Este protocolo describe un método sencillo para cultivar epidermis humana reconstituida tridimensional de una manera reproducible y robusta. Además, caracteriza la relación estructura-función del modelo de barrera epidérmica. Las respuestas biológicas de la epidermis humana reconstituida sobre estímulos proinflammatory también se presentan.
Un modelo humano tridimensional de la epidermis reconstruido de keratinocytes primarios neonatales se presenta. Aquí, se describe un protocolo para el proceso de cultivo y la caracterización del modelo. Los queratinocitos primarios neonatales se sumergen en inserciones de policarbonato permeables y se elevan a la interfaz aire-líquido tres días después de la siembra. Después de catorce días de estimulación con factores de crecimiento definidos y ácido ascórbico en medio de cultivo de calcio alto, el modelo está completamente diferenciado. El análisis histológico reveló una epidermis totalmente estratificada, mímico la morfología de la piel humana nativa. Para caracterizar el modelo y sus funciones de barrera, los niveles de la proteína y la localización específicos para la diferenciación del keratinocyte de la temprano-etapa (es decir, queratina 10), la diferenciación de la tarde-etapa (es decir, involucrin, loricrin, y filaggrin) y la adherencia del tejido (es decir, desmoglein 1), fueron evaluados por inmunofluorescencia. La integridad de la barrera tisular se evaluó aún más mediante la medición de la resistencia eléctrica transepitelial. La epidermis humanaeconstructed de R era responsiva a los estímulos proinflammatory (es decir, alfa del factor de necrosis del lipopolysaccharide y de tumor), llevando al lanzamiento creciente del cytokine (es decir, alfa del interleukin 1 e interleukin 8). Este protocolo representa un método in vitro directo y reproducible para cultivar epidermis humana reconstruida como herramienta para evaluar efectos ambientales y una amplia gama de estudios piel-relacionados.
La epidermis es la capa más externa de la piel, en la interfaz directa entre el cuerpo humano y el medio ambiente externo. Sus principales funciones son proporcionar protección e hidratación1. La epidermis actúa como una barrera física eficaz contra los agentes externos y previene la pérdida excesiva de agua del cuerpo. Estas funciones de la piel dependen principalmente de la disposición celular en las capas más externas de la piel, la composición y la organización de los lípidos intercelulares2. La epidermis se compone principalmente de queratinocitos que migran hacia arriba hacia el lado externo del tejido y se someten a la diferenciación. Existen 4-5 capas epidérmicas que se caracterizan por su etapa de diferenciación. Del interior al exterior, las capas epidérmicas parten de la epidermis viable, es decir, el estrato basal (SB), el estrato espinoso (SS) y el estrato granuloso (SG), hasta la capa superior no viable, es decir, el estrato córneo (SC)3. La capa basal está compuesta principalmente por queratinocitos enriquecidos con queratina proliferantes, que migran a través de las SS tras la diferenciación4. Durante la maduración de los queratinocitos, se producen varios cambios en la expresión y estructura de las proteínas. Los queratinocitos se adhieren a través de la formación de uniones desmosómicas5. En el SG se inicia la generación de cuerpos laminares. Consisten en precursores lipídicos y enzimas que son cruciales para la formación de la función barrera cutánea6. El SG también se caracteriza por la presencia de gránulos de queratohyalina en el citoplasma de los queratinocitos. En la interfaz con el SC, el contenido de los cuerpos laminares se extruye en los espacios intercelulares y los lípidos no polares como ceramidas, colesterol y ácidos grasos libres se organizan en bicapas lipídicas laminares apiladas para formar la matriz lipídica extracelular7. En el SC, las células pierden todos los orgánulos celulares incluyendo el núcleo, debido a los procesos de degradación enzimática y adoptan una morfología aplanada. Están rodeados por una envoltura cornificada hecha de capas de proteínas reticenadas, y se conocen como corneocitos8,9. Los componentes demosomales están reticenados a la envoltura cornificada para formar corneodesmosomas y unir los corneocitos. El epitelio resultante se renueva continuamente a partir de células madre, con un tiempo de rotación de aproximadamente 5-6 semanas10. El proceso de diferenciación de los queratinocitos, que resulta en una epidermis completamente estratificada, es crucial para la formación de la función barrera de la piel11.
Durante la herida y la inflamación, los queratinocitos inducen cambios en las moléculas de adhesión y los receptores de superficie y desencadenan respuestas proinflamatorias a través de la secreción de citoquinas, quimiocinas y péptidos antimicrobianos12. La piel no es sólo una barrera física contra las sustancias exógenas; también actúa como un sensor inmunológico tras la exposición a patógenos. Además, regula la difusión de varias sustancias a través de sus capas, como el contenido de agua para proteger el cuerpo humano de la deshidratación. La piel también participa en la síntesis de vitamina D y tiene varias otras funciones metabólicas3,13,14.
Para evaluar los efectos adversos de las sustancias exógenas, los toxicólogos han confiado durante décadas en la experimentación con animales, pero hoy en día no es el enfoque preferido. Además de tener una capacidad predictiva limitada para la toxicidad humana, los modelos animales implican numerosas cuestiones éticas. La prohibición de la experimentación con animales en la industria cosmética y la recomendación de seguir el principio de las 3R (es decir, sustitución, reducción y perfeccionamiento) en la investigación han dado lugar al desarrollo de métodos de ensayo alternativos basados en enfoques in vitro15. Los primeros modelos in vitro de células cutáneas ya han sido descritos en los años 90, y se ha logrado un impresionante desarrollo de simples monocultivos de queratinocitos humanos a modelos de epidermis y espesor completo totalmente diferenciados16. Hoy en día, la ingeniería de tejidos cutáneos ha ganado importancia tanto en el campo farmacéutico como en el dermato-cosmético. En las últimas dos décadas, varias compañías han comercializado epidermis humana reconstruida tridimensional (3D) (RhE) que representan herramientas estandarizadas y reproducibles para estudios relacionados con la piel. Se aceptan varios modelos comerciales de RhE para las pruebas in vitro de productos químicos en la piel de acuerdo con las directrices de la OCDE para las pruebas de irritación de la piel17,18 (es decir, la directriz de ensayo 43919)y la corrosión de la piel20 (es decir, la directriz de ensayo 43121). La prueba in vitro para la sensibilización de la piel22 (es decir, el ensayo SENS-IS) se encuentra actualmente en la vía de aprobación y en revisión por pares23. También hay numerosos otros ensayos desarrollados que utilizan modelos comerciales de RhE, para evaluar la fototoxicidad24,para probar formulaciones de fármacos25,formulaciones cosméticas e ingredientes activos26,para estudiar la función de barrera cutánea27 y para probar la respuesta biológica a los estresores ambientales28,29,30,31.
Además de los modelos de piel 3D disponibles en el mercado, múltiples grupos de investigación han desarrollado sus propios RhEs32,33,34,35,36,37. Los RhEs internos ofrecen la ventaja para controlar las condiciones de la cultura según el propósito del estudio. Específicamente, los investigadores pueden seleccionar el tipo y la fuente de los queratinocitos que se utilizarán para la reconstitución de su modelo epidérmico 3D (es decir, primario vs inmortalizado, neonatal vs. envejecido, donantes aleatorios individuales frente a donantes aleatorios agrupados, sexo, etnia, hábitos de vida individuales como fumar, etc.). Tienen la posibilidad de variar la composición del medio de cultivo e incorporar factores de crecimiento, vitaminas u otros compuestos que pueden modular la expresión de proteínas diana o lípidos. Con los RhEs internos, los investigadores también pueden investigar las respuestas biológicas y las propiedades biomecánicas en función del estado de diferenciación del modelo 3D. Además de esos parámetros intuitivos, hay esfuerzos continuos para aumentar la complejidad de los modelos de piel 3D y hacerlos más relevantes fisiológicamente, por ejemplo, agregando otros tipos de células epidérmicas (porejemplo,melanocitos y células inmunes)38,39,cultivando los queratinocitos sobre una matriz de colágeno poblada por fibroblastos40,41,42,e incluyendo componentes de la red vascular43,44,45.
Aunque es posible ajustar las condiciones del cultivo según las necesidades específicas, existen parámetros que deben respetarse para garantizar tanto la calidad como la relevancia de un RhE. Para cultivar los tejidos de RhE, los keratinocytes epidérmicos humanos normales (NHEKs) se siembran en los rellenos permeables específicos de la cultura cuya membrana sintética porosa separa los pozos en dos compartimientos, es decir, el compartimiento apical y basolateral. La porosidad de la membrana (es decir, un tamaño de poro de 0,4 μm) es tal que permite la formación de una monocapa celular en el compartimento apical sin migración de las células al lado del inserto basal, y la alimentación de los queratinocitos con nutrientes esenciales del medio de cultivo contenido en el compartimento basolateral. Al comienzo del proceso de reconstitución, los NHEKs se cultivan en condiciones sumergidas durante unos días para permitir su adhesión a la membrana. El nivel de calcio en ambos compartimentos se incrementa en comparación con la concentración de calcio utilizada para el cultivo 2D de NHEKs para ralentizar la proliferación de las células y promover en su lugar su diferenciación46. Un gradiente epidérmico de calcio es esencial para regular la formación de barreras y la homeostasis47,48. Los niveles altos de calcio (es decir, hasta 1,5 mM) promueven la formación de uniones intercelulares y modulan la formación de la envoltura cornificada durante la diferenciación terminal49. Una vez que los queratinocitos forman una monocapa continua y firmemente adherente en la membrana de soporte, se elimina el medio del compartimento apical y el proceso de cultivo continúa en la interfaz aire-líquido (ALI) para estimular la estratificación y establecer una barrera epidérmica50,51. Las condiciones específicas de cultivo son cruciales para obtener un epitelio completamente estratificado36. Durante el proceso de reconstitución en ALI, el medio en el compartimiento basolateral se complementa con el factor de crecimiento del keratinocyte (KGF), la insulina, el calcio, y el ácido ascórbico. El ácido ascórbico juega un papel importante en la formación de una barrera lipídica sc apropiada, muy parecida a la de la piel humana nativa52. Los queratinocitos cultivados en medio suplementado con ácido ascórbico demuestran un fenotipo diferenciado, con un mayor número de gránulos de queratohyalina, así como laminillas lipídicas intercelulares organizadas en los interstiticos de los corneocitos52. Dicha suplementación es esencial para mejorar la función de barrera epidérmica aumentando el contenido de envoltura cornificada y evitando el agotamiento de las reservas de antioxidantes hidrófilos53,54. KGF, un mediador paracrino importante de la proliferación y de la diferenciación epidérmicas, se utiliza para estimular el NHEKs55.
Las principales desventajas de las REs internas incluyen la pérdida de estandarización entre las instituciones de investigación y el aumento de la intensidad laboral y el consumo de tiempo (hasta 3 semanas en comparación con los modelos comerciales listos para usar). El objetivo del presente documento es abordar estos inconvenientes, sentando las bases para la producción a mayor escala. Además de las ventajas antes mencionadas de las REs internas, el protocolo actual tiene como objetivo reducir la variabilidad intra e interescal entre los tejidos, reducir los riesgos de contaminación y agilizar el proceso de cultivo.
El protocolo actual describe un método reproducible y robusto para cultivar RhEs usando NHEKs neonatal. Por otra parte, muestra resultados representativos de la caracterización de la morfología de rhes, integridad de la barrera, y la expresión de proteínas que son específicas para la diferenciación epidérmica. La estructura morfológica de RhEs fue examinada usando la coloración del hematoxylin y de la eosina (H&E) y la microscopia electrónica de transmisión (TEM). Para evaluar la integridad de la barrera, se midió la resistencia eléctrica transepidérmica (TEER) y el tiempo de exposición a Triton X-100 para reducir el 50% de la viabilidad tisular (ET50). La formación de ensambladuras desmosomal (es decir, desmoglein 1) era analizada por la inmunofluorescencia (SI) para evaluar la adherencia del keratinocyte. La formación de proteínas estructurales epidérmicas (es decir, involucrin, loricrin, y filaggrin) fue evaluada y detectada con SI. Estas proteínas están implicadas en la formación de la envoltura proteica altamente reticenlada que rodea a los corneocitos SC y como resultado son marcadores importantes para la diferenciación epidérmica en estadio tardío56,57. Además, if fue utilizado para analizar la queratina 10, una proteína inducida en células diferenciadas en etapa temprana en los SS58 y encontrada dentro de todas las capas diferenciadas. Finalmente, el RhE’ la respuesta de s a los estímulos proinflammatory (es decir, alfa del factor de necrosis del lipopolysaccharide y de tumor) fue investigada. Los niveles de interleucina 1 alfa (IL-1α) e interleucina 8 (IL-8) se midieron en los medios de cultivo celular, utilizando ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA).
Las RTe son ampliamente utilizadas como herramientas de cribado en los campos farmacéutico y dermato-cosmético36,75,76,77,78. Aunque varias compañías han puesto a disposición comercialmente tales RhEs, siguen siendo costosas y limitan la posibilidad de variar los parámetros de cultivo según sea necesario para abordar nuevas preguntas de investigación. Este trabajo describe el procedimiento de producción de rhEs internos de una manera robusta y confiable y proporciona una caracterización detallada de los tejidos obtenidos para confirmar la relevancia del modelo como un enfoque alternativo a la experimentación con animales.
Algunos de los pasos en el protocolo son cruciales para asegurar la diferenciación adecuada de queratinocitos y la reproducibilidad rhE. Esto se puede llevar a cabo utilizando las células óptimas, el tipo de medio (s), y las condiciones de cultivo. En el modelo de RhE propuesto, los NHEKs neonatales fueron seleccionados por su falta de exposición antigénica, en comparación con los NHEKs adultos. Además, los queratinocitos se limitaron a la etnia caucásica para evitar la variabilidad entre especies. Los queratinocitos primarios se utilizan típicamente por su capacidad para diferenciar y estratificar79. Se pueden obtener comercialmente o por aislamiento interno de la piel adulta80. El cultivo de una línea celular (es decir, HaCaT) en una membrana de policarbonato, ha demostrado fallar la diferenciación y ha demostrado una capacidad deteriorada para sintetizar lípidos que son necesarios para la formación de barreras81. Sin embargo, la inclusión de diferentes matrices de cultivo, como hidrogeles, colágeno, fibrina y esferoides, resultó en el desarrollo exitoso de modelos de piel 3D.78,82,83,84,85,86. Las líneas celulares inmortalizadas, N/TERT, han demostrado ser adecuadas para el desarrollo de RhEs35. Los queratinocitos primarios siguen siendo proliferativos en su cuarto o quinto paso61, por lo tanto, el protocolo actual incluye el uso de queratinocitos en su tercer paso. De Vuyst et al. han demostrado que la densidad de siembra celular es de importancia y debe ser suficiente (es decir, ≥ 2.5×105 células/cm2) para garantizar que el medio del compartimento basolateral no se difunda al compartimento apical. Una densidad de siembra insuficiente (es decir, < 2.5×105 células/cm2) puede resultar en una incapacidad para formar una barrera adecuada, que se indica por la difusión del medio desde el basolateral al compartimento apical, lo que resulta en condiciones de cultivo sumergido en lugar de ALI62. Medio de crecimiento de queratinocitos sin suero (ver Tabla de Materiales) se prefirió a efectos de reproducibilidad, ya que ofrece la ventaja de trabajar con un medio químicamente definido y reduce el riesgo de contaminación. Este medio tiene una menor concentración de calcio (es decir, 60 μM) y por lo tanto estimula la proliferación de queratinocitos87. El aumento de la concentración de calcio (es decir, 1,5 mM) desde el primer paso del cultivo de RhE, favorece la diferenciación de queratinocitos y la formación de barreras cutáneas y la homeostasis49. Además, el medio ALI se complementa con ácido ascórbico, que ha demostrado ser crucial para la formación de lípidos SC y para promover la diferenciación52,53,54. El medio ALI también contiene KGF, que es un factor de crecimiento secretado por fibroblastos que pueden unirse a los receptores transmembrana de queratinocitos y tras la activación tiene un doble papel en la diferenciación y reparación de heridas55,88. Es importante refrescar el medio ALI en intervalos de tiempo específicos, para proporcionar un suministro constante de nutrientes frescos a los RhEs. El uso de un sistema de placa portadora es crucial para el cultivo de RhE a mayor escala (es decir, 24 insertos/placa). Ofrece la ventaja de ahorrar tiempo, reducir el riesgo de contaminación y deja menos espacio para la introducción de errores humanos. También proporciona la posibilidad de cultivar RhEs en un alto volumen de medios (es decir, 1,5 mL), lo que reduce el número requerido de actualizaciones de medios ALI. Además, ofrece la posibilidad de transferir una placa completa de inserciones a una placa con medio fresco, evitando el contacto con las inserciones individualmente o descubriendo la tapa de la placa.
Hay varias limitaciones del modelo RhE que deben tenerse en cuenta. En la piel humana nativa hay un equilibrio entre la proliferación de queratinocitos en la capa basal y el desprendimiento de corneocitos en el SC (es decir, descamación)89. Sin embargo, in vitro, la descamación no tiene lugar. Por lo tanto, los corneocitos permanecen unidos al RhE y forman un SC grueso que es menos relevante fisiológicamente. Por lo tanto, hay un tiempo de cultivo limitado de RhEs. Además, este modelo de RhE es simple y directo, ya que consiste en un tipo de célula singular, es decir, el queratinocitos, que es el tipo celular más abundante de la epidermis. Sin embargo, hay otros tipos de células residentes en la epidermis, como melanocitos, células dendríticas (es decir, células de Langerhans), células T (por ejemplo, CD8+ células), y células de Merkel13. Para mejorar la relevancia fisiológica del modelo de piel, los investigadores han hecho que los modelos de piel sean más complejos mediante la adición de melanocitos38 , células inmunitarias39, o células derivadas del paciente90. Uno debe tener en cuenta que las propiedades de barrera de los modelos de piel humana son diferentes en comparación con la piel humana nativa, debido a una composición lipídica SC notablemente diferente y una mayor permeabilidad de barrera 91,92,93,94,95. Sin embargo, varios estudios han reportado cambios en las propiedades de barrera de los modelos de piel humana por el cultivo bajo hipoxia96 o disminución de la humedad relativa97, la modulación de la matriz dérmica con quitosano98, y alteración de los ácidos grasos libres en el medio de cultivo99. Por otra parte, en RhEs simples y más complejos, las condiciones de la cultura y la composición media se pueden modular para mímico características patológicas. Desafiando el modelo con cytokines, una morfología anormal100 y se pueden establecer alteraciones en los niveles de expresión de genes y proteínas que se observan típicamente en trastornos comunes de la piel, como dermatitis atópica y psoriasis35,101,102,103,104,105. Silenciar genes específicos en queratinocitos antes de iniciar el proceso de reconstitución del modelo 3D es otro enfoque utilizado para imitar las características de los trastornos de la piel e investigar nuevas soluciones terapéuticas106,107. Además de modelar solo una capa epidérmica, se puede incluir un compartimento dérmico en el modelo (es decir, los equivalentes de piel humana nombrados o los modelos de espesor completo) mediante la incrustación de fibroblastos en una matriz de colágeno antes de la reconstitución de RhE, lo que lo hace más relevante fisiológicamente y adecuado para el envejecimiento y los estudios relacionados con la cicatrización de heridas.108,109,110. Además, se han añadido esferoides tumorales a los equivalentes de la piel humana para estudiar la progresión del melanoma111,112. Los últimos avances en el campo de los modelos de piel son la bioimpresión y la piel en un chip. Múltiples grupos de investigación han tenido éxito recientemente en el desarrollo de equivalentes de piel bioimpresos (perfusibles)45,113,114. El protocolo propuesto aprovecha un formato de 24 pozos y una placa portadora, evitando inserciones para ser manipuladas individualmente. Sin embargo, la escala de estudio es todavía bastante limitada y carece de automatización. Al implementar el uso de bioimpresión o skin-on-a-chip, se pueden utilizar modelos de piel más pequeños con procesos más automatizados y a mayor escala.
El RhE descrito en este protocolo tiene semejanzas múltiples a los modelos epidérmicos comerciales ya desarrollados y bien caracterizados. El análisis morfológico ha demostrado que aunque el número de capas viables en el modelo RhE propuesto es menor en comparación con el de la piel humana nativa (es decir, 6-7 en comparación con 7-14), es comparable al del modelo EpiDerm RhE (es decir, 8-12)70. De manera similar a los modelos EpiDerm, EpiSkin y SkinEthic, la capa superior de RhE muestra un patrón de tejido de cesta de capas de corneocitos densamente empaquetadas28. Por otra parte, el análisis tem reveló que el número de capas sc en el modelo rhE propuesto (es decir, 15-25) es comparable a la de EpiDerm (es decir, 16-25)70. En general, el modelo de RhE propuesto demuestra una estructura similar a la de otros modelos epidérmicos comercializados, imitando la epidermis humana nativa. La integridad tisular medida por TEER está en rango con los modelos comerciales de RhE (es decir, entre 3000-5600 Ω.cm2)71,72,73 y otros RhEs internos (es decir, aproximadamente 5000 Ω.cm2)74,115. El modelo de RhE propuesto muestra estar bien diferenciado, como lo indica la presencia y correcta localización de marcadores de diferenciación y adhesión tisular. Por otra parte, el modelo propuesto del RhE muestra para ser responsivo a los estímulos proinflammatory (es decir, LPS y TNF-α).
Para concluir, el protocolo actual muestra cómo producir RhEs de una manera confiable y a una escala relativamente grande para satisfacer las necesidades de los investigadores tanto en instituciones académicas como privadas. El modelo de RhE propuesto muestra tener una morfología similar, diferenciación epidérmica y capacidad de respuesta biológica a otros modelos comerciales existentes. Proporciona una herramienta alternativa tanto para el campo farmacéutico como para el dermato-cosmético cuando se requiere acceso a un modelo de piel relevante.
The authors have nothing to disclose.
El Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco de la beca Marie Skłodowska-Curie con el acuerdo de subvención nº 765602 financiado este trabajo. Todos los autores reconocen el apoyo de la Fundación Adolphe Merkle y la Universidad de Ferrara y agradecen a Dow Silicones Belgium. El Dr. Miguel Spuch-Calvar es reconocido por preparar las imágenes gráficas del proceso de cultivo de RhE. Los autores agradecen a la Dra. Barbara Drasler, al Dr. Franco Cervellati y a la Dra. Agnès Tessier por su apoyo técnico y sus discusiones.
Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Antibiotic-antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15240062 | |
Aqueous Eosin Y solution | Sigma Aldrich | HT110280 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich or Merck | C8106 or 1.02378.0500 | Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 °C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. |
DAPI | Roche | 10236276001 | Prepare a stock at 100 μg/mL and store aliquots at -20 °C. Working conditon is 1 μg/mL. |
Entellan mounting medium | Merck | 1.07960.0500 | Mounting medium for H&E staining. |
EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | MEPI500CA | Contains 0.06 mM of Ca2+. |
Ethanol absolute | Any supplier | N/A | |
Formalin 10% | Leica Biosystems | 3800770 | |
Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | S0015 | To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 μg/mL hydrocortisone,5 μg/mL bovine transferrin, and 0.01 µg/mL human recombinant insulin-like growth factor-I. |
Isopropanol | Biosolve B.V. | 0016264102BS | |
Kaiser's glycerol gelatine, phenol-free | Merck | 1.08635.0100 | Mounting medium for IF staining. |
Keratinocyte growth factor (KGF) | R&D Systems | 251-KG-050 | Reconstitute KGF protein at 100 μg/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20°C. |
Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit | Roche | 4744926001 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20°C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark. |
Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5 | Sigma-Aldrich | L4524 | Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 °C. Working concentration is 100 μg/mL. |
Mayer’s Haematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS80 | |
Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) | Lonza | 00192906 | Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors. |
Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010056 or 10010-015 | Reference numbers can vary between countries. |
Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | ImmunoTools | 11344483 | Prepare a stock of 100 μg/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL |
Sterile ultrapure water | Any supplier | N/A | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93426 | |
Trypan blue (0.4% [v/v]) | Any supplier | N/A | |
Trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | R007100 | |
Trypsin/EDTA (0.05% [v/v]) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 25300054 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | Ab150113 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | Merck | 1.06448.0500 | For antigen retrieval buffer for IF staining. |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Dylight 488) | Agrisera | AS09 633 | |
Filaggrin Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-53243 | |
Involucrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-33742 | |
Keratin 10 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-32962 | |
Desmoglein-1 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | MAB944 | |
Loricrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP1-33610 |