Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Isolamento e valutazione funzionale di cellule staminali di cancro al seno umano da campioni di cellule e tessuti

Published: October 2, 2020 doi: 10.3791/61775
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2,3,4
1London Regional Cancer Program, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Western University, 3Department of Oncology, Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

Questo protocollo sperimentale descrive l'isolamento dei BCSC da campioni di cellule e tessuti di cancro al seno, nonché i saggi in vitro e in vivo che possono essere utilizzati per valutare il fenotipo e la funzione del BCSC.

Abstract

Le cellule staminali del cancro al seno (BCSC) sono cellule tumorali con caratteristiche simili alle cellule staminali ereditarie o acquisite. Nonostante la loro bassa frequenza, sono i principali contributori all'inizio del cancro al seno, alla recidiva, alle metastasi e alla resistenza alla terapia. È imperativo comprendere la biologia delle cellule staminali del cancro al seno al fine di identificare nuovi bersagli terapeutici per il trattamento del cancro al seno. Le cellule staminali del cancro al seno sono isolate e caratterizzate sulla base dell'espressione di marcatori di superficie cellulare unici come CD44, CD24 e dell'attività enzimatica dell'aldeide deidrogenasi (ALDH). Queste celluleALDH ad altocontenuto di CD44+CD24- costituiscono la popolazione BCSC e possono essere isolate mediante selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) per studi funzionali a valle. A seconda della domanda scientifica, possono essere utilizzati diversi metodi in vitro e in vivo per valutare le caratteristiche funzionali dei BCSC. Qui, forniamo un protocollo sperimentale dettagliato per l'isolamento di BCSC umani sia da popolazioni eterogenee di cellule di cancro al seno che da tessuto tumorale primario ottenuto da pazienti con cancro al seno. Inoltre, evidenziamo saggi funzionali a valle in vitro e in vivo , tra cui saggi di formazione di colonie, saggi di mammosfera, modelli di coltura 3D e saggi di xenotrapianto tumorale che possono essere utilizzati per valutare la funzione BCSC.

Introduction

Comprendere i meccanismi cellulari e molecolari delle cellule staminali del cancro al seno umano (BCSC) è fondamentale per affrontare le sfide incontrate nel trattamento del cancro al seno. L'emergere del concetto BCSC risale all'inizio del 21° secolo, dove una piccola popolazione di cellule CD44 + CD24-/basso cancro al seno sono state trovate in grado di generare tumori eterogenei nei topi 1,2. Successivamente, è stato osservato che le cellule di cancro al seno umano con elevata attività enzimatica dell'aldeide deidrogenasi (ALDHalto) mostravano anche proprietà simili alle cellule staminali3. Questi BCSCs rappresentano una piccola popolazione di cellule capaci di auto-rinnovamento e differenziazione, contribuendo alla natura eterogenea dei tumori bulk 1,2,3. Prove crescenti suggeriscono che alterazioni nelle vie di segnalazione evolutivamente conservate guidano la sopravvivenza e il mantenimento del BCSC 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Inoltre, il microambiente estrinseco cellulare ha dimostrato di svolgere un ruolo fondamentale nel dettare diverse funzioni BCSC15,16,17. Queste vie molecolari e i fattori esterni che regolano la funzione del BCSC contribuiscono alla recidiva del cancro al seno, alle metastasi18 e allo sviluppo di resistenza alle terapie 19,20,21, con l'esistenza residua di BCSC post-trattamento che rappresenta una sfida importante per la sopravvivenza globale delle pazienti con carcinoma mammario22,23 . La valutazione pre-clinica di questi fattori è quindi molto importante per identificare le terapie mirate al BCSC che potrebbero essere utili per ottenere migliori risultati di trattamento e una migliore sopravvivenza globale nei pazienti con cancro al seno.

Diversi modelli in vitro di linee cellulari di carcinoma mammario umano e modelli di xenotrapianto umano in vivo sono stati utilizzati per caratterizzare BCSCs 24,25,26,27,28,29. La capacità delle linee cellulari di ripopolarsi continuamente dopo ogni passaggio successivo rende questi un sistema modello ideale per eseguire studi omici e farmacogenomici. Tuttavia, le linee cellulari spesso non riescono a ricapitolare l'eterogeneità osservata nei campioni di pazienti. Pertanto, è importante integrare i dati delle linee cellulari con campioni derivati dal paziente. L'isolamento dei BCSC nella loro forma più pura è importante per consentire una caratterizzazione dettagliata dei BCSC. Il raggiungimento di questa purezza dipende dalla selezione di marcatori fenotipici specifici per i BCSC. Attualmente, il fenotipo cellulareALDH ad altocontenuto di CD44 + CD24- è più comunemente usato per distinguere e isolare i BCSC umani da popolazioni di cellule di cancro al seno di massa utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) per la massima purezza1, 3,26. Inoltre, le proprietà di BCSC isolati come l'auto-rinnovamento, la proliferazione e la differenziazione possono essere valutate utilizzando tecniche in vitro e in vivo.

Ad esempio, i saggi in vitro per la formazione di colonie possono essere utilizzati per valutare la capacità di una singola cellula di auto-rinnovarsi per formare una colonia di 50 cellule o più in presenza di diverse condizioni di trattamento30. I saggi della mammosfera possono anche essere utilizzati per valutare il potenziale di auto-rinnovamento delle cellule del cancro al seno in condizioni indipendenti dall'ancoraggio. Questo test misura la capacità delle singole cellule di generare e crescere come sfere (miscela di BCSC e non BCSC) ad ogni passaggio successivo in condizioni di coltura non aderenti prive di siero31. Inoltre, i modelli di coltura tridimensionale (3D) possono essere utilizzati per valutare la funzione BCSC, comprese le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice che ricapitolano da vicino il microambiente in vivo e consentono di studiare l'attività di potenziali terapie mirate al BCSC32. Nonostante le diverse applicazioni dei modelli in vitro, è difficile modellare la complessità delle condizioni in vivo utilizzando solo saggi in vitro. Questa sfida può essere superata utilizzando modelli di xenotrapianto murino per valutare il comportamento BCSC in vivo. In particolare, tali modelli servono come sistema ideale per valutare le metastasi del cancro al seno 33, studiare le interazioni con il microambiente durante la progressione della malattia 34, l'imaging in vivo 35 e per prevedere la tossicità e l'efficacia specifiche del paziente degli agenti antitumorali 34.

Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata per l'isolamento di BCSC umani ALDHad altocontenuto di CD44+CD24- alla massima purezza da popolazioni massicce di cellule eterogenee di carcinoma mammario. Forniamo anche una descrizione dettagliata di tre tecniche in vitro (saggio di formazione di colonie, saggio della mammosfera e modello di coltura 3D) e un saggio di xenotrapianto tumorale in vivo che può essere utilizzato per valutare diverse funzioni dei BCSC. Questi metodi sarebbero appropriati per l'uso da parte di ricercatori interessati a isolare e caratterizzare i BCSC da linee cellulari di carcinoma mammario umano o cellule di cancro al seno derivate da pazienti primari e tessuto tumorale ai fini della comprensione della biologia BCSC e / o dello studio di nuove terapie mirate al BCSC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

La raccolta di campioni chirurgici o bioptici derivati dai pazienti direttamente da pazienti con carcinoma mammario consenzienti è stata effettuata secondo il protocollo di etica umana approvato approvato dal comitato etico istituzionale. Tutti i topi utilizzati per generare modelli di xenotrapianto derivati dal paziente sono stati mantenuti e ospitati in una struttura per animali approvata dall'istituzione. Il tessuto tumorale da modelli di xenotrapianto derivati dal paziente utilizzando topi è stato generato secondo il protocollo etico approvato approvato dal comitato istituzionale per la cura degli animali.

1. Preparazione di linee cellulari

  1. Eseguire tutte le procedure di coltura cellulare e colorazione in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza. Utilizzare piatti/palloni e reagenti per colture cellulari sterili.
  2. Mantenere le cellule di cancro al seno umano a 37 °C con il 5% di CO2 in terreni definiti integrati con siero fetale bovino (FBS) e fattori di crescita necessari specifici per ciascuna linea cellulare.
  3. Mantenere colture cellulari di fibroblasti NIH3T3 di topo (per l'uso in saggi di formazione di colonie) a 37 °C con il 5% di CO2 nel Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di FBS.
  4. Per tutte le culture, ricostituire i vecchi media ogni 2-3 giorni con nuovi media. Una volta che le colture raggiungono il 75-80% di confluenza, subcoltura in più palloni di coltura cellulare sterile.

2. Preparazione del tessuto tumorale del cancro al seno

  1. Raccogliere i campioni chirurgici o bioptici derivati dal paziente direttamente da pazienti con cancro al seno consenzienti in base a un protocollo di etica umana approvato dal comitato etico istituzionale.
  2. Successivamente, raccogliere e generare tessuto tumorale da modelli di xenotrapianto derivati dal paziente utilizzando topi secondo un protocollo di etica animale approvato dal comitato istituzionale per la cura degli animali.
  3. Raccogliere tutti i tessuti tumorali in condizioni sterili in un tubo conico sterile da 50 mL contenente 30 mL di DMEM:F12 media, conservare sul ghiaccio ed elaborare i campioni come descritto di seguito entro 2 ore dalla raccolta.

3. Generazione di sospensioni monocellulari di cellule di cancro al seno

  1. Aspirare il mezzo dal pallone contenente un monostrato di cellule di cancro al seno che è confluente al 60-80% (linee cellulari di scelta). Lavare le cellule con 1x tampone fosfato salino (PBS). Aspirare il PBS e aggiungere la soluzione appropriata di dissociazione cellulare (ad es. Tripsina:EDTA; quanto basta per coprire il monostrato di cellule) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (consigliato) o a 37 °C.
  2. Aggiungere 5 ml di terreno di coltura per neutralizzare l'attività della soluzione di dissociazione cellulare.
  3. Trasferire la soluzione cellulare dissociata risultante in un tubo conico da 50 mL e centrifugare a 1000 x g per 5 minuti.
  4. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di 1x PBS. Contare le cellule usando un emocitometro e un microscopio.
    NOTA: Osservare l'aggregazione cellulare nell'emocitometro. Ripetere la fase di dissociazione cellulare se non si è formata una sospensione a cellula singola.
  5. Dopo il conteggio delle cellule, centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 1000 x g per 5 minuti, eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare nel tampone del substrato ALDH ad una concentrazione di 1 x 106 cellule/ml.

4. Generazione di sospensione monocellulare da campioni di tessuto

  1. Tritare il tessuto tumorale con lame chirurgiche utilizzando una tecnica incrociata per ottenere pezzi più piccoli di circa 1 mm di dimensione. Trasferire i pezzi di tessuto in un tubo conico fresco da 50 mL contenente 10 mL di tampone di dissociazione (1X collagenasi in DMEM:F12). Sigillare il tubo conico con parafilm e incubare a 37 °C in un incubatore agitatore per 40 minuti.
    NOTA: Se non è presente un incubatore agitatore, posizionare il tubo a bagnomaria a 37 °C e mescolare il tubo a vortice ogni 5-10 minuti.
  2. Pellettare il tessuto digerito centrifugando il campione a 530 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante e aggiungere 5 ml di tripsina. Pipettare su e giù utilizzando una pipetta da 1 mL (impostata su 750 μL) per interrompere il pellet e incubare in bagnomaria a 37 °C per 5 minuti. Dopo l'incubazione, pipettare su e giù vigorosamente per rilasciare singole cellule.
  3. Riempire il volume totale nel tubo a 25 ml con il fluido DMEM:F12 e centrifugare a 1000 x g per 5 minuti. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di soluzione di dispasi-DNasi. Incubare a bagnomaria a 37 °C per 5 min.
  4. Riempire il volume totale nel tubo a 10 ml con PBS. Miscelare pipettando su e giù, far passare la sospensione cellulare risultante attraverso un filtro cellulare da 40 μm collegato a un tubo conico fresco da 50 ml. Centrifugare a 1000 x g per 5 min.
  5. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di 1x PBS. Contare le cellule e completare la preparazione della sospensione cellulare come descritto nei punti 3.4 e 3.5.

5. Isolamento delle cellule staminali del cancro al seno (BCSC)

  1. Tubi di flusso dell'etichetta per il controllo non colorato, controlli di colorazione a cella singola (controllo DEAB, ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7, 7AAD), il tubo di controllo negativo (colorato con DEAB, CD44-PE, CD24-PE-Cy7 e 7AAD), il controllo fluorescente meno uno (FMO) e il tubo "sort" (colorato con ALDH, CD44, CD24 e 7AAD).
  2. Trasferire 500 μL (0,5 x 106 cellule) delle sospensioni cellulari dal passo 3.5 o dal punto 4.5 a ciascuna provetta che è solo cellule marcate, CD44, CD24 e 7AAD. Posizionare i tubi sul ghiaccio fino all'uso.
  3. Trasferire 2 ml di campione (2 x 106 celle) nella rispettiva provetta 'ALDH'. Aggiungere 5 μL di DEAB ai tubi "DEAB control" e "negative control" e tappare ermeticamente. Aggiungere 10 μL di substrato ALDH al tubo "ALDH", mescolare bene mediante vortice e trasferire immediatamente 500 μL nel corrispondente tubo "controllo DEAB" e "controllo negativo". Ricapitolare i "tubi DEAB", "controllo negativo" e "ALDH" e incubare a 37 °C per 30-60 minuti (non superare i 60 minuti).
    NOTA: Il tempo di incubazione ottimale può richiedere un'ottimizzazione a seconda della linea cellulare. Proteggere sempre il substrato ALDH e i tubi contenenti cellule colorate dalla luce.
  4. Dopo l'incubazione, centrifugare tutti i campioni per 5 minuti a 250 x g. Risospendere le cellule in 500 μL di tampone substrato ALDH. Aggiungere la concentrazione raccomandata dal produttore o ottimizzata dall'utente di cocktail di anticorpi anti-CD44-PE e anti-CD24-PE-Cy7 e incubare a 4 °C per 30 minuti. Aggiungere anticorpi anti-CD44-PE e anti-CD24-PE-Cy7 alle rispettive provette marcate con 'CD44' e 'CD24'.
  5. Dopo l'incubazione, centrifugare tutti i campioni a 250 x g per 5 minuti. Risospendere le cellule in 500 μL di tampone substrato ALDH. Incubare il tubo di 'controllo negativo', il 'tubo di smistamento' e il tubo '7ADD' con 7AAD (concentrazione suggerita: 0,25 μg/1 x 106 cellule) per 10 minuti su ghiaccio.
    NOTA: L'attività di ALDH viene rilevata nel canale fluorescente verde, pertanto è necessario utilizzare un fluorocromo con un diverso spettro di emissione compatibile. Laddove si osservi sovrapposizione spettrale durante la citometria a flusso multiparametrica, i controlli a singolo colore e il controllo FMO dovrebbero essere utilizzati come guida per consentire la compensazione tra fluorocromi per ridurre al minimo la fuoriuscita del segnale fluorescente in altri canali.
  6. Impostare il protocollo di analisi sullo strumento FACS in preparazione per l'analisi del campione. Creare grafici a dispersione (forward vs side scatter, forward scatter vs canali fluorescenti).
  7. Utilizzando il controllo non colorato, regolare il fotomoltiplicatore per separare i detriti dall'intera popolazione cellulare e regolare la tensione fluorescente per spostare l'intera popolazione cellulare attorno alla prima scala logaritmica (101). Utilizzando il controllo DEAB, spostare l'intera popolazione cellulare all'interno della seconda scala logaritmica (102) regolando il canale di tensione fluorescente verde.
  8. Analizzare prima tutti i singoli controlli di colorazione (ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7) e il controllo 7AAD e FMO, regolando la tensione per separare le celle colorate da quelle non colorate e per ridurre al minimo la fuoriuscita di segnali fluorescenti in altri canali.
  9. Gate sulla popolazione positiva per ogni singolo campione di cellula colorata. Utilizzando il tubo di controllo negativo, il gate per la vitalità (7AAD negativo), le popolazioni di cellule ALDHbasse eALDH alte (strategia di gating rappresentativa mostrata in Figura 1B).
  10. Analizzare campioni colorati multiparametrici di interesse per isolare i BCSC. Utilizzando le porte ALDHbasse ealte ALDH, selezionare rispettivamente la popolazione cellulare CD44+CD24- (BCSC) e CD44-CD24+ (non-BCSC) (Figura 1B).
  11. Raccogliere BCSC vitali e non BCSC in terreni di raccolta in provette di raccolta sterili (popolazioni da due linee cellulari rappresentative mostrate in Figura 2A & B). Utilizzare cellule selezionate per i saggi a valle in vitro e in vivo come descritto di seguito.
    NOTA: Oltre ai saggi in vitro e in vivo descritti di seguito, i BCSC possono essere convalidati misurando l'espressione di marcatori pluripotenti come SOX2, OCT4 e NANOG tramite tecniche standard di immunoblotting.

Figure 1
Figura 1: Strategia di gating FACS per l'isolamento di BCSC da linee cellulari di cancro al seno e campioni di tessuto. (A) Diagramma di flusso che descrive la procedura di isolamento BCSC. (B) Grafici FACS rappresentativi che mostrano la strategia di ordinamento utilizzata per isolare BCSC vitali e non BCSC da un pool eterogeneo di celle. Le cellule di carcinoma mammario umano MDA-MB-231 sono marcate contemporaneamente con 7-AAD, CD44-APC, CD24-PE e il substrato ALDH. I sottoinsiemi di celle sono stati isolati utilizzando un protocollo a quattro colori su una macchina FACS. Le celle vengono selezionate in base alla dispersione della luce prevista, quindi per i singoletti e la vitalità basata sull'esclusione 7-AAD. Le cellule vengono quindi analizzate per l'attività di ALDH e il 20% più positivo viene selezionato come popolazione ALDHalta, mentre il 20% inferiore delle cellule con la più bassa attività ALDH sono stati consideratiALDH bassi. Infine, il 50% delle cellulebasse di ALDH sono ulteriormente selezionate sulla base di un fenotipo CD44basso / -CD24 + e il 50% delle cellulealte di ALDH sono selezionate in base al fenotipo CD44 + CD24-. Questa cifra è stata adattata da Chu et al.17. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Le proporzioni di BCSCs sono variabili in diverse linee cellulari di cancro al seno. Immagine rappresentativa che mostra la proporzione differenziale di BCSC e non BCSC in (A) SUM159 e (B) MDA-MD-468 linee cellulari di carcinoma mammario triplo negativo dopo l'etichettatura e la selezione come descritto nella Figura 1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

6. Saggio di formazione delle colonie

  1. Risospendere le celle di interesse (celle ordinate dal passaggio 5.11 o celle non ordinate dai passaggi 3.5 o 4.5) in supporti completi.
  2. Etichettare tre tubi di flusso per 1 x 10 2, 2 x 10 2 e 5 x 102 celle. Aggiungere 2 mL di terreno completo e trasferire il numero di cella appropriato (ordinato dal punto 5.11 o le celle non ordinate dai punti 3.5 o 4.5) nelle rispettive provette. Mescolare accuratamente le soluzioni cellulari pipettandolo su e giù 5 volte.
  3. Placcare le celle in una piastra a 6 pozzetti e distribuire la sospensione cellulare ruotando delicatamente le piastre per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule.
  4. Incubare le piastre in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 fino alla comparsa di colonie (dove colonie = ≥50 cellule per colonia). Rifornire accuratamente i media due volte alla settimana senza disturbare la formazione di colonie.
  5. Aspirare il fluido e lavare una volta con 1 mL di PBS. Aggiungere 0,5 ml di soluzione viola cristallina allo 0,05% in ciascun pozzetto e incubare la piastra per 30 minuti. Rimuovere la macchia viola cristallina in eccesso lavando con 2 ml di acqua. Ripetere la fase di lavaggio fino a quando la colorazione di fondo non è stata rimossa.
  6. Utilizzando un microscopio con ingrandimento 4x e 10x, contare e registrare il numero totale di colonie generate (immagini rappresentative mostrate in Figura 3A).
  7. Calcolare la frequenza di formazione delle colonie come segue: Frequenza (%) = (# di colonie formate/numero di cellule seminate) x 100. Ad esempio, se 25 colonie sono generate da 1 x 102 cellule, allora la frequenza di formazione della colonia è, Frequenza = (25/100) x100 = 25%.
  8. In alternativa, sostituire i punti da 6.1 a 6.4 con un metodo alternativo che coinvolge la co-coltura con fibroblasti, che forniscono un supporto microambientale per i BCSC attraverso la produzione dei fattori di crescita e sopravvivenza necessari.
  9. Piatti di coltura a cellule pre-strato da 60 mm con collagene bovino di tipo I (diluizione 1 su 30 di collagene 3 mg/ml). Lasciare polimerizzare il collagene per 30 minuti in un incubatore a 37 °C. Aspirare il collagene non polimerizzato e lavare la piastra due volte con 1x PBS. Coprire la piastra rivestita di collagene con 1 mL di PBS e metterla da parte a temperatura ambiente fino all'uso.
  10. Etichettare tre tubi di flusso per 1 x 10 3, 5 x 103 e 1 x 104 celle. Aggiungere 4 ml di terreno di saggio formante colonie e trasferire il numero appropriato di cellule (ordinate dal punto 5.11 o cellule non selezionate dai punti 3.5 o 4.5) nelle rispettive provette. Aggiungere fibroblasti NIH3T3 di topo irradiati (4 x 104 cellule/ml di mezzi). Mescolare accuratamente le soluzioni cellulari pipettandolo su e giù 5 volte.
  11. Aspirare il PBS dal piatto di coltura rivestito di collagene dal punto 6.1 e placcare la miscela cellulare su ciascuna delle piastre di coltura cellulare come descritto al punto 6.3.
  12. Incubare le piastre in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 e lasciarle indisturbate per 7-10 giorni o fino alla formazione di colonie, senza reintegrare il substrato. Contare e registrare il numero totale di colonie generate come descritto nei passaggi 6.6 e 6.7.

7. Saggio della mammosfera

  1. Risospendere le cellule di interesse (cellule ordinate dal punto 5.11 o cellule non ordinate dai punti 3.5 o 4.5) in mezzi di mammosfera completi e celle a piastre con una densità di semina di 5 x 102 cellule / cm2 area in una piastra di coltura cellulare a bassissimo attacco da 96 pozzetti.
    NOTA: la densità di semina delle celle deve essere ottimizzata per diverse linee cellulari.
  2. Incubare le piastre di coltura per 5-10 giorni in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2. Rifornire accuratamente i mezzi due volte alla settimana senza disturbare la formazione della mammosfera.
  3. Dopo l'incubazione, contare il numero di mammosfere generate in ciascun pozzetto utilizzando un microscopio; dove le mammosfere sono definite come cluster di cellule di cancro al seno di diametro superiore a 100 μm (immagini rappresentative mostrate nella Figura 3B).
  4. Calcolare l'efficienza di formazione della mammosfera (MFE) come segue: MFE (%) = (numero di mammosfere per pozzetto) / (numero di cellule seminate per pozzetto) x 100 (cioè, se 5 mammosfere sono generate da 1 x 102 cellule in un pozzo, allora MFE = (5/100) x 100 = 5%).
  5. Per le mammosfere di sottocoltura, trasferire con cura i terreni contenenti il contenuto di mammosfere in un tubo conico fresco da 50 ml e centrifugare il mezzo a 1000 x g per 5 minuti. Rimuovere con cautela il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 500 μL di tripsina e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  6. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di mezzo completo per la mammosfera. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e ri-placcare le cellule in una piastra di coltura cellulare a attacco ultra-basso come descritto al punto 7.1.
    NOTA: Oltre alla sub-coltura, le cellule derivate dalla mammosfera possono anche essere ulteriormente analizzate da FACS per valutare il fenotipo BCSC e / o ottenere popolazioni pure di BCSC per altri saggi a valle.
  7. Per determinare il numero di cellule che iniziano la mammosfera contenute all'interno delle popolazioni cellulari, utilizzare un metodo alternativo che coinvolge l'analisi della diluizione che limita la sfera (SLDA). Celle a piastre in diluizioni seriali di numero di cellule da alto a basso in una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti a bassissimo attacco, con la più alta diluizione risultante in meno di una cella per pozzetto.
  8. Incubare la piastra di coltura per 10-14 giorni in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 e lasciarli indisturbati per evitare l'aggregazione cellulare.
  9. Dopo l'incubazione, contare il numero di mammosfere generate in ciascun pozzetto utilizzando un microscopio; dove le mammosfere sono definite come cluster di cellule di cancro al seno di diametro superiore a 100 μm. Calcola la frequenza e la significatività iniziali della sfera utilizzando il software online (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/) ELDA (Extreme Limiting Diluition Analysis).

8.3D modello culturale

  1. A seconda della domanda sperimentale, utilizzare l'estratto di membrana basale (BME) con o senza fattori di crescita (ridotto). Al fine di valutare l'effetto del fattore di crescita individuale sulle cellule tumorali, utilizzare il fattore di crescita BME ridotto. Aiuta anche a minimizzare gli effetti non specifici dei fattori di crescita endogeni presenti nel BME.
    NOTA: BME solidifica sopra i 10 °C. Mantenere sempre il BME sul ghiaccio anche durante la fase di scongelamento.
  2. Aggiungere con cautela 50 μL di BME per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti senza creare bolle d'aria e lasciare polimerizzare a 37 °C per 1 ora. Dopo 10 minuti di incubazione, aggiungere 100 μL di PBS per evitare l'essiccazione dello strato di gel.
  3. Risospendere le cellule selezionate dal punto 5.11 o le cellule non ordinate dai passaggi 3.5 o 4.5 a una concentrazione di 5 x 10da 3 a 5 x 104/200 μL in terreni di coltura 3D.
  4. Una volta che il BME si è polimerizzato, rimuovere il PBS, aggiungere 200 μL di sospensione cellulare a ciascun pozzetto e incubare in incubatore a 37 °C con CO2 al 5%. Aggiungere PBS ai pozzetti circostanti per evitare l'evaporazione del fluido.
    NOTA: Il numero ottimale di celle per la placcatura deve essere determinato prima dell'impostazione dell'esperimento. A seconda della domanda sperimentale, i BCSC possono essere coltivati da soli o con altri tipi di cellule (fibroblasti / cellule endoteliali / immunitarie ecc.).
  5. Aggiungi nuovi terreni ai piatti di coltura due volte alla settimana. Mantenere le colture per 10-14 giorni prima di analizzare la formazione di organoidi (immagini rappresentative mostrate in Figura 3C).
  6. Per la subcoltura, aspirare con cura il mezzo e aggiungere 200 μL di dispase a ciascun pozzetto contenente cellule. Incubare la piastra in un'incubatrice a 37 °C per 1 ora. A metà del periodo di incubazione (30 min), estrarre la piastra, pipettare delicatamente la soluzione di dispase su e giù 5 volte e riporre nell'incubatore per altri 30 minuti.
  7. Dopo 1 ora, trasferire la soluzione cellulare dissociata in un tubo di flusso. Lavare il pozzetto con 1x PBS contenente il 2% di FBS (fPBS) e trasferirlo nel tubo di flusso. Centrifugare il tubo a 1000 x g per 5 min. Aspirare con cautela il surnatante e aggiungere 500 μL di tripsina, incubare a 37 °C per 5 minuti. Inattivare la tripsina aggiungendo la stessa quantità di fPBS e centrifugare a 1000 x g per 5 minuti.
  8. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di terreno di coltura 3D. Contare le celle e ri-placcare il numero richiesto di celle nel BME come nei passaggi da 8.2 a 8.4.
    NOTA: è possibile raggruppare più pozzetti per analizzare ulteriormente o ordinare la popolazione cellulare di interesse.

Figure 3
Figura 3: Saggi in vitro per valutare la funzione delle cellule BCSC. I saggi in vitro sono stati eseguiti come descritto nelle sezioni di protocollo da 6.1 a 6.5 (A), da 7.1 a 7.4 (B) o 81. a 8,4 + 8,6 (C). (A) Immagine rappresentativa che mostra le colonie generate dalle cellule di cancro al seno umano MDA-MB-231; (B) Immagini rappresentative che mostrano la formazione di mammosfera da parte di linee cellulari umane MCF7, SUM159 o MDA-MB-468 e cellule di cancro al seno LRCP17 derivate dal paziente. (C) Immagini rappresentative che mostrano le strutture 3D formate da cellule di cancro al seno MCF7 e MDA-MB-231 in modelli di colture 3D. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

NOTA: Eseguire esperimenti sugli animali secondo un protocollo di etica animale approvato dal comitato istituzionale per la cura degli animali.

9. Modello di xenotrapianto in vivo

  1. Al fine di determinare la capacità di inizio del tumore delle cellule staminali del cancro al seno, preparare le cellule (popolazione ordinata dalla fase 5.7 o popolazioni non ordinate dalle fasi 3.5 o 4.5) utilizzando un approccio di diluizione limitante. Diluire serialmente le cellule in PBS utilizzando da 1 a 5 diversi gruppi di diluizione, con dosi a partire da 0,01-0,2 x 102 cellule/100 μL e fino a 1 x 106 cellule/100 μL.
    NOTA: le celle di popolazione non ordinate/intere possono essere utilizzate come controllo. Il numero di gruppi di diluizione utilizzati dipenderà dal risultato scientifico desiderato (ad esempio, se si verifica solo la tumorogenicità, può essere utilizzato 1 gruppo con un numero di cellule più elevato, mentre quando si calcola la capacità di iniziare il tumore, è ottimale testare 5 dosi di diluizione limitanti).
  2. Per generare modelli di xenotrapianto da cellule di cancro al seno umano, utilizzare topi femmina immunocompromessi (nudo atimico [nu/nu], ceppi immunodeficienti combinati non obesi/immunodeficienti gravi [NOD/SCID] o NOD/SCID IL2γ [NGS]).
    NOTA: Sebbene sia possibile utilizzare un minimo di 4 animali per gruppo, si raccomandano 8-12 animali per gruppo per ottenere risultati robusti, in particolare per limitare l'analisi di diluizione.
  3. Eseguire iniezioni standard di grasso mammario (MFP) utilizzando 100 μL/topo di ogni preparato cellulare, in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza.
    NOTA: Per una crescita ottimale del tumore al seno e metastasi spontanee agli organi distanti, si raccomanda la MFP toracica. In alternativa, può essere utilizzata anche la MFP inguinale.
  4. Dopo l'iniezione, monitorare i topi su base giornaliera per la salute generale e la crescita del tumore nel sito di iniezione. Al rilevamento di un tumore palpabile, iniziare a misurare le dimensioni del tumore con calibri in due dimensioni perpendicolari e registrare settimanalmente fino all'endpoint.
    NOTA: L'endpoint sperimentale è determinato in base alle normative stabilite dal protocollo istituzionale di etica animale; Tipicamente, l'endpoint per eutanasia è di solito richiesto una volta che i volumi tumorali raggiungono 1500 mm3. Per le popolazioni BCSC e/o dosi cellulari più elevate (ad es. >1 x 104 cellule), questo endpoint sarà probabilmente raggiunto entro 4-8 settimane dall'iniezione di MFP. Per dosi cellulari molto basse e/o popolazioni di cellule non BCSC, la crescita tumorale dovrebbe progredire fino a 8 mesi dopo l'iniezione.
  5. Da queste misurazioni, calcolare il volume del tumore utilizzando la seguente formula: Volume in mm3 = 0,52 x (larghezza)2 x lunghezza. Se si utilizza un approccio di diluizione limitante, calcolare la capacità e la significatività di avvio del tumore utilizzando il software online ELDA (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).
  6. In alternativa, per estendere umanamente l'endpoint, rimuovere chirurgicamente i tumori primari e continuare a monitorare i topi per la salute e / o lo sviluppo di metastasi spontanee in organi distanti. Utilizzare tessuto tumorale resecato per la generazione di xenotrapianti seriali.
  7. All'endpoint, prelevare tessuto da tumori primari e organi distanti (linfonodi, polmone, fegato, cervello, ossa) ed effettuare analisi istopatologiche e/o immunoistochimiche o dissociare il tessuto tumorale e utilizzarlo nei saggi in vitro descritti nei paragrafi 6-8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Il protocollo descritto consente l'isolamento di BCSC umani da una popolazione eterogenea di cellule di cancro al seno, sia da linee cellulari che da tessuto tumorale dissociato. Per ogni data linea cellulare o campione di tessuto, è fondamentale generare una sospensione monocellulare uniforme per isolare i BCSC alla massima purezza poiché la contaminazione delle popolazioni non-BCSC potrebbe comportare risposte cellulari variabili, specialmente se lo scopo dello studio è valutare l'efficacia degli agenti terapeutici mirati ai BCSC. L'applicazione di una rigorosa strategia di selezione ridurrà al minimo la presenza di non-BCSC contaminanti e si tradurrà nella capacità di raccogliere la proporzione di cellule di cancro al seno con caratteristiche simili alle cellule staminali che mostrano un fenotipo cellulare che le distingue dalla popolazione di massa di cellule tumorali. Le cellule di carcinoma mammario umano che mostrano una maggiore attività enzimatica di ALDH, esprimono alti livelli del marcatore di superficie cellulare CD44 e un'espressione bassa/negativa di CD24 hanno un fenotipo ALDHaltoCD44 + CD24- e possono essere classificate come BCSC. La proporzione di BCSC all'interno della popolazione di massa può variare tra linee cellulari o pazienti (Figura 2) e spesso dipende dallo stadio della malattia, con un carcinoma mammario più aggressivo che di solito mostra una percentuale maggiore di BCSC26,36,37.

I BCSC isolati possono essere utilizzati per eseguire diversi test in vitro e in vivo in cui il loro comportamento e la loro funzione possono essere confrontati con quelli delle popolazioni bulk e/o non BCSC. Ad esempio, la capacità di una singola cellula di cancro al seno di auto-rinnovarsi e generare colonie di 50 cellule può essere valutata mediante saggi che formano colonie (Figura 3A). La capacità dei BCSC di auto-rinnovarsi in condizioni sperimentali indipendenti dall'ancoraggio può essere valutata mediante saggi di mammosfera, in cui il numero variabile della sfera, le dimensioni e la capacità di avvio della sfera possono essere analizzati e correlati con la presenza e la funzione dei BCSC (Figura 3B). È importante determinare le densità delle cellule di semina per diverse linee cellulari di cancro al seno o campioni di tumore al seno per ottenere risultati ottimali. Ciò è particolarmente importante quando si esegue SLDA, poiché densità cellulari più elevate potrebbero portare all'aggregazione cellulare con conseguente interpretazione errata dell'attività cellulare.

La coltura di cellule di cancro al seno nella BME consente ai BCSC di formare strutture 3D che ricapitolano le condizioni in vivo (Figura 3C). La coltura 3D di cellule di cancro al seno in presenza di altri tipi di cellule microambientali come fibroblasti, cellule endoteliali e / o cellule immunitarie ha la capacità aggiuntiva di studiare il ruolo del microambiente nella crescita 3D dei BCSC38,39. Il numero di cellule specifiche richiesto per generare organoidi 3D può variare a seconda della linea cellulare o della fonte tumorale del paziente, e quindi è importante ottimizzare le condizioni di coltura e il numero di cellule prima di qualsiasi esperimento su larga scala.

Infine, i modelli di xenotrapianto murino in vivo possono essere utilizzati per comprendere le differenze nella crescita (Figura 4) di auto-rinnovamento, differenziazione e/o capacità di avvio del tumore dei BCSC in vivo rispetto ai non-BCSCs o alle popolazioni di cellule bulk. Spesso, le risposte cellulari in vitro osservate in presenza di fattori esogeni o agenti terapeutici non sono rappresentative del setting in vivo, suggerendo che l'osservazione in vitro dovrebbe essere accompagnata da studi in vivo quando possibile. Utilizzando modelli di xenotrapianto in vivo, l'eterogeneità cellulare e l'architettura tumorale sono preservate e quindi questi modelli possono servire come un sistema che imita da vicino il microambiente nei pazienti umani. In vivo L'LDA può essere eseguita per determinare la proporzione di cellule che iniziano il tumore in una data popolazione mista di cellule tumorali (BCSC o non BCSC)40,41. La gamma di diluizioni cellulari utilizzate dovrebbe essere ottimizzata e dipenderà dalla frequenza di avvio delle cellule nella popolazione cellulare di interesse. Idealmente queste diluizioni dovrebbero includere dosi che provocano la formazione di tumori al 100%, fino a dosi cellulari senza formazione di tumore e un intervallo ragionevole in mezzo. La frequenza delle cellule che iniziano il tumore nei campioni primari può essere variabile, e nei casi in cui i tumori al seno hanno numeri molto bassi o popolazioni eterogenee di cellule che iniziano il tumore, l'esecuzione di LDA può essere particolarmente difficile42. In questi casi, l'iniezione di un numero maggiore di cellule sarebbe più appropriata per comprendere la biologia del cancro al seno.

Figure 4
Figura 4: Saggi di xenotrapianto in vivo per valutare la funzione BCSC. Le cellule di carcinoma mammario MDA-MB-231 sono state isolate mediante FACS come descritto nella Figura 1 e iniettate nel cuscinetto di grasso mammario toracico destro di topi NSG femmina come descritto nelle sezioni di protocollo da 9.1 a 9.8 (5 x 105 cellule/topo; 4 topi/popolazione cellulare). La cinetica di crescita del tumore mammario primario è mostrata per le popolazioni ALDHhiCD44+CD24- (■) rispetto alle popolazioni ALDHbassedi CD44basse/-CD24+ (□). I dati rappresentati come media ± S.E.M. * = dimensioni tumorali significativamente diverse rispetto ai rispettivi sottogruppi ALDH bassidi CD44bassi / - allo stesso punto temporale (P < 0,05). Questa figura è stata adattata da Croker et al.26. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Le metastasi del cancro al seno e la resistenza alla terapia sono diventate la principale causa di mortalità nelle donne di tutto il mondo. L'esistenza di una sottopopolazione di cellule staminali del cancro al seno (BCSC) contribuisce all'aumento delle metastasi 26,43,44,45,46 e alla resistenza alla terapia21,47,48. Pertanto, l'obiettivo dei trattamenti futuri dovrebbe mirare a sradicare i BCSC per ottenere migliori risultati di trattamento, e ciò richiede metodi accurati per isolare e caratterizzare le caratteristiche funzionali dei BCSC utilizzando sia metodi in vitro che in vivo.

Linee cellulari immortalizzate derivate da diversi sottotipi di cancro al seno hanno dimostrato di essere modelli fattibili per studiare la biologia del cancro al seno, incluso l'isolamento e la caratterizzazione dei BCSC 26,49,50. L'elevata capacità proliferativa e la capacità di espansione illimitata delle linee cellulari forniscono un sistema modello ideale per l'esecuzione di studi altamente riproducibili e tecnicamente semplici. Tuttavia, a causa dell'origine clonale delle linee cellulari, potrebbero non riuscire a ricapitolare l'eterogeneità esibita da diversi pazienti e/o dalle cellule tumorali all'interno del tessuto tumorale. Inoltre, alterazioni genetiche possono essere acquisite durante il passaggio seriale di linee cellulari e possono indurre cambiamenti genotipici o fenotipici che possono confondere i risultati sperimentali51. Al contrario, le cellule primarie derivate dal paziente, nonostante la loro limitata capacità proliferativa ed di espansione, possono fornire un modello più accurato di quello osservato in vivo. Tuttavia, tali campioni possono essere più difficili da acquisire ed essere tecnicamente più impegnativi da lavorare. Tutti questi fattori dovrebbero essere considerati quando si sceglie un sistema di modello di partenza con cui isolare e caratterizzare i BCSC.

FACS è una tecnica comunemente usata per isolare le cellule di interesse in base all'espressione del marcatore di superficie cellulare52,53. Sulla base degli antigeni di superficie cellulare (CD44 e CD24) e dell'attività enzimatica dell'ALDH, i BCSC umani possono essere isolati ad alta purezza sia da linee cellulari di cancro al seno che da tessuti tumorali 1,2. L'efficienza di selezione determina la purezza del campione selezionato e si raccomanda agli utenti di analizzare una piccola porzione di campione selezionato incubato con colorante di vitalità per verificare l'efficienza della selezionedi 53,54. L'efficienza di selezione può essere confusa da molti fattori tra cui la presenza di grumi cellulari, un elevato numero di cellule morte o morenti, compensazione impropria dei fluorocromi e / o danni agli antigeni della superficie cellulare a causa della sensibilità alla tripsina o alla collagenasi durante le fasi di dissociazione pre-selezione53,54,55,56 . Pertanto, la generazione di una corretta sospensione a singola cellula e l'uso di appropriate tecniche di dissociazione cellulare aumenteranno l'efficienza di selezione. Durante l'esecuzione dell'ordinamento multiparametrico delle celle, è importante scegliere fluorocromi che riducano al minimo la sovrapposizione spettrale. In alcuni casi, dove la sovrapposizione spettrale non può essere evitata, un controllo che contiene tutti i fluorocromi tranne uno (fluorescenza meno uno, FMO) dovrebbe essere utilizzato per ridurre al minimo lo spillover dei segnali fluorescenti in altri canali54. In alternativa, la sovrapposizione spettrale può essere ridotta isolando immunomagneticamente le popolazioni cellulari prima dell'isolamento finale FACS delle cellule di interesse56.

I saggi in vitro come i saggi di formazione delle colonie e della mammosfera descritti in questo protocollo sono stati ampiamente utilizzati per studiare l'auto-rinnovamento e la capacità proliferativa dei BCSC 57,58,59,60,61,62. Inoltre, questi saggi possono essere utilizzati per valutare l'attività di diversi farmaci terapeutici sulla funzione BCSC. Diverse vie di segnalazione evolutivamente conservate sono state implementate nel mantenimento del BCSC 63, e sia i saggi 64,65,66 che quelli della mammosfera 64,67 sono stati utilizzati per valutare il valore dell'interruzione terapeutica di queste vie come intervento per bloccare la segnalazione intrinseca BCSC e ridurre l'attività BCSC e la progressione della malattia. Il test di formazione delle colonie utilizzando cellule primarie può essere difficile a causa della bassa densità cellulare, della variazione tra i campioni e della mancanza della sua adattabilità a condizioni isolate in vitro. Queste sfide possono essere superate coltivando BCSC su uno strato di agar morbido o cocoltivandoli con fibroblasti su un piatto di coltura cellulare rivestito di collagene68,69,70. Inoltre, l'integrazione dei fattori di crescita nei terreni di coltura (come FGF771) potrebbe anche migliorare la capacità di formazione delle colonie delle cellule isolate da campioni di tessuto. Inoltre, l'eccessiva digestione del tessuto utilizzando collagenasi o tripsina durante la fase di generazione della sospensione a singola cellula può comportare una capacità di formazione di colonie da bassa a zero e ridurre l'efficienza di formazione della mammosfera31. In entrambi i saggi, si deve prestare attenzione a incubare le piastre di analisi indisturbate per evitare l'interruzione delle strutture della colonia o della sfera mentre si stanno formando. Si raccomanda inoltre agli utenti di estendere il periodo di incubazione per le cellule primarie (rispetto alle linee cellulari) in quanto potrebbe essere necessario più tempo per queste cellule per formare colonie o sfere.

Molteplici linee di evidenza hanno dimostrato il ruolo critico della matrice extracellulare (ECM)15,17,72 e dei componenti stromali, come fibroblasti, cellule immunitarie, cellule endoteliali e adipociti nell'influenzare le funzioni BCSC 15. Pertanto, il modello di coltura 3D che descriviamo in questo protocollo può fornire un utile sistema sperimentale per aiutare a ricapitolare il microambiente tumorale in vivo in un ambiente in vitro. Sebbene il sistema di coltura 3D assomigli molto al microambiente tumorale nei pazienti oncologici, il mantenimento a lungo termine delle cellule come organoidi può essere difficile. Inoltre, l'ottimizzazione delle condizioni della cultura 3D e la capacità di studiare accuratamente l'auto-rinnovamento e la capacità di differenziazione dei BCSC è impegnativa73. L'efficienza degli organoidi formati nel sistema di coltura 3D dipende dai fattori di crescita integrati nei terreni di coltura74. L'assenza di componenti chiave (ad esempio, l'inibitore di ROCK) potrebbe portare a una ridotta o assente formazione di organoidi74. I terreni devono essere reintegrati ogni 3-4 giorni per mantenere la funzione cellulare ottimale e la sostenibilità della coltura. Al fine di ricapitolare le condizioni e la risposta in vivo, è sempre importante consentire alle cellule di formare organoidi prima di qualsiasi tipo di trattamento esogeno75. Le cellule derivate da campioni di pazienti dovrebbero avere tempo sufficiente per formare organoidi, in particolare se l'obiettivo è valutare la risposta al farmaco75.

Mentre questi metodi in vitro sono strumenti sperimentali attraenti e accessibili per caratterizzare la funzione BCSC, l'eterogeneità del tumore e l'effetto del microambiente tumorale sul comportamento BCSC non possono essere studiati con completa efficacia. Questi test in vitro dovrebbero pertanto essere integrati con modelli di xenotrapianto in vivo ogniqualvolta sia possibile, al fine di convalidare ulteriormente i risultati sperimentali relativi alla biologia della BSCS e/o alla risposta a nuove terapie. Sono stati utilizzati diversi modelli in vivo per lo studio della tumorigenicità e delle metastasi BCSC. Modelli murini ectopici (attecchimento sottocutaneo) e ortotopici (attecchimento MFP) sono stati utilizzati per generare tumori al seno e valutare i cambiamenti longitudinali nella crescita tumorale nel tempo50. Sebbene entrambi gli approcci di iniezione in vivo possano essere utilizzati per studiare la biologia BCSC, le componenti native stromali e vascolarizzate della MFP consentono una ricapitolazione più accurata della progressione del tumore mammario primario come osservato nelle pazienti, e quindi l'iniezione MFP è preferita76,77,78. Infine, l'uso di topi immunocompromessi è necessario per l'attecchimento di BCSCs umani e la crescita tumorale, e questo impedisce di incorporare il ruolo delle cellule immunitarie negli studi di tumorigenesi e metastasi79. Più recentemente, questa limitazione è stata affrontata attraverso l'uso di topi umanizzati in cui un sistema immunitario umano viene ricostituito tramite trapianto di midollo osseo prima dell'inizio degli studi di xenotrapianto80,81,82. Tuttavia, questi modelli sono costosi e tecnicamente impegnativi, e quindi non sono ancora comunemente usati83.

In sintesi, qui abbiamo fornito un protocollo per l'isolamento dei BCSC umani sia dalle linee cellulari di cancro al seno che dai campioni di tessuto tumorale derivati dal paziente. Abbiamo anche descritto protocolli in vitro e in vivo per saggi a valle che possono essere utilizzati per studiare la funzione BCSC, con la possibilità di essere ottimizzati per diverse fonti di cellule di cancro al seno e la flessibilità da eseguire in diverse condizioni sperimentali. Questi protocolli saranno utili per i ricercatori interessati alle cellule staminali tumorali, alla biologia del cancro al seno e allo sviluppo terapeutico, con l'obiettivo finale di migliorare i risultati dei pazienti in futuro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo i membri del nostro laboratorio per le loro utili discussioni e supporto. La nostra ricerca sulle cellule staminali del cancro al seno e sul microambiente tumorale è finanziata da sovvenzioni del Canadian Cancer Research Society Research Institute e del Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti Breast Cancer Program (Grant # BC160912). V.B. è supportato da una Western Postdoctoral Fellowship (Western University), e sia A.L.A. che V.B. sono supportati dalla Breast Cancer Society of Canada. C.L. è supportato da una borsa di studio Vanier Canada Graduate dal governo del Canada.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-Aminoactinomycin D (7AAD) BD 51-68981E suggested: 0.25 µg/1x106 cells
Acetone Fisher A18-1
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation
Basement membrane extract (BME) Corning 354234 Sold under the commercial name Matrigel
Cell culture plates: 6 well Corning 877218
Cell culture plates: 60mm Corning 353002
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment Corning 3474
Cell strainer: 40 micron BD 352340
Collagen Stemcell Technologies 7001 Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS
Collagenase Sigma 11088807001 1x
Conical tubes: 50 mL Fisher scientific 05-539-7
Crystal violet Sigma C6158 Use 0.05% crystal violet solution in water for staining
Dispase Stemcell Technologies 7913 5U/mL
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
DNAse Sigma D5052 0.1 mg/mL final concentration
FBS Avantor Seradigm Lifescience 97068-085  
Flow tubes: 5ml BD 352063 Polypropylene round-bottom tubes
Methanol Fisher 84124
mouse anti-Human CD24 antibody BD 561646 R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5
mouse anti-Human CD44 antibody BD 555479 R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB) Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation
PBS Wisent Inc 311-425-CL 1x, Without calcium and magnesium
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Mammosphere Media Composition
B27 Gibco 17504-44 1x
bFGF Sigma F2006 10 ng/mL
BSA Bioshop ALB003 04%
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 20 ng/mL
Insulin Sigma 16634 5 µg/mL
3D Organoid Media Composition
A8301 Tocris 2939 500 nM
B27 Gibco 17504-44 1x
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 5 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 20 ng/mL
FGF7 Peprotech 100-19 5 ng/mL
GlutaMax Invitrogen 35050-061 1x
HEPES Gibco 15630-080 10 mM
N-acetylcysteine Sigma A9165 1.25 mM
Neuregulin β1 Peprotech 100-03 5 nM
Nicotinamide Sigma N0636 5 mM
Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
R-spondin3 R&D 3500 250 ng/mL
SB202190 Sigma S7067 500 nM
Y-27632 Tocris 1254 5 µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  2. Shipitsin, M., et al. Molecular definition of breast tumor heterogeneity. Cancer Cell. 11 (3), 259-273 (2007).
  3. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  4. Sulaiman, A., et al. Dual inhibition of Wnt and Yes-associated protein signaling retards the growth of triple-negative breast cancer in both mesenchymal and epithelial states. Molecular Oncology. 12 (4), 423-440 (2018).
  5. Debeb, B. G., et al. Histone deacetylase inhibitors stimulate dedifferentiation of human breast cancer cells through WNT/β-catenin signaling. Stem Cells. 30 (11), 2366-2377 (2012).
  6. Klutzny, S., et al. PDE5 inhibition eliminates cancer stem cells via induction of PKA signaling. Cell Death & Disease. 9 (2), 192 (2018).
  7. DiMeo, T. A., et al. A novel lung metastasis signature links Wnt signaling with cancer cell self-renewal and epithelial-mesenchymal transition in basal-like breast cancer. Cancer Research. 69 (13), 5364-5373 (2009).
  8. Liu, C. C., Prior, J., Piwnica-Worms, D., Bu, G. LRP6 overexpression defines a class of breast cancer subtype and is a target for therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (11), 5136-5141 (2010).
  9. Miller-Kleinhenz, J., et al. Dual-targeting Wnt and uPA receptors using peptide conjugated ultra-small nanoparticle drug carriers inhibited cancer stem-cell phenotype in chemo-resistant breast cancer. Biomaterials. 152, 47-62 (2018).
  10. Mamaeva, V., et al. Inhibiting Notch Activity in Breast Cancer Stem Cells by Glucose Functionalized Nanoparticles Carrying γ-secretase Inhibitors. Molecular Therapy. 24 (5), 926-936 (2016).
  11. Ithimakin, S., et al. HER2 drives luminal breast cancer stem cells in the absence of HER2 amplification: implications for efficacy of adjuvant trastuzumab. Cancer Research. 73 (5), 1635-1646 (2013).
  12. Koike, Y., et al. Anti-cell growth and anti-cancer stem cell activities of the non-canonical hedgehog inhibitor GANT61 in triple-negative breast cancer cells. Breast Cancer. 24 (5), 683-693 (2017).
  13. Sun, Y., et al. Estrogen promotes stemness and invasiveness of ER-positive breast cancer cells through Gli1 activation. Molecular Cancer. 13, 137 (2014).
  14. Colavito, S. A., Zou, M. R., Yan, Q., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Significance of glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) expression in claudin-low breast cancer and crosstalk with the nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NFκB) pathway. Breast Cancer Research. 16 (5), 444 (2014).
  15. Bhat, V., Allan, A. L., Raouf, A. Role of the Microenvironment in Regulating Normal and Cancer Stem Cell Activity: Implications for Breast Cancer Progression and Therapy Response. Cancers. 11 (9), (2019).
  16. Pio, G. M., Xia, Y., Piaseczny, M. M., Chu, J. E., Allan, A. L. Soluble bone-derived osteopontin promotes migration and stem-like behavior of breast cancer cells. PloS One. 12 (5), 0177640 (2017).
  17. Chu, J. E., et al. Lung-derived factors mediate breast cancer cell migration through CD44 receptor-ligand interactions in a novel ex vivo system for analysis of organ-specific soluble proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-191 (2014).
  18. McGowan, P. M., et al. Notch1 inhibition alters the CD44hi/CD24lo population and reduces the formation of brain metastases from breast cancer. Molecular Cancer Research. 9 (7), 834-844 (2011).
  19. Mao, J., et al. ShRNA targeting Notch1 sensitizes breast cancer stem cell to paclitaxel. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (6), 1064-1073 (2013).
  20. Duru, N., et al. HER2-associated radioresistance of breast cancer stem cells isolated from HER2-negative breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6634-6647 (2012).
  21. Croker, A. K., Allan, A. L. Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44+ human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (1), 75-87 (2012).
  22. Creighton, C. J., et al. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13820-13825 (2009).
  23. Calcagno, A. M., et al. Prolonged drug selection of breast cancer cells and enrichment of cancer stem cell characteristics. Journal of the National Cancer Institute. 102 (21), 1637-1652 (2010).
  24. Feng, Y., et al. Breast cancer development and progression: Risk factors, cancer stem cells, signaling pathways, genomics, and molecular pathogenesis. Genes Dis. 5 (2), 77-106 (2018).
  25. Samanta, D., Gilkes, D. M., Chaturvedi, P., Xiang, L., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors are required for chemotherapy resistance of breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5429-5438 (2014).
  26. Croker, A. K., et al. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (8), 2236-2252 (2009).
  27. Morel, A. P., et al. Generation of breast cancer stem cells through epithelial-mesenchymal transition. PloS One. 3 (8), 2888 (2008).
  28. Muntimadugu, E., Kumar, R., Saladi, S., Rafeeqi, T. A., Khan, W. CD44 targeted chemotherapy for co-eradication of breast cancer stem cells and cancer cells using polymeric nanoparticles of salinomycin and paclitaxel. Colloids Surf B Biointerfaces. 143, 532-546 (2016).
  29. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2014).
  30. Munshi, A., Hobbs, M., Meyn, R. E. Clonogenic cell survival assay. Methods in Molecular Medicine. 110, 21-28 (2005).
  31. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  32. Shin, C. S., Kwak, B., Han, B., Park, K. Development of an in vitro 3D tumor model to study therapeutic efficiency of an anticancer drug. Molecular Pharmaceutics. 10 (6), 2167-2175 (2013).
  33. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  34. Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse models of cancer. Annual Review of Pathology. 6, 95-119 (2011).
  35. Lyons, S. K. Advances in imaging mouse tumour models in vivo. Journal of Pathology. 205 (2), 194-205 (2005).
  36. Margaryan, N. V., et al. The Stem Cell Phenotype of Aggressive Breast Cancer Cells. Cancers. 11 (3), (2019).
  37. Ma, F., et al. Enriched CD44(+)/CD24(-) population drives the aggressive phenotypes presented in triple-negative breast cancer (TNBC). Cancer Letters. 353 (2), 153-159 (2014).
  38. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER(+) Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388-401 (2019).
  39. Phan-Lai, V., et al. Three-dimensional scaffolds to evaluate tumor associated fibroblast-mediated suppression of breast tumor specific T cells. Biomacromolecules. 14 (5), 1330-1337 (2013).
  40. O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
  41. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
  42. Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6468-6473 (2011).
  43. Abraham, B. K., et al. Prevalence of CD44+/CD24-/low cells in breast cancer may not be associated with clinical outcome but may favor distant metastasis. Clinical Cancer Research. 11 (3), 1154-1159 (2005).
  44. Balic, M., et al. Most early disseminated cancer cells detected in bone marrow of breast cancer patients have a putative breast cancer stem cell phenotype. Clinical Cancer Research. 12 (19), 5615-5621 (2006).
  45. Charafe-Jauffret, E., et al. Aldehyde dehydrogenase 1-positive cancer stem cells mediate metastasis and poor clinical outcome in inflammatory breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (1), 45-55 (2010).
  46. Marcato, P., et al. Aldehyde dehydrogenase activity of breast cancer stem cells is primarily due to isoform ALDH1A3 and its expression is predictive of metastasis. Stem Cells. 29 (1), 32-45 (2011).
  47. Lacerda, L., Pusztai, L., Woodward, W. A. The role of tumor initiating cells in drug resistance of breast cancer: Implications for future therapeutic approaches. Drug Resist Updat. 13 (4-5), 99-108 (2010).
  48. Liu, S., Wicha, M. S. Targeting breast cancer stem cells. Journal of Clinical Oncology. 28 (25), 4006-4012 (2010).
  49. D'Angelo, R. C., et al. Notch reporter activity in breast cancer cell lines identifies a subset of cells with stem cell activity. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (3), 779-787 (2015).
  50. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  51. Forozan, F., et al. Comparative genomic hybridization analysis of 38 breast cancer cell lines: a basis for interpreting complementary DNA microarray data. Cancer Research. 60 (16), 4519-4525 (2000).
  52. Lanier, L. L. Just the FACS. Journal of Immunology. 193 (5), 2043-2044 (2014).
  53. Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 19-39 (2007).
  54. Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
  55. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  56. Sun, C., et al. Immunomagnetic separation of tumor initiating cells by screening two surface markers. Scientific Reports. 7, 40632 (2017).
  57. Rodríguez, C. E., et al. Breast cancer stem cells are involved in Trastuzumab resistance through the HER2 modulation in 3D culture. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (2), 1381-1391 (2018).
  58. Kim, D. W., Cho, J. Y. NQO1 is Required for β-Lapachone-Mediated Downregulation of Breast-Cancer Stem-Cell Activity. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), (2018).
  59. Xu, L. Z., et al. p62/SQSTM1 enhances breast cancer stem-like properties by stabilizing MYC mRNA. Oncogene. 36 (3), 304-317 (2017).
  60. Huang, X., et al. Breast cancer stem cell selectivity of synthetic nanomolar-active salinomycin analogs. BMC Cancer. 16, 145 (2016).
  61. Liu, T. J., et al. CD133+ cells with cancer stem cell characteristics associates with vasculogenic mimicry in triple-negative breast cancer. Oncogene. 32 (5), 544-553 (2013).
  62. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  63. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  64. Palomeras, S., Ruiz-Martínez, S., Puig, T. Targeting Breast Cancer Stem Cells to Overcome Treatment Resistance. Molecules. 23 (9), (2018).
  65. McClements, L., et al. Targeting treatment-resistant breast cancer stem cells with FKBPL and its peptide derivative, AD-01, via the CD44 pathway. Clinical Cancer Research. 19 (14), 3881-3893 (2013).
  66. Berger, D. P., Henss, H., Winterhalter, B. R., Fiebig, H. H. The clonogenic assay with human tumor xenografts: evaluation, predictive value and application for drug screening. Annals of Oncology. 1 (5), 333-341 (1990).
  67. Tian, J., et al. Dasatinib sensitises triple negative breast cancer cells to chemotherapy by targeting breast cancer stem cells. British Journal of Cancer. 119 (12), 1495-1507 (2018).
  68. Samoszuk, M., Tan, J., Chorn, G. Clonogenic growth of human breast cancer cells co-cultured in direct contact with serum-activated fibroblasts. Breast Cancer Research. 7 (3), 274-283 (2005).
  69. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  70. Xu, Y., Hu, Y. D., Zhou, J., Zhang, M. H. Establishing a lung cancer stem cell culture using autologous intratumoral fibroblasts as feeder cells. Cell Biology International. 35 (5), 509-517 (2011).
  71. Palmieri, C., et al. Fibroblast growth factor 7, secreted by breast fibroblasts, is an interleukin-1beta-induced paracrine growth factor for human breast cells. Journal of Endocrinology. 177 (1), 65-81 (2003).
  72. Bourguignon, L. Y., Peyrollier, K., Xia, W., Gilad, E. Hyaluronan-CD44 interaction activates stem cell marker Nanog, Stat-3-mediated MDR1 gene expression, and ankyrin-regulated multidrug efflux in breast and ovarian tumor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (25), 17635-17651 (2008).
  73. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  74. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  75. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
  76. Okano, M., et al. Orthotopic Implantation Achieves Better Engraftment and Faster Growth Than Subcutaneous Implantation in Breast Cancer Patient-Derived Xenografts. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).
  77. Zhang, Y., et al. Establishment of a murine breast tumor model by subcutaneous or orthotopic implantation. Oncology Letters. 15 (5), 6233-6240 (2018).
  78. Zhang, W., et al. Comparative Study of Subcutaneous and Orthotopic Mouse Models of Prostate Cancer: Vascular Perfusion, Vasculature Density, Hypoxic Burden and BB2r-Targeting Efficacy. Scientific Reports. 9 (1), 11117 (2019).
  79. Kim, R., Emi, M., Tanabe, K. Cancer immunoediting from immune surveillance to immune escape. Immunology. 121 (1), 1-14 (2007).
  80. Rosato, R. R., et al. Evaluation of anti-PD-1-based therapy against triple-negative breast cancer patient-derived xenograft tumors engrafted in humanized mouse models. Breast Cancer Research. 20 (1), 108 (2018).
  81. Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 99 (2018).
  82. Meraz, I. M., et al. An Improved Patient-Derived Xenograft Humanized Mouse Model for Evaluation of Lung Cancer Immune Responses. Cancer Immunol Res. 7 (8), 1267-1279 (2019).
  83. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. Biodrugs. 32 (3), 245-266 (2018).

Tags

Ricerca sul cancro numero 164 cellule staminali del cancro al seno (BCSC) selezione delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) saggio di formazione di colonie saggio della mammosfera modello di coltura 3D modello tumorale in vivo
Isolamento e valutazione funzionale di cellule staminali di cancro al seno umano da campioni di cellule e tessuti
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., … More

Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., Rodriguez-Torres, M., Allan, A. L. Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples. J. Vis. Exp. (164), e61775, doi:10.3791/61775 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter