Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Isolatie en functionele beoordeling van menselijke borstkankerstamcellen uit cel- en weefselmonsters

Published: October 2, 2020 doi: 10.3791/61775
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2,3,4
1London Regional Cancer Program, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Western University, 3Department of Oncology, Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

Dit experimentele protocol beschrijft de isolatie van BCSC's uit borstkankercel- en weefselmonsters, evenals de in vitro en in vivo assays die kunnen worden gebruikt om bcsc-fenotype en -functie te beoordelen.

Abstract

Borstkankerstamcellen (BCSC's) zijn kankercellen met erfelijke of verworven stamcelachtige kenmerken. Ondanks hun lage frequentie leveren ze een belangrijke bijdrage aan borstkankerinitiatie, terugval, metastase en therapieresistentie. Het is noodzakelijk om de biologie van borstkankerstamcellen te begrijpen om nieuwe therapeutische doelen te identificeren voor de behandeling van borstkanker. Borstkankerstamcellen worden geïsoleerd en gekarakteriseerd op basis van expressie van unieke celoppervlakmarkers zoals CD44, CD24 en enzymatische activiteit van aldehydedehydrogenase (ALDH). Deze ALDHhogeCD44+CD24-cellen vormen de BCSC-populatie en kunnen worden geïsoleerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) voor downstream functionele studies. Afhankelijk van de wetenschappelijke vraag kunnen verschillende in vitro en in vivo methoden worden gebruikt om de functionele kenmerken van BCSC's te beoordelen. Hier bieden we een gedetailleerd experimenteel protocol voor isolatie van menselijke BCSC's uit zowel heterogene populaties van borstkankercellen als primair tumorweefsel verkregen van borstkankerpatiënten. Daarnaast belichten we downstream in vitro en in vivo functionele assays, waaronder kolonievormende assays, mammosfeer assays, 3D-kweekmodellen en tumor xenograft assays die kunnen worden gebruikt om de BCSC-functie te beoordelen.

Introduction

Het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van menselijke borstkankerstamcellen (BCSC's) is cruciaal voor het aanpakken van de uitdagingen die worden ondervonden bij de behandeling van borstkanker. De opkomst van het BCSC-concept dateert uit het begin van de21e eeuw, waar een kleine populatie CD44 + CD24- / lage borstkankercellen in staat bleek te zijn om heterogene tumoren bij muizen te genereren 1,2. Vervolgens werd waargenomen dat menselijke borstkankercellen met een hoge enzymatische activiteit van aldehydedehydrogenase (ALDHhoog) ook vergelijkbare stamcelachtige eigenschappen vertoonden3. Deze BCSC's vertegenwoordigen een kleine populatie cellen die in staat zijn tot zelfvernieuwing en differentiatie, wat bijdraagt aan de heterogene aard van bulktumoren 1,2,3. Accumulerend bewijs suggereert dat veranderingen in evolutionair geconserveerde signaalroutes bcsc-overleving en -onderhoud stimuleren 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Bovendien is aangetoond dat de extrinsieke micro-omgeving van de cel een cruciale rol speelt bij het dicteren van verschillende BCSC-functies 15,16,17. Deze moleculaire routes en de externe factoren die de BCSC-functie reguleren, dragen bij aan de terugval van borstkanker, metastase18 en de ontwikkeling van resistentie tegen therapieën 19,20,21, waarbij het resterende bestaan van BCSC's na de behandeling een grote uitdaging vormt voor de algehele overleving van borstkankerpatiënten 22,23 . Preklinische evaluatie van deze factoren is daarom erg belangrijk voor het identificeren van BCSC-gerichte therapieën die gunstig kunnen zijn voor het bereiken van betere behandelingsresultaten en een verbeterde algehele overleving bij borstkankerpatiënten.

Verschillende in vitro menselijke borstkanker cellijnmodellen en in vivo menselijke xenograftmodellen zijn gebruikt om BCSC's 24,25,26,27,28,29 te karakteriseren. Het vermogen van cellijnen om continu opnieuw te bevolken na elke opeenvolgende passage maakt deze een ideaal modelsysteem om op omics gebaseerde en farmacogenomische studies uit te voeren. Cellijnen slagen er echter vaak niet in om de heterogeniteit die in patiëntenmonsters wordt waargenomen, samen te vatten. Daarom is het belangrijk om cellijngegevens aan te vullen met patiënt-afgeleide monsters. Isolatie van BCSC's in hun zuiverste vorm is belangrijk voor het mogelijk maken van gedetailleerde karakterisering van BCSC's. Het bereiken van deze zuiverheid hangt af van de selectie van fenotypische markers die specifiek zijn voor BCSC's. Momenteel wordt het ALDHhogeCD44 + CD24-celfenotype het meest gebruikt om menselijke BCSC's te onderscheiden en te isoleren van bulk borstkankercelpopulaties met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) voor maximale zuiverheid 1, 3,26. Bovendien kunnen de eigenschappen van geïsoleerde BCSC's zoals zelfvernieuwing, proliferatie en differentiatie worden geëvalueerd met behulp van in vitro en in vivo technieken.

In vitro kolonievormende assays kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om het vermogen van een enkele cel om zichzelf te vernieuwen te beoordelen om een kolonie van 50 cellen of meer te vormen in aanwezigheid van verschillende behandelingsomstandigheden30. Mammosfeertests kunnen ook worden gebruikt om het zelfvernieuwingspotentieel van borstkankercellen onder verankeringsonafhankelijke omstandigheden te beoordelen. Deze test meet het vermogen van afzonderlijke cellen om te genereren en te groeien als bollen (mengsel van BCSC's en niet-BCSC's) bij elke opeenvolgende passage in serumvrije niet-adherente kweekomstandigheden31. Bovendien kunnen 3-dimensionale (3D) cultuurmodellen worden gebruikt om de BCSC-functie te beoordelen, inclusief cel-cel- en celmatrixinteracties die de in vivo micro-omgeving nauw samenvatten en onderzoek naar de activiteit van potentiële BCSC-gerichte therapieën mogelijk maken32. Ondanks de uiteenlopende toepassingen van in vitro modellen, is het moeilijk om de complexiteit van in vivo condities te modelleren met alleen in vitro assays. Deze uitdaging kan worden overwonnen door gebruik te maken van xenograftmodellen van muizen om BCSC-gedrag in vivo te evalueren. Dergelijke modellen dienen met name als een ideaal systeem voor het beoordelen van borstkankermetastase33, het onderzoeken van interacties met de micro-omgeving tijdens ziekteprogressie34, in vivo beeldvorming35, en voor het voorspellen van patiëntspecifieke toxiciteit en werkzaamheid van antitumormiddelen34.

Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving voor de isolatie van menselijke ALDHhogeCD44 +CD24- BCSC's met maximale zuiverheid uit bulkpopulaties van heterogene borstkankercellen. We geven ook een gedetailleerde beschrijving van drie in vitro technieken (kolonievormende assay, mammosfeertest en 3D-cultuurmodel) en een in vivo tumor xenograft-assay die kan worden gebruikt om verschillende functies van BCSC's te beoordelen. Deze methoden zouden geschikt zijn voor gebruik door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het isoleren en karakteriseren van BCSC's van menselijke borstkankercellijnen of van primaire patiënten afgeleide borstkankercellen en tumorweefsel met het oog op het begrijpen van BCSC-biologie en / of het onderzoeken van nieuwe BCSC-gerichte therapieën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het verzamelen van patiënt-afgeleide chirurgische of biopsiemonsters rechtstreeks van instemmende borstkankerpatiënten werd uitgevoerd onder een goedgekeurd humaan ethisch protocol goedgekeurd door de institutionele ethische raad. Alle muizen die werden gebruikt om van de patiënt afgeleide xenograftmodellen te genereren, werden onderhouden en ondergebracht in een door de instelling goedgekeurde dierenfaciliteit. Het tumorweefsel van van de patiënt afgeleide xenograftmodellen met behulp van muizen werd gegenereerd volgens een goedgekeurd ethisch protocol dat is goedgekeurd door de institutionele dierverzorgingscommissie.

1. Voorbereiding van cellijnen

  1. Voer alle celkweek- en kleuringsprocedures uit onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast. Gebruik steriele celkweekschalen/kolven en reagentia.
  2. Menselijke borstkankercellen op 37 °C houden met 5% CO2 in gedefinieerde media aangevuld met foetaal runderserum (FBS) en noodzakelijke groeifactoren die specifiek zijn voor elke cellijn.
  3. Houd de NIH3T3 fibroblastcelculturen van de muis (voor gebruik in kolonievormende testen) op 37 °C met 5% CO2 in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS.
  4. Voor alle culturen, vul de oude media elke 2-3 dagen aan met verse media. Zodra de culturen 75-80% samenvloeiing bereiken, subcultuur in meerdere steriele celkweekkolven.

2. Voorbereiding van borstkanker tumorweefsel

  1. Verzamel de van de patiënt afgeleide chirurgische of biopsiemonsters rechtstreeks van instemmende borstkankerpatiënten onder een menselijk ethisch protocol dat is goedgekeurd door de institutionele ethische commissie.
  2. Verzamel en genereer vervolgens tumorweefsel uit van de patiënt afgeleide xenograftmodellen met behulp van muizen onder een dierethisch protocol dat is goedgekeurd door de institutionele dierverzorgingscommissie.
  3. Verzamel alle tumorweefsels onder steriele omstandigheden in een steriele conische buis van 50 ml met 30 ml DMEM: F12-media, houd op ijs en verwerk de monsters zoals hieronder beschreven binnen 2 uur na verzameling.

3. Generatie van eencellige suspensies van borstkankercellen

  1. Aspirate media uit de kolf met een monolaag van borstkankercellen die 60-80% confluent is (cellijnen naar keuze). Was de cellen met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Aspirateer PBS en voeg een geschikte celdissociatieoplossing toe (bijv. Trypsine:EDTA; net genoeg om de monolaag van cellen te bedekken) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (aanbevolen) of bij 37 °C.
  2. Voeg 5 ml kweekmedia toe om de activiteit van de celdissociatieoplossing te neutraliseren.
  3. Breng de resulterende gedissocieerde celoplossing over in een conische buis van 50 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1000 x g .
  4. Gooi supernatant weg en resuspendeerde de celpellet in 5 ml 1x PBS. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en een microscoop.
    OPMERKING: Let op celklontering in de hemocytometer. Herhaal de celdissociatiestap als er geen eencellige suspensie is gevormd.
  5. Na het tellen van de cel, centrifugeer de celsuspensie opnieuw bij 1000 x g gedurende 5 minuten, gooi supernatant weg en resuspendeer de celpellet in ALDH-substraatbuffer in een concentratie van 1 x 106 cellen / ml.

4. Genereren van eencellige suspensie uit weefselmonsters

  1. Gehakt het tumorweefsel met chirurgische messen met behulp van een kriskras techniek om kleinere stukjes van ongeveer 1 mm groot te verkrijgen. Breng de stukjes weefsel over in een verse conische buis van 50 ml met 10 ml dissociatiebuffer (1x collagenase in DMEM: F12). Sluit de conische buis af met parafilm en incubeer bij 37 °C in een shaker incubator gedurende 40 minuten.
    OPMERKING: Als er geen shaker incubator is, plaats de buis dan in een waterbad van 37 °C en meng de buis door elke 5-10 minuten te vortexen.
  2. Pelleteer het verteerde weefsel door het monster gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 530 x g . Gooi het supernatant weg en voeg 5 ml trypsine toe. Pipetteer op en neer met behulp van 1 ml pipet (ingesteld op 750 μL mark) om de pellet te verstoren en gedurende 5 minuten in een waterbad van 37 °C te incuberen. Pipet na incubatie krachtig op en neer om enkele cellen vrij te maken.
  3. Vul het totale volume in de buis aan tot 25 ml met DMEM:F12-media en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1000 x g . Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in 1 ml dispase-DNase-oplossing. Incubeer gedurende 5 minuten in een waterbad van 37 °C.
  4. Vul het totale volume in de buis aan tot 10 ml met PBS. Meng door op en neer te pipetteren, laat de resulterende celsuspensie door een 40 μm celzeef die aan een verse conische buis van 50 ml is bevestigd. Centrifugeer bij 1000 x g gedurende 5 min.
  5. Gooi supernatant weg en resuspendeer de celpellet in 5 ml 1x PBS. Tel de cellen en voltooi de voorbereiding van de celsuspensie zoals beschreven in stap 3.4 en 3.5.

5. Isolatie van borstkankerstamcellen (BCSC's)

  1. Label flow tubes voor de unstained control, single cell staining controls (DEAB control, ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7, 7AAD), de negative control tube (gekleurd met DEAB, CD44-PE, CD24-PE-Cy7 en 7AAD), fluorescent minus one (FMO) control en de 'sort' tube (gekleurd met ALDH, CD44, CD24 en 7AAD).
  2. Breng 500 μL (0,5 x 106 cellen) van de celsuspensies van stap 3.5 of stap 4.5 over naar elke buis die alleen cellen is gelabeld, CD44, CD24 en 7AAD. Plaats de buisjes tot gebruik op ijs.
  3. Breng 2 ml monster (2 x 106 cellen) over naar de respectieve 'ALDH'-buis. Voeg 5 μL DEAB toe aan de buizen 'DEAB-controle' en 'negatieve controle' en sluit deze stevig af. Voeg 10 μL ALDH-substraat toe aan de 'ALDH'-buis, meng goed door vortexing en breng onmiddellijk 500 μL over naar de overeenkomstige 'DEAB-controle' en 'negatieve controle'-buis. Vat de 'DEAB-controle', 'negatieve controle' en 'ALDH-buizen' samen en incubeer bij 37 °C gedurende 30-60 minuten (niet langer dan 60 minuten).
    OPMERKING: De optimale incubatietijd kan optimalisatie vereisen, afhankelijk van de cellijn. Bescherm het ALDH-substraat en de buizen met gekleurde cellen altijd tegen licht.
  4. Na incubatie centrifugeert u alle monsters gedurende 5 minuten bij 250 x g. Resuspensieer de cellen in 500 μL ALDH substraatbuffer. Voeg de door de fabrikant aanbevolen of door de gebruiker geoptimaliseerde concentratie anti-CD44-PE en anti-CD24-PE-Cy7 antilichaamcocktail toe en incubeer bij 4 °C gedurende 30 minuten. Voeg anti-CD44-PE en anti-CD24-PE-Cy7 antilichamen toe aan respectievelijke 'CD44' en 'CD24' gelabelde buizen.
  5. Na incubatie centrifugeert u alle monsters bij 250 x g gedurende 5 minuten. Resuspensieer de cellen in 500 μL ALDH substraatbuffer. Incubeer de 'negatieve controle'-buis, 'Sorteerbuis' en de '7ADD'-buis met 7AAD (aanbevolen concentratie: 0,25 μg/1 x 106 cellen) gedurende 10 minuten op ijs.
    OPMERKING: De ALDH-activiteit wordt gedetecteerd in het groene fluorescerende kanaal, daarom moet een fluorochroom met een ander compatibel emissiespectrum worden gebruikt. Waar spectrale overlap wordt waargenomen tijdens multi-parameter flowcytometrie, moeten enkele kleurcontroles en FMO-controle als leidraad worden gebruikt om compensatie tussen fluorochelen mogelijk te maken om de overloop van fluorescerend signaal naar andere kanalen te minimaliseren.
  6. Stel het analyseprotocol op het FACS-instrument in ter voorbereiding op de monsteranalyse. Maak scatter plots (forward vs side scatter, forward scatter vs fluorescent channels).
  7. Pas met behulp van de niet-gekleurde besturing de fotomultiplicator aan om puin van de hele celpopulatie te scheiden en pas de fluorescentiespanning aan om de hele celpopulatie rond de eerste logschaal te verplaatsen (101). Verplaats met behulp van de DEAB-besturing de hele celpopulatie binnen de tweede logschaal (102) door het groene fluorescentiespanningskanaal aan te passen.
  8. Analyseer eerst alle enkele kleuringsregelaars (ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7) en 7AAD- en FMO-regeling, pas de spanning aan om gekleurd van niet-gekleurde cellen te scheiden en om het morsen van fluorescerende signalen naar andere kanalen te minimaliseren.
  9. Poort op de positieve populatie voor elk enkel gekleurd celmonster. Met behulp van de negatieve controlebuis, poort voor levensvatbaarheid (7AAD negatief), ALDHlage en ALDHhoge celpopulaties (representatieve gating strategie weergegeven in figuur 1B).
  10. Analyseer multiparameter gekleurde monsters van belang om BCSC's te isoleren. Met behulp van de levensvatbare ALDHlage en ALDHhoge poorten, selecteer voor CD44 + CD24- (BCSC) en CD44-CD24 + (niet-BCSC) celpopulatie respectievelijk (figuur 1B).
  11. Verzamel levensvatbare BCSC's en niet-BCSC's in verzamelmedia in steriele verzamelbuizen (populaties van twee representatieve cellijnen weergegeven in figuur 2A&B). Gebruik gesorteerde cellen voor downstream in vitro en in vivo assays zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Naast de hieronder beschreven in vitro en in vivo assays, kunnen BCSC's worden gevalideerd door de expressie van pluripotente markers zoals SOX2, OCT4 en NANOG te meten via standaard immunoblotting technieken.

