde stabling gel (som normalt fjernes), som tilstedeværelsen af uopløselige proteiner eller protein aggregater i bunden af brønde ville indikere dårlig opløselighed og en mulig manglende skridt under prøven forberedelse.
    3. Efter elektroforese fjernes geler fra glaspladerne og pletten med Coomassie Brilliant Blue-opløsning (50% H2O, 40% EtOH, 10% eddikesyre og R250 Coomassie Brilliant Blue) i 30 min.
    4. De-pletten med en opløsning bestående af 50% H2O, 40% EtOH, 10% eddikesyreopløsning, indtil gelbaggrunden fremstår lyseblå.
    5. Til sidst overføres gelen i petriskåle, der indeholder deioniseret vand, for at opnå de-farvning og rehydrering af polyacrylamid geler. Proteiner skal fremstå som blå bånd med gennemsigtig baggrund.

Representative Results

OPL og IPL blev adskilt fra PL af en frisk lagt ubefrugtet æg til at analysere deres protein profiler ved SDS-PAGE. Den eksperimentelle arbejdsgang for hele protokollen er illustreret i figur 2. Figur 3 viser proteinudslip ved forskellige Tris-koncentrationer (figur 3A), forskellige pH-mængder (figur 3B) og forskellige NaCl-koncentrationer (figur 3C). De resulterende to underlag blev observeret under lyset af kikkertens dissekerende mikroskop og er vist i figur 4, hvor IPL er gennemskinnelig, mens OPL er tæt, overskyet og hvidlig. Disse funktioner kan delvist bevidne effektiviteten af sublayer adskillelse.

Efter adskillelsen blev OPL og IPL lyophilized uafhængigt, og deres proteinindhold blev fuldstændig opløst takket være en kombination af mekanisk slibning, brugen af et anionisk vaskemiddel (SDS) og et reducerende middel (beta-mercaptoethanol), efterfulgt af kogning. Efter migration i en polyacrylamidgel (SDS-PAGE elektroforese) udviser OPL- og IPL-prøverne særskilte elektroforentiske profiler (figur 5) som forventet.

Figure 1
Figur 1: Strukturen af PL af et frisk lagt ubefrugtet æg. Skematisk repræsentation og transmission elektronmikroskopi mikrograf af hele PL i tværsnit (personoplysninger, ©Plateforme IBiSA de Microscopie Electronique, University og CHRU of Tours, Frankrig, S. Georgeault). Bemærk, at dette billede er hentet fra PL, der er udarbejdet som præsenteret i denne protokol. OPL, ydre perivitellinelag; IPL, indre perivitelline lag. Sort pilespids angiver den fortløbende membran, der adskiller de to underlag. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Arbejdsproces, der opsummerer de to hovedtrin i protokollen og eksempler på programmer. Protokollen er optimeret til proteomic analyse af PL lag, men det kan stoppes på nogle trin for andre applikationer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Optimering af buffersammensætningen for PL-prøvetagning. Kort sagt blev ren PL (n = 4) inkuberet i samme volumen af de forskellige bufferopløsninger i 2 timer.PL blev fjernet, og proteinkoncentrationen blev anslået ved at måle absorbansen ved 280 nm i den resterende buffer. (A)Virkningen af Tris-HCl-koncentrationen ved pH 8. (B) Virkningen af pH (7 til 9). (C)Virkningerne af NaCl-fusionen. Ud fra disse resultater konkluderede vi, at bufferen bestående af 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM NaCl er den mest hensigtsmæssige, da den begrænser proteintab. Resultaterne udtrykkes som et middel ± standardafvigelse for fire forskellige PL-prøver. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af en Tukeys multiple sammenligningstest. P-værdi <0,05 blev anset for signifikant (ns, ikke signifikant; * p<0,05, *** p<0,001, **** p<0,0001). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: OPL- og IPL-funktioner under et kikkertde dissekerende mikroskop. Efter adskillelsen syntes IPL (til højre) gennemskinnelig, og OPL (til venstre) var uigennemsigtig. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: SDS-PAGE analyse af adskilt OPL og IPL fra frisk lagt ubefrugtet æg. 4%-20% acrylamid gel efterfulgt af Coomassie strålende blå farvning. Massen af standardbånd for molekylvægt er angivet i kDa. OPL-profilen består hovedsageligt af proteiner med en molekylær masse >30 kDa, mens de store bånd, der opdages på IPL-profilen, har molekylære masser <30 kDa. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Succesen med denne protokol afhænger af to kritiske trin, der blev uafhængigt optimeret: den mekaniske adskillelse af OPL og IPL, der skal være så mindre destrukturering som muligt, efterfulgt af den komplette proteinopløselighed af hvert underlag, som omvendt destrukturerer og denaturerer. Den fremhæver også nogle specifikke punkter, der skal tages i betragtning for at sikre en vellykket gennemførelse af hvert trin.

Protokollen afhænger ikke af æggeskalfarven, ægvægten, produktionstypen eller hønens genetiske stamme. Det afhænger dog af æggets friskhed. Faktisk gennemgår ægget dybe interne fysiskkemiske modifikationer hurtigt efter at være blevet lagt, selvom disse ændringer kan forsinkes, når opbevaring udføres under køleforhold14,15. Tabet af kuldioxid gennem æggeskal porerne under opbevaring resulterer i stigningen i æggehvide pH (fra 7,8 til 9,5), mens nogle vand udvekslinger forekomme mellem æggeblomme og hvid, på tværs af PL. Begge modifikationer har en negativ indvirkning på pl'ens molekylære og histologiske struktur , der bliver svækket og mindre anspændt14,15, sandsynligvis på grund af fysisk-kemiske modifikationer af proteinindholdet16,17,18. Det antages, at adskillelsen af underlag bliver meget vanskelig med lagrede æg, især hvis opbevaringen udføres i lang tid ved stuetemperatur. Indtil nu er protokollen blevet udført ved hjælp af æg, der opbevares i mindre end 4 dage ved 4 °C, og den maksimale opbevaringsvarighed for et æg til effektivt at udtage prøver af PL-underlag er endnu ikke kendt. Derudover, hvis målet er analysen af hvert underlag, er det vigtigt at bruge ubefrugtede æg. På lådagen er embryoet af et befrugtet æg 23 timer gammelt, og dets udvikling er meget hurtig bagefter, hvis ægget inkuberes. Faktisk, embryonale udvikling og væksten af nogle extraembryonic strukturer udvide ved hjælp af PL som en substrat, som således hurtigt nedbrydes, og erstattet af extraembryonic æggeblomme sæk19.

Efter manuel adskillelse af æggeblommen og æggehviden skal æggeblommen rengøres fra æggehvide spor og fra chalazae, der forblev tæt fastgjort til PL. Spidsen er at rulle æggeblommen forsigtigt på et filterpapir og udføre omfattende vaske af æggeblommen i bufferede opløsninger (10 mM Tris-HCl pH 8). Den pH-værdi, der anvendes til bufferen, er i overensstemmelse med æggehvidets fysiologiske pH-værdi14 og har vist sig at minimere proteintabet (figur 3). Brugen af en kølebuffer vil derefter bidrage til at fjerne PL'en fra æggeblommen, fordi bufferen ved 4 °C vil lette PL-fjernelsen, når lipidblommen trækker sig tilbage og bliver mindre flydende ved denne temperatur. Yderligere vask vil gøre det muligt at fjerne æggeblommerester fra PL. Det er også vigtigt at skære den zone, der svarer til germinalskiven, ud, fordi denne struktur, der indeholder kvindelig pronucleus, muligvis ikke er repræsentativ for PL. Det er stedet for befrugtning og multiplikation af embryonale celler, når ægget befrugtes. Det formodes at have en særlig sammensætning, der måske ikke er repræsentativ for hele PL, hvilket er grunden til, at det blev fjernet. Dette specifikke trin lettes kraftigt, når æggeblommen nedsænkes i en kold buffer. Selv om denne germinale diskstruktur kasseres i denne protokol (ud af målene), kan specifikke analyser af dette område i befrugtede æg være meget nyttige for forskere, der er interesseret i at studere udviklingen af PL-indholdet (proteomics og aktivitet) og struktur (elektronmikroskopi), i de tidlige stadier af embryogenese19,20,21. På nuværende tidspunkt er hele PL strukturelt intakt og kan behandles til yderligere strukturel analyse ved elektronmikroskopi (figur 2), til trin 1.2 eller til trin 2.1 (hvis målet er at analysere hele PL).

Trin 1.2 skal udføres under et kikkert dissekerende mikroskop, da PL er meget tynd og skrøbelig (ca. 10 μm tyk). Adskillelsen af underlag er næsten umulig i vand eller i buffer mangler minimal salt, og indledende forsøg ved hjælp af disse muligheder har resulteret i alvorlige PL skader. Således forbliver den buffer, der er valgt til dette trin, ved fysiologisk pH (pH 8) og indeholder 50 mM NaCl. Dette trin er besværligt og skal udføres omhyggeligt og forsigtigt for at forhindre PL-rivning. Når de er adskilt, kan de to underlag let identificeres, da de udviser ejendommelige fysiske træk (uigennemsigtige versus gennemskinnelige). En mangel på homogenitet af IPL i lyset af mikroskopet bør afspejle en ufuldstændig adskillelse og dermed tilstedeværelsen af de resterende pletter af OPL til stede på IPL. Derudover er det meget svært at behandle hele membranen, og brugen af 2 cm x 3 cm stykker øger chancerne for succes betydeligt. Det opnåede underlag er egnet til histologisk undersøgelse ved elektronmikroskopi (figur 1). Det er bemærkelsesværdigt, at en specifik lineær struktur (0,05 til 1 μm tyk) navngivet den kontinuerlige membran (CM) er synlig på mikrografen (Figur 1) og forbliver normalt fastgjort til det ene eller det andet underlag under adskillelsesprocessen. Det er tidligere blevet offentliggjort, at når du bruger en relativt høj saltmolaritet til adskillelse (500 mM), forblev CM fastgjort til OPL7, mens brugen af vand5 vil favorisere fastgørelse af CM til IPL. I denne protokol anvendes en lav saltmolaritet til at nå de specifikke mål (PL-underlag strukturelt intakt og minimalt tab af proteiner), hvilket betyder, at dette CM sandsynligvis er forbundet med IPL. Yderligere analyse af IPL og OPL ved transmissionselektronmikroskopi ville imidlertid klart fremgå af denne hypotese. PL-, OPL- eller IPL-lag, der er opnået ved afslutningen af trin 1, kan også anvendes til in vitro-analyser til sæd-ægbindingsanalyser22 eller til at analysere de tidlige trin i embryonal udvikling23,24.

Trin 2 henviser til opløseligheden af proteinindholdet, delvist (trin 2.1) eller helt (trin 2.2). PL og/eller OPL er først lyofile for at fjerne vandmolekyler og for at give mulighed for præcise vægtmålinger. PL består hovedsageligt af vand (88%)7, mens tørstof indeholder hovedsageligt proteiner (80% til 90% afhængigt af undersøgelser), kulhydrater, fedtstoffer og mineraler2,7,25. I betragtning af at vandet i PL fjernes ved frysetørring, at kulhydrater i det væsentlige genvindes i PL glycoproteiner, og at fedt og mineraler stammer fra æggeblomme, hovedsagelig kasseres ved omfattende vaske, antages det, at den resulterende PL næsten udelukkende består af proteiner. Således bør den vægtværdi, der opnås efter fuldstændig lyofilisering, hovedsagelig svare til proteiner. En tilsvarende mængde PL, OPL og/eller IPL fortyndes derefter i den buffer, der indeholder 0,5 M NaCl. Den høje saltmolaritet kombineret med den mekaniske ødelæggelse af fibernettet ved slibning letter i høj grad proteinopløselighed under ikke-denatureringsforhold. Dette trin efterfølges af den komplette opløselighed ved hjælp af kogende SDS-vaskemiddel og reduktionsmidlet beta-mercaptoethanol (trin 2.2). Faktisk er nogle IPL-proteiner SDS-opløselige glycoproteiner25,26,27 og de vigtigste bestanddele af OPL er NaCl-opløselige1,11. Ved hjælp af denne protokol så vi ikke nogen resterende pellet af uopløselige proteiner efter centrifugering, hvilket indikerer, at opløselsen sandsynligvis var afsluttet. Proteiner fra PL, OPL, og / eller IPL blev derefter analyseret af SDS-PAGE. De resulterende proteinprofiler er i overensstemmelse med publiceret litteratur2,4,11,16, men signalets opløsning og intensitet er stærkt forbedret og meget mere homogen mellem forskellige uafhængige IPL- og OPL-stikprøver.

Derudover er kvantitativ sammenligning mellem OPL og IPL mulig takket være nøjagtigheden af den vægt, vi udledte for de respektive underlag2,7. Desuden er både OPL- og IPL-profiler meget forskellige, og bortset fra et svagt bånd ved 14 kDa og 75 kDa deler begge PL-underlag ikke synligt bånd, der viser samme molekylvægt. Denne observation bekræfter effektiviteten af sublayers adskillelse uden signifikant krydskontaminering. Ifølge den eneste PL proteomic analyse offentliggjort1, de mest intense bånd i OPL (<30 kDa) skal svare til lysozym (14 kDa), vitelline membran ydre lag protein 1 (17 kDa), aviær beta-defensin 11 (tilsyneladende molekylvægt på 12 kDa), mens de intense bånd af IPL (30 kDa) sandsynligvis er Zona-Pellucida protein 1 (102 kDa) og Zona-Pellucida protein 3 (47 kDa). Fordelingen af de meget rigelige PL-proteiner ovotransferrin (78 kDa), ovalbumin-relateret protein X (45 kDa), ovalbumin (43 kDa)1 mellem underlag er endnu ikke belyst. Faktisk tyder den høje molekylvægt af disse proteiner (>30 kDa) på, at de er IPL-proteiner baseret på SDS-PAGE-profilen, men deres vævsspecifikitet (ovidukt-udtrykte proteiner) vil hellere knytte disse proteiner til OPL28,29. Desuden har nogle foreslået en potentiel kontaminering af PL-prøver med æggehvide og æggeblommeproteiner på grund af utilstrækkelig vask1. Dette manglende oplysninger er grundlaget for udviklingen af denne protokol, som vil blive yderligere anvendt til dybtgående kvantitative proteomics af PL, OPL og IPL.

Alternativt, fra trin 2.1 og efter centrifugering for at fjerne det uopløselige stof, er det muligt at udtrække nogle specifikke proteiner til yderligere biokemisk og biologisk karakterisering. En sådan fremgangsmåde er for nylig blevet anvendt til at karakterisere de biologiske aktiviteter og/eller 3D-strukturen af de to hovedkomponenter i OPL, vitellinemembranens ydre lagprotein 1 (VMO1) og aviær beta-defensin 11 (AvBD11)30,31. Tilgængeligheden af disse proteiner som rensede molekyler kan også bidrage til at producere specifikke antistoffer til yderligere forsøg såsom immunohistochemistry eller til udvikling af kvantitative assays, herunder enzym-Linked Immunosorbent Assays.

De to vigtigste begrænsninger i denne protokol er (1) udfordringen med sublayers adskillelse, især hvis æg er blevet opbevaret mere end 4 dage ved 4 ° C og (2) det faktum, at den komplette proteinopløselighed kræver reduktion og denaturering buffere, som forringer den iboende biologiske aktivitet af de resulterende prøver. Med hensyn til den første begrænsning kræver mekanisk adskillelse tekniske færdigheder, men opnås let efter 2 eller 3 eksperimentelle træninger. Nogle IPL små stykker kan forblive knyttet til OPL og vice versa som begge underlag er tæt forbundet. Den ene underlags kontaminering med den anden bør dog være minimal, hvis den mekaniske adskillelse udføres forsigtigt. Typiske IPL- og OPL SDS-PAGE-profiler efter optimal sublayeradskillelse er illustreret i figur 5. Med hensyn til den anden begrænsning er eksperimentelle trin, der præsenteres i denne artikel, blevet optimeret til proteomiske analyser for at give en udtømmende liste over proteiner, der udgør hvert underlag. For yderligere karakterisering af hvert proteins biologiske aktiviteter er det nødvendigt at stoppe ved trin 2.1.2, før du bruger denatureringsbetingelser (trin 2.2.1, brug af buffer med SDS og beta-mercaptoethanol efterfulgt af kogning). Det er imidlertid bemærkelsesværdigt, at proteiner fra trin 2.1.2 kun er saltopløselige proteiner, mens saltuopløselige proteiner danner aggregater. En mulighed for yderligere at vurdere deres respektive aktivitet kan være at producere saltuopløselige proteiner som rekombinante proteiner ved hjælp af heterologe systemer (E. coli, baculovirus, gær osv.).

Denne protokol kan tilpasses andre fugleæg med henblik på sammenlignende undersøgelser for bedre at kunne forstå hver arts originalitet. PL udviser faktisk nogle fuglespecifikke forhold både strukturelt og med hensyn til proteinsammensætning , sandsynligvis på grund af tilpasning til nye miljøer, men også til udviklingsmæssige specificiteter2,6,9,32. Udviklingen af denne protokol, der kræver moderat teknik og klassisk udstyr/materialer, åbner nye forskningsveje inden for fuglegengivelses- og speciationsundersøgelser.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Philippe Didier og Karine Anger (INRAE, TØRV, 37380, Nouzilly, Frankrig, https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12) for at give ubefrugtede Isa-brune æg. Vi takker også University of Tours, Frankrig for at finansiere M. Bregeons ph.d. Dette arbejde modtog en finansiel støtte fra Det Franske Nationale Forskningsagentur (EQLIPSE, ANR-19-CE21-0006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binocular dissecting microscope Vision Engineering, France Model Mantis Elite
Lyophilizer Cryotec, France Model Cosmos 80
Mini-Protean II electrophoresis cell Biorad, Hercules, USA 1652960 Any apparatus adapted for protein electrophoresis
Mixer Mill MM400 Retsch, Hann, Germany 20.745.0001 Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample
Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm Dutscher, Brumath 5066
Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm Dutscher, Brumath 327005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mann, K. Proteomic analysis of the chicken egg vitelline membrane. Proteomics. 8 (11), 2322-2332 (2008).
  2. Chung, W. H., Lai, K. M., Hsu, K. -C. Comparative study on histological structures of the vitelline membrane of hen and duck egg observed by cryo-scanning electron microscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (3), 1794-1799 (2010).
  3. Kido, S., Doi, Y. Separation and Properties of the Inner and Outer Layers of the Vitelline Membrane of Hen's Eggs. Poultry Science. 67 (3), 476-486 (1988).
  4. Steele, M. G., Meldrum, W., Brillard, J. P., Wishart, G. J. The interaction of avian spermatozoa with the perivitelline layer in-vitro and in-vivo. Journal of Reproduction and Fertility. 101 (3), 599-603 (1994).
  5. Bain, J. M., Hall, J. M. Observations on the development and structure of the vitelline membrane of the hen's egg: an electron microscope study. Australian Journal of Biological Sciences. 22 (3), 653-665 (1969).
  6. Damaziak, K., Kieliszek, M., Buclaw, M. Characterization of structure and protein of vitelline membranes of precocial (ring-necked pheasant, gray partridge) and superaltricial (cockatiel parrot, domestic pigeon) birds. PLoS One. 15 (1), 0228310 (2020).
  7. Bellairs, R., Harkness, M., Harkness, R. D. The vitelline membrane of the hen's egg: a chemical and electron microscopical study. Journal of Ultrastructure Research. 8 (3-4), 339-359 (1963).
  8. Kido, S., et al. Characterization of vitelline membrane outer layer protein I, VMO-I: amino acid sequence and structural stability. Journal of Biochemistry. 117 (6), 1183-1191 (1995).
  9. Damaziak, K., et al. Comparative analysis of structure and strength of vitelline membrane and physical parameters of yolk of ostrich, emu, and greater rhea eggs. Poultry Science. 97 (3), 1032-1040 (2018).
  10. Kirunda, D. F., McKee, S. R. Relating quality characteristics of aged eggs and fresh eggs to vitelline membrane strength as determined by a texture analyzer. Poultry Science. 79 (8), 1189-1193 (2000).
  11. Back, J. F., Bain, J. M., Vadehra, D. V., Burley, R. W. Proteins of the outer layer of the vitelline membrane of hen's eggs. Biochimica Et Biophysica Acta. 705 (1), 12-19 (1982).
  12. Waclawek, M., Foisner, R., Nimpf, J., Schneider, W. J. The chicken homologue of zona pellucida protein-3 is synthesized by granulosa cells. Biology of Reproduction. 59 (5), 1230-1239 (1998).
  13. Okumura, H., et al. A newly identified zona pellucida glycoprotein, ZPD, and dimeric ZP1 of chicken egg envelope are involved in sperm activation on sperm-egg interaction. Biochemical Journal. 384, Pt 1 191-199 (2004).
  14. Guyot, N., Rehault-Godbert, S., Nys, Y., Baron, F. Understanding the natural antibacterial defences of egg white and their regulation. Achieving Sustainable Production of Eggs Volume 1. Roberts, J. 1, Burleigh Dodds Science Publishing Limited. Cambridge, UK. 161-193 (2016).
  15. Trziszka, T., Smolinska, T. Chemical Characterization of the Vitelline Membrane of Hens Eggs. Food Chemistry. 8 (1), 61-70 (1982).
  16. Berardinelli, A., Ragni, L., Giunchi, A., Gradari, P., Guarnieri, A. Physical-mechanical modifications of eggs for food-processing during storage. Poultry Science. 87 (10), 2117-2125 (2008).
  17. Kelley, A. J. The effects of storage time on vitelline membrane protein banding patterns and interior egg quality of eggs from nonmolted and molted hens. Texas A&M University. , Master of Science Thesis (2003).
  18. Schafer, A., Drewes, W., Schwagele, F. Analysis of vitelline membrane proteins of fresh and stored eggs via HPLC. Zeitschrift Für LebensmittelUntersuchung Und-Forschung A. Food Research and Technology. 206 (5), 329-332 (1998).
  19. Romanoff, A. L. The avian embryo: Structural and functional development. , The Macmillan Company. New York, NY. (1960).
  20. Haas, H. J., Spratt, N. T. Contributions to an analysis of the avian vitelline membrane's potential to promote outgrowth of the yolk sac-serosal membrane. The Anatomical Record. 184 (2), 227-231 (1976).
  21. Jensen, C. Ultrastructural changes in the avian vitelline membrane during embryonic development. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 21 (3), 467-484 (1969).
  22. Barbato, G. F., Cramer, P. G., Hammerstedt, R. H. A practical in vitro sperm-egg binding assay that detects subfertile males. Biology of Reproduction. 58 (3), 686-699 (1998).
  23. New, D. A. T. The Adhesive Properties and Expansion of the Chick Blastoderm. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 7 (2), 146-164 (1959).
  24. New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3 (4), 326-331 (1955).
  25. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. I. Membrane structure and its deterioration with age. Journal of Biochemistry. 78 (2), 261-268 (1975).
  26. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. II. Physicochemical properties of glycoprotein I. Journal of Biochemistry. 79 (6), 1351-1356 (1976).
  27. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. III. Physicochemical properties of glycoprotein II. Journal of Biochemistry. 81 (5), 1543-1548 (1977).
  28. Réhault-Godbert, S., et al. Ovalbumin-related protein X is a heparin-binding ov-serpin exhibiting antimicrobial activities. Journal of Biological Chemistry. 288 (24), 17285-17295 (2013).
  29. Gautron, J., et al. Ovotransferrin is a matrix protein of the hen eggshell membranes and basal calcified layer. Connective Tissue Research. 42 (4), 255-267 (2001).
  30. Guyot, N., et al. Proteomic analysis of egg white heparin-binding proteins: towards the identification of natural antibacterial molecules. Scientific Reports. 6, 27974 (2016).
  31. Guyot, N., et al. function, and evolution of Gga-AvBD11, the archetype of the structural avian-double-beta-defensin family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 337-345 (2020).
  32. Mori, M., Masuda, N. Proteins of the vitelline membrane of quail (Coturnix coturnix japonica) eggs. Poultry Science. 72 (8), 1566-1572 (1993).

Tags

Biokemi Problem 167 høneæg perivitellinelag mekanisk adskillelse histologiske struktur proteinopløselighed proteomics
Mekanisk adskillelse og proteinopløselighed af de ydre og indre perivitellineunderlag fra hønseæg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bregeon, M., Guyot, N.,… More

Bregeon, M., Guyot, N., Réhault-Godbert, S. Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs. J. Vis. Exp. (167), e61739, doi:10.3791/61739 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter