Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kapillær elektroforese massespektrometri tilnærminger for karakterisering av protein og metabolitt korona ervervet av nanomaterialer

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61760
Automatic Translation
*1, *2, *3, 4, 1, 2, 3
1School of Geography Earth and Environmental Sciences, University of Birmingham, 2Biomedical Microscale Analytics, Leiden University, 3Institute of Medical Biochemistry, Medical University of Innsbruck, 4AB Sciex UK Ltd
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å karakterisere fullstendig biomolekylær korona, proteiner og metabolitter, anskaffet av nanomaterialer fra biofluider ved hjelp av en kapillær elektroforese - massespektrometri tilnærming.

Abstract

Adsorpsjonen av biomolekyler fra omkringliggende biologiske matriser til overflaten av nanomaterialer (NMs) for å danne korona har vært av interesse det siste tiåret. Interessen for bio-nano-grensesnittet oppstår fra det faktum at den biomolekylære koronaen gir en biologisk identitet til NMs og dermed får kroppen til å identifisere dem som "selv". For eksempel har tidligere studier vist at proteinene i korona er i stand til å samhandle med membranreseptorer for å påvirke cellulært opptak og fastslått at korona er ansvarlig for cellulær smugling av NMs og deres eventuelle toksisitet. Til dags dato har de fleste undersøkelser fokusert på protein korona og oversett de mulige virkningene av metabolittene som er inkludert i korona eller synergistiske effekter mellom komponenter i fullstendig biomolekylær korona. Som sådan demonstrerer dette arbeidet metoder for å karakterisere både protein- og metabolittkomponentene i biomolekylær korona ved hjelp av bunn-opp proteomikk og metabolomics tilnærminger parallelt. Dette inkluderer en partikkel fordøyelse av protein korona med et overflateaktivt middel som brukes til å øke protein utvinning, og en passiv karakterisering av metabolitt korona ved å analysere metabolitt matriser før og etter NM eksponeringer. Dette arbeidet introduserer kapillær elektroforese – massespektrometri (CESI-MS) som en ny teknikk for NM koronakarakterisering. Protokollene som er skissert her demonstrerer hvordan CESI-MS kan brukes til pålitelig karakterisering av både protein og metabolitt korona ervervet av NMs. Flyttingen til CESI-MS reduserer volumet av prøve som kreves (sammenlignet med tradisjonell væskekromatografi - massespektrometri (LC-MS) tilnærminger) med flere injeksjoner mulig fra så lite som 5 μL prøve, noe som gjør den ideell for volumbegrensede prøver. Videre reduseres miljøkonsekvensene av analyse med hensyn til LC-MS på grunn av de lave strømningshastighetene (<20 nL / min) i CESI-MS, og bruk av vandige elektrolytter som eliminerer behovet for organiske løsningsmidler.

Introduction

Bio-nano interaksjoner, ved grensesnittet mellom nanomaterialer (NM) overflater og biologiske matriser hvorfra biomolekyl adsorb til NM, er et intenst forskningsområde som underbygger nanosikkerhet og nanomedisin1. Dette laget av adsorbert biomolekyler gir en biologisk identitet til NMs, og cellene identifiserer dem dermed som "selv", og påvirker deretter cellulært opptak, distribusjon og biologiske endepunkter2,3,4. De aller fleste bio-nano studier har fokusert på proteinene i korona, og har vist at proteiner varierer kvantitativt og kvalitativt mellom NMs av forskjellige komposisjoner5. Denne variasjonen er avhengig av både egenskapene til NM som størrelse, funksjonalisering og materiale i tillegg til egenskapene til den biologiske matrisen, inkludert sammensetning og saltinnhold5. Et stigende interesseområde for bio-nano-grensesnittet er metabolittene som adsorberer til NMs6. Flere studier har vist at, som med proteinene, er NM-egenskaper en nøkkelfaktor for å bestemme sammensetningen av metabolittene i korona og at de kan påvirke biologiske utfall av NM-eksponering6,7,8.

I studier av biomolekylær korona er det fire forskjellige faser til karakterisering, koronadannelse, isolering av biomolekylene i korona, deres deteksjon via kvalitativ eller kvantitativ massespektrometri og identifikasjon9. Til dags dato har en rekke teknikker blitt vedtatt for å isolere protein korona inkludert koking i SDS-PAGE løpebuffer, løsningsmiddel og saltutvinning eller direkte fordøyelse av proteiner in situ på overflaten av NMs. Når det gjelder metabolittene i korona, er isolasjonen mer kompleks med ulike metoder ved hjelp av løsningsmidler eller til og med oppløsningen av NMs foreslått som løsninger8,10,11. Men i motsetning til protein korona en "one size fits all" tilnærming er usannsynlig å gjelde for isolering av metabolitter fra NMs, på grunn av det brede kjemiske rommet okkupert av metabolome og mangfoldet av mulige NMs. En alternativ tilnærming er å karakterisere den biologiske matrisen før og etter NM-eksponering med forskjellen i metabolittkonsentrasjoner tilskrevet adsorpsjon av metabolitter til NMs.12

Denne alternative tilnærmingen vil gjelde for alle biofluider og NMs, og selv om det krever dobbelt så mye analyse, tilbyr den følgelig et mye mer presist mål på metabolitt korona og har ingen risiko for lave metabolittutvinninger fra NM-overflaten som forveksles med lav binding av den spesifikke metabolitten.

Det andre trinnet i den biomolekylære koronaanalysen er påvisning av biomolekylene. Tradisjonelt for proteinene i korona har dette vært remit av nano-LC-MS, arbeidshesten av proteomikk; andre tilnærminger som NMR13, 1D og 2D SDS-PAGE er også brukt. Når det gjelder metabolitten corona LC-MS7, GC-MS8 og direkte infusjonsmassespektrometri har blitt brukt14. Imidlertid har en ny tilnærming nylig begynt å få trekkraft, nemlig kapillær elektroforese-massespektrometri (CE-MS)11,15 og har vært til stede i NM-laboratorier som en frittstående teknikk for å karakterisere ulike fysiske og kjemiske egenskaper til NMs16. CE-MS er en ortogonal separasjonsteknikk for nanoLC-MS og GC-MS og er i stand til å muliggjøre påvisning av svært polare og ladede metabolitter17,18. Videre er CE-MS godt egnet for analyse av proteiner og deres posttranslasjonelle modifikasjoner som fosforylering og glykosylering19,20,21,22. Det siste trinnet, identifisering og dataanalyse kan utføres på flere måter, avhengig av om en kvantitativ / kvalitativ eller målrettet / umålt tilnærming brukes, faller dette imidlertid utenfor denne protokollen.

CESI-MS, en kombinasjon av CE og et nanoESI-grensesnitt, er et nylig fremskritt innen CE-teknologi ved hjelp av et kappeløst grensesnitt. Dette muliggjør direkte tilkobling av ultra-lav strømning CE (<20 nL/min) til et høyoppløselig massespektrometer uten fortynning, noe som resulterer i betydelig forbedret deteksjonsfølsomhet23,24,25. CESI-MS gjør det mulig å analysere volumbegrensede prøver (< 10 μL) samtidig som en svært sensitiv analyse26opprettholdes. CESI-MS sammenligner også gunstig med tradisjonelle nanoLC-MS-tilnærminger med lav strømningshastighet som brukes i proteomikk og metabolomikk når det gjelder reproduserbarhet27,28, gjennomstrømning og overføring, noe som gjør det til et spennende prospekt for fullstendig biomolekylær koronakarakterisering.

For å synliggjøre potensialet til CESI-MS for analysene av bio-nano interaksjoner beskriver dette arbeidet prøveprepareringen som kreves for å isolere NM biomolekylær korona fra en enkelt human plasmaprøve på en slik måte at data maksimeres fra både protein- og metabolittaspektene ved den komplette biomolekylære NM-koronaen. Mens vi rapporterer om bruk av humant plasma, vil denne protokollen være like passende for andre biofluider som blodserum, komplett cellekulturmedium, cellelysat, cerebrospinalvæske eller urin. Analysene av disse to komponentene (proteiner og metabolitter) vil da bli beskrevet ved hjelp av nøytrale belagte CESI-kapillærer for protein korona og nakne silika kapillærer for både kationiske og anioniske metabolitter.

Protocol

Bruk av human biofluid ble godkjent i henhold til IRB-protokollretningslinjene fra Universitetet i Leiden og Innsbruck Medical University. Når menneske- eller dyrebiofluider undersøkes, kreves det etisk godkjenning fra forskningsinstitusjonen, og er innhentet ved resultatene vist i denne protokollen. Videre bør det også gjennomføres tilstrekkelig rapportering for å sikre åpenhet og gjenbruk av data i fremtidig arbeid9,29,30.

1. Fremstilling av bakgrunnselektrolytter (BGE)

MERK: Alle løsemidler skal tilberedes i en egnet avtrekkshette, og tilstrekkelig personlig verneutstyr må brukes til alle trinn (labcoat, hansker og vernebriller). I hvert trinn er det nødvendig med lavbindende plastflasker for å minimere analytttap og forurensning av prøve med salter utvasket fra glassvarer.

  1. Forbered 10% eddiksyre BGE (v / v), pH 2.2 på daglig basis for metabolomics.
    1. I en 10 ml volumetrisk kolbe tilsett 1 ml eddiksyre, etterfulgt av tilsetning av deionisert (DI) vann til den merkede linjen og grundig blanding.
  2. Forbered 100 mM eddiksyre, pH 2,9 på daglig basis for proteomikk.
    1. I en 10 ml volumetrisk kolbe tilsett 57 μL eddiksyre, etterfulgt av tilsetning av DI-vann til den merkede linjen og grundig blanding.

2. NM forberedelse

  1. Spre NMs kraftig i vann ved hjelp av publiserte retningslinjer31,32,33.
    MERK: I utviklingen av denne protokollen ble 7 NMs brukt som følger: henholdsvis 100 og 1000 nm karboksylert polystyren ble brukt til henholdsvis protein og metabolitt korona. 100 nm umodifiserte polystyren-NMs, 13 nm anatase TiO2 NMs som var umodifiserte eller belagt med enten polyakrylat- eller PVP-polymerer og 22 nm umodifiserte SiO2 NMs ble brukt til både protein- og metabolitt koronaer. Mens metoden ble utviklet og demonstrert ved hjelp av disse NMs, bør det bemerkes at denne tilnærmingen vil gjelde for et bredt spekter av NM-komposisjoner, størrelser, former og morfologier.
  2. Karakteriser partikkelstørrelse ved hjelp av enten dynamisk lysspredning34,35, enkel partikkel induktivt koblet plasmamassespektrometri36, nanopartikkelsporingsanalyse37, eller overføringselektronmikroskopi og overflateladning som zetapotensial ved hjelp av en zeta sizer34.

3. Biomolekylær koronadannelse

  1. Split 2 ml humant plasma (eller biofluid av valg) i 1 ml aliquots, en for metabolitt og protein korona og den andre for plasma metabolom karakterisering.
  2. Inkuber 1 mg/ml NMs i det humane plasmaet i 1 time ved 37 °C mens du forsiktig blander ved 500 o/min i en termomikser. Etter inkubasjon sentrifugering prøven på 4000 x g i 15 min ved 4 °C for å pellets NMs.
  3. Samle plasma supernatant for metabolitt korona analyse. Behold NM-protein corona-komplekset for protein korona-karakterisering.

4. Protein korona isolasjon

  1. Resuspend NM-proteinkomplekset (pellets) i 1 ml 10x PBS Buffer og virvel kraftig i 2 min for å fjerne ubundne proteiner. Sentrifuger PBS-oppløsningen ved 4000 x g i 15 minutter ved 4 °C for å pelletse NMs, og fjern forsiktig supernatanten uten å forstyrre pelletsen.
  2. Resuspend pellet i 1 ml ammonium bikarbonatbuffer (ABC) (100 mM, pH 8.0) og virvel kraftig i 2 min for å fjerne ubundne proteiner og uønskede salter. Sentrifuge ved 4000 x g i 15 min ved 4 °C for å pelletse NMs; fjern og kast supernatanten. Gjenta dette trinnet.
  3. Reduser proteindisulfidbindinger ved å oppløse NM-proteinpellet i 20 μL ABC-buffer (100 mM pH 8) som inneholder 10 mM dithiotheritol. Inkuber reduksjonsløsningen i 30 min ved 56 °C.
  4. For å fordøye proteiner, tilsett 2 μg sekvenseringsgrad Trypsin til 20 μL ABC som inneholder 0,1% overflateaktivt middel. Inkuber fordøyeløsningen i 16 timer ved 37 °C.
  5. Alkylat prøven ved tilsetning av 20 μL iodoacetamid ved 55 mM i 100 mM ABC og inkubere ved romtemperatur i 20 minutter.
  6. Tilsett 20 μL 0,1 M HCl for å holde overflateaktivt og la det stå i 10 minutter ved romtemperatur.
  7. Berike og desaltpeptider ved hjelp av en C18-pakket avsalting pipettespiss.
    1. Våt spissen med 80 μL 0,1% maursyre 50% acetonitril 5 ganger, rengjør med 80 μL 0,1% maursyre 5 ganger, trekk opp og eluter prøve 10 ganger, avsalt prøve ved å skylle 80 μL 0,1% maursyre 5 ganger og elute prøven 2 ganger med 80 μL 0,1% maursyre 70% acetonitril i en ren lav binding PCR tube.
  8. Lyofiliser prøvene og oppbevar ved -20 °C til analyse.

5. Metabolitt korona isolasjon

  1. Ta kontrollplasmaet og supernatanten fra NM plasmainkubasjon fra trinn 3.3 og hold på is under prøvepreparering.
  2. Ta 50 μL fra hver i separate hetteglass og fortynn 1 av 10 med DI-vann. Ta 50 μL av hver fortynnet prøve og flytt til nye hetteglass for trinn 5.3.
  3. Tilsett 200 μL kloroform, 250 μL metanol og 350 μL DI vann og kraftig virvelblanding i 2 min. Sentrifuge i 10 min ved 20 800 x g ved 4 °C.
  4. Ta 500 μL supernatant og filtrer gjennom et 3 kDa sentrifugalfilter i 2 timer ved 10 000 x g ved 4 °C. Ta 430 μL ultrafiltrat og tørk i en hastighetsvac. Prøver kan nå fryses før analyse.

6. Utarbeidelse av CESI-MS-system38

MERK: Før kapillærene monteres, må du kontrollere at innløps- og utløpsenden av kapillærene er intakte og at det ikke er synlige brudd i kapillæren.

  1. Installasjon av en nøytral belagt kapillær for protein korona analyse39.
    1. Plasser en ny nøytral belagt kapillær (90 cm lengde med 30 μm innvendig diameter) i CESI-instrumentet i henhold til produsentens retningslinjer.
  2. Utarbeidelse av CESI-kapillærer for proteomisk analyse.
    1. Skyll separasjonskapillæren i foroverretningen ved hjelp av 100 mM HCl i 5 min ved 100 psi og se etter dråpeformasjon ved utløpet av kapillæren. Skyll separasjonkapillæren med BGE ved 100 psi i 10 minutter og deretter DI-vann ved 100 psi i 30 minutter (dette er bare nødvendig for nye kapillærer).
    2. Skyll både separasjonkapillæren og den ledende kapillæren med BGE ved 90 psi i 5 minutter og sørg for at dråper dannes ved utløpsenden av begge kapillærene.
    3. Skyll separasjonkapillæren med DI-vann ved 90 psi i 10 minutter, deretter 50 psi i 10 min med 0,1 M HCl, etterfulgt igjen av 90 psi i 10 minutter med DI-vann og til slutt BGE ved 90 psi i 10 minutter. Koble CESI til MS ved hjelp av en nanospraykilde og -adapter som tidligere beskrevet38.
  3. Installasjon av bare smeltet silika kapillær for metabolitt korona karakterisering38.
    1. Plasser en ny, sammensmeltet silikakapillær (90 cm lengde med en innvendig diameter på 30 μm) i CESI-instrumentet i henhold til produsentens retningslinjer.
  4. Fremstilling av CESI kapillærer for metabolomics analyse.
    1. Skyll separasjonskapillæren i foroverretningen ved hjelp av 100% MeOH ved 50 psi i 15 minutter og se etter dråpedannelse ved utløpet av kapillæren. Skyll både separasjonskaken og den ledende kapillæren med BGE ved 90 psi i 5 minutter og sørg for at dråper dannes ved utløpet av begge kapillærene.
    2. Skyll separasjonkapillæren med DI-vann ved 90 psi i 10 minutter, deretter 50 psi i 10 min med 0,1 M NaOH, etterfulgt igjen av 90 psi i 10 minutter med DI-vann og til slutt BGE ved 90 psi i 10 minutter. Koble CESI til ESI-MS ved hjelp av en nanospraykilde og -adapter som beskrevet tidligere. 38

7. CE-MS for protein korona analyse

  1. Resuspendprøver fra trinn 4.8 i 20 μL av 50 mM ammoniumacetat pH 4.0.
  2. Utfør 5 psi 10 s hydrodynamisk injeksjon av prøven. Separat ved hjelp av en 30 kV separasjonsspenning med følgende trykkgradient: 0-10 min ved 1 psi, 10-35 min ved 1,5 psi og 35-45 min ved 5 psi ved bruk av 100 mM, pH 2,9 eddiksyre som BGE.
  3. Samle massespektra mellom 250-2000 m/z med topp-10 dataavhengig fragmenteringsinnhenting.
  4. Mellom prøver, skyll kapillær med 0,1 M HCl i 3 min ved 100 psi og 10 min 100 psi BGE for separasjon kapillær og i 3 min ved 100 psi for ledende flytende kapillær.

8. CESI-MS for metabolitt korona analyse

MERK: Alle prøver må analyseres to ganger, én gang i positiv modus for påvisning av kasjoner og én gang i negativ modus for påvisning av anioner. Kontrollplasmaprøvene må analyseres minst 5 ganger.

  1. Resuspend NM eksponerte og ueksponerte plasmaprøver fra trinn 5.4 i 430 μL DI-vann og kraftig virvel i 2 min. Filtrer gjennom et 0,1 μm membranfilter.
  2. Ta 95 μL filtrat og tilsett 5 μL interne standarder ved 200 μM for kationer (L-metioninsulfon) og 400 μM for anioner (2,2,4,4-D4-sitronsyre) og virvel kraftig. Sentrifuge ved 4000 x g ved 4 °C i 10 minutter før CESI-MS-analyse.
  3. Injiser prøven hydrodynamisk i 30 s (kasjoner) og 40 s (anioner) ved 2 psi.
  4. Separate metabolitter i 10% eddiksyre med en separasjonsspenning på 30 kV i fremover (kasjoner) og omvendt (anioner) modus. Omvendt separasjonsmodus er assistert med 0,5 psi fremovertrykk på separasjonkapillæren.
  5. Angi massespektrometer for å samle inn data i positiv (kasjoner) eller negativ modus (anioner) over masseområdet 65-1000 m/z. Mellom prøver, skyll kapillær med 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, DI vann og BGE ved 50 psi i 2 minutter.

Representative Results

Den beskrevne metoden er den første til å karakterisere både proteiner og metabolitter i NM biomolekylær korona ved hjelp av samme humane plasmaprøve. Denne metoden er i stand til å oppdage > 200 proteiner og >150 metabolitter, og dermed muliggjøre den mest omfattende oversikten over den komplette biomolekylære koronaen som skal bestemmes, noe som muliggjør økt forståelse av NMs cellulære vedlegg, opptak og påvirkninger.

Bruken av CESI-MS for både proteomikk (figur 1) og metabolomics (figur 2) separasjon og deteksjon viser gode separasjonsvinduer på begge kapillærene for hver tilnærming.

Denne metoden er i stand til å skille mellom proteinene i korona på tvers av et bredt spekter av NMs-komposisjoner, og dermed demonstrere metodenes anvendbarhet for NMs på tvers av et bredt spekter av fysiske og kjemiske egenskaper (tabell 1).

De unike fingeravtrykkene til metabolitt korona kan også skille seg ut ved hjelp av den metabolomiske grenen av denne metodikken (figur 3). Selv om denne tilnærmingen benytter en passiv tilnærming for å karakterisere NM metabolitt korona det er fortsatt i stand til å avdekke interessant innsikt i rollen som metabolitter i biomolekylære korona som differensial adsorpsjon av isomers (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: Eksemplarisk elektroferogram av en SiO2 protein korona separasjon ved hjelp av CESI-MS etter en on-partikkel fordøyelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eksempel på ekstraherte ionelektroferogrammer hentet fra endogene forbindelser i plasma av CE-MS. De nummererte forbindelsene er som følger: 1. Ornithine; 2. Lysin; 3. Arginin; 4. Histidin; 5. Kreatin; 6. Glycin; 7. Alanin; 8. Valine; 9. Isoleucin; 10. Leucine; 11. Serine; 12. Threonine; 13. Asparagine; 14. Metionin; 15. Glutamin; 16. Glutaminsyre; 17. Fenyl-D5-alanin; 18. Fenylalanin; 19. Tyrosin; 20. Proline; 21. Metioninsulfon (intern standard). Publisert under en Creative Commons CC BY-lisens med åpen tilgang og gjengitt fra Zhang et al17. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Analyse av protein korona på tvers av en rekke 6 NMs. Varmekart over proteinklasser identifisert på silika (SiO2), titania (TiO2), PVP-avkortet titania (TiO2-PVP), dispex capped titania (TiO2-Dispex), polystyren og karboksylerte polystyren NMs. Prosenter refererer til proteinenes overflod i forhold til totalt proteininnhold basert på topp 3 peptider overflod for hvert protein. Gitt forskjellene som observeres i de relative overflodene av proteiner i de forskjellige NM-koronaene, er det klart at denne foreslåtte protokollen er tilstrekkelig følsom for å skille mellom protein korona av forskjellige NMs. Figur gjengitt fra en CESI-MS-analyse av protein korona, publisert under en åpen Tilgang Creative Commons CC BY lisens11. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Figure 3
Figur 3: Målrettet analyse av kationiske metabolitter i NM-korona. Adsorpsjon av kationer til SiO2 og TiO2 NMs. Red refererer til den første konsentrasjonen av metabolitter, mens blå refererer til konsentrasjonen av metabolitter etter en 1 h inkubasjon med NMs ved 37 °C. Reduksjonen i metabolittkonsentrasjonen i oppløsningen er et resultat av metabolitt adsorpsjon til NM-overflaten. Ingen signifikant adsorpsjon av metabolitter ble observert for polystyren NMs. Box-plott representerer minimums- og maksimumsverdier, median- og interkvartile områder. Figur gjengitt fra en CESI-MS målrettet analyse av metabolitt korona publisert under en open access Creative Commons CC BY lisens15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Målrettet analyse av anioniske metabolitter i NM-korona med fokus på isomer adsorpsjon. Adsorpsjon av anioner til en rekke titania NMs viser klare forskjeller mellom ulike isomerer som sukkerfosfater. Rød refererer til den første konsentrasjonen av metabolitter, mens blå refererer til konsentrasjonen av metabolitter etter en 1 h inkubasjon med NM ved 37 °C. Reduksjonen i metabolittkonsentrasjon i oppløsning er et resultat av metabolitt adsorpsjon til NM overflaten. Ingen signifikant adsorpsjon av metabolitter ble observert for SiO2 og polystyren NMs. Box-plottene representerer minimums- og maksimumsverdier, median- og interkvartile områder. Figur gjengitt fra en CESI-MS målrettet analyse av metabolitt korona publisert under en åpen tilgang Creative Common CC BY lisens15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Analytt Gjennomsnittlig RSD-toppområde Gjennomsnittlig overføringstid for RSD
1928 peptider intradag (n=3) 15% 0.30%
27 kations intradag (n=16) 5.80% 2.20%
27 kation mellom dagen (n=36) 8.60% 1.80%

Tabell 2: Reproduserbarhet av CESI-MS tekniske replikerer for peptider og kationiske metabolitter. RSD: relativ standardavvik, som et mål på reproduserbarhet. Reproduserbarheten av CESI-MS når det gjelder toppområder og migrasjonstider er veldig bra, med alle analytter som har en gjennomsnittlig RSD-<15% og migrasjonstider <2,2%. Disse resultatene viser den høye graden av tillit som kan tilskrives dataene som samles inn ved hjelp av denne teknikken, og bekrefter at variasjoner som oppdages skyldes reelle forskjeller i prøvesammensetning (berikelse på NMs) i stedet for analytisk variasjon. Tabell 2 genereres fra resultater som ble presentert tidligere11,15.

Discussion

Dette er den første metoden som foreslås å karakterisere den komplette biomolekylære koronainkorporerende proteiner og metabolitter, fra samme prøve, ved hjelp av CESI-MS. Evnen til å karakterisere både proteiner og metabolitter fra samme prøve vil øke mengden data som samles inn fra en enkelt eksperimentell eksponering, noe som muliggjør ny innsikt i prosessen med koronadannelse og dens effekter for NMs toksisitet og effekt som nanomedisiner. Videre er CESI-MS en ideell plattform for å karakterisere begge klasser av biomolekyler med bare en endring av kapillær som kreves. Fremover vil nye metoder utviklet for ikke-vandig CE gjøre det mulig å utføre lipidomikk ved hjelp av CE-MS40, og det er nå mulig å analysere proteiner, metabolitter og lipider ved hjelp av en enkelt plattform. De nåværende konvensjonelle tilnærmingene ville kreve to dedikerte LC-MS-plattformer, en for protein korona og en for metabolitt korona. Dermed kan denne tilnærmingen samle dobbelt så mye data ved hjelp av en enkelt analytisk plattform.

Det er noen forbehold om denne tilnærmingen spesielt med metabolitt korona som denne protokollen foreslår en indirekte måling av korona. Som sådan kan det oppstå problemer når metabolittnivåene er til stede ved høye konsentrasjoner i forhold til NMs og den påfølgende nedgangen i metabolittkonsentrasjonen i matrisen er liten. Men i motsetning til protein korona, er det usannsynlig at en "one size fits all" tilnærming til å isolere metabolitt korona vil bli utviklet på grunn av at hvert NM har unike overflatekjemier. Fremover er det mer sannsynlig at NM-spesifikke tilnærminger for å isolere metabolitt korona vil bli utviklet og validert; Dette gjelder bare for det spesifikke NM. Til tross for dette vil CESI-MS fortsatt være en svært egnet plattform for karakterisering av de polarladede metabolittene uavhengig av hvordan de er isolert. Også bemerkelsesverdig er at hvis en pellet ikke dannes under sentrifugeringstrinnene designet for å pellets NMs, kan det være nødvendig med en høyere sentrifugalkraft; Dette vil mest sannsynlig skje med mindre tette NMs. Det er også kritisk at alle filtreringstrinn overholdes innenfor protokollen på grunn av den smale boringen av kapillærene, disse kan lett bli blokkert hvis noe svevestøv ikke er tilstrekkelig eliminert fra prøven.

Mens protein korona har vært et intenst forskningsområde i en årrekke, er evnen til å kombinere det med metabolitt korona et nytt interessefelt for forskere som undersøker bio-nano-grensesnittet6,14. Til dags dato har flertallet av disse studiene fokusert på den ikke-polare, lipidfraksjonen av metabolitten corona9,28. Denne nåværende metoden muliggjør karakterisering av de svært polare og ladede metabolittene i korona som inkluderer viktige metabolitter involvert i energimetabolisme, glykolyse og DNA-syntese. Som et resultat, når det kombineres med proteomics arbeidsflyten, er en mer helhetlig karakterisering av biomolekylær korona mulig. Dette muliggjør en mer dyptgående analyse av bio-nano interaksjoner fremover. Denne metoden muliggjør forbedret mekanistisk innsikt i reseptormediert endokytose via protein og metabolittinteraksjoner med membranreseptorer. Videre kan inter- og intra koronainteraksjoner mellom proteiner og små molekyler utforskes; for eksempel har det nylig vist seg at proteinene i korona spiller en nøkkelrolle i rekrutteringen av metabolitter15. Det er verdt å merke seg at de representative resultatene i figur 3 og figur 4 er absolutt kvantifisering av metabolitter, men en umålt tilnærming ved hjelp av multivariat dataanalyse for å sammenligne alle CE-MS-funksjoner i kontroller sammenlignet med eksponert plasma vil også belyse metabolittbinding. Dermed er det et betydelig rom for å undersøke hvordan, og hvilke, metabolitter og proteiner påvirker deres respektive rekruttering til NM koronaer. Disse tilleggsstudiene kan bidra til å designe koronaer for å optimalisere levering av nanomedisiner eller avdekke ytterligere hindringer for deres utvikling som undertrykkelse av farmasøytisk virkning på grunn av biomolekylær koronablokkering eller maskering av målrettingsfunksjoner.

CESI-MS med sine nanoskalastrømningshastigheter på rundt 20 nL / min og minimal bruk av organiske løsningsmidler gir en forbedring i grønn og økonomisk legitimasjon over henholdsvis standard LC-MS og nanoLC-MS når det gjelder bruk av løsningsmidler, de viktigste utfordringene for henholdsvis metabolomikk og proteomikkstudier. CESI-MS gir svært reproduserbare resultater for både migreringstid og toppområde som sammenligner seg gunstig med LC-MS-baserte metoder11,15. Sammenlignet med nanoLC-MS er overføring heller ikke et problem i CESI-MS. Derfor er det ikke nødvendig med omfattende systemopprydding mellom utvalgsanalyser, noe som i stor grad forbedrer prøvegjennomstrømningen11.

Oppsummert er den foreslåtte arbeidsflyten den første til å detaljere en tilnærming for å karakterisere både protein- og metabolittkomponentene i den komplette biomolekylære koronaen til NMs. Dette låser opp et nytt aspekt av bio-nano interaksjoner, metabolitt korona, og dermed muliggjør innsamling av dobbelt så mye data fra samme prøve, noe som muliggjør en mer fullstendig forståelse av interaksjoner ved bio-nano-grensesnittet.

Disclosures

J.A.T er ansatt i AB Sciex UK Ltd som deltar som bransjepartner på ACEnano-prosjektet, J.A.T og alle andre forfattere har ingen interessekonflikt i dette arbeidet.

Acknowledgments

A.J.C, J.A.T og I.L erkjenner finansiering fra EU-kommisjonen via Horisont 2020-prosjektet ACEnano (Grant No. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z anerkjenner ph.d.-midler fra China Scholarship Council (CSC, nr. 201507060011). R.R anerkjenner den økonomiske støtten til Vidi-tilskuddsordningen til Den nederlandske organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO Vidi 723.0160330).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithiothreitol Sigma 10197777001
2,2,4,4-D4-citric Simga 485438-1G Internal standard anion
Ammonium Acetate >98% Sigma A1542
Ammonium Bicarbonate >99.5% Sigma 09830
Capillary cartridge coolant Sciex 359976
CESI 8000 instrument Sciex A98089
CESI Cap Sciex B24699
CESI Vials Sciex B11648
Chloroform Sigma 650498 Toxic, use in a fume hood
Glacial Acetic acid Sigma A6283
Hydrochloric acid 1mol/L Sigma 43617
Iosoacetamide Sigma I1149
L-methionine sulfone Sigma M0876-1G Internal standard cation
Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve) Sigma 14262 Use in a fume hood
Microvials Sciex 144709
nanoVials Sciex 5043467
Neutral Surface Cartridge 30 µM ID x 90 cm total length Sciex B07368
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source Sciex B07363 B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers
OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 µm ID x 90 cm total length Sciex B07367
Phospahte buffered saline 10x Sigma P7059
Pierce C18 Tips, 100 µL bed Thermo Fisher Scientific 87784
Polystyrene 100 nm Polysciences Inc 876
Polystyrene carboxylated 100 nm Polysciences Inc 16688
Polystyrene carboxylated 1000 nm Polysciences Inc 08226
Rapigest SF (surfactant) Waters 186001860
Sequencing Grade modified Trypsin Promega V5111
SiO2 Ludox TM-40 Sigma 420786
Sodium Hydroxide solution Simga 72079
TiO2 Dispex coated Promethion particles Bespoke particles
TiO2 PVP coated Promethion particles Bespoke particles
TiO2 uncoated Promethion particles Bespoke particles

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ke, P. C., Lin, S., Parak, W. J., Davis, T. P., Caruso, F. A Decade of the Protein Corona. ACS Nano. 11 (12), 11773-11776 (2017).
  2. Sasidharan, A., Riviere, J. E., Monteiro-Riviere, N. A. Gold and silver nanoparticle interactions with human proteins: impact and implications in biocorona formation. Journal of Materials Chemistry B. 3 (10), 2075-2082 (2015).
  3. Albanese, A., et al. Secreted biomolecules alter the biological identity and cellular interactions of nanoparticles. ACS Nano. 8 (6), 5515-5526 (2014).
  4. Lynch, I., Dawson, K. A. Protein-nanoparticle interactions. Nano Today. 3 (1-2), 40-47 (2008).
  5. Tenzer, S., et al. Rapid formation of plasma protein corona critically affects nanoparticle pathophysiology. Nature Nanotechnology. 8 (10), 772-781 (2013).
  6. Chetwynd, A. J., Lynch, I. The rise of the nanomaterial metabolite corona, and emergence of the complete corona. Environmental Science: Nano. 7 (4), 1041-1060 (2020).
  7. Lee, J. Y., et al. Analysis of lipid adsorption on nanoparticles by nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 1-10 (2018).
  8. Pink, M., Verma, N., Kersch, C., Schmitz-Spanke, S. Identification and characterization of small organic compounds within the corona formed around engineered nanoparticles. Environmental Science: Nano. 5 (6), 1420-1427 (2018).
  9. Chetwynd, A. J., Wheeler, K. E., Lynch, I. Best practice in reporting corona studies: Minimum information about Nanomaterial Biocorona Experiments (MINBE). Nano Today. 28, 100758 (2019).
  10. Zhang, H., et al. Quantitative proteomics analysis of adsorbed plasma proteins classifies nanoparticles with different surface properties and size. Proteomics. 11 (23), 4569-4577 (2011).
  11. Faserl, K., Chetwynd, A. J., Lynch, I., Thorn, J. A., Lindner, H. H. Corona isolation method matters: Capillary electrophoresis mass spectrometry based comparison of protein corona compositions following on-particle versus in-solution or in-gel digestion. Nanomaterials. 9 (6), 898 (2019).
  12. Nasser, F., Lynch, I. Secreted protein eco-corona mediates uptake and impacts of polystyrene nanoparticles on Daphnia magna. Journal of Proteomics. 137, 45-51 (2016).
  13. Hellstrand, E., et al. Complete high-density lipoproteins in nanoparticle corona. FEBS Journal. 276 (12), 3372-3381 (2009).
  14. Grintzalis, K., Lawson, T. N., Nasser, F., Lynch, I., Viant, M. R. Metabolomic method to detect a metabolite corona on amino functionalised polystyrene nanoparticles. Nanotoxicology. , 1-12 (2019).
  15. Chetwynd, A. J., Zhang, W., Thorn, J. A., Lynch, I., Ramautar, R. The nanomaterial metabolite corona determined using a quantitative metabolomics approach: A pilot study. Small. , (2020).
  16. Chetwynd, A. J., Guggenheim, E. J., Briffa, S. M., Thorn, J. A., Lynch, I., Valsami-Jones, E. Current application of capillary electrophoresis in nanomaterial characterisation and its potential to characterise the protein and small molecule corona. Nanomaterials. 8 (2), 99 (2018).
  17. Zhang, W., et al. Assessing the suitability of capillary electrophoresis-mass spectrometry for biomarker discovery in plasma-based metabolomics. Electrophoresis. , 00126 (2019).
  18. Ramautar, R., Somsen, G. W., de Jong, G. J. CE-MS for metabolomics: Developments and applications in the period 2016-2018. Electrophoresis. 40 (1), 165-179 (2019).
  19. Sarg, B., Faserl, K., Lindner, H. H. Identification of novel site-specific alterations in the modification level of myelin basic protein isolated from mouse brain at different ages using capillary electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 17 (19), 1700269 (2017).
  20. Faserl, K., Sarg, B., Maurer, V., Lindner, H. H. Exploiting charge differences for the analysis of challenging post-translational modifications by capillary electrophoresis-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1498, 215-223 (2017).
  21. Zhang, Z., Qu, Y., Dovichi, N. J. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for bottom-up proteomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 108, 23-37 (2018).
  22. Shen, X., et al. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for top-down proteomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 120, 115644 (2019).
  23. Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (2), 885-892 (2012).
  24. Faserl, K., Kremser, L., Müller, M., Teis, D., Lindner, H. H. Quantitative proteomics using ultralow flow capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 87 (9), 4633-4640 (2015).
  25. Faserl, K., Sarg, B., Kremser, L., Lindner, H. Optimization and evaluation of a sheathless capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry platform for peptide analysis: comparison to liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (19), 7297-7305 (2011).
  26. Segers, K., et al. CE-MS metabolic profiling of volume-restricted plasma samples from an acute mouse model for epileptic seizures to discover potentially involved metabolomic features. Talanta. 217, 121107 (2020).
  27. Chetwynd, A. J., David, A. A review of nanoscale LC-ESI for metabolomics and its potential to enhance the metabolome coverage. Talanta. 182, 380-390 (2018).
  28. Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-Mass spectrometry at trial by metabo-ring: Effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
  29. Faria, M., et al. Minimum information reporting in bio-nano experimental literature. Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).
  30. Leong, H. S., et al. On the issue of transparency and reproducibility in nanomedicine. Nature Nanotechnology. 14 (7), 629-635 (2019).
  31. Kaur, I., et al. Dispersion of nanomaterials in aqueous media: Towards protocol optimization. Journal of Visualized Experiments. (130), e56074 (2017).
  32. Bihari, P., et al. Optimized dispersion of nanoparticles for biological in vitro and in vivo studies. Particle and Fibre Toxicology. 5 (1), 1-14 (2008).
  33. Taurozzi, J. S., Hackley, V. A., Wiesner, M. R. Ultrasonic dispersion of nanoparticles for environmental, health and safety assessment - and recommendations. Nanotoxicology. 5 (4), 711-729 (2011).
  34. Lu, P. J., et al. Methodology for sample preparation and size measurement of commercial ZnO nanoparticles. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 628-636 (2018).
  35. Langevin, D., et al. Inter-laboratory comparison of nanoparticle size measurements using dynamic light scattering and differential centrifugal sedimentation. NanoImpact. 10, 97-107 (2018).
  36. Lee, S., Bi, X., Reed, R. B., Ranville, J. F., Herckes, P., Westerhoff, P. Nanoparticle size detection limits by single particle ICP-MS for 40 elements. Environmental Science and Technology. 48 (17), 10291-10300 (2014).
  37. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).
  38. Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples. Journal of Visualized Experiments. , e54535 (2016).
  39. Faserl, K., Sarg, B., Lindner, H. H. Application of CE-MS for the analysis of histones and histone modifications. Methods. , (2020).
  40. Azab, S., Ly, R., Britz-Mckibbin, P. Robust method for high-throughput screening of fatty acids by multisegment injection-nonaqueous capillary electrophoresis-mass spectrometry with Sstringent quality control. Analytical Chemistry. 91 (3), 2329-2336 (2019).
  41. Zhang, X., Pandiakumar, A. K., Hamers, R. J., Murphy, C. J. Quantification of lipid corona formation on colloidal nanoparticles from lipid vesicles. Analytical Chemistry. 19 (24), 14387-14394 (2018).

Tags

Kjemi utgave 164 ervervet biomolekyl korona nanomateriale metabolomikk proteomikk CE-MS nanomedisin kapillær elektroforese CESI-MS
Kapillær elektroforese massespektrometri tilnærminger for karakterisering av protein og metabolitt korona ervervet av nanomaterialer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chetwynd, A. J., Zhang, W., Faserl,… More

Chetwynd, A. J., Zhang, W., Faserl, K., Thorn, J. A., Lynch, I., Ramautar, R., Lindner, H. H. Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials. J. Vis. Exp. (164), e61760, doi:10.3791/61760 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter