यह प्रोटोकॉल प्रजनन योग्य और मजबूत तरीके से त्रि-आयामी पुनर्गठित मानव एपिडर्मिस की खेती करने के लिए एक सीधी विधि का वर्णन करता है। इसके अतिरिक्त, यह एपिडर्मल बैरियर मॉडल के संरचना-कार्य संबंध की विशेषता है। प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं पर पुनर्गठित मानव एपिडर्मिस की जैविक प्रतिक्रियाएं भी प्रस्तुत की जाती हैं।
नवजात प्राथमिक केराटिनोसाइट्स से पुनर्निर्मित एक त्रि-आयामी मानव एपिडर्मिस मॉडल प्रस्तुत किया गया है। इसके साथ ही, खेती की प्रक्रिया और मॉडल के लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। नवजात प्राथमिक केराटिनोसाइट्स पारम पॉलीकार्बोनेट आवेषण पर जलमग्न हो जाते हैं और सीडिंग के तीन दिन बाद एयर-लिक्विड इंटरफेस में उठा ले जाते हैं । उच्च कैल्शियम संस्कृति माध्यम में परिभाषित विकास कारकों और एस्कॉर्बिक एसिड के साथ उत्तेजना के चौदह दिनों के बाद, मॉडल पूरी तरह से अलग है। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने एक पूरी तरह से स्तरीकृत एपिडर्मिस का खुलासा किया, जो देशी मानव त्वचा की आकृति विज्ञान की नकल करता है। मॉडल और उसके बाधा कार्यों की विशेषता के लिए, प्रोटीन का स्तर और स्थानीयकरण प्रारंभिक चरण के लिए केराटिनोसिटे भेदभाव (यानी, केराटिन 10), देर से चरण भेदभाव (यानी, इनवोलुक्रिन, लोरिक्रिन, और फिलाग्रिन) और ऊतक आसंजन (यानी, डेस्मोग्लेइन 1) का आकलन इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किया गया था। ऊतक बाधा अखंडता आगे ट्रांसेपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया गया था । आरएक्स्ट्रक्टेड ह्यूमन एपिडर्मिस प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं (यानी, लिपोपोलीसैकराइड और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा) के लिए उत्तरदायी था, जिससे साइटोकिन रिलीज (यानी, इंटरल्यूकिन 1 अल्फा और इंटरल्यूकिन 8) बढ़ गया था। यह प्रोटोकॉल पर्यावरणीय प्रभावों और त्वचा से संबंधित अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला का आकलन करने के लिए एक उपकरण के रूप में पुनर्निर्मित मानव एपिडर्मिस की खेती करने के लिए एक सीधी और प्रजनन योग्य इन विट्रो विधि का प्रतिनिधित्व करता है।
एपिडर्मिस मानव शरीर और बाहरी वातावरण के बीच सीधे इंटरफेस पर त्वचा की सबसे बाहरी परत है। इसका मुख्य कार्य सुरक्षा और जलयोजन प्रदान करनाहै 1. एपिडर्मिस बाहरी एजेंटों के खिलाफ एक प्रभावी शारीरिक बाधा के रूप में कार्य करता है और शरीर से अत्यधिक पानी की हानि को रोकता है। ये त्वचा कार्य मुख्य रूप से त्वचा की सबसे बाहरी परतों, संरचना और इंटरसेलुलर लिपिड2के संगठन में सेलुलर व्यवस्था पर निर्भर करते हैं। एपिडर्मिस मुख्य रूप से केराटिनोसाइट्स से बना है जो ऊतक के बाहरी हिस्से में ऊपर की ओर प्रवास करता है और भेदभाव से गुजरता है। 4-5 एपिडर्मल परतें हैं जो उनके भेदभाव के चरण की विशेषता हैं। अंदर से बाहर तक एपिडर्मल लेयर व्यवहार्य एपिडर्मिस यानी स्ट्रेटम बेसले (एसबी), स्ट्रैटम स्पिनोसम (एसएस) और स्ट्रैटम ग्रैनुलोसम (एसजी) से शुरू होकर गैर-व्यवहार्य ऊपरी परत यानी स्ट्रैटम कॉर्नियम (एससी)3से होती है । बेसल परत मुख्य रूप से केराटिन-समृद्ध केराटिनोसाइट्स से बनी है, जो एसएस के माध्यम से भेदभाव4पर माइग्रेट होती है। केराटिनोसिट परिपक्वता के दौरान, प्रोटीन अभिव्यक्ति और संरचना में विभिन्न परिवर्तन होते हैं। केराटिनोसाइट्स डेस्मोसोमल जंक्शनों 5 केगठनके माध्यम से पालन करते हैं । एसजी में लैलूंगा निकायों की पीढ़ी शुरू की जाती है। इनमें लिपिड अग्रदूत और एंजाइम होते हैं जो त्वचा बाधा कार्य के गठन के लिए महत्वपूर्ण