Summary
이 문서에서는 구조적 변경을 최소화하고 프로테오믹 분석을 위해 각 하위 층의 단백질 용해화를 최적화하면서 닭 계란의 외부 및 내부 인식 하층을 분리하는 간단한 방법을 보고합니다.
Abstract
달걀 노른자를 둘러싸고 있는 각성층은 수정, 계란 방어 및 조류 배아의 발달에서 근본적인 역할을 합니다. 그것은 밀접하게 연관되고 명백한 여성 생식 기관에 의해 형성되는 2개의 단백질이 많은 아층에 의해 형성됩니다. 두 구조 모두 정의된 기능 적 특이성을 갖는 것으로 가정됩니다. 각 하위 층을 구성하는 단백질의 기능을 특성화하기 위해 첫 번째 과제는 구조적 손상을 제한하면서 이 두 개의 복잡한 층의 기계적 분리를 허용하는 조건을 확립하는 것입니다. 두 번째 단계는 후속 생화학 분석을 위해 이 두 하위 층으로부터 단백질 용해화를 용이하게 하기 위해 실험 조건을 최적화하는 것입니다. 이 접근법의 효율성은 두 구조 사이에 구별될 것으로 예상되는 도데실 황산염-폴리 아크릴아미드 겔 전기포아시스(SDS-PAGE)에 의해 각 하위층의 단백질 프로파일을 분석하여 평가된다. 이 2단계 절차는 간단합니다. 그것은 고전적인 생화학 장비 및 시약을 필요로; 심층적인 프로테오믹스와 호환됩니다. 또한 비교 생물학을 위한 다른 조류 알로 전염될 수 있으며, 각성 층의 구조와 조성이 종별 특징을 갖는 것으로 나타났다는 것을 알고 있다. 또한, 서브레이어 분리(step 1)를 위해 개발된 비-분해 조건은 전자 현미경을 스캔 및 전송하여 구조 분석을 허용한다. 또한 후속 단백질 정제를 위한 초기 단계를 구성하여 각각의 생물학적 활동 및 3D 구조를 분석하거나, 추가 면역히스토케또는 기능적 분석을 수행할 수 있다. 이러한 연구는 이 두 하위 층의 생리적 기능을 해독하는 데 도움이 될 것입니다.
Introduction
이 방법의 목적은 달걀 노른자를 둘러싸고 조류 종의 번식에 근본적인 역할을 하는 얇은 단백질 층인 계피층(PL)의 후속 생화학적 특성화를 허용하는 프로토콜을 제공하는 것이다. 문헌에서 "비텔린 막"이라고도 불리는 PL은 여러 유형의 당단백질로 구성된 두꺼운 섬유의 3차원 네트워크입니다. 난소에서 조립되는 내부 각막층(IPL)과 외부 각막층(OPL, 흰색과 접촉함)으로 구성되며, IPL(도1)에누워 있고, 인펀디부룸에 의해 생산된다. 이 후자의 조직은 배란 후 성숙한 노른자 여포를 수신하는 oviduct의 깔때기와 같은 상부 세그먼트이며, 수정이 일어나는 부위입니다. OPL의 분비는 이 두 사건 후에 생기고 oviduct의 그밖 특정 세그먼트에 있는 계란 흰자와 계란 껍질의 연속한 예금에 선행됩니다. PL의 생리적 기능은 배아 발생의 수정 및 초기 단계뿐만 아니라 배아의 신체적 및 분자 보호와관련이 있습니다. 전체 PL에서 수행된 닭 계란의 프로테오믹 분석은 137개의 다른 단백질1의존재를 밝혔습니다, 그러나 IPL과 OPL 사이 이 단백질의 대부분의 분포는 해명될 남아 있습니다. IPL 및 OPL에서 사용할 수 있는 최소한의 양의 데이터는 매우 뚜렷한 단백질 프로파일2,3,4를나타내며, 이는 서로 다른 구조적 및 기능적 특성을 시사한다. OPL과 IPL 사이 단백질의 분포에 대한 데이터의 상대적 부족은 얇고 임베디드된 두 하위 층을 분리하는 어려움 때문일 수 있습니다.
여기에 제시된 방법은 단백질 함량을 보존하면서 각각의 조직학적 구조에 제한된 충격으로 두 하위층을 분리하고, 프로테오믹스에 의한 후속 분석을 위한 단백질의 완전한 용해화를 허용하는 프로토콜을 제공하는 데 사용되는 조건을 설명합니다. 1) PL 샘플링 및 OPL/IPL 분리 및 2) 대량 분광분석을 위한 단백질 용해성 및 전기포고증을 위한 PL, OPL 및 IPL 처리의 두 가지 주요 단계가 포함된다. 워크플로는 그림 2에표시됩니다. 눈에 띄게, 본 프로토콜은 프로테오믹 분석(Step 2.2)에 최적화되었지만, 조직학(예를 들어, 전자 현미경 검사법), 면역조직화학분석, 기능성 연구(1단계), 염용성 단백질의 정제를 위한 일부 단계에서 중지될 수 있다(step2.1)(2.1) (그림 2).
첫 번째 단계는 달걀 노른자로부터 총 PL을 제거하는 것입니다(도 2,단계 1.1). 게시된 모든 방법은 노른자에서 달걀 흰자를 수동으로 분리하거나 계란 분리기 사용으로 시작합니다. 그 다음에는 남은 달걀 흰자와 두꺼운 샬라자에의 제거가 포셉을 사용하거나 필터 용지5(도 2A)에흡착하여 제거한다. 다음으로, PL 을 샘플링하도록 선택한 기술은 게시된 아티클에 따라 변수입니다. 일부 논문에는 노른자의 여러 가지 세차재가 포함되어 있습니다. 용액1,5,6,0.85 ~ 1% 식염수2,7,8,0.15 M NaCl/N-[Tris(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에타네술포닉, pH7.4,또는 0.01HCl(0.01 HCl) 이러한 절차는 닭고기, 오리, 링넥 페아산트, 회색 파트리지, 코카티엘 앵무새, 국산 비둘기 또는 쥐달걀2,6,9에적용되었다. 달걀 노른자가 수성 용액없이 페트리 접시에 유지되는 동안 PL의 제거는 PL이 깨지기 쉽고 달걀 노른자가 PL1,5에 충실하는 경향이 있기 때문에 매우 힘들 수 있으므로 나중에 제거하기가 어려울 수 있습니다. 37°C3에서 1시간 동안 산성 완충제 또는 용액을 사용하는 것도 바람직하지 않으며 이러한 조건으로 인해 PL 구조를 변화시킬 수 있고 단백질 손실이 발생할 수 있다. 또한 이 영역은 전체PL4,6,10(도 2B)을반영하지 않는 뚜렷한 구조적 및 분자 패턴을 가질 가능성이 있기 때문에 발아 디스크를 함유하는 영역을 제거하는 것도 중요하다. 이 방법은 일부 게시된 기사에서 강조한 아이디어를 활용하고 무결성을 유지하면서 PL 샘플링을 용이하게 하는 몇 가지 개선사항(그림2C)을제안합니다.
두 번째 단계는 두 개의 하위 레이어를 분리하는 것으로구성됩니다(도 2,단계 1.2). 이 단계는 OPL과 IPL이 서로 단단히 묶여 있기 때문에 중요합니다. 이 단계는 쌍안경 해부 현미경의 밑에 집게로 주의 깊게 수행되어야 합니다. OPL/IPL 분리를 보고하는 간행물은 매우 제한된2,3,7,11이며 그 중 일부는 하위 층의 조직학적 구조에 영향을 미칠 가능성이 있는 특정 조건(37°C에서 산성 완충제1시간 2,3)을사용하거나 단백질 손실 또는 노른자 또는 백색 오염에 기여할 가능성이 있다. 더 나은 IPL에서 OPL을 구별하기 위해, 일부 저자는 약간 OPL (내부 층은 무색 남아)11에toluidine 파란색의 사용을보고했다. 개발된 방법에서, 우리는 분리가 용이하게 달성되고 어떤 염료(도 2D)의사용을 필요로하지 않도록 조건을 최적화했습니다.
두 번째 주요 단계는 각 하위 층을 구성하는 단백질의 용용성입니다. 고전적으로, 청정 리오필1,건조2,6,또는 신선하게 제조된3,4,11 PL/서브레이어를 전기포에 사용되는 Laemmli 버퍼와 직접 혼합함으로써 달성된다. 다른 저자들은 1% NaCl에서 층의 예비 용해화를 선호했으며, 1% SDS 버퍼링 용액2,3,11 또는 실온 또는 트리톤에서 프로테아제 억제제 및 SDS6을 함유한 용액에서 45°C12에서배양한 후, 일정한 격렬한 교반하에서. 일부 저자는 또한 PL인산염 완충식염 식염수 또는 우레아에서 배양되고 초음파 처리 된 프로토콜을 설명했다13. 이러한 치료법은 모두 Laemmli 완충제에서 원심분리 및 희석에 뒤따랐으며, 모든 것은 불용성 물질(원심분리 후 얻은 펠릿)이 분석될 샘플로부터 버려지므로 층으로부터 불완전한 단백질 용용성의 단점을 공유하였다.
또한, 단백질 용용화를 위한 특정 저자의 데칭 조건(urea, 세제, 고온 등)의 사용은 단백질을 돌이킬 수 없게 비활성화하고, 생물학적 활동을 방해하며, 또한 그들의 3D 구조를 손상시킬 가능성이 높기 때문에 특성화에 대한 후속 단백질 정제와 호환되지 않는다. 이 특정 단계 2의 경우 이 프로토콜에는 PL/OPL/IPL 기계적 탈구 후 비-데스팅 조건 하에서 가장 풍부한 단백질의 용해화를 허용하는 제1 서브스텝이 포함되어 있으며, 필요한 경우 추가 단백질 연구를 방해하지 않을것이며(도 2,단계 2.1), 전기포피및 깊이 2.2에 대한 단백질의 완전한 용해화를 허용하는 제2 서브스텝(2.1). 그것은 실험 연구에 의해 검증 된 새로운 아이디어에서 발생하는 다양한 출판 논문과 조정에서 가져온 제안을 결합합니다.
Protocol
1.PL, IPL 및 OPL 샘플링
- PL 샘플링
- 새로 놓인 수정되지 않은 달걀을 수동으로 부수고 유리 비커에 누워있는 달걀 분리기를 사용하여 노른자를 흰색에서 분리하십시오. 작은 가위로 샬라자에를 제거하고 필터 용지 위에 노른자를 굴려 투명하고 가시적인 구조로 나타나는 부착 된 알부민을 제거합니다(그림 2A).
주의: PL을 가위로 펑크하지 않도록 주의하십시오. 샬라자를 제거하기 위해 가위 대신 핀셋을 사용하면 PL 파손 및 후속 노른자 누출이 발생할 수 있습니다. 필터 용지의 롤링 스텝은 매우 중요하며 PL 파손을 유발할 수 있는 용지 필터의 흡수 특성으로 인해 매우 빠르게 수행해야 합니다. 또한 평신도의 날부터 수정되지 않은 계란을 사용하여이 첫 번째 단계와 모든 후속 단계의 성공을 최적화하는 것이 매우 중요합니다. 또는 냉각된 환경에서 10일 미만 저장된 계란을 사용할 수 있지만 실험자는 PL 변경의 잠재적 위험을 고려해야 합니다. - 이전에 4°C로 냉각된 10m MM Tris-HCl pH pH 8을 포함하는 결정화기에 노른자를 침수하고 무딘 가위를 사용하여 1cm 영역 내에서 발아 디스크를 통해 PL 영역을 제거합니다(도2B).
참고: 처음에는 PL이 탈이온수에 침지되었지만, 이러한 접근법은 pH 제어의 부족과 그 후 하위 층을 분리하는 어려움(1.2단계)과 같은 몇 가지 단점이 있다. 따라서, 트라이농도(도3A)및 pH(도3B)를포함하는 몇몇 조건을 시험하였다. pH 8에서 완충제의 사용은 탈염 또는 탈염수 대신 계란 생리학(달걀 흰자의 pH는 평신도에 약 7.8)에 따라 단백질 손실을 최소화한다. 대조적으로, 산성 또는 매우 알칼리성 pH는 PL 탈구성 및 초기 단백질 용해화를 유발하는 것으로 의심된다(도3B). 10m Tris-HCl pH pH 8로 구성된 완충제는 계란 생리학을 존중하고 상당한 단백질 용해화를 일으키지 않기 때문에 최적의 것으로 나타났다(작업 완충제의 단백질 농도는 최소한의 유지, 도 3A,B). - 버퍼에 작은 가위로 PL을 파열합니다. 파열된 PL의 두 가장자리를 집게하여 PL을 노른자에서 벗겨냅니다.
- 10mM Tris-HCl의 여러 욕조에서 PL을 여러 번 헹구고 노른자의 흔적이 보이지 않게 할 때까지 pH 8을 헹구는 PL을 유지합니다. 이 단계에서 PL이 버퍼에 깨끗하고 흰색이며 부동되어 있는지 확인합니다. 그것은 서브 레이어 분리를 위한 단계 1.2에서 처리될 수 있거나 생화학적 분석을 위해 2.1단계로 직접 처리될 수 있다.
- 새로 놓인 수정되지 않은 달걀을 수동으로 부수고 유리 비커에 누워있는 달걀 분리기를 사용하여 노른자를 흰색에서 분리하십시오. 작은 가위로 샬라자에를 제거하고 필터 용지 위에 노른자를 굴려 투명하고 가시적인 구조로 나타나는 부착 된 알부민을 제거합니다(그림 2A).
- OPL 및 IPL 샘플링
- OPL을 플라스틱 페트리 접시에 올려 놓고 주름이 적어 평평하게 유지하여 전체 PL 샘플을 펴보시면 됩니다. 10m MTS-HCl pH 8, 50 mM NaCl로 샘플을 덮습니다. PL이 플라스틱에 더 잘 붙어 있기 때문에 플라스틱 페트리 접시 (그리고 유리가 아닌)를 사용하여 PL 움직임을 제한하십시오.
- OPL 측을 찾으려면 IPL이 아닌 OPL에 연결된 나머지 샬라자의 위치를 살펴보십시오. 이 단계는 하위 층 분리를 용이하게하기 위해 작은 NaCl 농도 (50 mM)가 필요합니다.
참고: 도 3C 및 문헌(11)에 제시된 그래프를 기반으로, 이 농도는 주요 단백질 손실로 이끌어서는 안 됩니다. 처음에, 탈이온화된 물은이전에설명된 바와 같이 서브레이어를 분리하는 데 사용되었지만,이 기술은 매우 힘들고 구조적 PL 무결성의 변경의 결과로 밝혀졌다. 따라서, 상이한 NaCl농도(도 3C)는염이 두 하위 층의 분리를 용이하게 함에 따라 시험되었다. 그러나 NaCl 농도 >100 mM을 사용하면 PL로부터 단백질 용해성/방출이 증가하며, 이는 여기서 목표가 아닌(2단계의 목표가 될 것이다)(도 3C). 10m Tris-HCl pH 8 버퍼에 50mM NaCl을 첨가하면 두 하위 레이어의 분리를 용이하게 하고 단백질 손실을 최소화합니다.
- OPL 측을 찾으려면 IPL이 아닌 OPL에 연결된 나머지 샬라자의 위치를 살펴보십시오. 이 단계는 하위 층 분리를 용이하게하기 위해 작은 NaCl 농도 (50 mM)가 필요합니다.
- 총 PL을 작은 가위로 약 2cm x 3cm의 조각으로 자른다. 각 PL 조각의 두 층을 쌍안경 해부현미경(도 4)에서초정밀 팁 집게로 기계적으로 분리합니다. 생성된 IPL 및 OPL 샘플을 -80°C의 마이크로튜브에 개별적으로 저장하여 추가 사용까지 보관합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 두 층의 분리의 효율성과 시설은 계란의 신선도에 크게 의존한다는 점에 유의해야합니다. 실제로, 저장된 계란은 PL 느슨해지는 (및 약화)로 인해 달걀 흰자 pH의 급속한 증가와 노른자 지수의 후속 변경으로 인해 급격한 내부 수정을 보여줍니다. IPL은 OPL과 비교하여 더 취약합니다. 따라서, 상기 OPL의 면을 위에 놓고 집게로 OPL을 당겨서 두 하위층을 분리하는 것이 바람직하다. 두 하위 계층 모두 귀중한 주의를 기울여 처리해야합니다.
- OPL을 플라스틱 페트리 접시에 올려 놓고 주름이 적어 평평하게 유지하여 전체 PL 샘플을 펴보시면 됩니다. 10m MTS-HCl pH 8, 50 mM NaCl로 샘플을 덮습니다. PL이 플라스틱에 더 잘 붙어 있기 때문에 플라스틱 페트리 접시 (그리고 유리가 아닌)를 사용하여 PL 움직임을 제한하십시오.
2. 단백질 용해성 및 SDS 페이지 분석을 위한 샘플 처리
-
1차 단백질 용해성
- 동결 건조 IPL 및 OPL 샘플을 개별적으로 합니다. 동결 건조가 완료되면 누출 방지 나사 캡을 소지한 깨끗한 마이크로튜브의 각 샘플에서 대략 1 mg을 잘라냅니다. 나머지 샘플을 단단히 닫힌 튜브에 보관하여 -80°C에서 장시간 보관하십시오.
참고: 누출 방지 나사 캡이 있는 마이크로튜브를 사용하면 시료 재수화를 방지하고 시료를 고정할 수 있는 방수 및 누출 방지 클로저를 보장합니다. - 각 lyophilized 서브 레이어의 1 mg을 50 mM Tris pH 7, 500 mM NaCl의 400 μL로 혼합하십시오. 믹서 밀을 30Hz에서 5분 동안 2회 사용하여 미세 입자에서 OPL 및 OPL 구조를 분해하고 단백질 용해화를 용이하게 합니다. 두 개의 깨끗한 마이크로 튜브에서 OPL 및 IPL을 포함하는 샘플의 400 μL을 수집합니다.
참고: 여기에서 사용되는 버퍼는 단백질 용해성(1단계와 달리)을 증가시키기 위해 선택되었습니다. 이러한 완충제는 도 3에제시된 결과에 기초하여, 이는 pH 7(도3B)에서단백질 용해제의 증가를 나타내고 0.5M NaCl(도3C)을사용하였다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 이 단계에서, 샘플은 주요 PL 단백질의 단백질 정제를 위해 사용되거나 2.2단계로 가공될 수 있다.
- 동결 건조 IPL 및 OPL 샘플을 개별적으로 합니다. 동결 건조가 완료되면 누출 방지 나사 캡을 소지한 깨끗한 마이크로튜브의 각 샘플에서 대략 1 mg을 잘라냅니다. 나머지 샘플을 단단히 닫힌 튜브에 보관하여 -80°C에서 장시간 보관하십시오.
-
전기 포에이시스를 위한 단백질 용해성
- 5x SDS-PAGE 샘플 버퍼(100 μL, 0.25 M Tris-HCl, 0.05% 브로모페놀 블루, 50% 글리세롤, 5% SDS, 5% 베타-메르카포에탄올, pH 6.8)을 샘플의 각 400 μL에 추가하고 100°C의 시료와 열은 100°C로 가열합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며 샘플은 -80°C로 저장할 수 있습니다. 프로토콜의 이 단계에서 OPL 및 IPL은 완전히 용해됩니다. 시료 용해도화의 효율은 10,000 x g에서5분 동안 원심분리시 샘플을 원심분리하여 평가할 수 있다. 완전한 수용성 원심 분리 후 눈에 보이는 펠릿의 부재가 특징입니다. 따라서, 완전한 용해화 후, 1 mg의 lyophilized 서브레이어가 단백질 1 mg에 해당한다고 여기에서 간주됩니다(500 μL 샘플의 단백질 농도는 2 mg/mL입니다). 실제로 PL은 80% 이상의 단백질2,15로구성된다. 5배 샘플 버퍼를 사용하면 샘플 희석을 제한하지만 1x 또는 2배 샘플 버퍼도 사용할 수 있습니다. - SDS 폴리아크릴아미드 젤(4%-20% 그라데이션 젤)에 최대 20μg의 단백질/차선을 적재하고 수직 전기전도 시스템을 사용하여 120V에서 전기포전을 수행합니다.
참고: 4%-20% 그라데이션 젤의 사용은 필수는 아니지만 OPL 및 IPL이 분자량이 있는 단백질을 전시하고 &10 kDa에서 >250 kDa에 이르는 단백질을 전시하는 것이 바람직하다. 또한 유정 바닥에 불용성 단백질 또는 단백질 골재의 존재가 불용성 및 시료 준비 중에 가능한 누락 된 단계를 나타낼 것이기 때문에 스태킹 젤 (일반적으로 제거됨)을 유지하는 것이 유용 할 수 있습니다. - 전기 포근 후, 30 분 동안 쿠마시 브릴리언트 블루 용액 (50 % H2O, 40 % EtOH, 10 % 아세트산, R250 쿠마시 브릴리언트 블루)와 유리 플레이트와 스테인에서 젤을 제거합니다.
- 젤 배경이 밝은 파란색으로 나타날 때까지 50% H2O, 40% EtOH, 10% 아세트산 용액으로 구성된 용액을 가진 탈얼룩.
- 마지막으로 탈이온 된 물을 포함하는 페트리 접시에 젤을 전달하여 폴리 아크릴라미드 젤의 염색 및 수분을 보충합니다. 단백질은 투명한 배경의 파란색 밴드로 나타나야 합니다.
- 5x SDS-PAGE 샘플 버퍼(100 μL, 0.25 M Tris-HCl, 0.05% 브로모페놀 블루, 50% 글리세롤, 5% SDS, 5% 베타-메르카포에탄올, pH 6.8)을 샘플의 각 400 μL에 추가하고 100°C의 시료와 열은 100°C로 가열합니다.
Representative Results
OPL과 IPL은 SDS-PAGE에 의해 단백질 프로파일을 분석하기 위해 새로 배치된 수정되지 않은 계란의 PL에서 분리되었습니다. 전체 프로토콜의 실험 워크플로우는 그림 2에설명되어 있습니다. 도 3은 다른 트리체농도(도 3A),다양한 pH(도3B)및 상이한 NaCl 농도(도3C)에서단백질 방출을 나타낸다. 결과 2개의 하위층은 쌍안경 해부 현미경의 빛 하에서 관찰되고 OPL이 조밀하고 흐리고 희끄러워지는 동안 IPL이 반투명되는 도 4에 표시된다. 이러한 기능은 부분적으로 하위 계층 분리의 효율성을 증언 할 수 있습니다.
분리 후 OPL및 IPL은 독립적으로 lyophilized되었고, 기계적 연삭, 음이온 세제(SDS) 및 환원제(베타-메르카포에탄올)의 조합으로 단백질 함량이 완전히 용해되었고, 그 다음으로 끓는다. 폴리아크릴아미드 젤(SDS-PAGE 전기포감)에서 이동한 후 OPL 및 IPL 샘플은 예상대로 뚜렷한 전기전도프로파일(그림 5)을나타낸다.
그림 1: 새로 배치된 수정되지 않은 계란의 PL 구조. 단면에서 전체 PL의 회로도 표현 및 전송 전자 현미경 현미경 검사기 (개인 데이터, ©Plateme IBiSA 드 현미경 전자, 투어의 대학 및 CHRU, 프랑스, S. Georgeault). 이 그림은 이 프로토콜에 제시된 대로 준비된 PL에서 얻은 것입니다. OPL, 외부 각막 층; IPL, 내부 인식 층. 검은 색 화살촉은 두 개의 하위 레이어를 분리하는 연속 멤브레인을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 프로토콜의 두 가지 주요 단계와 응용 프로그램의 예제를 요약한 워크플로. 프로토콜은 PL 계층의 프로테오믹 해석에 최적화되었지만 다른 응용 프로그램의 일부 단계에서 중지할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: PL 샘플링을 위한 버퍼 컴포지션의 최적화. 간단히, 클린 PL(n=4)은 2h.PL에 대한 다양한 완충용의 동일한 부피로 배양되었고, 단백질 농도는 나머지 완충제에서 280nm에서 흡수도를 측정하여 추정되었다. (A)pH 8에서 트리스-HCl 농도의 효과. (B)pH (7 ~ 9)의 효과. (C)NaCl 농도의 효과. 이러한 결과로부터, 우리는 10m Tris-HCl, pH 8, 50 mM NaCl로 구성된 완충제가 단백질 손실을 제한하기 때문에 가장 적절하다는 결론을 내렸습니다. 결과는 4개의 다른 PL 견본의 평균 ± 표준 편차로 표현됩니다. 통계 분석은 단방향 ANOVA를 사용하여 수행되었으며 Tukey의 여러 비교 테스트가 뒤따랐습니다. P-값 & 0.05는 중요한 것으로 간주되었다 (ns, 중요하지 않음; * p&0.05, *** p&0.001, **** p&0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: OPL 및 IPL은 쌍안경 해부 현미경의 밑에 특징입니다. 분리 후 IPL(오른쪽)이 반투명으로 나타났고 OPL(왼쪽)은 불투명했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 새로 배치된 수정되지 않은 계란에서 분리된 OPL 및 IPL의 SDS-PAGE 분석. 4%-20% 아크릴아미드 젤이 그 뒤를 이어 쿠마시 의 화려한 블루 스테인링. 분자량 표준 밴드의 질량은 kDa로 표시됩니다. OPL 프로파일은 주로 분자 질량및 gt;30 kDa를 갖는 단백질로 구성된 반면 IPL 프로파일에서 검출된 주요 대역은 분자 질량&30 kDa를 가지고 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
현재 프로토콜의 성공은 독립적으로 최적화된 두 가지 중요한 단계에 의존합니다: OPL과 IPL의 기계적 분리는 가능한 한 덜 구조화되어야 하는 것, 반대로 구조화 및 분해되는 각 하위 계층의 완전한 단백질 용해화가 뒤따릅니다. 또한 각 단계의 성공적인 성과를 보장하기 위해 고려해야 할 몇 가지 구체적인 사항을 강조합니다.
프로토콜은 계란 껍질 색깔, 계란 무게, 생산의 모형, 또는 암탉의 유전 긴장에 의존하지 않습니다. 그러나, 그것은 계란의 신선도에 따라 달라 집니다. 실제로, 계란은 냉장 조건 하에서 저장이 수행될 때 이러한 변경이 지연될 수 있지만, 배치 된 후 신속하게 심오한 내부 물리 화학 적 수정을 겪습니다14,15. 저장 중 달걀 껍질 모공을 통한 이산화탄소의 손실로 인해 달걀 흰자 pH(7.8에서 9.5)가 증가하는 반면, 일부 물 교환은 노른자와 흰색 사이에 발생하며 PL을 가로질러 발생합니다. 두 수정 모두 약해지고 덜 긴장되는 PL의 분자 및 조직학적 구조에 부정적인 영향을 미치며,14,15,단백질 함량의 물리화학적 변형으로 인한 가능성이16,17,18. 특히 저장이 실온에서 장기간 수행되는 경우 저장 계란으로 아층의 분리가 매우 어려워질 것으로 가정합니다. 현재까지, 프로토콜은 4°C에서 4일 미만 저장된 계란을 사용하여 수행되었으며, PL 하위층을 효율적으로 샘플링하기 위해 계란을 위한 최대 저장 기간은 아직 알려지지 않았다. 또한, 목적이 각 하위 층의 분석인 경우 수정되지 않은 계란을 사용하는 것이 중요합니다. 평신도의 날에, 수정란의 배아는 23 h 이며 그 개발은 매우 빠른 후, 계란 배양 하는 경우. 실제로, 배아 발달 및 일부 외화 구조의 성장은 따라서 급속히 저하되고, 외화 노른자낭(19)으로대체되는 지하층으로 PL을 사용하여 확장된다.
노른자와 달걀 흰자를 수동으로 분리한 후, 노른자는 달걀 흰자 흔적과 PL에 단단히 붙어 있는 샬라자에서 청소해야 합니다. 팁은 노른자를 필터 용지에 조심스럽게 굴려 버퍼링 된 솔루션 (10m Tris-HCl pH 8)에서 노른자의 광범위한 세차를 수행하는 것입니다. 완충제에 사용되는 pH는 달걀흰자(14)의 생리적 pH와 일치하며 단백질 손실을 최소화하는 것으로나타났다(도 3). 냉장 버퍼의 사용은 4°C에서, 리디딕 노른자가 후퇴하고 이 온도에서 덜 유체가 되기 때문에 노른자에서 PL을 제거하는 데 도움이 됩니다. 추가 세차재는 PL에서 노른자 잔류물을 제거 할 수 있습니다. 또한 여성 프로뉴클레누스를 포함하는 이 구조가 PL을 대표하지 않을 수 있기 때문에 발아 디스크에 대응하는 영역을 잘라내는 것도 중요하다. 계란이 수정될 때 배아 세포의 수정 및 곱셈부위입니다. 전체 PL을 대표하지 않을 수 있는 특정 조성물을 가지게 되는데, 이는 그것이 제거된 이유입니다. 이 특정 단계는 노른자가 차가운 버퍼에 침지될 때 강력하게 촉진됩니다. 이러한 발아 디스크 구조는 본 프로토콜(목표 에서)에서 폐기되지만, 수정란에서 이 영역의 특정 분석은 배아 발생19,20,21의초기 단계에서 PL 함량(proteomics 및 활동) 및 구조(전자 현미경 검사법)의 진화를 연구하는 데 관심이 있는 과학자들에게 매우 유용할 수 있다. 이 단계에서, 전체 PL은 구조적으로 손상되지 않으며 전자 현미경 검사법(도2)에의한 추가 구조 분석을 위해 처리될 수 있으며, 1.2단계 또는 2.1단계(전체 PL을 분석하는 경우).
1.2단계는 PL이 매우 얇고 깨지기 쉽기 때문에 쌍안경 해부 현미경으로 수행되어야 합니다(약 10 μm 두께). 하위 레이어의 분리는 물이나 최소한의 소금이 부족한 버퍼에서 거의 불가능하며 이러한 옵션을 사용한 초기 시도는 심각한 PL 손상을 초래했습니다. 따라서, 이 단계를 위해 선택된 버퍼는 생리학적 pH(pH 8)에 남아 있으며 50mM NaCl을 함유한다. 이 단계는 힘들며 PL 파열을 방지하기 위해 신중하고 부드럽게 수행해야합니다. 분리되면, 두 하위 레이어는 특이한 물리적 특징(불투명대 반투명)을 나타낼 때 쉽게 식별할 수 있습니다. 현미경의 빛 아래 IPL의 균질성의 부족은 불완전한 분리를 반영하고 따라서 IPL에 존재하는 OPL의 나머지 반점의 존재를 반영한다. 또한, 전체 멤브레인을 치료하기 는 매우 어렵고 2cm x 3cm 조각의 사용은 성공 가능성을 크게 향상시킵니다. 얻어진 결과 서브층은 전자 현미경 검사법(도1)에의한 조직학적 연구에 적합합니다. 연속 멤브레인(CM)이라는 이름의 특정 선형 구조(0.05 ~ 1 μm 두께)가현미경(도 1)에서볼 수 있으며 일반적으로 분리 과정에서 하나 또는 다른 하위 층에 부착된 채로 남아 있다는 점은 주목할 만하다. 이전에는 분리(500mMMM)를 위해 상대적으로 높은 염분어를 사용할 때, CM은 OPL7에 부착된 채로 남아 있으며, 물5의 사용은 IPL에 CM의 부착을 선호한다는 것이 이전에 발표되었다. 이 프로토콜에서, 낮은 염분 어모함은 특정 목표(PL 하위층 구조적으로 손상되지 않고 단백질의 최소한의 손실)를 달성하기 위해 사용되며, 이는 이 CM이 IPL과 연관될 가능성이 높다는 것을 의미합니다. 그러나, 전염 전자 현미경 검사법에 의한 IPL 및 OPL의 추가 분석은 이 가설에 명확하게 명시될 것입니다. 1단계 말기에서 얻어진 PL, OPL 또는 IPL 층은 정자-계란 결합분석(22)에 대한 시험관 내 분석에 사용될 수도 있거나 배아발달(23,24)의초기 단계를 분석할 수 있다.
2단계는 단백질 함량의 용해화를 부분적으로(단계 2.1) 또는 완전히(단계 2.2)를 지칭한다. PL 및/또는 OPL은 먼저 물 분자를 제거하고 정확한 체중 측정을 허용하기 위해 lyophilized됩니다. 실제로 PL은 주로 물(88%)7로구성되며, 건조물질은 본질적으로 단백질(연구에 따라 80%~90%), 탄수화물, 지방, 미네랄2,7,25를함유하고 있다. PL에 함유된 물은 동결 건조에 의해 제거되고, 탄수화물이 PL 당단백질에서 본질적으로 회수되고, 노른자에서 유래한 지방과 미네랄이 본질적으로 광범위한 세차에 의해 버려지는 것을 고려하면, 결과 PL은 거의 독점적으로 단백질로 구성된다고 가정한다. 따라서 완전한 lyophilization 후에 얻은 체중 값은 주로 단백질에 대응해야 한다. 그런 다음 동일한 양의 PL, OPL 및/또는 IPL이 0.5 M NaCl을 포함하는 버퍼에서 희석됩니다. 높은 염분은 섬유질 네트워크의 기계적 파괴와 결합하여 비침하 조건에서 단백질 용해성을 크게 용이하게 합니다. 이 단계는 끓는, SDS 세제 및 환원제 베타-메르카토에탄올(step 2.2)을 이용한 완전한 용용화를 선행한다. 실제로, 일부 IPL 단백질은 SDS 수용성 당단백질25,26,27이며 OPL의 주요 성분은 NaCl 수용성1,11이다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 원심 분리 후에 불용성 단백질의 어떤 남아 있는 펠릿을 볼 수 없었습니다, 이는 수용성 가능성이 완료되었다는 것을 나타냅니다. PL, OPL 및/또는 IPL의 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 결과 단백질 프로파일은 출판된 문헌2,4,11,16과일치하지만, 신호의 해상도와 강도는 다양한 IPL 및 OPL 독립 샘플링 사이에 매우 개선되고 훨씬 더 균일하다.
또한, OPL과 IPL 간의 정량적 비교는 각각의 하위 계층에 대해 유추한 중량의 정확도 덕분에가능2,7. 더욱이, OPL과 IPL 프로파일은 모두 매우 뚜렷하며 14 kDa와 75 kDa의 희미한 밴드를 제외하고는 두 PL 하위 레이어모두 동일한 분자량을 표시하는 밴드를 눈에 띄게 공유하지 않습니다. 이 관찰은 중요한 교차 오염없이 하위 층 분리의 효율성을 확증합니다. 1에발표된 유일한 PL 프로테오믹 분석에 따르면, OPL(&30 kDa)에서 가장 강렬한 밴드는 리소지메(14kDa), 비텔린 막 외부 층 단백질 1(17kDa), 조류 베타-디펜신 1에 대응해야 한다. 1 (명백한 분자량 12 kDa), IPL의 강렬한 밴드 동안 (>30 kDa) 가능성이 조나 펠루시다 단백질 1 (102 kDa) 및 조나 펠루치다 단백질 3 (47 kDa). 매우 풍부한 PL 단백질 오보트랜스퍼린(78 kDa), 배부민 관련 단백질 X(45 kDa), 배부민(43kDa)1의 분포는 해명된 채로 남아 있다. 실제로, 이러한 단백질의 높은 분자량(>30 kDa)은 SDS-PAGE 프로파일에 기초한 IPL 단백질이지만, 조직 특이성(oviduct-표현 단백질)은 이러한 단백질을 OPL28,29에오히려 연관시킬 것이라고 제안합니다. 더욱이, 몇몇은 불충분한 세척 1 때문에 달걀 흰자와 달걀 노른자 단백질에 의하여 PL 견본의 잠재적인 오염을건의했습니다. 이러한 부족한 정보는 PL, OPL 및 IPL의 심층 적 정량적 프로테오믹스에 더 사용될 현재 프로토콜의 개발을 위한 기초가 된다.
대안적으로, 2.1단계및 원심분리 후 불용성 물질을 제거하기 위해, 추가생화학적 및 생물학적 특성화를 위해 일부 특정 단백질을 추출할 수 있다. 이러한 접근법은 최근 OPL의 두 가지 주요 성분의 생물학적 활동 및/또는 3D 구조를 특성화하기 위해 적용되었으며, 비텔린 막 외부 층 단백질 1(VMO1) 및 조류 베타-디펜신(11)30,31. 정제 분자로서 이러한 단백질의 가용성은 또한 면역 히스토케와 같은 추가 실험을 위한 특정 항체를 생성하거나 효소-연결된 면역흡성 분석서를 포함한 정량적 분석의 개발을 위해 생성하는 데 도움이 될 수 있다.
이 프로토콜의 2개의 중요한 한계는 (1) 계란이 4°C에서 4일 이상 저장된 경우에 특히 아층 분리를 가진 도전이고 (2) 완전한 단백질 용해화가 결과 견본의 본질적인 생물학적 활동을 손상시키는 완충제를 감소및 데마킹해야 한다는 사실입니다. 첫 번째 제한에 관해서는 기계적 분리에는 기술적 기술이 필요하지만 2 또는 3 실험 훈련 후에 쉽게 달성 할 수 있습니다. 일부 IPL 작은 조각은 OPL에 부착된 상태로 유지될 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 그러나 기계적 분리가 신중하게 수행되는 경우 한 하위 레이어의 오염은 최소화되어야 합니다. 최적의 하위 계층 분리 후 일반적인 IPL 및 OPL SDS-PAGE 프로파일은 도 5에도시되어 있다. 두 번째 제한에 관해서는, 본 문서에서 제시된 실험 단계는 각 하위 층을 구성하는 단백질의 철저한 목록을 제공하기 위하여 proteomic 분석에 최적화되었습니다. 각 단백질의 생물학적 활동의 추가 특성화를 위해, 2.1.2 단계에서 중지한 후, 데마포링 조건(단계 2.2.1, SDS 및 베타-메카토에탄올을 사용한 완충제 사용 후 끓는 다음). 그러나 2.1.2 단계에서 발생하는 단백질은 염용성 단백질만을 섭취하는 반면 염용불불성 단백질은 응집체를 형성한다는 점은 주목할 만합니다. 이들의 활성을 추가로 평가하는 한 가지 옵션은 이종 시스템을 이용한 재조합 단백질로서 염불용 단백질을 생산하는 것일 수있다(대장균,바쿨로바이러스, 효모 등).
이 프로토콜은 각 종의 독창성을 더 잘 이해하기 위해 비교 연구를 위해 다른 조류 계란에 적응 할 수 있습니다. 실제로 PL은 새로운 환경에 적응뿐만 아니라 발달 특이성2,6,9,32에적응할 가능성이 높은 단백질 조성측면에서 구조적으로 나아간 조류 특이성을 나타낸다. 적당한 기술성과 고전적인 장비 /재료가 필요한이 프로토콜의 개발은 조류 재생 및 표본 연구 분야에서 새로운 연구 길을 열어줍니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 필립 디디에와 캐린 분노 (INRAE, PEAT, 37380, 누질리, 프랑스, https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12)에 기름지게되지 않은 이사 갈색 계란을 제공해 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 투어의 대학, M. Bregeon의 박사 학위에 대한 자금 조달에 대한 프랑스 감사합니다. 이 작품은 프랑스 국립 연구 기관 (EQLIPSE, ANR-19-CE21-0006)으로부터 재정 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular dissecting microscope | Vision Engineering, France | Model Mantis Elite | |
| Lyophilizer | Cryotec, France | Model Cosmos 80 | |
| Mini-Protean II electrophoresis cell | Biorad, Hercules, USA | 1652960 | Any apparatus adapted for protein electrophoresis |
| Mixer Mill MM400 | Retsch, Hann, Germany | 20.745.0001 | Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample |
| Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm | Dutscher, Brumath | 5066 | |
| Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm | Dutscher, Brumath | 327005 |
References
- Mann, K. Proteomic analysis of the chicken egg vitelline membrane. Proteomics. 8 (11), 2322-2332 (2008).
- Chung, W. H., Lai, K. M., Hsu, K. -C. Comparative study on histological structures of the vitelline membrane of hen and duck egg observed by cryo-scanning electron microscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (3), 1794-1799 (2010).
- Kido, S., Doi, Y. Separation and Properties of the Inner and Outer Layers of the Vitelline Membrane of Hen's Eggs. Poultry Science. 67 (3), 476-486 (1988).
- Steele, M. G., Meldrum, W., Brillard, J. P., Wishart, G. J. The interaction of avian spermatozoa with the perivitelline layer in-vitro and in-vivo. Journal of Reproduction and Fertility. 101 (3), 599-603 (1994).
- Bain, J. M., Hall, J. M. Observations on the development and structure of the vitelline membrane of the hen's egg: an electron microscope study. Australian Journal of Biological Sciences. 22 (3), 653-665 (1969).
- Damaziak, K., Kieliszek, M., Buclaw, M. Characterization of structure and protein of vitelline membranes of precocial (ring-necked pheasant, gray partridge) and superaltricial (cockatiel parrot, domestic pigeon) birds. PLoS One. 15 (1), 0228310 (2020).
- Bellairs, R., Harkness, M., Harkness, R. D. The vitelline membrane of the hen's egg: a chemical and electron microscopical study. Journal of Ultrastructure Research. 8 (3-4), 339-359 (1963).
- Kido, S., et al. Characterization of vitelline membrane outer layer protein I, VMO-I: amino acid sequence and structural stability. Journal of Biochemistry. 117 (6), 1183-1191 (1995).
- Damaziak, K., et al. Comparative analysis of structure and strength of vitelline membrane and physical parameters of yolk of ostrich, emu, and greater rhea eggs. Poultry Science. 97 (3), 1032-1040 (2018).
- Kirunda, D. F., McKee, S. R. Relating quality characteristics of aged eggs and fresh eggs to vitelline membrane strength as determined by a texture analyzer. Poultry Science. 79 (8), 1189-1193 (2000).
- Back, J. F., Bain, J. M., Vadehra, D. V., Burley, R. W. Proteins of the outer layer of the vitelline membrane of hen's eggs. Biochimica Et Biophysica Acta. 705 (1), 12-19 (1982).
- Waclawek, M., Foisner, R., Nimpf, J., Schneider, W. J. The chicken homologue of zona pellucida protein-3 is synthesized by granulosa cells. Biology of Reproduction. 59 (5), 1230-1239 (1998).
- Okumura, H., et al. A newly identified zona pellucida glycoprotein, ZPD, and dimeric ZP1 of chicken egg envelope are involved in sperm activation on sperm-egg interaction. Biochemical Journal. 384, Pt 1 191-199 (2004).
- Guyot, N., Rehault-Godbert, S., Nys, Y., Baron, F. Understanding the natural antibacterial defences of egg white and their regulation. Achieving Sustainable Production of Eggs Volume 1. Roberts, J. 1, Burleigh Dodds Science Publishing Limited. Cambridge, UK. 161-193 (2016).
- Trziszka, T., Smolinska, T. Chemical Characterization of the Vitelline Membrane of Hens Eggs. Food Chemistry. 8 (1), 61-70 (1982).
- Berardinelli, A., Ragni, L., Giunchi, A., Gradari, P., Guarnieri, A. Physical-mechanical modifications of eggs for food-processing during storage. Poultry Science. 87 (10), 2117-2125 (2008).
- Kelley, A. J. The effects of storage time on vitelline membrane protein banding patterns and interior egg quality of eggs from nonmolted and molted hens. Texas A&M University. , Master of Science Thesis (2003).
- Schafer, A., Drewes, W., Schwagele, F. Analysis of vitelline membrane proteins of fresh and stored eggs via HPLC. Zeitschrift Für LebensmittelUntersuchung Und-Forschung A. Food Research and Technology. 206 (5), 329-332 (1998).
- Romanoff, A. L. The avian embryo: Structural and functional development. , The Macmillan Company. New York, NY. (1960).
- Haas, H. J., Spratt, N. T. Contributions to an analysis of the avian vitelline membrane's potential to promote outgrowth of the yolk sac-serosal membrane. The Anatomical Record. 184 (2), 227-231 (1976).
- Jensen, C. Ultrastructural changes in the avian vitelline membrane during embryonic development. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 21 (3), 467-484 (1969).
- Barbato, G. F., Cramer, P. G., Hammerstedt, R. H. A practical in vitro sperm-egg binding assay that detects subfertile males. Biology of Reproduction. 58 (3), 686-699 (1998).
- New, D. A. T. The Adhesive Properties and Expansion of the Chick Blastoderm. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 7 (2), 146-164 (1959).
- New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3 (4), 326-331 (1955).
- Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. I. Membrane structure and its deterioration with age. Journal of Biochemistry. 78 (2), 261-268 (1975).
- Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. II. Physicochemical properties of glycoprotein I. Journal of Biochemistry. 79 (6), 1351-1356 (1976).
- Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. III. Physicochemical properties of glycoprotein II. Journal of Biochemistry. 81 (5), 1543-1548 (1977).
- Réhault-Godbert, S., et al. Ovalbumin-related protein X is a heparin-binding ov-serpin exhibiting antimicrobial activities. Journal of Biological Chemistry. 288 (24), 17285-17295 (2013).
- Gautron, J., et al. Ovotransferrin is a matrix protein of the hen eggshell membranes and basal calcified layer. Connective Tissue Research. 42 (4), 255-267 (2001).
- Guyot, N., et al. Proteomic analysis of egg white heparin-binding proteins: towards the identification of natural antibacterial molecules. Scientific Reports. 6, 27974 (2016).
- Guyot, N., et al. function, and evolution of Gga-AvBD11, the archetype of the structural avian-double-beta-defensin family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 337-345 (2020).
- Mori, M., Masuda, N. Proteins of the vitelline membrane of quail (Coturnix coturnix japonica) eggs. Poultry Science. 72 (8), 1566-1572 (1993).
