פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לטיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי מחדש באופן ניתן לשחזור וחזק. בנוסף, הוא מאפיין את הקשר המבני-פונקציה של מודל מחסום האפידרמיס. התגובות הביולוגיות של האפידרמיס האנושי המחודש על גירויים proinflammatory מוצגים גם.
מודל אפידרמיס אנושי תלת מימדי ששוחזר מקרטינוציטים ראשוניים של יילודים מוצג. להלן מתואר פרוטוקול לתהליך הטיפוח ולאפיון המודל. קרטינוציטים ראשוניים של יילודים גדלים שקועים על מוסיף פוליקרבונט חדיר ומרימים לממשק נוזלי האוויר שלושה ימים לאחר הזריעה. לאחר ארבעה עשר ימים של גירוי עם גורמי גדילה מוגדרים וחומצה אסקורבית במדיום תרבית סידן גבוהה, המודל מובחן לחלוטין. ניתוח היסטולוגי חשף אפידרמיס מרובד לחלוטין, מחקה את המורפולוגיה של עור אנושי ילידי. כדי לאפיין את המודל ואת פונקציות המחסום שלו, רמות החלבון והלוקליזציה הספציפית לבידול קרטינוציט בשלב מוקדם (כלומר, קרטין 10), בידול בשלב מאוחר (כלומר, אינוולוקרין, לורירין ופילגרין) והדבקת רקמות (כלומר, desmoglein 1), הוערכו על ידי כשל חיסוני. שלמות מחסום הרקמה הוערכה עוד יותר על ידי מדידת התנגדות חשמלית טרנספיתליאלית. אפידרמיס אנושיeconstructed היה מגיב גירויים proinflammatory (כלומר, lipopolysaccharide ו גורם נמק הגידול אלפא), המוביל שחרור ציטוקינים מוגברת (כלומר, interleukin 1 אלפא ואינטרלוקין 8). פרוטוקול זה מייצג שיטת במבחנה פשוטה הניתנת לשחזור כדי לטפח אפידרמיס אנושי משוחזר ככלי להערכת השפעות סביבתיות ומגוון רחב של מחקרים הקשורים לעור.
האפידרמיס הוא השכבה החיצונית ביותר של העור, בממשק הישיר בין גוף האדם לסביבה החיצונית. תפקידיו העיקריים הם לספק הגנה והידרציה1. האפידרמיס פועל כמחסום פיזי יעיל נגד גורמים חיצוניים ומונע אובדן מים מוגזם מהגוף. תפקודי עור אלה תלויים בעיקר בסידור התאי בשכבות החיצוניות ביותר של העור, בהרכב ובארגון השומנים הבין-תאיים2. האפידרמיס מורכב בעיקר מקרטינוציטים הנודדים כלפי מעלה לצד החיצוני של הרקמה ועוברים בידול. ישנן 4-5 שכבות אפידרמיס המאופיינים בשלב הבידול שלהן. מבפנים החוצה, שכבות האפידרמיס מתחילות מהאפידרמיס בר קיימא, כלומר, השכבה basale (SB), ספינוסום השכבה (SS), ואת גרנולוזום השכבה (SG), לשכבה העליונה שאינה בת קיימא, כלומר, קרן השכבה (SC)3. שכבת הבסיס מורכבת בעיקר מקרטינוציטים מועשרים בקרטין מתרבים, הנודדים דרך ה- SS עם הבידול4. במהלך התבגרות קרטינוציט, מתרחשים שינויים שונים בביטוי ובמבנה החלבון. קרטינוציטים דבקים בהיווצרות צמתים דמוסומליים5. בס”ג, דור גופי המללר הוא יזם. הם מורכבים מבשרי שומנים ואנזימים החיוניים להיווצרות תפקוד מחסום העור6. SG מאופיין גם על ידי נוכחות של גרגירי keratohyalin בציטופלסמה של קרטינוציטים. בממשק עם SC, התוכן של גופים lamellar מובלט לתוך החללים הבין תאיים ואת השומנים שאינם קוטב כגון ceramides, כולסטרול, וחומצות שומן חינם להתארגן לתוך bilayers השומנים לאמלרי מוערם כדי ליצור את מטריצת השומנים חוץ תאיים7. ב SC, תאים לאבד את כל אברונים הסלולר כולל הגרעין, בשל תהליכי השפלה אנזימטית לאמץ מורפולוגיה שטוחה. הם מוקפים מעטפה cornified עשוי שכבות חלבון מקושרים, והם מכונים corneocytes8,9. רכיבים דמוסומליים מקושרים למעטפת הקרנית כדי ליצור corneodesmosomes ולקשור את corneocytes יחד. האפיתל שנוצר מתחדש ללא הרף מתאי גזע, עם זמן מחזור של כ 5-6 שבועות10. תהליך הבידול של הקרטינוציטים, שתוצאתו אפידרמיס מרובד לחלוטין, הוא חיוני להיווצרות פונקציית המחסום של העור11.
במהלך פציעה ודלקת, קרטינוציטים לגרום לשינויים מולקולות הידבקות קולטני פני השטח ולהפעיל תגובות proinflammatory באמצעות הפרשת ציטוקינים, כימוקינים, פפטידים מיקרוביאלית12. העור הוא לא רק מחסום פיזי נגד חומרים אקסוגני; הוא משמש גם כחיישן חיסוני בעת חשיפה לפתוגנים. בנוסף, הוא מסדיר את הדיפוזיה של מספר חומרים על פני שכבותיו, כגון תכולת המים כדי להגן על גוף האדם מפני התייבשות. העור מעורב גם בסינתזה של ויטמין D ויש לו פונקציות מטבוליות שונות אחרות3,13,14.
כדי להעריך את ההשפעות השליליות של חומרים אקסוגניים, טוקסיקולוגים הסתמכו במשך עשרות שנים על ניסויים בבעלי חיים, אבל כיום זה לא הגישה המועדפת. מלבד יכולת חיזוי מוגבלת של רעילות אנושית, מודלים של בעלי חיים כרוכים בסוגיות אתיות רבות. האיסור על ניסויים בבעלי חיים בתעשיית הקוסמטיקה וההמלצה לפעול על פי עקרון 3R (כלומר החלפה, הפחתה ועידון) במחקר הובילו לפיתוח שיטות בדיקה חלופיות המבוססות על גישות במבחנה15. מודלים ראשונים של תאי עור במבחנה כבר תוארו בשנות ה -90, והתפתחות מרשימה מתרבויות מונו קרטינוציטים אנושיות פשוטות לאפידרמיס מובחן לחלוטין ומודלים בעובי מלא הושגה16. כיום, הנדסת רקמת העור צברה חשיבות הן בתחום התרופות והן בתחום הדרמטו-קוסמטיקה. בשני העשורים האחרונים, מספר חברות מיסחרו אפידרמיס אנושי תלת מימדי (3D) המשוחזר (RhE) המייצגים כלים סטנדרטיים ומשוחזרים למחקרים הקשורים לעור. מספר דגמי RhE מסחריים מתקבלים לבדיקת עור במבחנה של כימיקלים על פי הנחיות ה-OECD לבדיקת גירוי בעור17,18 (כלומר, הנחיות בדיקה 43919) וקורוזיה בעור20 (כלומר, הנחיות בדיקה 43121). מבחן במבחנה עבור רגישות העור22 (כלומר, SENS-IS assay) נמצא כעת במסלול האישור ותחת ביקורת עמיתים23. ישנם גם מבחנים רבים אחרים שפותחו כי לנצל מודלים מסחריים RhE, כדי להעריך phototoxicity24, כדי לבדוק ניסוחים סמים25, ניסוחים קוסמטיים ומרכיבים פעילים26, כדי ללמוד את תפקוד מחסום העור27 ולבדוק את התגובה הביולוגית לחצים סביבתיים28,29,30,31.
בנוסף לדגמי עור תלת מימדיים זמינים מסחרית, קבוצות מחקר מרובות פיתחו RhEs משלהם32,33,34,35,36,37. Es בתוך הבית מציעים את היתרון לשליטה בתנאי התרבות בהתאם למטרת המחקר. באופן ספציפי, החוקרים יכולים לבחור את הסוג ואת המקור של keratinocytes לשמש לשיחזור מודל האפידרמיס 3D שלהם (כלומר, ראשוני לעומת מונצח, יילודים לעומת גיל, יחיד לעומת בריכה תורמים אקראיים, מין, מוצא אתני, הרגלי חיים בודדים כגון עישון, וכו ‘). יש להם את האפשרות לשנות את הרכב מדיום התרבות ולשלב גורמי גדילה, ויטמינים, או תרכובות אחרות שיכולות לווסת את הביטוי של חלבוני היעד או שומנים. עם RhEs בתוך הבית, החוקרים יכולים גם לחקור תגובות ביולוגיות ותכונות ביומכניות כפונקציה של מצב הבידול של מודל 3D. בנוסף לפרמטרים אינטואיטיביים אלה, ישנם מאמצים מתמשכים להגביר את המורכבות של מודלים עור 3D ולהפוך אותם רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית, למשל על ידי הוספת סוגי תאים אפידרמליים אחרים (למשל מלנוציטים ותאיחיסון) 38,39, על ידי culturing keratinocytes על גבי מטריצת קולגן מאוכלס פיברובלסט40,41,42, ועל ידי הכללת רכיבים של רשת כלי הדם43,44,45.
למרות שניתן לכוונן את תנאי התרבות בהתאם לצרכים ספציפיים, ישנם פרמטרים שיש לכבד כדי להבטיח הן את האיכות ואת הרלוונטיות של RhE. כדי לטפח רקמות RhE, קרטינוציטים אפידרמליים אנושיים נורמליים (NHEKs) נזרעים לתוך תוספות תרבות חדירות ספציפיות אשר קרום סינתטי נקבובי מפריד את הבארות לשני תאים, כלומר, תא apical ו basolateral. נקבוביות הממברנה (כלומר, גודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר) היא כזו שהיא מאפשרת היווצרות של מונולאייר תא בתא האפסי ללא הגירה של תאים לצד הכנס הבסיסי, והאכלת הקרטינוציטים בחומרים מזינים חיוניים מאמצעי התרבות הכלולים בתא הבזולטרלי. בתחילת תהליך ההשבה, NHEKs מתורבתים בתנאים שקועים במשך כמה ימים כדי לאפשר את הדבקותם על הממברנה. רמת הסידן בשני התאים מוגברת בהשוואה לריכוז הסידן המשמש לתרבות הדו-ממד של NHEKs כדי להאט את התפשטות התאים ולקדם במקום זאת את הבידול שלהם46. שיפוע סידן אפידרמלי חיוני כדי לווסת את היווצרות המחסום ואת הומאוסטזיס47,48. רמות סידן גבוהות (כלומר, עד 1.5 מ”מ) לקדם את היווצרותם של צמתים בין תאיים לווסת את היווצרות המעטפה cornified במהלך בידול סופני49. לאחר קרטינוציטים יוצרים monolayer רציף ודבק בחוזקה על הממברנה התומכת, המדיום מהתא apical מוסר ואת תהליך התרבות ממשיך בממשק אוויר נוזלי (עלי) כדי לעורר ריבוד ולהקים מחסום אפידרמיס50,51. תנאי תרבות ספציפיים חיוניים להשגת אפיתל מרובד לחלוטין36. במהלך תהליך ההשבה ב ALI, המדיום בתא basolateral מתווסף פקטורי גדילה קרטינוציט (KGF), אינסולין, סידן, וחומצה אסקורבית. חומצה אסקורבית ממלאת תפקיד מרכזי בהיווצרות מחסום השומנים המתאים SC, דומה מאוד לזה של העור האנושי הילידי52. קרטינוציטים הגדלים במדיום אסקורבי בתוספת חומצה מדגימים פנוטיפ מובחן, עם מספר משופר של גרגירי קרטוהילין, כמו גם לאמלה שומנים בין תאיים מאורגנים ב interstices של corneocytes52. תוספת כזו חיונית כדי לשפר את תפקוד מחסום האפידרמיס על ידי הגדלת תכולת מעטפה cornified והימנעות דלדול של חנויות נוגדות חמצוןהידרופיליות 53,54. KGF, מתווך פרקרין חשוב של התפשטות אפידרמיס ובידול, משמש כדי לעורר את NHEKs55.
החסרונות העיקריים של RhEs בתוך הבית כוללים את אובדן התקינה בין מוסדות מחקר ועוצמה עבודה מוגברת וצריכת זמן (עד 3 שבועות לעומת מודלים מסחריים מוכנים לשימוש). מטרת הנייר הנוכחי היא לטפל בחסרונות אלה, הגדרת הבסיס לייצור בקנה מידה גדול יותר. בנוסף ליתרונות הנ”ל של RhEs בתוך הבית, הפרוטוקול הנוכחי נועד להפחית את השונות התוך-אינטר-משתנה בין הרקמות, להפחית את סיכוני הזיהום ולייעל את תהליך הטיפוח.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה הניתנת לשחזור וחזקה לטיפוח RhEs באמצעות NHEKs יילודים. יתר על כן, הוא מראה תוצאות מייצגות של אפיון המורפולוגיה RhEs, שלמות המחסום, וביטוי של חלבונים ספציפיים לבידול אפידרמיס. המבנה המורפולוגי של ורס נבדק באמצעות מטוקסילין ואאוסין (H&E) מכתימים ומיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM). כדי להעריך את שלמות המחסום, נמדדו ההתנגדות החשמלית הטרנס-פידרמלית (TEER) וזמן החשיפה לטריטון X-100 כדי להפחית 50% מכדאיות הרקמות (ET50). היווצרות צמתים desmosomal (כלומר, desmoglein 1) נותח על ידי immunofluorescence (IF) כדי להעריך הידבקות קרטינוציטית. היווצרותם של חלבונים מבניים אפידרמליים (כלומר, involucrin, loricrin, ו filaggrin) הוערך וזוהה עם IF. חלבונים אלה מעורבים בהיווצרות מעטפת החלבון המקושרת מאוד המקיפה את הקורנאוציטים של SC וכתוצאה מכך הם סמנים חשובים לבידול אפידרמיס בשלב מאוחר56,57. בנוסף, IF שימש לניתוח קרטין 10, חלבון המושרה בתאים מובחנים בשלב מוקדם ב- SS58 ונמצא בתוך כל השכבות המובחנות. לבסוף, התגובה של RhE לגירויים פרואינפלמטוריים (כלומר, lipopolysaccharide וגורם נמק הגידול אלפא) נחקרה. רמות האינטרלוקין 1 אלפא (IL-1α) והאינטרלוקין 8 (IL-8) נמדדו במדיית תרבות התא, באמצעות מבחנים אימונוסורבנטיים הקשורים לאנזימים (ELISA).
RhEs נמצאים בשימוש נרחב ככלי הקרנה בתחום התרופות והדרמטו-קוסמטיקה36,75,76,77,78. למרות שמספר חברות הפכו RhEs כאלה לזמינים מסחרית, הן נשארות יקרות ומגבילות את האפשרות לשנות את הפרמטרים של הטיפוח כנדרש כדי לענות על שאלות מחקר חדשות. מאמר זה מתאר את הליך הייצור של ריס בתוך הבית בצורה חזקה ואמינה ומספק אפיון מפורט של הרקמות המתקבלות כדי לאשר את הרלוונטיות של המודל כגישה חלופית לניסויים בבעלי חיים.
חלק מהשלבים בפרוטוקול חיוניים כדי להבטיח בידול קרטינוציט נאותה ושחזור RhE. זה יכול להתבצע על ידי ניצול התאים האופטימליים, סוגים בינוניים, ותנאי טיפוח. במודל RhE המוצע, NHEKs יילודים נבחרו בשל חוסר החשיפה האנטיגנית שלהם, בהשוואה NHEKs מבוגרים. יתר על כן, קרטינוציטים הוגבלו למוצא האתני הקווקזי כדי למנוע שונות בין מינים. קרטינוציטים ראשוניים משמשים בדרך כלל ליכולתם להבדיל ולריבוד79. ניתן להשיגם באופן מסחרי או על ידי בידוד פנימי מעור מבוגר80. הטיפוח של קו תאים (כלומר, HaCaT) על קרום פוליקרבונט, הוכיח להיכשל בידול והפגין יכולת לקויה לסנתז שומנים הדרושים להיווצרות מחסום81. עם זאת, הכללת מטריצות תרבות שונות, כגון הידרוג’לים, קולגן, פיברין ותרבויות ספרואידים, הביאה להתפתחות מוצלחת של דגמי עור תלת-ממדיים78,82,83,84,85,86. קווי התאים המונצחים, N/TERT, הוכחו כמתאימים לפיתוח RhEs35. קרטינוציטים ראשוניים נשארים מתרבים בקטע הרביעי או החמישי שלהם61לכן הפרוטוקול הנוכחי כולל שימוש בקרטינוציטים בקטע השלישי שלהם. דה Vuyst ואח ‘ הוכיחו כי צפיפות זריעת התא הוא בעל חשיבות צריך להיות מספיק (כלומר, ≥ 2.5×105 תאים/ס”מ2) כדי להבטיח שהמדיום מתא הבזולטרלי לא יתפזר לתא האפical. צפיפות זריעה לא מספקת (כלומר, < 2.5×105 תאים/ס”מ2) יכול לגרום לחוסר יכולת ליצור מחסום ראוי, אשר מסומן על ידי דיפוזיה של מדיום מן basolateral לתא apical, וכתוצאה מכך שקוע במקום תנאי תרבות ALI62. מדיום צמיחה קרטינוציט ללא סרום (ראה טבלת חומרים) הועדף למטרות רבייה, שכן הוא מציע את היתרון של עבודה עם מדיום מוגדר כימית ומפחית את הסיכון לזיהום. למדיום זה יש ריכוז סידן נמוך יותר (כלומר, 60 מיקרומטר) ולכן מגרה את התפשטות הקרטינוציטים87. הגדלת ריכוז הסידן (כלומר, 1.5 מ”מ) מהשלב הראשון של טיפוח RhE, מעדיף בידול קרטינוציט והיווצרות מחסום עור והומאוסטזיס49. בנוסף, המדיום ALI הוא בתוספת חומצה אסקורבית, אשר הוכיחה להיות חיוני להיווצרות של שומנים SC ולקדם בידול52,53,54. המדיום ALI מכיל גם KGF, שהוא גורם גדילה המופרש על ידי פיברובלסטים שיכולים להיקשר לקולטנים transmembrane קרטינוציט ותוקפה יש תפקיד כפול בידול ותיקון פצעים55,88. חשוב לרענן את המדיום ALI במרווחי זמן ספציפיים, כדי לספק אספקה מתמדת של חומרים מזינים טריים RhEs. השימוש במערכת לוח נושא חיוני לטיפוח RhE בקנה מידה גדול יותר (כלומר, 24 מוסיף / צלחת). הוא מציע את היתרון של חיסכון בזמן, הפחתת הסיכון לזיהום, ומשאיר פחות מקום להכנסת טעויות אנוש. זה גם מספק את האפשרות לתרבות RhEs בנפח גבוה של מדיה (כלומר, 1.5 מ”ל), אשר מקטין את המספר הנדרש של רענון בינוני ALI. בנוסף, הוא מציע את האפשרות להעביר צלחת מלאה של מוסיף לצלחת עם מדיום טרי, הימנעות ממגע עם מוסיף בנפרד או לחשוף את מכסה הצלחת.
ישנן מספר מגבלות של מודל RhE שיש לציין. בעור האדם המקומי יש שיווי משקל בין התפשטות הקרטינוציטים בשכבת הבסיס לבין ניתוק הקורנפלומיטים ב- SC (כלומר, פירוק)89. עם זאת, במבחנה, desquamation אינו מתרחש. לכן, corneocytes להישאר מחובר RhE וליצור SC עבה כי הוא פחות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. לפיכך, יש טווח זמן טיפוח מוגבל של RhEs. יתר על כן, מודל RhE זה הוא פשוט וישיר, שכן הוא מורכב מסוג תא יחיד, כלומר, קרטינוציט, שהוא סוג התא הנפוץ ביותר של האפידרמיס. עם זאת, ישנם סוגי תאים אחרים המתגוררים באפידרמיס, כגון מלנוציטים, תאים דנדריטיים (כלומר, תאי לנגרהאנס), תאי T (למשל, CD8+ תאים) ותאי מרקל13. כדי לשפר את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודל העור, החוקרים הפכו את מודלי העור למורכבים יותר על ידי הוספת מלנוציטים38 תאי מערכת החיסון,39או תאים שמקורם על-ידי המטופל,90. יש לזכור כי תכונות המחסום של מודלים עור אנושי שונים בהשוואה לעור אנושי ילידי, בשל הרכב שומני SC שונה חדירות מחסום גבוה יותר 91,92,93,94,95. עם זאת, מספר מחקרים דיווחו על שינויים במאפייני המחסום של מודלים של עור אנושי על ידי טיפוח תחת היפוקסיה96 או ירידה בלחות יחסית97אפנון המטריצה העורית עם צ’יטוסאן,98ושינוי בחומצות השומן החופשיות במדיום התרבות,99. יתר על כן, הן RhEs פשוט ומורכב יותר, תנאי התרבות הרכב בינוני ניתן לווסת לחקות תכונות פתולוגיות. על ידי קריאת תיגר על המודל עם ציטוקינים, מורפולוגיה חריגה100 ושינויים ברמות ביטוי גנים וחלבונים ניתן לקבוע כי הם נצפו בדרך כלל בהפרעות עור נפוצות, כגון אטופיק דרמטיטיס ופסוריאזיס35,101,102,103,104,105. השתקת גנים ספציפיים בקרטינוציטים לפני ייזום תהליך ההשתקה מחדש של מודל תלת-ממד היא גישה נוספת המשמשת לחיקוי תכונות של הפרעות עור ולחקור פתרונות טיפוליים חדשים106,107. מלבד דוגמנות שכבת אפידרמיס בלבד, ניתן לכלול במודל תא עורי (כלומר, שווה ערך לעור אנושי או מודלים בעובי מלא) על ידי הטמעת פיברובלסטים במטריצת קולגן לפני ארגון מחדש של RhE, מה שהופך אותו לרלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית ומתאים למחקרים הקשורים להזדקנות וריפוי פצעים.108,109,110. בנוסף, ספירואידים גידול נוספו שווה ערך לעור האדם כדי ללמוד התקדמות מלנומה111,112. ההתקדמות האחרונה בתחום דגמי העור היא ביו-הדפסה ועור על שבב. קבוצות מחקר מרובות הצליחו לאחרונה בפיתוח מקבילות עור ביו-מודפסות (perfusable)45,113,114. הפרוטוקול המוצע מנצל פורמט של 24 באר ולוחית צליל תקשורת, ונמנע מתוספות שיש לטפל בהן בנפרד. עם זאת, סולם המחקר עדיין מוגבל למדי וחסר אוטומציה. על ידי יישום השימוש בביו-הדפסה או עור על שבב, ניתן להשתמש בדגמי עור קטנים יותר עם תהליכים אוטומטיים יותר ובקנה מידה גדול יותר.
ל- RhE המתואר בפרוטוקול זה יש קווי דמיון רבים לדגמי האפידרמיס המסחריים שכבר פותחו ומאופיינים היטב. הניתוח המורפולוגי הוכיח כי למרות שמספר השכבות המעשיות במודל RhE המוצע נמוך יותר בהשוואה לזה של עור אנושי מקומי (כלומר, 6-7 לעומת 7-14), הוא דומה לזה של מודל EpiDerm RhE (כלומר, 8-12)70. בדומה לדגמי האפידרם, האפיסקין ו- SkinEthic, שכבת RhE העליונה מציגה תבנית אריגת סל של שכבות קורנוציטים צפופות28. יתר על כן, ניתוח TEM גילה כי מספר שכבות SC במודל RhE המוצע (כלומר, 15-25) דומה לזה של EpiDerm (כלומר, 16-25)70. בסך הכל, מודל RhE המוצע מדגים מבנה דומה לזה של מודלים אפידרמיס ממוסחרים אחרים, מחקה את האפידרמיס האנושי יליד. שלמות הרקמה כפי שהיא נמדדת על ידי TEER היא בטווח עם דגמי RhE מסחריים (כלומר, בין 3000-5600 Ω.cm2)71,72,73 ו RhEs אחרים בתוך הבית (כלומר, כ 5000 Ω.cm2)74,115. מודל RhE המוצע מראה להיות מובחן היטב, כפי שצוין על ידי נוכחות ולוקליזציה נכונה של בידול וסמני הידבקות רקמות. יתר על כן, מודל RhE המוצע מראה להיות מגיב גירויים proinflammatory (כלומר, LPS ו TNF-α).
לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי מראה כיצד לייצר RhEs בצורה אמינה ובקנה מידה גדול יחסית כדי לענות על הצרכים של חוקרים במוסדות אקדמיים ופרטיים כאחד. מודל RhE המוצע מראה שיש מורפולוגיה דומה, בידול אפידרמיס, והיענות ביולוגית למודלים מסחריים קיימים אחרים. הוא מספק כלי חלופי הן לתחום התרופות והן לתחום הדרמטו-קוסמטיקה כאשר נדרשת גישה למודל עור רלוונטי.
The authors have nothing to disclose.
תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת מענק מארי סקלודובסקי-קירי עם הסכם המענק מס’ 765602 מימנה עבודה זו. כל המחברים מכירים בתמיכת קרן אדולף מרקל ואוניברסיטת פרארה ומכירים בהכרת תודה בדאו סיליקון בלגיה. ד”ר מיגל Spuch-Calvar הוא הודה להכנת התמונות הגרפיות של תהליך הטיפוח RhE. המחברים מודים לד”ר ברברה דרסלר, ד”ר פרנקו סרבלטי וד”ר אגנס טסייה על התמיכה הטכנית והדיונים.
Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Antibiotic-antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15240062 | |
Aqueous Eosin Y solution | Sigma Aldrich | HT110280 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich or Merck | C8106 or 1.02378.0500 | Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 °C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. |
DAPI | Roche | 10236276001 | Prepare a stock at 100 μg/mL and store aliquots at -20 °C. Working conditon is 1 μg/mL. |
Entellan mounting medium | Merck | 1.07960.0500 | Mounting medium for H&E staining. |
EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | MEPI500CA | Contains 0.06 mM of Ca2+. |
Ethanol absolute | Any supplier | N/A | |
Formalin 10% | Leica Biosystems | 3800770 | |
Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | S0015 | To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 μg/mL hydrocortisone,5 μg/mL bovine transferrin, and 0.01 µg/mL human recombinant insulin-like growth factor-I. |
Isopropanol | Biosolve B.V. | 0016264102BS | |
Kaiser's glycerol gelatine, phenol-free | Merck | 1.08635.0100 | Mounting medium for IF staining. |
Keratinocyte growth factor (KGF) | R&D Systems | 251-KG-050 | Reconstitute KGF protein at 100 μg/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20°C. |
Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit | Roche | 4744926001 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20°C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark. |
Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5 | Sigma-Aldrich | L4524 | Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 °C. Working concentration is 100 μg/mL. |
Mayer’s Haematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS80 | |
Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) | Lonza | 00192906 | Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors. |
Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010056 or 10010-015 | Reference numbers can vary between countries. |
Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | ImmunoTools | 11344483 | Prepare a stock of 100 μg/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL |
Sterile ultrapure water | Any supplier | N/A | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93426 | |
Trypan blue (0.4% [v/v]) | Any supplier | N/A | |
Trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | R007100 | |
Trypsin/EDTA (0.05% [v/v]) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 25300054 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | Ab150113 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | Merck | 1.06448.0500 | For antigen retrieval buffer for IF staining. |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Dylight 488) | Agrisera | AS09 633 | |
Filaggrin Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-53243 | |
Involucrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-33742 | |
Keratin 10 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-32962 | |
Desmoglein-1 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | MAB944 | |
Loricrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP1-33610 |