हैं6. एसजी भी केराटिनोसाइट्स के साइटोप्लाज्म में केराटोयालिन कणिकाओं की उपस्थिति की विशेषता है। अनुसूचित जाति के साथ इंटरफेस पर, लैमलर निकायों की सामग्री को अंतरकोशिकीय रिक्त स्थान में निकाला जाता है और सेरामाइड्स, कोलेस्ट्रॉल और मुफ्त फैटी एसिड जैसे गैर-ध्रुवीय लिपिड बाह्य लैमेलर लिपिड बिलियर्स में बाह्य लिपिड मैट्रिक्स7बनाने के लिए व्यवस्थित होते हैं। अनुसूचित जाति में, कोशिकाएं एंजाइमैदार गिरावट प्रक्रियाओं के कारण नाभिक सहित सभी सेलुलर ऑर्गेनेल्स खो देती हैं और एक चपटी आकृति विज्ञान को अपनाती हैं। वे क्रॉस-लिंक्ड प्रोटीन परतों से बने एक कॉर्निफाइड लिफाफे से घिरे हुए हैं, और उन्हें कॉर्नियोसाइट्स8, 9के रूप में जानाजाताहै। डेस्मोसोमल घटक कॉर्नियोडोसोम्स बनाने के लिए कॉर्निफाइड लिफाफे से क्रॉस-लिंक होते हैं और कॉर्नियोसाइट्स को एक साथ बांधते हैं। परिणामस्वरूप एपिथेलियम लगातार स्टेम सेल से नवीनीकृत किया जाता है, लगभग 5-6 सप्ताह10के कारोबार के समय के साथ । केराटिनोसाइट्स की भेदभाव प्रक्रिया, जिसके परिणामस्वरूप पूरी तरह से स्तरीकृत एपिडर्मिस होता है, त्वचा11के बाधा कार्य के गठन के लिए महत्वपूर्ण है।
घायल और सूजन के दौरान, केराटिनोसाइट्स आसंजन अणुओं और सतह रिसेप्टर्स में परिवर्तन को प्रेरित करते हैं और साइटोकिन्स, केमोकिंस और एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स12के स्राव के माध्यम से प्रोइनफ्लेमेटरी प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करते हैं। त्वचा न केवल बहिर्जात पदार्थों के खिलाफ एक शारीरिक बाधा है; यह रोगजनकों के संपर्क में आने पर एक प्रतिरक्षा सेंसर के रूप में भी कार्य करता है। इसके अलावा, यह अपनी परतों में कई पदार्थों के प्रसार को नियंत्रित करता है, जैसे कि मानव शरीर को निर्जलीकरण से बचाने के लिए पानी की मात्रा। त्वचा विटामिन डी के संश्लेषण में भी शामिल है और इसमें विभिन्न अन्य मेटाबॉलिक कार्यहैं 3,13,14.
बहिर्जात पदार्थों के प्रतिकूल प्रभावों का आकलन करने के लिए विष विज्ञानियों ने पशु परीक्षण पर दशकों से भरोसा किया है, लेकिन आजकल यह पसंदीदा दृष्टिकोण नहीं है । मानव विषाक्तता के लिए सीमित भविष्य कहनेवाला क्षमता होने के अलावा, पशु मॉडल कई नैतिक मुद्दों को शामिल । कॉस्मेटिक उद्योग में पशु परीक्षण पर प्रतिबंध और अनुसंधान में 3आर सिद्धांत (यानी, प्रतिस्थापन, कमी और शोधन) का पालन करने की सिफारिश के कारण इन विट्रो दृष्टिकोण15के आधार पर वैकल्पिक परीक्षण विधियों का विकास हुआ है। 90 के 90 के में पहले इन विट्रो त्वचा सेल मॉडल का वर्णन पहले ही किया जा चुका है, और सरल मानव केराटिनोसाइट मोनो-संस्कृतियों से पूरी तरह से विभेदित एपिडर्मिस और पूर्ण मोटाई मॉडल के लिए एक प्रभावशाली विकास16हासिल किया गया है। आजकल, त्वचा ऊतक इंजीनियरिंग दोनों दवा और डर्माटो कॉस्मेटिक क्षेत्रों में महत्व प्राप्त किया है । पिछले दो दशकों में, कई कंपनियों ने त्रि-आयामी (3 डी) का व्यावसायीकरण किया है जो मानव एपिडर्मिस (आरएचई) का पुनर्निर्माण करता है जो त्वचा से संबंधित अध्ययनों के लिए मानकीकृत और प्रजनन योग्य उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्वचा की जलन17, 18(यानी, परीक्षण दिशानिर्देश 43919) और त्वचा जंग20 (यानी, परीक्षण दिशानिर्देश 43121)के परीक्षण के लिए ओईसीडी दिशानिर्देशों के अनुसार रसायनों के इन विट्रो त्वचा परीक्षण के लिए कई वाणिज्यिक आरएचई मॉडल स्वीकार किए जाते हैं। त्वचा संवेदीकरण के लिए इन विट्रो परीक्षण22 (यानी, सेंस-आईएस परख) वर्तमान में अनुमोदन ट्रैक में है और पीयर-रिव्यू23के तहत है । फोटोटॉक्सिसिटी24का मूल्यांकन करने, दवा योगों का परीक्षण करने के लिए, कॉस्मेटिक फॉर्मूलेशन25,कॉस्मेटिक फॉर्मूलेशन और सक्रिय अवयवों26का परीक्षण करने के लिए, त्वचा बाधा समारोह का अध्ययन करने और पर्यावरणीय तनावों के लिए जैविक प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के लिए28,29, 30,31।
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 3डी त्वचा मॉडलों के अलावा, कई शोध समूहों ने अपने स्वयं के आरएचईएस32, 33,34,35,36,37विकसित किए हैं। इन-हाउस आरएचईएस अध्ययन के उद्देश्य के अनुसार संस्कृति की स्थितियों को नियंत्रित करने के लिए लाभ प्रदान करते हैं। विशेष रूप से, शोधकर्ता अपने 3 डी एपिडर्मल मॉडल (यानी, प्राथमिक बनाम अमर, नवजात बनाम वृद्ध, एकल बनाम पूल्ड यादृच्छिक दानदाताओं, लिंग, जातीयता, धूम्रपान, आदि जैसे व्यक्तिगत रहने की आदतों) के पुनर्गठन के लिए उपयोग किए जाने वाले केराटिनोसाइट्स के प्रकार और स्रोत का चयन कर सकते हैं। उनके पास संस्कृति माध्यम की संरचना में भिन्नता और विकास कारकों, विटामिन, या अन्य यौगिकों को शामिल करने की संभावना है जो लक्षित प्रोटीन या लिपिड की अभिव्यक्ति को संशोधित कर सकते हैं। इन-हाउस आरएचईएस के साथ, शोधकर्ता 3 डी मॉडल के विभेदन स्थिति के एक समारोह के रूप में जैविक प्रतिक्रियाओं और बायोमैकेनिकल गुणों की भी जांच कर सकते हैं। उन सहज मापदंडों के अलावा, 3डी त्वचा मॉडल की जटिलता को बढ़ाने और उन्हें अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक बनाने के लिए निरंतर प्रयास किए जा रहे हैं, उदाहरण के लिए अन्य एपिडर्मल सेल प्रकारों (जैसे मेलानोसाइट्स और प्रतिरक्षाकोशिकाओं)38,39को जोड़कर, फाइब्रोब्लास्ट आबादी वाले कोलेजन मैट्रिक्स40, 41, 42केशीर्ष पर केराटिनोसाइट्स को जोड़कर और संवहनी नेटवर्क43,44, 45के घटकों को शामिल करके।
हालांकि विशिष्ट जरूरतों के अनुसार संस्कृति की स्थिति को ट्यून करना संभव है, ऐसे पैरामीटर हैं जिन्हें आरएचई की गुणवत्ता और प्रासंगिकता दोनों की गारंटी देने के लिए सम्मानित किया जाना चाहिए। आरएचई ऊतकों की खेती करने के लिए, सामान्य मानव एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स (एनएचईके) को विशिष्ट पारगम्य संस्कृति आवेषण में वरीयता प्राप्त किया जाता है जिसकी असुरक्षित सिंथेटिक झिल्ली कुओं को दो डिब्बों में अलग करती है, यानी, एपिकल और बेसोटेरल डिब्बे। झिल्ली की छिद्रता (यानी, 0.4 माइक्रोन का एक पोर आकार) ऐसा है कि यह बेसल डालने पक्ष में कोशिकाओं के प्रवास के साथ एपिकल डिब्बे में सेल मोनोलेयर के गठन की अनुमति देता है, और बेसल डालने के माध्यम से आवश्यक पोषक तत्वों के साथ केराटिनोसाइट्स की फीडिंग करता है। पुनर्गठन प्रक्रिया की शुरुआत में, NHEKs कुछ दिनों के लिए जलमग्न परिस्थितियों में सुसंस्कृत करने के लिए झिल्ली पर उनके आसंजन की अनुमति है । दोनों डिब्बों में कैल्शियम का स्तर एनएचईके की 2डी संस्कृति के लिए उपयोग की जाने वाली कैल्शियम एकाग्रता की तुलना में बढ़ा है ताकि कोशिकाओं के प्रसार को धीमा किया जा सके और उनके भेदभावको बढ़ावादिया जा सके । बाधा बनने और होयोस्टेसिस47 , 48को विनियमित करने के लिए एपिडर्मल कैल्शियम ढाल आवश्यक है । उच्च कैल्शियम का स्तर (यानी, 1.5 m m तक) इंटरसेलुलर जंक्शनों के गठन को बढ़ावा देता है और टर्मिनल भेदभाव49के दौरान कॉर्निफाइड लिफाफे के गठन को संशोधित करता है। एक बार जब केराटिनोसाइट्स सहायक झिल्ली पर एक निरंतर और कसकर अनुयायी मोनोलेयर बनाते हैं, तो एपिकल डिब्बे से माध्यम को हटा दिया जाता है और स्तरीकरण को प्रोत्साहित करने और एक एपिडर्मल बैरियर50, 51 स्थापितकरने के लिए वायु-तरल इंटरफ़ेस (अली) पर संस्कृति प्रक्रिया जारी रहती है। पूरी तरह से स्तरीकृत एपिथेलियम36प्राप्त करने के लिए विशिष्ट संस्कृति की स्थिति महत्वपूर्ण है । अली में पुनर्गठन प्रक्रिया के दौरान, बेसोलेटरल डिब्बे में माध्यम को केराटिनसाइट ग्रोथ फैक्टर (केजीएफ), इंसुलिन, कैल्शियम और एस्कॉर्बिक एसिड के साथ पूरक किया जाता है। एस्कॉर्बिक एसिड एक उपयुक्त अनुसूचित जाति लिपिड बाधा के गठन में एक प्रमुख भूमिका निभाता है, जो देशी मानव त्वचा52से निकटता से मिलता-जुलता है। एस्कॉर्बिक एसिड-पूरक माध्यम में उगाए जाने वाले केराटिनोसाइट्स एक विभेदित फेनोटाइप प्रदर्शित करते हैं, जिसमें केराटोयालिन कणिकाओं की बढ़ी हुई संख्या के साथ-साथ कॉर्नियोसाइट्स52के इंटरस्टिस में इंटरसेलुलर लिपिड लैमेले का आयोजन किया जाता है। कॉर्निफाइड लिफाफा सामग्री में वृद्धि करके और हाइड्रोफिलिक एंटीऑक्सीडेंट स्टोर53,54की कमी से बचने के लिए एपिडर्मल बैरियर कार्य में सुधार करने के लिए इस तरह की पूरकता आवश्यक है । केजीएफ, एपिडर्मल प्रसार और भेदभाव का एक महत्वपूर्ण पैराक्राइन मध्यस्थ, एनएचईके55को प्रोत्साहित करने के लिए उपयोग किया जाता है।
इन-हाउस आरएचईएस के मुख्य डाउनसाइड्स में अनुसंधान संस्थानों के बीच मानकीकरण का नुकसान और श्रम तीव्रता और समय की खपत में वृद्धि (तैयार-टू-उपयोग वाणिज्यिक मॉडलों की तुलना में 3 सप्ताह तक) शामिल है। वर्तमान पत्र का उद्देश्य इन कमियों को दूर करना है, जो बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए आधार निर्धारित करते हैं । इन-हाउस आरएचईएस के उपर्युक्त लाभों के अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य ऊतकों के बीच अंतर-और अंतर-परिवर्तनशीलता को कम करना, संदूषण जोखिमों को कम करना और खेती की प्रक्रिया को कारगर बनाना है।
वर्तमान प्रोटोकॉल नवजात एनएचईके का उपयोग करके RhEs की खेती करने के लिए एक प्रजनन योग्य और मजबूत विधि का वर्णन करता है। इसके अलावा, यह आरएचईएस आकृति विज्ञान, बाधा अखंडता और प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लक्षण वर्णन के प्रतिनिधि परिणामों को दर्शाता है जो एपिडर्मल भेदभाव के लिए विशिष्ट हैं। हेमेटॉक्सीलिन और ईओसिन (एचएंडई) स्टेनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग करके आरएचईएस रूपात्मक संरचना की जांच की गई थी। बाधा अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए, ट्रांसपेडरमल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) और ट्राइटन एक्स-100 के एक्सपोजर समय को ऊतक व्यवहार्यता (ईटी50)के 50% को कम करने के लिए मापा गया था। केराटिनोसिटे आसंजन का मूल्यांकन करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) द्वारा डेस्मोसोमल जंक्शनों (यानी, डेस्मोग्लेन 1) के गठन का विश्लेषण किया गया था। एपिडर्मल स्ट्रक्चरल प्रोटीन (यानी, इनोलूक्राइन, लोरिक्रिन और फिलाग्रिन) के गठन का मूल्यांकन किया गया और आईएफ के साथ इसका पता लगाया गया। ये प्रोटीन अत्यधिक क्रॉस-लिंक्ड प्रोटीन लिफाफे के गठन में शामिल होते हैं जो एससी कॉर्नियोसाइट्स को घेरे हुए हैं और परिणामस्वरूप देर से चरण के एपिडर्मल भेदभाव56,57के लिए महत्वपूर्ण मार्कर हैं। इसके अतिरिक्त, यदि का उपयोग केराटिन 10 का विश्लेषण करने के लिए किया गया था, जो एसएस58 में प्रारंभिक चरण की विभेदित कोशिकाओं में प्रेरित प्रोटीन है और सभी विभेदित परतों के अंदर पाया जाता है। अंत में, प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं (यानी, लिपोपोलीसैकराइड और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा) के लिए आरएचई की प्रतिक्रिया की जांच की गई। एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) का उपयोग करके सेल कल्चर मीडिया में इंटरल्यूकिन 1 अल्फा (आईएल-1α) और इंटरल्यूकिन 8 (आईएल-8) के स्तर को मापा गया था।
आरएचई का व्यापक रूप से फार्मास्यूटिकल और डर्माटो-कॉस्मेटिक क्षेत्रों में स्क्रीनिंग टूल के रूप में उपयोग किया जाता है36,75,76,77,78. हालांकि कई कंपनियों ने इस तरह के RhEs व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कराया है, वे महंगे रहते है और नए अनुसंधान सवालों को संबोधित करने के लिए आवश्यक के रूप में खेती मापदंडों भिंन करने की संभावना को सीमित । यह पत्र इन-हाउस आरएचईएस की उत्पादन प्रक्रिया को एक मजबूत और विश्वसनीय तरीके से बताता है और पशु परीक्षण के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में मॉडल की प्रासंगिकता की पुष्टि करने के लिए प्राप्त ऊतकों का विस्तृत लक्षण वर्णन प्रदान करता है।
प्रोटोकॉल में कुछ कदम उचित keratinocyte भेदभाव और RhE प्रजनन को आश्वस्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । यह इष्टतम कोशिकाओं, मध्यम प्रकार (एस) और खेती की स्थिति का उपयोग करके किया जा सकता है। प्रस्तावित आरएचई मॉडल में, वयस्क एनएचईके की तुलना में एंटीजेनिक एक्सपोजर की कमी के लिए नवजात एनएचईके का चयन किया गया था। इसके अलावा, केराटिनोसाइट्स अंतर-प्रजातियों परिवर्तनशीलता से बचने के लिए कोकेशियान जातीयता तक सीमित थे। प्राथमिक केराटिनोसाइट्स का उपयोग आमतौर पर अंतर करने और स्तरीकरण करने की उनकी क्षमता के लिए किया जाता है79. वे व्यावसायिक रूप से या वयस्क त्वचा से घर में अलगाव द्वारा प्राप्त किया जा सकता है80. पॉलीकार्बोनेट झिल्ली पर एक सेल लाइन (यानी, HaCaT) की खेती ने भेदभाव को विफल करने के लिए दिखाया है और बाधा गठन के लिए आवश्यक लिपिड को संश्लेषित करने के लिए एक बिगड़ा क्षमता का प्रदर्शन किया है81. हालांकि, विभिन्न संस्कृति मैट्रिस के शामिल होने, जैसे हाइड्रोगेल, कोलेजन, फाइब्रिन, और गोलाकार संस्कृतियों, 3 डी त्वचा मॉडल के सफल विकास के परिणामस्वरूप78,82,83,84,85,86. अमर सेल लाइनों, N/TERT, RhEs के विकास के लिए उपयुक्त दिखाया गया है35. प्राथमिक केराटिनोसाइट्स अपने चौथे या पांचवें मार्ग पर प्रसारित रहते हैं61, इसलिए वर्तमान प्रोटोकॉल में उनके तीसरे मार्ग में केराटिनोसाइट्स का उपयोग शामिल है। डी Vuyst एट अल ने दिखा दिया है कि सेल सीडिंग घनत्व महत्व का है और पर्याप्त होने की जरूरत है (यानी, ≥ 2.5×105 कोशिकाएं/सेमी2) यह सुनिश्चित करने के लिए कि बसोटेरल डिब्बे से माध्यम एपिकल डिब्बे तक फैलाना नहीं है। एक अपर्याप्त सीडिंग घनत्व (यानी, < 2.5×105 कोशिकाएं/सेमी2) एक उचित बाधा बनाने में असमर्थता में परिणाम कर सकते हैं, जो बेसोलाटरल से एपिकल कंपार्टमेंट तक माध्यम के प्रसार से संकेत मिलता है, जिसके परिणामस्वरूप अली संस्कृति की स्थिति के बजाय जलमग्न हो जाता है62. सीरम मुक्त keratinocyte विकास माध्यम (देखें सामग्री की तालिका) प्रजनन प्रयोजनों के लिए पसंद किया गया था, क्योंकि यह एक रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम के साथ काम करने का लाभ प्रदान करता है और संदूषण के जोखिम को कम कर देता है। इस माध्यम में कैल्शियम एकाग्रता कम होती है (यानी, 60 माइक्रोन) और इसलिए केराटिनोसाइट्स के प्रसार को उत्तेजित करता है87. आरएचई खेती के पहले चरण से कैल्शियम एकाग्रता (यानी, 1.5 mM) में वृद्धि, केराटिनोसाइट भेदभाव और त्वचा बाधा गठन और हो्योस्टेसिस के पक्ष में है49. इसके अलावा, अली माध्यम को एस्कॉर्बिक एसिड के साथ पूरक किया जाता है, जो अनुसूचित जाति लिपिड के गठन और भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है52,53,54. अली माध्यम में केजीएफ भी होता है, जो फाइब्रोब्लास्ट द्वारा स्रावित एक विकास कारक है जो केराटिनोसाइट ट्रांसमेम्ब्रान रिसेप्टर्स को बांध सकता है और सक्रियण पर भेदभाव और घाव की मरम्मत में दोहरी भूमिका होती है55,88. आरएचई को ताजा पोषक तत्वों की निरंतर आपूर्ति प्रदान करने के लिए, विशिष्ट समय अंतराल पर अली माध्यम को ताज़ा करना महत्वपूर्ण है। एक वाहक प्लेट प्रणाली का उपयोग बड़े पैमाने पर आरएचई खेती के लिए महत्वपूर्ण है (यानी, 24 आवेषण/प्लेट)। यह समय की बचत का लाभ प्रदान करता है, संदूषण के जोखिम को कम करने, और मानव त्रुटियों की शुरूआत के लिए कम जगह छोड़ देता है । यह मीडिया की उच्च मात्रा (यानी, 1.5 एमएल) में संस्कृति आरएचई को भी संभावना प्रदान करता है, जो अली माध्यम के ताज़ा होने की आवश्यक संख्या को कम करता है। इसके अतिरिक्त, यह ताजा माध्यम के साथ एक प्लेट में आवेषण की एक पूरी प्लेट स्थानांतरित करने की संभावना प्रदान करता है, व्यक्तिगत रूप से आवेषण के साथ संपर्क से बचने या प्लेट ढक्कन को उजागर करता है।
आरएचई मॉडल की कई सीमाएं हैं जिन्हें नोट किया जाना चाहिए। देशी मानव त्वचा में बेसल परत में केराटिनोसाइट्स के प्रसार और अनुसूचित जाति में कॉर्नियोसाइट्स की टुकड़ी (यानी, डेक्वेमेशन) के बीच एक संतुलन है89. हालांकि, इन विट्रो, डेस्क्वेशन नहीं होता है। इसलिए, कॉर्नियोसाइट्स आरएचई से जुड़े रहते हैं और एक मोटी अनुसूचित जाति बनाते हैं जो कम शारीरिक रूप से प्रासंगिक है। इसलिए, आरएचईएस की एक सीमित खेती समय-समय पर है। इसके अलावा, यह आरएचई मॉडल सरल और सीधा है, क्योंकि इसमें एक विलक्षण सेल प्रकार होता है, यानी केराटिनोसिट, जो एपिडर्मिस का सबसे प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार है। हालांकि, एपिडर्मिस में अन्य सेल प्रकार के निवासी हैं, जैसे मेलानोसाइट्स, डेंड्रिटिक कोशिकाएं (यानी, लैंगरहंस कोशिकाएं), टी कोशिकाएं (जैसे, सीडी 8+ कोशिकाओं), और मर्केल कोशिकाओं13. त्वचा मॉडल की शारीरिक प्रासंगिकता को बढ़ाने के लिए, शोधकर्ताओं ने मेलानोसाइट्स जोड़कर त्वचा मॉडल को और अधिक जटिल बना दिया है38 , प्रतिरक्षा कोशिकाएं39, या रोगी से व्युत्पन्न कोशिकाएं90. एक ध्यान में रखना चाहिए कि मानव त्वचा मॉडल के बाधा गुण देशी मानव त्वचा की तुलना में अलग हैं, विशेष रूप से एक अलग अनुसूचित जाति लिपिड संरचना और एक उच्च बाधा पारमशीलता के कारण 91,92,93,94,95. हालांकि, कई अध्ययनों हाइपोक्सिया के तहत खेती द्वारा मानव त्वचा मॉडल के बाधा गुणों में परिवर्तन की सूचना दी है96 या सापेक्ष आर्द्रता में कमी97, चिटोसन के साथ डर्मल मैट्रिक्स का मॉडुलन98, और संस्कृति माध्यम में मुक्त फैटी एसिड में परिवर्तन99. इसके अलावा, सरल और अधिक जटिल आरएचई दोनों में, संस्कृति की स्थिति और मध्यम संरचना को पैथोलॉजिकल सुविधाओं की नकल करने के लिए संग्राहक किया जा सकता है। साइटोकिन्स के साथ मॉडल को चुनौती देकर, एक असामान्य आकृति विज्ञान100 और जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन स्थापित किया जा सकता है जो आम तौर पर आम त्वचा विकारों में मनाया जाता है, जैसे एटोपिक डर्मेटाइटिस और सोरायसिस35,101,102,103,104,105. 3 डी मॉडल की पुनर्गठन प्रक्रिया शुरू करने से पहले केराटिनोसाइट्स में विशिष्ट जीन को मुंह से रखना त्वचा विकारों की विशेषताओं की नकल करने और नए चिकित्सीय समाधानों की जांच करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक और दृष्टिकोण है106,107. केवल एक एपिडर्मल परत मॉडलिंग के अलावा, एक डर्मल डिब्बे को मॉडल में शामिल किया जा सकता है (यानी, मानव त्वचा समकक्ष या पूर्ण मोटाई मॉडल का नाम) आरएचई पुनर्गठन से पहले कोलेजन मैट्रिक्स में फाइब्रोब्लास्ट एम्बेड करके, जिससे यह अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक और उम्र बढ़ने और घाव भरने से संबंधित अध्ययनों के लिए उपयुक्त हो जाता है108,109,110. इसके अतिरिक्त, मेलानोमा प्रगति का अध्ययन करने के लिए मानव त्वचा समकक्ष में ट्यूमर स्फेरॉइड जोड़े गए हैं111,112. स्किन मॉडल के क्षेत्र में नवीनतम प्रगति बायो-प्रिंटिंग और स्किन-ऑन-ए-चिप हैं। कई अनुसंधान समूहों (perfusable) जैव मुद्रित त्वचा समकक्ष के विकास में हाल ही में सफल रहे है45,113,114. प्रस्तावित प्रोटोकॉल एक 24 अच्छी तरह से प्रारूप और एक वाहक प्लेट का लाभ लेता है, आवेषण से परहेज करने के लिए व्यक्तिगत रूप से संभाला जाएगा । हालांकि, अध्ययन पैमाने अभी भी काफी सीमित है और स्वचालन का अभाव है । जैव-मुद्रण या त्वचा-ऑन-ए-चिप के उपयोग को लागू करके, छोटे त्वचा मॉडल का उपयोग अधिक स्वचालित प्रक्रियाओं और बड़े पैमाने पर किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित आरएचई में पहले से विकसित और अच्छी तरह से विशेषता वाले वाणिज्यिक एपिडर्मल मॉडल में कई समानताएं हैं। रूपात्मक विश्लेषण ने दिखा दिया है कि हालांकि प्रस्तावित आरएचई मॉडल में व्यवहार्य परतों की संख्या देशी मानव त्वचा (यानी, 7-14 की तुलना में 6-7) की तुलना में कम है, यह एपिडर्म आरएचई मॉडल (यानी, 8-12)70के बराबर है। इसी तरह एपिडर्म, एपिस्किन और स्किनएथिक मॉडल के लिए, ऊपरी आरएचई परत घनी पैक कॉर्नियोसाइट परतों28के बास्केट-बुनाई पैटर्न को दर्शाती है। इसके अलावा, TEM विश्लेषण से पता चला है कि प्रस्तावित RhE मॉडल (यानी, 15-25) में अनुसूचित जाति परतों की संख्या EpiDerm (यानी, 16-25)७०के बराबर है । कुल मिलाकर, प्रस्तावित आरएचई मॉडल अन्य व्यावसायीकृत एपिडर्मल मॉडल के समान संरचना को दर्शाता है, जो देशी मानव एपिडर्मिस की नकल करता है। टीईईआर द्वारा मापी गई ऊतक अखंडता वाणिज्यिक आरएचई मॉडल (यानी, 3000-5600 Ω.सेमी2)71, 72,73 और अन्य इन-हाउस आरएचईएस (यानी लगभग 5000 Ω.सेमी2)74,115के बीच है। प्रस्तावित आरएचई मॉडल को अच्छी तरह से विभेदित दिखाया गया है, जैसा कि भेदभाव और ऊतक आसंजन मार्कर की उपस्थिति और सही स्थानीयकरण द्वारा इंगित किया गया है। इसके अलावा, प्रस्तावित आरएचई मॉडल प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं (यानी एलपीएस और टीएनएफ-α) के लिए उत्तरदायी होने के लिए उत्तरदायी होने का पता चलता है।
समाप्त करने के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे एक विश्वसनीय तरीके से RhEs का उत्पादन करने के लिए और एक अपेक्षाकृत बड़े पैमाने पर दोनों अकादमिक और निजी संस्थानों में शोधकर्ताओं की जरूरतों को पूरा करने के लिए । प्रस्तावित आरएचई मॉडल में अन्य मौजूदा वाणिज्यिक मॉडलों के लिए समान आकृति विज्ञान, एपिडर्मल भेदभाव और जैविक जवाबदेही दिखाई गई है। यह दोनों दवा और डर्माटो कॉस्मेटिक क्षेत्र के लिए एक वैकल्पिक उपकरण प्रदान करता है जब एक प्रासंगिक त्वचा मॉडल के लिए उपयोग की आवश्यकता है ।
The authors have nothing to disclose.
यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम मैरी Skłodowska-क्यूरी अनुदान के तहत अनुदान समझौते के साथ नहीं 765602 इस काम वित्त पोषित । सभी लेखकों एडॉल्फे Merkle फाउंडेशन और फेरारा विश्वविद्यालय के समर्थन को पहचानते है और कृतज्ञता से डो सिलिकॉन बेल्जियम स्वीकार करते हैं । डॉ मिगुएल स्पुच-कलवर को आरएचई खेती प्रक्रिया की चित्रमय छवियों को तैयार करने के लिए स्वीकार किया जाता है। लेखक डॉ बारबरा ड्रेसलर, डॉ फ्रैंको सेरवेलाटी और डॉ एग्नेस टेसियर को उनके तकनीकी समर्थन और चर्चाओं के लिए धन्यवाद देते हैं ।
Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Antibiotic-antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15240062 | |
Aqueous Eosin Y solution | Sigma Aldrich | HT110280 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich or Merck | C8106 or 1.02378.0500 | Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 °C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. |
DAPI | Roche | 10236276001 | Prepare a stock at 100 μg/mL and store aliquots at -20 °C. Working conditon is 1 μg/mL. |
Entellan mounting medium | Merck | 1.07960.0500 | Mounting medium for H&E staining. |
EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | MEPI500CA | Contains 0.06 mM of Ca2+. |
Ethanol absolute | Any supplier | N/A | |
Formalin 10% | Leica Biosystems | 3800770 | |
Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | S0015 | To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 μg/mL hydrocortisone,5 μg/mL bovine transferrin, and 0.01 µg/mL human recombinant insulin-like growth factor-I. |
Isopropanol | Biosolve B.V. | 0016264102BS | |
Kaiser's glycerol gelatine, phenol-free | Merck | 1.08635.0100 | Mounting medium for IF staining. |
Keratinocyte growth factor (KGF) | R&D Systems | 251-KG-050 | Reconstitute KGF protein at 100 μg/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20°C. |
Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit | Roche | 4744926001 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20°C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark. |
Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5 | Sigma-Aldrich | L4524 | Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 °C. Working concentration is 100 μg/mL. |
Mayer’s Haematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS80 | |
Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) | Lonza | 00192906 | Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors. |
Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010056 or 10010-015 | Reference numbers can vary between countries. |
Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | ImmunoTools | 11344483 | Prepare a stock of 100 μg/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL |
Sterile ultrapure water | Any supplier | N/A | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93426 | |
Trypan blue (0.4% [v/v]) | Any supplier | N/A | |
Trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | R007100 | |
Trypsin/EDTA (0.05% [v/v]) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 25300054 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | Ab150113 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | Merck | 1.06448.0500 | For antigen retrieval buffer for IF staining. |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Dylight 488) | Agrisera | AS09 633 | |
Filaggrin Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-53243 | |
Involucrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-33742 | |
Keratin 10 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-32962 | |
Desmoglein-1 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | MAB944 | |
Loricrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP1-33610 |