该协议描述了一种简单明了的方法,以可复制和稳健的方式培养三维重组的人类表皮。此外,它还特征了表皮屏障模型的结构-功能关系。还介绍了重组后的人类表皮对前燃刺激的生物学反应。
介绍了从新生儿原发性角质细胞重建的三维人类表皮模型。在此,描述了栽培过程和模型特征的协议。新生儿原发性角蛋白细胞被浸入渗透聚碳酸酯插入物上,播种三天后提升到空气液体接口。经过14天的刺激,在高钙培养介质中具有明确的生长因子和抗酸,模型完全分化。组织学分析揭示了一种完全分层的表皮,模仿了原生人类皮肤的形态。为了描述模型及其屏障功能、蛋白质水平和针对早期角蛋白分化(即角蛋白10)、晚期分化(即非曲霉素、洛里林和长丝蛋白)和组织粘附(即脱脂素1),通过免疫荧光进行评估。通过测量跨层电阻进一步评估组织屏障完整性。R经济构想 的人类表皮对发炎刺激(即脂糖和肿瘤坏死因子α)有反应,导致细胞因子释放增加(即血红素1α和血红素8)。该协议代表一种简单易行的体外方法,旨在培养 重建的 人类表皮,作为评估环境影响和广泛皮肤相关研究的工具。
表皮是皮肤的最外层,位于人体与外部环境的直接界面上。其主要功能是提供保护和水化1。表皮作为防止外部制剂的有效物理屏障,防止身体过度缺水。这些皮肤功能主要取决于皮肤最外层的细胞排列、细胞间脂质2的组成和组织。表皮主要由角蛋白细胞组成,这些角蛋白细胞向上迁移到组织外侧并经历分化。有4-5个表皮层的特点是其分化阶段。从内部到外部,表皮层从可行的表皮开始,即地层基座(SB)、地层脊柱(SS)和地层颗粒(SG),到不可生存的最上层,即地层角膜(SC)3。基底层主要由增殖的角蛋白富含角蛋白细胞组成,在分化4时通过党团迁移。在角蛋白细胞成熟期间,蛋白质表达和结构发生各种变化。角蛋白细胞坚持通过形成脱烟体交汇点5。在SG中,启动了跛脚体的生成。它们由脂质前体和酶组成,对形成皮肤屏障功能至关重要。SG的特点是角蛋白颗粒在角蛋白细胞质中存在。在与SC的接口中,跛脚体的含量被挤出细胞间空间,非极性脂质(如脑酰、胆固醇和游脂酸)组织成堆积的拉米拉脂质双层,形成细胞外脂质基质7。在SC中,由于酶降解过程,细胞失去包括细胞核在内的所有细胞细胞,并采用扁平形态。它们被一个由交叉链接的蛋白质层构成的玉米化信封包围着,被称为角细胞8,9。脱硫体成分与玉米化信封交叉连接,形成角膜体,并将角细胞结合在一起。由此产生的上皮不断从干细胞中更新,周转时间约为5-6周10。角蛋白细胞的分化过程,导致一个完全分层的表皮,是关键形成皮肤11的屏障功能。
在受伤和炎症期间,角蛋白细胞诱导粘附分子和表面受体的变化,并通过细胞因子、化疗因子和抗菌肽12的分泌触发发炎反应。皮肤不仅是外源性物质的物理屏障:在接触病原体时,它也充当免疫传感器。此外,它还调节几种物质在其各层的扩散,如水含量,以保护人体免受脱水。皮肤也参与维生素D的合成,并具有各种其他代谢功能3,13,14。
为了评估外源性物质的不利影响,毒理学家几十年来一直依赖动物试验,但现在它不是首选的方法。动物模型除了对人类毒性的预测能力有限外,还涉及许多伦理问题。化妆品行业禁止动物试验,并建议在研究中遵循3R原则(即更换、减少和改进),导致基于体外方法15的替代测试方法的发展。第一个体外皮肤细胞模型已经在90年代被描述,一个令人印象深刻的发展,从简单的人类角蛋白细胞单一培养到完全分化表皮和全厚模型已经取得了16。如今,皮肤组织工程在制药和皮肤化妆品领域都越来越重要。在过去的二十年里,几家公司已经将三维(3D)重建的人类表皮(RhE)商业化,这些表皮是皮肤相关研究的标准化和可重复的工具。根据 OECD 皮肤刺激测试准则,接受多个商用 RhE 模型进行化学品体外皮肤测试17、18(即测试指南 43919)和皮肤腐蚀20(即测试指南 43121)。皮肤敏感性 22 (即 SENS-IS 检测) 的体外测试目前处于批准轨道,并处于同行评审23中。此外,还开发了许多其他检测方法,利用商用RhE模型,评估光毒性24,测试药物配方25,化妆品配方和活性成分26,研究皮肤屏障功能27,并测试生物反应环境压力源28,29,30,31。
除了市售的3D皮肤模型,多个研究小组已经开发出自己的RhEs 32,33,34,35,36,37。内部 RhEs 根据研究的目的为控制文化条件提供了优势。具体来说,研究人员可以选择用于重组其3D表皮模型的角蛋白细胞的类型和来源(即初级与不朽、新生儿与老年人、单一与随机捐赠者、性别、种族、个人生活习惯(如吸烟等)。他们有可能改变培养介质的组成,并纳入生长因子,维生素,或其他化合物,可以调节目标蛋白质或脂质的表达。通过内部RhEs,研究人员还可以研究生物反应和生物力学特性,作为3D模型分化状态的函数。除了这些直观的参数,还有不断的努力,以提高3D皮肤模型的复杂性,使他们更生理相关, 例如,通过添加其他表皮细胞类型(如黑色素细胞和免疫细胞)38,39,通过培养细胞细胞在纤维细胞填充胶原蛋白基质40,41,42之上,并通过包括血管网络43,44,45的组成部分。
虽然可以根据特定需求调整文化条件,但必须尊重一些参数,以确保 RhE 的质量和相关性。为了培养RhE组织,正常的人类表皮角蛋白细胞(NHEKs)被植入特定的渗透培养插入物中,其多孔合成膜将井分成两个隔间,即骨质疏导室和基底室。膜的孔隙度(即孔径为0.4μm)允许在基底隔间中形成细胞单层,没有细胞向基底插入侧迁移,并允许从玄武岩舱中含有的培养介质中喂养角蛋白细胞。在重建过程开始时,NHEK 在水下条件下培养数天,以便将其粘附在膜上。与用于NHEK二维培养的钙浓度相比,两个隔间的钙含量均有所提高,以减缓细胞的增殖,促进细胞的分化。表皮钙梯度对于调节屏障的形成和平衡47,48至关重要。高钙含量(即高达1.5mM)促进细胞间结的形成,并在终端分化49期间调节玉米化信封的形成。一旦角蛋白细胞在支撑膜上形成连续且紧密粘附的单层,就会去除附体隔间中的介质,并在空气-液体接口 (ALI) 继续培养过程,以刺激分层并建立表皮屏障50,51。特定的文化条件对于获得完全分层的上皮36至关重要。在ALI的重组过程中,玄武岩舱中的介质辅以角蛋白细胞生长因子(KGF)、胰岛素、钙和抗腐酸。抗坏酸在形成适当的SC脂质屏障方面起着重要作用,与原生人类皮肤52非常相似。在抗坏酸补充介质中生长的角蛋白细胞表现出一种分化表型,具有增强的角蛋白颗粒,以及组织细胞间脂质跛脚在角细胞52的间歇。这种补充对于通过增加玉米化信封含量和避免亲水抗氧化储存53,54耗尽来改善表皮屏障功能至关重要。KGF是表皮增殖和分化的重要准肾上腺介质,用于刺激NHEK55。
内部 RhEs 的主要缺点包括研究机构之间标准化的丧失以及劳动力强度和时间消耗的增加(与现成的商业模式相比,最多 3 周)。本文件的目的是解决这些缺点,为更大规模的生产打下基础。除了上述内部RhEs的优势外,目前的议定书还旨在减少组织内部和组织之间的变异性,减少污染风险,并简化栽培过程。
当前协议描述了使用新生儿 NHEK 培养 RhEs 的可重复和稳健的方法。此外,它显示了RhEs形态特征、屏障完整性和表皮分化特异性蛋白质表达的代表性结果。使用血氧林和黄素(H&E)染色和传输电子显微镜(TEM)检查了RhEs形态结构。为了评估屏障的完整性,测量了透皮电阻 (TEER) 和 Triton X-100 的暴露时间,以降低 50% 的组织生存能力 (ET50)。通过免疫荧光(IF)分析脱烟素结(即脱烟素1)的形成,以评估角蛋白细胞粘附。表皮结构蛋白(即非自愿蛋白、洛里林和长丝蛋白)的形成通过IF进行评估和检测。这些蛋白质参与形成围绕SC角细胞的高度交叉链接的蛋白质包络,因此是后期表皮分化56,57的重要标志。此外,IF还用于分析角蛋白10,一种在SS58早期分化细胞中诱导的蛋白质,存在于所有分化层中。最后,对RhE对催化刺激(即脂糖和肿瘤坏死因子α)的反应进行了调查。细胞培养介质使用酶相关免疫分析 (ELISA) 测量了血间素 1 阿尔法 (IL-1+) 和血间素 8 (IL-8) 的水平。
在制药和皮肤化妆品领域,RhEs被广泛用作筛选工具,36、75、76、77、78。虽然几家公司已经将此类RhEs商业化,但它们仍然成本高昂,并限制了根据需要改变种植参数以解决新的研究问题的可能性。本文以可靠可靠的方式描述了内部 RhEs 的生产过程,并详细描述了获得的组织,以确认该模型作为动物测试的替代方法的相关性。
协议中的某些步骤对于确保适当的角蛋白细胞分化和 RhE 可重复性至关重要。这可以通过利用最佳细胞、中等类型和培养条件来实现。在提议的RhE模型中,新生儿NHEK因缺乏抗原性暴露而选择,而成人NHEK则选择。此外,角蛋白细胞仅限于白种人族裔,以避免物种间的变异。主要角蛋白细胞通常用于其区分和分层的能力79.它们可以通过商业或内部隔离成人皮肤获得80.聚碳酸酯膜上细胞系(即HaCaT)的培养表明分化失败,并显示出合成屏障形成所必需的脂质的能力受损81.然而,包括不同的文化矩阵,如水凝胶,胶原蛋白,纤维蛋白和球形培养物,导致3D皮肤模型的成功开发78,82,83,84,85,86.不朽的细胞系,N/TERT,已被证明适合RhEs的发展35.主要角蛋白细胞在第四或第五段时仍然具有扩散性61因此,目前的议定书包括在其第三段中使用角蛋白细胞。De Vuyst等人已经证明细胞播种密度很重要,需要足够(即≥2.5×105 细胞/厘米2)确保基底舱的介质不会扩散到顶棚。播种密度不足(即, < 2.5×105 细胞/厘米2)可能导致无法形成适当的屏障,这表现为介质从玄武岩扩散到顶层隔间,导致淹没而不是ALI文化条件62.无血清角蛋白细胞生长介质(参见 材料表)优先用于可重复性目的,因为它提供了与化学定义介质配合使用的优势,并降低了污染风险。这种介质的钙浓度较低(即60μM),因此刺激角蛋白细胞的增殖87.从RhE培养的第一步开始,提高钙浓度(即1.5m),有利于角蛋白分化和皮肤屏障形成和平衡49.此外,ALI介质还辅以抗坏酸,这已证明对SC脂质的形成和促进分化至关重要52,53,54.ALI介质还含有KGF,这是一个由成纤维细胞分泌的生长因子,可以与角蛋白细胞转膜受体结合,激活后在分化和伤口修复方面具有双重作用55,88.重要的是在特定的时间间隔刷新ALI介质,为RhEs提供源源不断的新鲜营养物质。使用载波板系统对于更大规模地培养 RhE 至关重要(即 24 个插入/板)。它提供了节省时间、降低污染风险的优点,并为引入人为错误留出的空间较小。它还提供了在大量媒体(即 1.5 mL)中培养 RhEs 的可能性,从而减少了所需的 ALI 媒体刷新次数。此外,它提供了将一整盘插入物转移到具有新鲜介质的板中的可能性,避免单独与插入物接触或揭开板盖。
RhE 模型存在若干应注意的局限性。在原生人类皮肤中,基底层角蛋白细胞的增殖与SC中角细胞的分离(即去挤压)之间存在平衡89.然而,在体外,脱压不发生。因此,角细胞仍然附着在RhE上,形成一个在生理上不太相关的厚SC。因此,RhEs 的培养时间跨度有限。此外,这个RhE模型简单明了,因为它由单一的细胞类型,即角蛋白细胞组成,这是表皮最丰富的细胞类型。然而,表皮中还有其他细胞类型,如黑色素细胞、树突状细胞(即兰格汉斯细胞)、T细胞(如CD8)+ 细胞),和默克尔细胞13.为了提高皮肤模型的生理相关性,研究人员通过添加黑色素细胞使皮肤模型更加复杂38 ,免疫细胞39,或患者衍生的细胞90.人们应该记住,人类皮肤模型的屏障特性与原生人皮肤不同,因为SC脂质成分明显不同,屏障渗透性较高 91,92,93,94,95.然而,一些研究已经报告了在缺氧下培养人类皮肤模型的屏障特性的变化96 或相对湿度降低97,皮肤基质与奇托桑的调制98,并在培养介质中自由脂肪酸的改变99.此外,在简单和复杂的RhEs中,文化条件和中等组成可以调节以模拟病理特征。通过挑战模型与细胞因子,一个异常的形态100 基因和蛋白质表达水平的变化可以确定,通常观察到在常见的皮肤疾病,如特异性皮炎和牛皮病35,101,102,103,104,105.在启动3D模型的重组过程之前,在角蛋白细胞中隔离特定基因是另一种用来模仿皮肤疾病特征和研究新的治疗方法的方法106,107.除了仅对表皮层建模外,皮肤隔间还可以通过在 RhE 重组前将成纤维细胞嵌入胶原蛋白基质中,使其在生理上更具相关性,并适合衰老和伤口愈合相关研究,从而包含在模型中(即命名的人类皮肤等价物或全厚模型)中108,109,110.此外,肿瘤球体已被添加到人类皮肤等价物,以研究黑色素瘤进展111,112.皮肤模型领域的最新进展是生物打印和片上皮肤。多个研究小组最近成功地开发出(可渗透的)生物印花皮肤等价物45,113,114.拟议的协议利用了 24 井格式和承运板,避免了单独处理插入。然而,研究规模仍然相当有限,缺乏自动化。通过实现生物打印或片上皮肤的使用,较小的皮肤模型可用于更自动化的流程和更大规模的流程。
本协议中描述的 RhE 与已经开发且具有良好特征的商业表皮模型具有多种相似之处。形态分析表明,虽然建议的RhE模型中可行的层数低于原生人皮肤(即6-7与7-14),但它可与EpiDerm RhE模型(即8-12)70的层数相媲美。与表皮、EpiSkin 和皮肤伦理模型类似,上 RhE 层显示了密集包装的角细胞层28的篮子编织模式。此外,TEM 分析显示,拟议的 RhE 模型中的 SC 层数(即 15-25)与 EpiDerm(即 16-25)70的数目相当。总体而言,建议的RhE模型展示了与其他商业化表皮模型类似的结构,模仿了本地人类表皮。TEER 测量的组织完整性与商用 RhE 模型(即 3000-5600 Ω.cm2)71、72、73和其他内部 RhE(即约 5000 Ω.cm2)74,115 之间。建议的 RhE 模型显示差异很大,差异化和组织粘附标记的存在和正确定位就说明了这一点。此外,拟议的RhE模型表明对发炎刺激(即LPS和TNF-α)有反应。
最后,目前的议定书展示了如何以可靠的方式和规模生产RhEs,以满足学术和私营机构研究人员的需求。建议的RhE模型显示与其他现有商业模型具有相似的形态、表皮分化和生物反应能力。当需要访问相关的皮肤模型时,它为制药和皮肤化妆品领域提供了替代工具。
The authors have nothing to disclose.
根据玛丽·斯考多夫斯卡-居里赠款,欧洲联盟的Horizhos20研究和创新方案与赠款协议第765602资助这项工作。所有作者都感谢阿道夫·默克尔基金会和费拉拉大学的支持,并感激地感谢比利时陶氏硅胶公司。米格尔·斯普奇-卡尔瓦尔博士因准备RhE栽培过程的图形图像而得到认可。作者感谢芭芭拉·德拉斯勒博士、佛朗哥·塞尔韦拉蒂博士和阿涅斯·泰西尔博士的技术支持和讨论。
Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Antibiotic-antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15240062 | |
Aqueous Eosin Y solution | Sigma Aldrich | HT110280 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich or Merck | C8106 or 1.02378.0500 | Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 °C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. |
DAPI | Roche | 10236276001 | Prepare a stock at 100 μg/mL and store aliquots at -20 °C. Working conditon is 1 μg/mL. |
Entellan mounting medium | Merck | 1.07960.0500 | Mounting medium for H&E staining. |
EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | MEPI500CA | Contains 0.06 mM of Ca2+. |
Ethanol absolute | Any supplier | N/A | |
Formalin 10% | Leica Biosystems | 3800770 | |
Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | S0015 | To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 μg/mL hydrocortisone,5 μg/mL bovine transferrin, and 0.01 µg/mL human recombinant insulin-like growth factor-I. |
Isopropanol | Biosolve B.V. | 0016264102BS | |
Kaiser's glycerol gelatine, phenol-free | Merck | 1.08635.0100 | Mounting medium for IF staining. |
Keratinocyte growth factor (KGF) | R&D Systems | 251-KG-050 | Reconstitute KGF protein at 100 μg/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20°C. |
Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit | Roche | 4744926001 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20°C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark. |
Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5 | Sigma-Aldrich | L4524 | Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 °C. Working concentration is 100 μg/mL. |
Mayer’s Haematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS80 | |
Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) | Lonza | 00192906 | Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors. |
Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010056 or 10010-015 | Reference numbers can vary between countries. |
Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | ImmunoTools | 11344483 | Prepare a stock of 100 μg/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL |
Sterile ultrapure water | Any supplier | N/A | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93426 | |
Trypan blue (0.4% [v/v]) | Any supplier | N/A | |
Trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | R007100 | |
Trypsin/EDTA (0.05% [v/v]) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 25300054 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | Ab150113 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | Merck | 1.06448.0500 | For antigen retrieval buffer for IF staining. |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Dylight 488) | Agrisera | AS09 633 | |
Filaggrin Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-53243 | |
Involucrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-33742 | |
Keratin 10 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-32962 | |
Desmoglein-1 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | MAB944 | |
Loricrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP1-33610 |