Figure 1
Figuur 1: FACS gating strategie voor isolatie van BCSC's uit borstkankercellijnen en weefselmonsters. (A) Stroomdiagram dat de procedure van BCSC-isolatie beschrijft. (B) Representatieve FACS-percelen met de sorteerstrategie die wordt gebruikt om levensvatbare BCSC's en niet-BCSC's te isoleren uit een heterogene pool van cellen. MDA-MB-231 menselijke borstkankercellen worden gelijktijdig gelabeld met 7-AAD, CD44-APC, CD24-PE en het ALDH-substraat. Celsubsets werden geïsoleerd met behulp van een vierkleurenprotocol op een FACS-machine. Cellen worden geselecteerd op basis van verwachte lichtverstrooiing, vervolgens op singlets en levensvatbaarheid op basis van 7-AAD-uitsluiting. Cellen worden vervolgens geanalyseerd op ALDH-activiteit en de bovenste 20% meest positieve worden geselecteerd als deALDH-hoge populatie, terwijl de onderste 20% van de cellen met de laagste ALDH-activiteit alsALDH-laag werden beschouwd. Ten slotte wordt 50% van deALDH-lage cellen verder geselecteerd op basis van een CD44-laag/ -CD24 + fenotype en 50% van deALDH-hoge cellen worden geselecteerd op basis van CD44 + CD24-fenotype. Dit cijfer is overgenomen uit Chu et al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: BCSC-verhoudingen zijn variabel in verschillende borstkankercellijnen. Representatieve afbeelding van het differentiële aandeel bcsc's en niet-bcsc's in (A) SUM159 en (B) MDA-MD-468 triple negatieve borstkankercellijnen na etikettering en sortering zoals beschreven in figuur 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Kolonievormende test

  1. Resuspensie de cellen van belang (gesorteerde cellen uit stap 5.11 of ongesorteerde cellen uit stap 3.5 of 4.5) in volledige media.
  2. Label drie stromingsbuizen voor 1 x 102, 2 x 102 en 5 x 102 cellen. Voeg 2 ml volledige media toe en breng het juiste celnummer (gesorteerd uit stap 5.11 of ongesorteerde cellen uit stap 3.5 of 4.5) over in de respectieve buizen. Meng de celoplossingen grondig door het 5 keer op en neer te pipetteren.
  3. Plaats de cellen in een 6-well plaat en verdeel de celsuspensie door de platen voorzichtig te draaien om een uniforme verdeling van de cellen te verkrijgen.
  4. Incubeer de platen in een 37 °C, 5% CO2 incubator totdat er kolonies verschijnen (waarbij kolonies = ≥50 cellen per kolonie). Vul de media twee keer per week voorzichtig aan zonder de kolonievorming te verstoren.
  5. Aspirateer media en was eenmaal met 1 ml PBS. Voeg 0,5 ml 0,05% kristalvioletoplossing toe aan elk putje en incubeer de plaat gedurende 30 minuten. Verwijder overtollige kristalvioletvlek door te wassen met 2 ml water. Herhaal de wasstap totdat de achtergrondvlekken zijn verwijderd.
  6. Met behulp van een microscoop met een vergroting van 4x en 10x telt en registreert u het totale aantal gegenereerde kolonies (representatieve afbeeldingen weergegeven in figuur 3A).
  7. Bereken de frequentie van kolonievorming als volgt: Frequentie (%) = (aantal gevormde kolonies/aantal gezaaide cellen) x 100. Als er bijvoorbeeld 25 kolonies worden gegenereerd uit 1 x 102 cellen, dan is de frequentie van kolonievorming: Frequentie = (25/100) x100 = 25%.
  8. U kunt ook stap 6.1 tot en met 6.4 vervangen door een alternatieve methode waarbij cocultuur wordt gebruikt door fibroblasten, die bcsc's in micro-omgeving ondersteunen door de productie van noodzakelijke groei- en overlevingsfactoren.
  9. Pre-coat cel 60 mm kweekschotels met type I rundercollageen (1 op 30 verdunning van 3 mg / ml collageen). Laat collageen gedurende 30 minuten polymeriseren in een incubator van 37 °C. Aspirateer het ongepolymeriseerde collageen en was de plaat twee keer met 1x PBS. Bedek de met collageen gecoate plaat met 1 ml PBS en zet deze op kamertemperatuur tot gebruik.
  10. Label drie stromingsbuizen voor 1 x 103, 5 x 103 en 1 x 104 cellen. Voeg 4 ml kolonievormende testmedia toe en breng het juiste aantal cellen (gesorteerd uit stap 5.11 of ongesorteerde cellen uit stap 3.5 of 4.5) over in de respectieve buizen. Voeg bestraalde muis NIH3T3 fibroblasten (4 x 104 cellen / ml media) toe. Meng celoplossingen grondig door het 5 keer op en neer te pipetteren.
  11. Aspirateer de PBS uit de met collageen gecoate kweekschaal uit stap 6.1 en plaats het celmengsel op elk van de celkweekplaten zoals beschreven in stap 6.3.
  12. Incubeer de platen in een 37 °C, 5% CO2 incubator en laat ze 7-10 dagen ongestoord of totdat er kolonies ontstaan, zonder de media aan te vullen. Tel en noteer het totale aantal gegenereerde kolonies zoals beschreven in stap 6.6 en 6.7.

7. Mammosfeertest

  1. Resuspensie de cellen van belang (gesorteerde cellen uit stap 5.11 of ongesorteerde cellen uit stap 3.5 of 4.5) in volledige mammosfeermedia en plaatcellen met een zaaidichtheid van 5 x 102 cellen / cm2 gebied in een 96 goed ultra-lage hechtingscelkweekplaat.
    OPMERKING: De dichtheid van het zaaien van cellen moet worden geoptimaliseerd voor verschillende cellijnen.
  2. Incubeer de kweekplaten gedurende 5-10 dagen in een incubator van 37 °C met 5% CO2. Vul de media twee keer per week zorgvuldig aan zonder de vorming van de mammosfeer te verstoren.
  3. Tel na incubatie het aantal mammosfeer dat in elke put wordt gegenereerd met behulp van een microscoop; waarbij mammosfeer wordt gedefinieerd als clusters van borstkankercellen met een diameter van meer dan 100 μm (representatieve beelden weergegeven in figuur 3B).
  4. Bereken de mammosfeervormingsefficiëntie (MFE) als volgt: MFE (%) = (aantal mammosfeer per put)/ (aantal cellen gezaaid per put) x 100 (d.w.z. als 5 mammospheres worden gegenereerd door 1 x 102 cellen in een put, dan MFE = (5/100) x 100 = 5%).
  5. Om mammospheres te subcultureren, breng de media met mammospheres-inhoud zorgvuldig over in een verse conische buis van 50 ml en centrifugemedia bij 1000 x g gedurende 5 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant, resuspendeer de celpellet in 500 μL trypsine en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 1 ml volledige mammosfeermedia. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en plaats de cellen opnieuw in een celkweekplaat met ultralage hechting zoals beschreven in stap 7.1.
    OPMERKING: Naast subkweek kunnen de van de mammosfeer afgeleide cellen ook verder worden geanalyseerd door FACS om het BCSC-fenotype te beoordelen en / of zuivere populaties BCSC's te verkrijgen voor andere downstream-assays.
  7. Om het aantal mammosfeer-initiërende cellen in uw celpopulaties te bepalen, gebruikt u een alternatieve methode met bolbeperkende verdunningsanalyse (SLDA). Plaatcellen in seriële verdunningen van hoge tot lage celaantallen in een 96-put ultralage hechtingscelkweekplaat, waarbij de hoogste verdunning resulteert in minder dan één cel per put.
  8. Incubeer de kweekplaat gedurende 10-14 dagen in een incubator van 37 °C met 5% CO2 en laat ze ongestoord om celaggregatie te voorkomen.
  9. Tel na incubatie het aantal mammosfeer dat in elke put wordt gegenereerd met behulp van een microscoop; waarbij mammospheres worden gedefinieerd als borstkankercelclusters met een diameter van meer dan 100 μm. Bereken de bol-initiërende frequentie en significantie met behulp van Extreme Limiting Dilution Analysis (ELDA) online software (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).

8.3D cultuurmodel

  1. Gebruik, afhankelijk van de experimentele vraag, keldermembraanextract (BME) met of zonder groeifactoren (verminderd). Om het effect van individuele groeifactor op kankercellen te evalueren, gebruikt u groeifactor verlaagde BME. Het helpt ook bij het minimaliseren van de niet-specifieke effecten van endogene groeifactoren die aanwezig zijn in BME.
    OPMERKING: BME stolt boven 10 °C. Houd BME altijd op ijs, zelfs tijdens de dooistap.
  2. Voeg voorzichtig 50 μL BME per put toe in een plaat met 96 putten zonder luchtbellen te creëren en laat deze gedurende 1 uur polymeriseren bij 37 °C. Voeg na 10 minuten incubatie 100 μL PBS toe om uitdroging van de gellaag te voorkomen.
  3. Resuspensie van de gesorteerde cellen uit stap 5.11 of ongesorteerde cellen uit stap 3.5 of 4.5 in een concentratie van 5 x 103 tot 5 x 104/200 μL in 3D-kweekmedia.
  4. Zodra de BME is gepolymeriseerd, verwijdert u PBS, voegt u 200 μL celsuspensie toe aan elke put en incubeert u in een incubator van 37 °C met 5% CO2. Voeg PBS toe aan de omliggende putten om verdamping van de media te voorkomen.
    OPMERKING: Het optimale aantal cellen voor plating moet worden bepaald voordat het experiment wordt ingesteld. Afhankelijk van de experimentele vraag kunnen BCSC's alleen of met andere celtypen worden gekweekt (fibroblasten / endotheel / immuuncellen enz.).
  5. Voeg twee keer per week verse media toe aan de kweekborden. Houd culturen gedurende 10-14 dagen aan voordat de vorming van organoïden wordt geanalyseerd (representatieve afbeeldingen weergegeven in figuur 3C).
  6. Voor subkweek, aspirateer de media zorgvuldig en voeg 200 μL dispase toe aan elke put die cellen bevat. Incubeer de plaat in een incubator van 37 °C gedurende 1 uur. Halverwege de incubatietijd (30 min), haal de plaat eruit, pipetteer de dispase-oplossing 5 keer voorzichtig op en neer en plaats terug in de incubator voor nog eens 30 minuten.
  7. Breng na 1 uur de gedissocieerde celoplossing over naar een stromingsbuis. Was de put met 1x PBS met 2% FBS (fPBS) en breng het over in de stromingsbuis. Centrifugeer de buis bij 1000 x g gedurende 5 min. Zuig het supernatant voorzichtig aan en voeg 500 μL trypsine toe, incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Inactiveer trypsine door een gelijke hoeveelheid fPBS toe te voegen en centrifugeer bij 1000 x g gedurende 5 minuten.
  8. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in 1 ml 3D-kweekmedia. Tel de cellen en vergul het vereiste aantal cellen in de BME zoals in stap 8.2 tot en met 8.4.
    OPMERKING: Meerdere putten kunnen worden samengevoegd om de interessante celpopulatie verder te analyseren of te sorteren.

Figure 3
Figuur 3: In vitro assays om bcsc-celfunctie te beoordelen. In vitro testen werden uitgevoerd zoals beschreven in protocolsecties 6.1 tot en met 6.5 (A), 7.1 tot 7.4 (B) of 81. tot 8,4 + 8,6 (C). (A) Representatieve afbeelding van de kolonies gegenereerd door MDA-MB-231 menselijke borstkankercellen; (B) Representatieve beelden van mammosfeervorming door MCF7, SUM159 of MDA-MB-468 menselijke cellijnen en van patiënten afgeleide LRCP17 borstkankercellen. (C) Representatieve beelden van de 3D-structuren gevormd door MCF7- en MDA-MB-231 borstkankercellen in 3D-culturenmodellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

OPMERKING: Voer dierproeven uit onder een dierethisch protocol dat is goedgekeurd door de institutionele dierverzorgingscommissie.

9. In vivo xenograft model

  1. Om de tumorinitiatiecapaciteit van borstkankerstamcellen te bepalen, bereidt u cellen voor (gesorteerde populatie uit stap 5.7 of ongesorteerde populaties uit stap 3.5 of 4.5) met behulp van een beperkende verdunningsbenadering. Serieel verdunde cellen in PBS met behulp van tussen de 1 en 5 verschillende verdunningsgroepen, met doses zo laag als 0,01-0,2 x 102 cellen/100 μL en zo hoog als 1 x 106 cellen/100 μL.
    OPMERKING: Ongesorteerde/hele populatiecellen kunnen als controle worden gebruikt. Het aantal gebruikte verdunningsgroepen zal afhangen van het gewenste wetenschappelijke resultaat (bijv. als alleen tumorgeniciteit wordt getest, kan 1 groep bij een hoger celgetal worden gebruikt, terwijl het bij het berekenen van tumorinitierende capaciteit optimaal is om 5 beperkende verdunningsdoses te testen).
  2. Om xenograftmodellen te genereren uit menselijke borstkankercellen, gebruikt u immuungecompromitteerde vrouwelijke muizen (athymisch naakt [nu/nu], niet-obese diabetische/ernstige gecombineerde immunodeficiënte [NOD/SCID] of NOD/SCID IL2γ [NGS] stammen).
    OPMERKING: Hoewel er minimaal 4 dieren per groep kunnen worden gebruikt, wordt 8-12 dieren per groep aanbevolen om robuuste resultaten te verkrijgen, met name voor het beperken van verdunningsanalyse.
  3. Voer standaard MFP-injecties (mammary fat pad) uit met 100 μL / muis van elk celpreparaat, onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast.
    OPMERKING: Voor optimale borsttumorgroei en spontane metastase naar verre organen wordt de thoracale MFP aanbevolen. Als alternatief kan ook de inguinale MFP worden gebruikt.
  4. Controleer na de injectie de muizen dagelijks op algemene gezondheid en tumorgroei op de injectieplaats. Na detectie van een palpabele tumor, begin met het meten van de tumorgrootte door remklauwen in twee loodrechte dimensies en registreer wekelijks tot het eindpunt.
    OPMERKING: Het experimentele eindpunt wordt bepaald op basis van de voorschriften die zijn vastgelegd in het institutionele protocol inzake dierethiek; typisch, eindpunt door euthanasie is meestal vereist zodra tumorvolumes 1500 mm3 bereiken. Voor BCSC-populaties en/of hogere celdoses (bijv. >1 x 104 cellen) zal dit eindpunt waarschijnlijk binnen 4-8 weken na MFP-injectie worden bereikt. Voor zeer lage celdoses en/of niet-BCSC-celpopulaties moet de tumorgroei tot 8 maanden na de injectie kunnen vorderen.
  5. Bereken op basis van deze metingen het tumorvolume met behulp van de volgende formule: Volume in mm3 = 0,52 x (breedte)2 x lengte. Als u een beperkende verdunningsbenadering gebruikt, berekent u de tumorinitierende capaciteit en significantie met behulp van ELDA online software (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).
  6. Als alternatief, om het eindpunt humaan uit te breiden, primaire tumoren operatief te verwijderen en muizen te blijven controleren op gezondheid en / of ontwikkeling van spontane metastase in verre organen. Gebruik gereseceerd tumorweefsel voor het genereren van seriële xenotransplantaties.
  7. Oogst op het eindpunt weefsel van primaire tumoren en verre organen (lymfeklieren, longen, lever, hersenen, bot) en voer histopathologische en/of immunohistochemische analyse uit of dissocieerde het tumorweefsel en gebruik in de in vitro assays beschreven in rubrieken 6-8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het beschreven protocol maakt isolatie van menselijke BCSC's mogelijk van een heterogene populatie van borstkankercellen, hetzij uit cellijnen of uit gedissocieerd tumorweefsel. Voor een bepaalde cellijn of weefselmonster is het van cruciaal belang om een uniforme eencellige suspensie te genereren om BCSC's met maximale zuiverheid te isoleren, aangezien het besmetten van niet-BCSC-populaties kan leiden tot variabele cellulaire reacties, vooral als het onderzoek tot doel heeft de werkzaamheid van therapeutische middelen gericht op BCSC's te evalueren. Toepassing van een strenge sorteerstrategie zal de aanwezigheid van contaminerende niet-BCSC's minimaliseren en resulteren in het vermogen om het aandeel borstkankercellen te verzamelen met stamcelachtige kenmerken die een cellulair fenotype vertonen dat hen onderscheidt van een bulkpopulatie van kankercellen. Menselijke borstkankercellen die een verhoogde ALDH-enzymatische activiteit vertonen, hoge niveaus van de celoppervlakmarker CD44 tot expressie brengen en een lage / negatieve expressie van CD24 hebben eenALDH-hoogCD44 + CD24-fenotype en kunnen worden geclassificeerd als BCSC's. Het aandeel BCSC's binnen de bulkpopulatie kan variëren tussen cellijnen of patiënten (figuur 2) en hangt vaak af van het ziektestadium, waarbij agressievere borstkanker meestal een hoger percentage BCSC'svertoont 26,36,37.

Geïsoleerde BCSC's kunnen worden gebruikt om verschillende in vitro en in vivo assays uit te voeren waarbij hun gedrag en functie kan worden vergeleken met dat van de bulk- en / of niet-BCSC-populaties. Het vermogen van een enkele borstkankercel om zichzelf te vernieuwen en kolonies van 50 cellen te genereren, kan bijvoorbeeld worden beoordeeld door kolonievormende testen (figuur 3A). Het vermogen van BCSC's om zichzelf te vernieuwen onder verankeringsonafhankelijke experimentele omstandigheden kan worden beoordeeld door mammosfeertests, waarbij variabel bolnummer, grootte en bol-initiërende capaciteit kunnen worden geanalyseerd en gecorreleerd met de aanwezigheid en functie van BCSC's (figuur 3B). Het is belangrijk om de zaaiceldichtheden voor verschillende borstkankercellijnen of borsttumormonsters te bepalen om optimale resultaten te verkrijgen. Dit is vooral belangrijk bij het uitvoeren van SLDA, omdat hogere celdichtheden kunnen leiden tot celaggregatie, wat resulteert in een verkeerde interpretatie van cellulaire activiteit.

Door borstkankercellen in BME te kweken, kunnen BCSC's 3D-structuren vormen die in vivo omstandigheden samenvatten (figuur 3C). 3D-cultuur van borstkankercellen in aanwezigheid van andere micro-omgevingsceltypen zoals fibroblasten, endotheelcellen en / of immuuncellen heeft de extra capaciteit om de rol van micro-omgeving in 3D-groei van BCSC'ste onderzoeken 38,39. De specifieke celnummers die nodig zijn om 3D-organoïden te genereren, kunnen variëren afhankelijk van de cellijn of tumorbron van de patiënt, en daarom is het belangrijk om de kweekomstandigheden en celnummers te optimaliseren voorafgaand aan grootschalige experimenten.

Ten slotte kunnen in vivo xenograftmodellen van muizen worden gebruikt om de verschillen in groei (figuur 4) zelfvernieuwing, differentiatie en/of tumor-initiërend vermogen van BCSC's in vivo te begrijpen in vergelijking met niet-BCSC's of bulkcelpopulaties. Vaak zijn de in vitro cellulaire responsen waargenomen in de aanwezigheid van exogene factoren of therapeutische middelen niet representatief voor in vivo setting, wat suggereert dat in vitro observatie waar mogelijk moet worden aangevuld met in vivo studies. Met behulp van in vivo xenograftmodellen wordt de cellulaire heterogeniteit en tumorarchitectuur bewaard en dus kunnen deze modellen dienen als een systeem dat de micro-omgeving bij menselijke patiënten nauw nabootst. In vivo LDA kan worden uitgevoerd om het aandeel tumor-initiërende cellen in een bepaalde gemengde populatie van kankercellen (BCSC's of niet-BCSC's) te bepalen 40,41. Het bereik van de gebruikte celverdunningen moet worden geoptimaliseerd en is afhankelijk van de frequentie van het initiëren van cellen in de celpopulatie van belang. Idealiter zouden deze verdunningen doses moeten omvatten die resulteren in 100% tumorvorming, tot celdoses zonder tumorvorming en een redelijk bereik daartussenin. De frequentie van tumor-initiërende cellen in primaire monsters kan variabel zijn, en in gevallen waarin borsttumoren zeer lage aantallen of heterogene populaties van tumor-initiërende cellen hebben, kan het uitvoeren van LDA bijzonder uitdagend zijn42. In deze gevallen zou het injecteren van een groter aantal cellen geschikter zijn voor het begrijpen van de biologie van borstkanker.

Figure 4
Figuur 4: In vivo xenograft assays om bcsc-functie te beoordelen. MDA-MB-231 borstkankercellen werden geïsoleerd door FACS zoals beschreven in figuur 1 en geïnjecteerd in de rechter thoracale borstmaagvetkussen van vrouwelijke NSG-muizen zoals beschreven in protocolsecties 9.1 tot 9.8 (5 x 105 cellen/muis; 4 muizen/celpopulatie). Primaire borsttumorgroeikinetiek wordt getoond voor ALDHhiCD44+CD24- (■) versus ALDHlageCD44lage/-CD24+ (□) populaties. Gegevens weergegeven als de gemiddelde ± S.E.M. * = significant andere tumorgrootte dan respectievelijke ALDHlageCD44lage / - subsets op hetzelfde tijdstip (P < 0,05). Dit cijfer is overgenomen uit Croker et al.26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Borstkankermetastase en resistentie tegen therapie zijn wereldwijd belangrijke doodsoorzaken bij vrouwen geworden. Het bestaan van een subpopulatie van borstkankerstamcellen (BCSC's) draagt bij aan verbeterde metastase 26,43,44,45,46 en therapieresistentie 21,47,48. Daarom moet de focus van toekomstige behandelingen gericht zijn op het uitroeien van BCSC's om betere behandelingsresultaten te bereiken, en dit vereist nauwkeurige methoden voor het isoleren en karakteriseren van de functionele kenmerken van BCSC's met behulp van zowel in vitro als in vivo methoden.

Vereeuwigde cellijnen afgeleid van verschillende subtypes van borstkanker hebben bewezen haalbare modellen te zijn om borstkankerbiologie te bestuderen, inclusief de isolatie en karakterisering van BCSC's 26,49,50. De hoge proliferatieve capaciteit en het onbeperkte uitbreidingsvermogen van cellijnen bieden een ideaal modelsysteem voor het uitvoeren van studies die zeer reproduceerbaar en technisch eenvoudig zijn. Vanwege de klonale oorsprong van cellijnen kunnen ze echter de heterogeniteit die door verschillende patiënten en / of kankercellen in tumorweefsel wordt getoond, niet samenvatten. Bovendien kunnen genetische veranderingen worden verkregen tijdens seriële passaging van cellijnen en kunnen genotypische of fenotypische veranderingen veroorzaken die experimentele resultaten kunnen verstoren51. Daarentegen kunnen primaire patiënt-afgeleide cellen, ondanks hun beperkte proliferatieve en expansieve vermogen, een nauwkeuriger model bieden voor dat wat in vivo is waargenomen. Dergelijke monsters kunnen echter moeilijker te verkrijgen zijn en technisch uitdagender zijn om mee te werken. Al deze factoren moeten worden overwogen bij het kiezen van een startmodelsysteem waarmee BCSC's kunnen worden geïsoleerd en gekarakteriseerd.

FACS is een veelgebruikte techniek om interessante cellen te isoleren op basis van celoppervlakmarkerexpressie52,53. Op basis van celoppervlakantigenen (CD44 en CD24) en ALDH-enzymatische activiteit kunnen menselijke BCSC's met hoge zuiverheid worden geïsoleerd uit zowel borstkankercellijnen alstumorweefsels 1,2. De sorteerefficiëntie bepaalt de zuiverheid van het gesorteerde monster en het wordt aanbevolen dat gebruikers een klein deel van het gesorteerde monster analyseren dat is geïncubeerd met levensvatbaarheidskleurstof om de efficiëntie van het sorteren van53,54 te controleren. De sorteerefficiëntie kan worden verstoord door vele factoren, waaronder de aanwezigheid van celklonters, een groot aantal dode of stervende cellen, onjuiste compensatie van de fluorochelen en / of schade aan antigenen van het celoppervlak als gevolg van gevoeligheid voor trypsine of collagenase tijdens het sorteren van dissociatiestappen 53,54,55,56 . Daarom zal het genereren van een goede eencellige suspensie en het gebruik van geschikte celdissociatietechnieken de sorteerefficiëntie verhogen. Bij het sorteren van multiparameters is het belangrijk om fluorchromen te kiezen die spectrale overlap minimaliseren. In sommige gevallen, waar spectrale overlapping niet kan worden vermeden, moet een controle worden gebruikt die alle fluorochelen behalve één (fluorescentie minus één, FMO) bevat om de overloop van fluorescerende signalen naar andere kanalen te minimaliseren54. Als alternatief kan de spectrale overlap worden verminderd door immunomagnetisch celpopulaties te isoleren voorafgaand aan de definitieve FACS-isolatie van cellen van belang56.

In vitro assays zoals de kolonievormende en mammosfeertests beschreven in dit protocol zijn uitgebreid gebruikt om de zelfvernieuwing en het proliferatieve vermogen van BCSC's 57,58,59,60,61,62 te bestuderen. Bovendien kunnen deze testen worden gebruikt om de activiteit van verschillende therapeutische geneesmiddelen op de BCSC-functie te beoordelen. Verschillende evolutionair geconserveerde signaalroutes zijn geïmplementeerd in BCSC-onderhoud63, en zowel kolonievormende 64,65,66 als mammosfeertests64,67 zijn gebruikt om de waarde van therapeutische verstoring van deze routes te beoordelen als een interventie om BCSC-intrinsieke signalering te blokkeren en BCSC-activiteit en ziekteprogressie te verminderen. Kolonievormende test met behulp van primaire cellen kan een uitdaging zijn vanwege de lage celdichtheid, variatie tussen monsters en het gebrek aan aanpassingsvermogen aan geïsoleerde in vitro omstandigheden. Deze uitdagingen kunnen worden overwonnen door BCSC's te kweken op een zachte agarlaag of door ze te cocultureren met fibroblasten op een met collageen gecoat celcultuurschaal 68,69,70. Bovendien zou het aanvullen van groeifactoren in de kweekmedia (zoals FGF771) ook het kolonievormende vermogen van cellen geïsoleerd uit weefselmonsters kunnen verbeteren. Bovendien kan oververtering van weefsel met behulp van collagenase of trypsine tijdens de eencellige suspensiegeneratiestap resulteren in een laag tot nul kolonievormend vermogen en de mammosfeervormende efficiëntie verminderen31. In beide assays moet ervoor worden gezorgd dat de testplaten ongestoord worden geïncubeerd om verstoring van kolonie- of bolstructuren tijdens het vormen te voorkomen. Het wordt ook aanbevolen dat gebruikers de incubatietijd voor primaire cellen (ten opzichte van cellijnen) verlengen, omdat het langer kan duren voordat deze cellen kolonies of bollen vormen.

Meerdere bewijslijnen hebben de cruciale rol aangetoond van extracellulaire matrix (ECM)15,17,72 en stromale componenten, zoals fibroblasten, immuuncellen, endotheelcellen en adipocyten bij het beïnvloeden van BCSC-functies 15. Het 3D-cultuurmodel dat we in dit protocol beschrijven, kan dus een nuttig experimenteel systeem bieden om de in vivo tumormicro-omgeving in een in vitro setting te helpen samenvatten. Hoewel het 3D-kweeksysteem sterk lijkt op de tumormicro-omgeving bij kankerpatiënten, kan langdurig onderhoud van cellen als organoïden moeilijk zijn. Bovendien is optimalisatie van de 3D-cultuuromstandigheden en het vermogen om zelfvernieuwing en differentiatievermogen van BCSC's nauwkeurig te onderzoekeneen uitdaging 73. De efficiëntie van organoïden gevormd in het 3D-kweeksysteem hangt af van de groeifactoren die worden aangevuld in de kweekmedia74. Afwezigheid van belangrijke componenten (bijvoorbeeld ROCK-remmer) kan leiden tot verminderde of geen organoïdevorming74. Media moeten elke 3-4 dagen worden aangevuld om de optimale cellulaire functie en de duurzaamheid van de cultuur te behouden. Om in vivo omstandigheden en respons te recapituleren, is het altijd belangrijk om de cellen organoïden te laten vormen voorafgaand aan elke vorm van exogene behandeling75. Cellen afkomstig van patiëntmonsters moeten voldoende tijd geven om organoïden te vormen, vooral als het doel de evaluatie van geneesmiddelrespons75 is.

Hoewel deze in vitro methoden aantrekkelijke en toegankelijke experimentele hulpmiddelen zijn voor het karakteriseren van de BCSC-functie, kunnen tumorheterogeniteit en het effect van tumormicro-omgeving op BCSC-gedrag niet met volledige effectiviteit worden bestudeerd. Deze in vitro assays moeten daarom waar mogelijk worden aangevuld met in vivo xenograftmodellen om experimentele bevindingen met betrekking tot BSCS-biologie en/of respons op nieuwe therapeutica verder te valideren. Verschillende in vivo modellen zijn gebruikt om BCSC tumorigeniciteit en metastase te bestuderen. Ectopische (subcutane engraftment) en orthotopische (MFP-engraftment) muismodellen zijn gebruikt om borsttumoren te genereren en longitudinale veranderingen in tumorgroei in de loop van de tijd te beoordelen50. Hoewel beide in vivo injectiebenaderingen kunnen worden gebruikt om BCSC-biologie te bestuderen, maken de inheemse stromale en vasculatuurgerelateerde componenten van de MFP een nauwkeurigere recapitulatie van primaire borsttumorprogressie mogelijk zoals waargenomen bij patiënten, en dus heeft MFP-injectie de voorkeur 76,77,78. Ten slotte is het gebruik van immuungecompromitteerde muizen vereist voor engraftment van menselijke BCSC's en tumorgroei, en dit voorkomt dat de rol van immuuncellen in tumorigenese- en metastasestudieswordt opgenomen 79. Meer recent is deze beperking aangepakt door het gebruik van gehumaniseerde muizen waarbij een menselijk immuunsysteem wordt gereconstitueerd via beenmergtransplantatie voorafgaand aan de start van xenograftstudies 80,81,82. Deze modellen zijn echter duur en technisch uitdagend, en worden dus nog steeds niet vaak gebruikt83.

Samenvattend hebben we hier een protocol verstrekt voor de isolatie van menselijke BCSC's uit zowel borstkankercellijnen als van patiënten afgeleide tumorweefselmonsters. We hebben ook in vitro en in vivo protocollen beschreven voor downstream assays die kunnen worden gebruikt om de BCSC-functie te bestuderen, met de mogelijkheid om te worden geoptimaliseerd voor verschillende borstkankercelbronnen en de flexibiliteit om te worden uitgevoerd onder verschillende experimentele omstandigheden. Deze protocollen zullen nuttig zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in kankerstamcellen, borstkankerbiologie en therapeutische ontwikkeling, met als uiteindelijk doel de resultaten van patiënten in de toekomst te verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We bedanken de leden van ons laboratorium voor hun nuttige discussies en steun. Ons onderzoek naar borstkankerstamcellen en de tumormicro-omgeving wordt gefinancierd door subsidies van het Canadian Cancer Research Society Research Institute en het U.S. Army Department of Defense Breast Cancer Program (Grant # BC160912). V.B. wordt ondersteund door een Western Postdoctoral Fellowship (Western University), en zowel A.L.A. als V.B. worden ondersteund door de Breast Cancer Society of Canada. C.L. wordt ondersteund door een Vanier Canada Graduate Scholarship van de Canadese overheid.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-Aminoactinomycin D (7AAD) BD 51-68981E suggested: 0.25 µg/1x106 cells
Acetone Fisher A18-1
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation
Basement membrane extract (BME) Corning 354234 Sold under the commercial name Matrigel
Cell culture plates: 6 well Corning 877218
Cell culture plates: 60mm Corning 353002
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment Corning 3474
Cell strainer: 40 micron BD 352340
Collagen Stemcell Technologies 7001 Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS
Collagenase Sigma 11088807001 1x
Conical tubes: 50 mL Fisher scientific 05-539-7
Crystal violet Sigma C6158 Use 0.05% crystal violet solution in water for staining
Dispase Stemcell Technologies 7913 5U/mL
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
DNAse Sigma D5052 0.1 mg/mL final concentration
FBS Avantor Seradigm Lifescience 97068-085  
Flow tubes: 5ml BD 352063 Polypropylene round-bottom tubes
Methanol Fisher 84124
mouse anti-Human CD24 antibody BD 561646 R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5
mouse anti-Human CD44 antibody BD 555479 R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB) Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation
PBS Wisent Inc 311-425-CL 1x, Without calcium and magnesium
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Mammosphere Media Composition
B27 Gibco 17504-44 1x
bFGF Sigma F2006 10 ng/mL
BSA Bioshop ALB003 04%
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 20 ng/mL
Insulin Sigma 16634 5 µg/mL
3D Organoid Media Composition
A8301 Tocris 2939 500 nM
B27 Gibco 17504-44 1x
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 5 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 20 ng/mL
FGF7 Peprotech 100-19 5 ng/mL
GlutaMax Invitrogen 35050-061 1x
HEPES Gibco 15630-080 10 mM
N-acetylcysteine Sigma A9165 1.25 mM
Neuregulin β1 Peprotech 100-03 5 nM
Nicotinamide Sigma N0636 5 mM
Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
R-spondin3 R&D 3500 250 ng/mL
SB202190 Sigma S7067 500 nM
Y-27632 Tocris 1254 5 µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  2. Shipitsin, M., et al. Molecular definition of breast tumor heterogeneity. Cancer Cell. 11 (3), 259-273 (2007).
  3. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  4. Sulaiman, A., et al. Dual inhibition of Wnt and Yes-associated protein signaling retards the growth of triple-negative breast cancer in both mesenchymal and epithelial states. Molecular Oncology. 12 (4), 423-440 (2018).
  5. Debeb, B. G., et al. Histone deacetylase inhibitors stimulate dedifferentiation of human breast cancer cells through WNT/β-catenin signaling. Stem Cells. 30 (11), 2366-2377 (2012).
  6. Klutzny, S., et al. PDE5 inhibition eliminates cancer stem cells via induction of PKA signaling. Cell Death & Disease. 9 (2), 192 (2018).
  7. DiMeo, T. A., et al. A novel lung metastasis signature links Wnt signaling with cancer cell self-renewal and epithelial-mesenchymal transition in basal-like breast cancer. Cancer Research. 69 (13), 5364-5373 (2009).
  8. Liu, C. C., Prior, J., Piwnica-Worms, D., Bu, G. LRP6 overexpression defines a class of breast cancer subtype and is a target for therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (11), 5136-5141 (2010).
  9. Miller-Kleinhenz, J., et al. Dual-targeting Wnt and uPA receptors using peptide conjugated ultra-small nanoparticle drug carriers inhibited cancer stem-cell phenotype in chemo-resistant breast cancer. Biomaterials. 152, 47-62 (2018).
  10. Mamaeva, V., et al. Inhibiting Notch Activity in Breast Cancer Stem Cells by Glucose Functionalized Nanoparticles Carrying γ-secretase Inhibitors. Molecular Therapy. 24 (5), 926-936 (2016).
  11. Ithimakin, S., et al. HER2 drives luminal breast cancer stem cells in the absence of HER2 amplification: implications for efficacy of adjuvant trastuzumab. Cancer Research. 73 (5), 1635-1646 (2013).
  12. Koike, Y., et al. Anti-cell growth and anti-cancer stem cell activities of the non-canonical hedgehog inhibitor GANT61 in triple-negative breast cancer cells. Breast Cancer. 24 (5), 683-693 (2017).
  13. Sun, Y., et al. Estrogen promotes stemness and invasiveness of ER-positive breast cancer cells through Gli1 activation. Molecular Cancer. 13, 137 (2014).
  14. Colavito, S. A., Zou, M. R., Yan, Q., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Significance of glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) expression in claudin-low breast cancer and crosstalk with the nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NFκB) pathway. Breast Cancer Research. 16 (5), 444 (2014).
  15. Bhat, V., Allan, A. L., Raouf, A. Role of the Microenvironment in Regulating Normal and Cancer Stem Cell Activity: Implications for Breast Cancer Progression and Therapy Response. Cancers. 11 (9), (2019).
  16. Pio, G. M., Xia, Y., Piaseczny, M. M., Chu, J. E., Allan, A. L. Soluble bone-derived osteopontin promotes migration and stem-like behavior of breast cancer cells. PloS One. 12 (5), 0177640 (2017).
  17. Chu, J. E., et al. Lung-derived factors mediate breast cancer cell migration through CD44 receptor-ligand interactions in a novel ex vivo system for analysis of organ-specific soluble proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-191 (2014).
  18. McGowan, P. M., et al. Notch1 inhibition alters the CD44hi/CD24lo population and reduces the formation of brain metastases from breast cancer. Molecular Cancer Research. 9 (7), 834-844 (2011).
  19. Mao, J., et al. ShRNA targeting Notch1 sensitizes breast cancer stem cell to paclitaxel. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (6), 1064-1073 (2013).
  20. Duru, N., et al. HER2-associated radioresistance of breast cancer stem cells isolated from HER2-negative breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6634-6647 (2012).
  21. Croker, A. K., Allan, A. L. Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44+ human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (1), 75-87 (2012).
  22. Creighton, C. J., et al. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13820-13825 (2009).
  23. Calcagno, A. M., et al. Prolonged drug selection of breast cancer cells and enrichment of cancer stem cell characteristics. Journal of the National Cancer Institute. 102 (21), 1637-1652 (2010).
  24. Feng, Y., et al. Breast cancer development and progression: Risk factors, cancer stem cells, signaling pathways, genomics, and molecular pathogenesis. Genes Dis. 5 (2), 77-106 (2018).
  25. Samanta, D., Gilkes, D. M., Chaturvedi, P., Xiang, L., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors are required for chemotherapy resistance of breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5429-5438 (2014).
  26. Croker, A. K., et al. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (8), 2236-2252 (2009).
  27. Morel, A. P., et al. Generation of breast cancer stem cells through epithelial-mesenchymal transition. PloS One. 3 (8), 2888 (2008).
  28. Muntimadugu, E., Kumar, R., Saladi, S., Rafeeqi, T. A., Khan, W. CD44 targeted chemotherapy for co-eradication of breast cancer stem cells and cancer cells using polymeric nanoparticles of salinomycin and paclitaxel. Colloids Surf B Biointerfaces. 143, 532-546 (2016).
  29. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2014).
  30. Munshi, A., Hobbs, M., Meyn, R. E. Clonogenic cell survival assay. Methods in Molecular Medicine. 110, 21-28 (2005).
  31. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  32. Shin, C. S., Kwak, B., Han, B., Park, K. Development of an in vitro 3D tumor model to study therapeutic efficiency of an anticancer drug. Molecular Pharmaceutics. 10 (6), 2167-2175 (2013).
  33. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  34. Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse models of cancer. Annual Review of Pathology. 6, 95-119 (2011).
  35. Lyons, S. K. Advances in imaging mouse tumour models in vivo. Journal of Pathology. 205 (2), 194-205 (2005).
  36. Margaryan, N. V., et al. The Stem Cell Phenotype of Aggressive Breast Cancer Cells. Cancers. 11 (3), (2019).
  37. Ma, F., et al. Enriched CD44(+)/CD24(-) population drives the aggressive phenotypes presented in triple-negative breast cancer (TNBC). Cancer Letters. 353 (2), 153-159 (2014).
  38. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER(+) Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388-401 (2019).
  39. Phan-Lai, V., et al. Three-dimensional scaffolds to evaluate tumor associated fibroblast-mediated suppression of breast tumor specific T cells. Biomacromolecules. 14 (5), 1330-1337 (2013).
  40. O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
  41. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
  42. Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6468-6473 (2011).
  43. Abraham, B. K., et al. Prevalence of CD44+/CD24-/low cells in breast cancer may not be associated with clinical outcome but may favor distant metastasis. Clinical Cancer Research. 11 (3), 1154-1159 (2005).
  44. Balic, M., et al. Most early disseminated cancer cells detected in bone marrow of breast cancer patients have a putative breast cancer stem cell phenotype. Clinical Cancer Research. 12 (19), 5615-5621 (2006).
  45. Charafe-Jauffret, E., et al. Aldehyde dehydrogenase 1-positive cancer stem cells mediate metastasis and poor clinical outcome in inflammatory breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (1), 45-55 (2010).
  46. Marcato, P., et al. Aldehyde dehydrogenase activity of breast cancer stem cells is primarily due to isoform ALDH1A3 and its expression is predictive of metastasis. Stem Cells. 29 (1), 32-45 (2011).
  47. Lacerda, L., Pusztai, L., Woodward, W. A. The role of tumor initiating cells in drug resistance of breast cancer: Implications for future therapeutic approaches. Drug Resist Updat. 13 (4-5), 99-108 (2010).
  48. Liu, S., Wicha, M. S. Targeting breast cancer stem cells. Journal of Clinical Oncology. 28 (25), 4006-4012 (2010).
  49. D'Angelo, R. C., et al. Notch reporter activity in breast cancer cell lines identifies a subset of cells with stem cell activity. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (3), 779-787 (2015).
  50. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  51. Forozan, F., et al. Comparative genomic hybridization analysis of 38 breast cancer cell lines: a basis for interpreting complementary DNA microarray data. Cancer Research. 60 (16), 4519-4525 (2000).
  52. Lanier, L. L. Just the FACS. Journal of Immunology. 193 (5), 2043-2044 (2014).
  53. Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 19-39 (2007).
  54. Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
  55. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  56. Sun, C., et al. Immunomagnetic separation of tumor initiating cells by screening two surface markers. Scientific Reports. 7, 40632 (2017).
  57. Rodríguez, C. E., et al. Breast cancer stem cells are involved in Trastuzumab resistance through the HER2 modulation in 3D culture. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (2), 1381-1391 (2018).
  58. Kim, D. W., Cho, J. Y. NQO1 is Required for β-Lapachone-Mediated Downregulation of Breast-Cancer Stem-Cell Activity. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), (2018).
  59. Xu, L. Z., et al. p62/SQSTM1 enhances breast cancer stem-like properties by stabilizing MYC mRNA. Oncogene. 36 (3), 304-317 (2017).
  60. Huang, X., et al. Breast cancer stem cell selectivity of synthetic nanomolar-active salinomycin analogs. BMC Cancer. 16, 145 (2016).
  61. Liu, T. J., et al. CD133+ cells with cancer stem cell characteristics associates with vasculogenic mimicry in triple-negative breast cancer. Oncogene. 32 (5), 544-553 (2013).
  62. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  63. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  64. Palomeras, S., Ruiz-Martínez, S., Puig, T. Targeting Breast Cancer Stem Cells to Overcome Treatment Resistance. Molecules. 23 (9), (2018).
  65. McClements, L., et al. Targeting treatment-resistant breast cancer stem cells with FKBPL and its peptide derivative, AD-01, via the CD44 pathway. Clinical Cancer Research. 19 (14), 3881-3893 (2013).
  66. Berger, D. P., Henss, H., Winterhalter, B. R., Fiebig, H. H. The clonogenic assay with human tumor xenografts: evaluation, predictive value and application for drug screening. Annals of Oncology. 1 (5), 333-341 (1990).
  67. Tian, J., et al. Dasatinib sensitises triple negative breast cancer cells to chemotherapy by targeting breast cancer stem cells. British Journal of Cancer. 119 (12), 1495-1507 (2018).
  68. Samoszuk, M., Tan, J., Chorn, G. Clonogenic growth of human breast cancer cells co-cultured in direct contact with serum-activated fibroblasts. Breast Cancer Research. 7 (3), 274-283 (2005).
  69. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  70. Xu, Y., Hu, Y. D., Zhou, J., Zhang, M. H. Establishing a lung cancer stem cell culture using autologous intratumoral fibroblasts as feeder cells. Cell Biology International. 35 (5), 509-517 (2011).
  71. Palmieri, C., et al. Fibroblast growth factor 7, secreted by breast fibroblasts, is an interleukin-1beta-induced paracrine growth factor for human breast cells. Journal of Endocrinology. 177 (1), 65-81 (2003).
  72. Bourguignon, L. Y., Peyrollier, K., Xia, W., Gilad, E. Hyaluronan-CD44 interaction activates stem cell marker Nanog, Stat-3-mediated MDR1 gene expression, and ankyrin-regulated multidrug efflux in breast and ovarian tumor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (25), 17635-17651 (2008).
  73. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  74. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  75. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
  76. Okano, M., et al. Orthotopic Implantation Achieves Better Engraftment and Faster Growth Than Subcutaneous Implantation in Breast Cancer Patient-Derived Xenografts. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).
  77. Zhang, Y., et al. Establishment of a murine breast tumor model by subcutaneous or orthotopic implantation. Oncology Letters. 15 (5), 6233-6240 (2018).
  78. Zhang, W., et al. Comparative Study of Subcutaneous and Orthotopic Mouse Models of Prostate Cancer: Vascular Perfusion, Vasculature Density, Hypoxic Burden and BB2r-Targeting Efficacy. Scientific Reports. 9 (1), 11117 (2019).
  79. Kim, R., Emi, M., Tanabe, K. Cancer immunoediting from immune surveillance to immune escape. Immunology. 121 (1), 1-14 (2007).
  80. Rosato, R. R., et al. Evaluation of anti-PD-1-based therapy against triple-negative breast cancer patient-derived xenograft tumors engrafted in humanized mouse models. Breast Cancer Research. 20 (1), 108 (2018).
  81. Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 99 (2018).
  82. Meraz, I. M., et al. An Improved Patient-Derived Xenograft Humanized Mouse Model for Evaluation of Lung Cancer Immune Responses. Cancer Immunol Res. 7 (8), 1267-1279 (2019).
  83. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. Biodrugs. 32 (3), 245-266 (2018).

Tags

Kankeronderzoek Nummer 164 Borstkankerstamcel (BCSC) fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kolonievormende test mammosfeertest 3D-cultuurmodel in vivo tumormodel
Isolatie en functionele beoordeling van menselijke borstkankerstamcellen uit cel- en weefselmonsters
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., … More

Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., Rodriguez-Torres, M., Allan, A. L. Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples. J. Vis. Exp. (164), e61775, doi:10.3791/61775 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter