Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om driedimensionale gereconstitueerde menselijke epidermis op een reproduceerbare en robuuste manier te cultiveren. Bovendien kenmerkt het de structuur-functierelatie van het epidermale barrièremodel. De biologische reacties van de gereconstitueerde menselijke epidermis op pro-inflammatoire stimuli worden ook gepresenteerd.
Een driedimensionaal menselijk epidermismodel gereconstrueerd uit neonatale primaire keratinocyten wordt gepresenteerd. Hierin wordt een protocol beschreven voor het teeltproces en de karakterisering van het model. Neonatale primaire keratinocyten worden ondergedompeld op doorlatende polycarbonaatinzetstukken gekweekt en drie dagen na het zaaien naar de lucht-vloeistofinterface gebracht. Na veertien dagen stimulatie met gedefinieerde groeifactoren en ascorbinezuur in een hoog calciumkweekmedium, is het model volledig gedifferentieerd. Histologische analyse onthulde een volledig gestratificeerd epidermis, die de morfologie van de inheemse menselijke huid nabootste. Om het model en zijn barrièrefuncties te karakteriseren, werden eiwitniveaus en lokalisatie specifiek voor keratinocytdifferentiatie in een vroeg stadium (d.w.z. keratine 10), differentiatie in een laat stadium (d.w.z. involucrine, loricrine en filaggrin) en weefseladhesie (d.w.z. desmogleine 1) beoordeeld door immunofluorescentie. De integriteit van de weefselbarrière werd verder geëvalueerd door transepitheliale elektrische weerstand te meten. Reconstructed menselijke epidermis reageerde op pro-inflammatoire stimuli (d.w.z. lipopolysaccharide en tumornecrosefactor alfa), wat leidde tot een verhoogde afgifte van cytokine (d.w.z. interleukine 1 alfa en interleukine 8). Dit protocol vertegenwoordigt een eenvoudige en reproduceerbare in vitro methode om gereconstrueerde menselijke epidermis te cultiveren als een instrument om milieueffecten en een breed scala aan huidgerelateerde studies te beoordelen.
De epidermis is de buitenste laag van de huid, op de directe interface tussen het menselijk lichaam en de externe omgeving. De belangrijkste functies zijn bescherming en hydratatie1. De opperhuid fungeert als een effectieve fysieke barrière tegen externe middelen en voorkomt overmatig waterverlies uit het lichaam. Deze huidfuncties zijn voornamelijk afhankelijk van de cellulaire opstelling in de buitenste lagen van de huid, de samenstelling en organisatie van intercellulaire lipiden2. De epidermis bestaat voornamelijk uit keratinocyten die naar boven migreren naar de buitenkant van het weefsel en differentiatie ondergaan. Er zijn 4-5 epidermale lagen die worden gekenmerkt door hun differentiatiestadium. Van binnen naar buiten beginnen de epidermale lagen van de levensvatbare epidermis, d.w.z. het stratum basale (SB), het stratum spinosum (SS) en het stratum granulosum (SG), tot de niet-levensvatbare bovenste laag, d.w.z. het stratum corneum (SC)3. De basale laag bestaat voornamelijk uit proliferatie van keratineverrijkte keratinocyten, die bij differentiatie door het SS migreren4. Tijdens de rijping van keratinocyt treden verschillende veranderingen in eiwitexpressie en structuur op. Keratinocyten hechten zich door de vorming van desmosomale verbindingen5. In de SG wordt de generatie van lamellaire lichamen geïnitieerd. Ze bestaan uit lipidenprecursoren en enzymen die cruciaal zijn voor de vorming van de huidbarrièrefunctie6. De SG wordt ook gekenmerkt door de aanwezigheid van keratohyalinekorrels in het cytoplasma van de keratinocyten. Op het raakvlak met de SC wordt het gehalte van de lamellaire lichamen geëxtrudeerd in de intercellulaire ruimtes en de niet-polaire lipiden zoals ceramiden, cholesterol en vrije vetzuren organiseren zich in gestapelde lamellaire lipide tweelagen om de extracellulaire lipidenmatrix te vormen7. In de SC verliezen cellen alle cellulaire organellen, inclusief de kern, als gevolg van enzymatische afbraakprocessen en nemen ze een afgeplatte morfologie aan. Ze zijn omgeven door een gelikte envelop van onderling verbonden eiwitlagen en worden corneocyten8,9genoemd . Desmosomale componenten zijn gekruist aan de cornified envelop om corneodesmosomen te vormen en de corneocyten aan elkaar te binden. Het resulterende epitheel wordt voortdurend vernieuwd uit stamcellen, met een omlooptijd van ongeveer 5-6 weken10. Het differentiatieproces van de keratinocyten, wat resulteert in een volledig gestratificeerd epidermis, is cruciaal voor de vorming van de barrièrefunctie van de huid11.
Tijdens wondvorming en ontsteking induceren keratinocyten veranderingen in adhesiemoleculen en oppervlaktereceptoren en veroorzaken pro-inflammatoire reacties via afscheiding van cytokinen, chemokinen en antimicrobiële peptiden12. De huid is niet alleen een fysieke barrière tegen exogene stoffen; het fungeert ook als een immuunsensor bij blootstelling aan ziekteverwekkers. Bovendien reguleert het de verspreiding van verschillende stoffen over de lagen, zoals het watergehalte om het menselijk lichaam te beschermen tegen uitdroging. De huid is ook betrokken bij de synthese van vitamine D en heeft verschillende andere metabolische functies3,13,14.
Om de nadelige effecten van exogene stoffen te beoordelen, vertrouwen toxicologen al tientallen jaren op dierproeven, maar tegenwoordig is het niet de voorkeursbenadering. Naast het beperkte voorspellend vermogen voor menselijke toxiciteit, brengen diermodellen tal van ethische kwesties met zich mee. Het verbod op dierproeven in de cosmetische industrie en de aanbeveling om het 3R-beginsel (d.w.z. vervanging, vermindering en verfijning) in onderzoek te volgen, hebben geleid tot de ontwikkeling van alternatieve testmethoden op basis van in vitro benaderingen15. De eerste in vitro huidcelmodellen zijn al beschreven in de jaren 90, en een indrukwekkende ontwikkeling van eenvoudige menselijke keratinocyt monoculturen tot volledig gedifferentieerde epidermis- en volledige diktemodellen is bereikt16. Tegenwoordig is huidweefseltechnologie belangrijk geworden op zowel farmaceutisch als dermato-cosmetisch gebied. In de afgelopen twee decennia hebben verschillende bedrijven driedimensionale (3D) gereconstrueerde menselijke epidermis (RhE) gecommercialiseerd die gestandaardiseerde en reproduceerbare hulpmiddelen voor huidgerelateerde studies vertegenwoordigen. Verschillende commerciële RhE-modellen worden geaccepteerd voor in vitro huidtesten van chemische stoffen volgens oeso-richtlijnen voor het testen van huidirritatie17,18 (d.w.z. testrichtlijn 43919) en huidcorrosie20 (d.w.z. testrichtlijn 43121). De in-vitrotest voor huidsensibilisatie22 (d.w.z. SENS-IS-test) bevindt zich momenteel in het goedkeuringstraject en wordt door collega’s beoordeeld23. Er zijn ook tal van andere tests ontwikkeld die commerciële RhE-modellen gebruiken, om fototoxiciteit24te evalueren, om medicijnformuleringen25,cosmetische formuleringen en actieve ingrediënten te testen26, om de huidbarrièrefunctie27 te bestuderen en om de biologische reactie op omgevingsstressoren28,29,30,31te testen .
Naast commercieel verkrijgde 3D-huidmodellen hebben meerdere onderzoeksgroepen hun eigen RhEs32,33,34,35,36,37ontwikkeld . In-house RhEs bieden het voordeel voor het beheersen van de cultuuromstandigheden volgens het doel van de studie. In het bijzonder kunnen onderzoekers het type en de bron van de keratinocyten selecteren die moeten worden gebruikt voor de reconstitutie van hun 3D-epidermale model (d.w.z. primair versus vereeuwigd, neonatale versus leeftijd, enkele versus gepoolde willekeurige donoren, geslacht, etniciteit, individuele leefgewoonten zoals roken, enz.). Ze hebben de mogelijkheid om de samenstelling van het kweekmedium te variëren en groeifactoren, vitamines of andere verbindingen op te nemen die de expressie van doeleiwitten of lipiden kunnen moduleren. Met in-house RhEs kunnen onderzoekers ook biologische reacties en biomechanische eigenschappen onderzoeken als functie van de differentiatietoestand van het 3D-model. Naast deze intuïtieve parameters zijn er voortdurende inspanningen om de complexiteit van 3D-huidmodellen te vergroten en fysiologisch relevanter te maken, bijvoorbeeld door andere epidermale celtypen toe te voegen (bijv. melanocyten en immuuncellen)38,39, door de keratinocyten bovenop een fibroblast-bevolkte collageenmatrix40 , 41,42te cultiveren en door componenten van het vasculaire netwerk43,44,45op te nemen .
Hoewel het mogelijk is om de cultuuromstandigheden af te stemmen op specifieke behoeften, zijn er parameters die moeten worden gerespecteerd om zowel de kwaliteit als de relevantie van een RhE te garanderen. Om RhE-weefsels te kweken, worden normale menselijke epidermale keratinocyten (NHEKs) gezaaid in specifieke permeabele kweekinzetstukken waarvan het poreuze synthetische membraan de putten in twee compartimenten scheidt, d.w.z. het apicale en basolaterale compartiment. De porositeit van het membraan (d.w.z. een poriegrootte van 0,4 μm) is zodanig dat het de vorming van een celmonolaag in het apicale compartiment mogelijk maakt zonder migratie van cellen naar de basale insertzijde, en het voeden van de keratinocyten met essentiële voedingsstoffen uit het kweekmedium in het basolaterale compartiment. Aan het begin van het reconstitutieproces worden NHEK’s een paar dagen onder water gekweekt om hun hechting op het membraan mogelijk te maken. Het calciumgehalte in beide compartimenten is verhoogd in vergelijking met de calciumconcentratie die wordt gebruikt voor de 2D-cultuur van NHEKs om de proliferatie van cellen te vertragen en in plaats daarvan hun differentiatie te bevorderen46. Een epidermale calciumgradiënt is essentieel om de barrièrevorming en homeostase te reguleren47,48. Hoge calciumspiegels (d.w.z. tot 1,5 mM) bevorderen de vorming van intercellulaire verbindingen en moduleren de vorming van de cornified envelop tijdens terminale differentiatie49. Zodra keratinocyten een continue en nauw hechtende monolaag op het ondersteunende membraan vormen, wordt het medium uit het apicale compartiment verwijderd en gaat het kweekproces verder op de lucht-vloeistofinterface (ALI) om stratificatie te stimuleren en een epidermale barrière vast te stellen50,51. Specifieke kweekomstandigheden zijn van cruciaal belang voor het verkrijgen van een volledig gelaagd epitheel36. Tijdens het reconstitutieproces bij ALI wordt het medium in het basolaterale compartiment aangevuld met keratinocytgroeifactor (KGF), insuline, calcium en ascorbinezuur. Ascorbinezuur speelt een belangrijke rol bij de vorming van een geschikte SC-lipidebarrière, die sterk lijkt op die van de inheemse menselijke huid52. Keratinocyten gekweekt in ascorbinezuur-aangevuld medium tonen een gedifferentieerd fenotype, met een verhoogd aantal keratohyalinekorrels, evenals georganiseerde intercellulaire lipide lamellen in de interstices van de corneocyten52. Een dergelijke suppletie is essentieel om de epidermale barrièrefunctie te verbeteren door het gehalte aan cornified envelope te verhogen en uitputting van hydrofiele antioxidantvoorraden53,54te voorkomen . KGF, een belangrijke paracrinemediator van epidermale proliferatie en differentiatie, wordt gebruikt om de NHEKs55te stimuleren.
De belangrijkste nadelen van interne RhEs zijn het verlies van standaardisatie tussen onderzoeksinstellingen en verhoogde arbeidsintensiteit en tijdsconsumptie (tot 3 weken in vergelijking met de kant-en-klare commerciële modellen). Het doel van dit document is om deze nadelen aan te pakken en de basis voor de productie op grotere schaal te leggen. Naast de bovengenoemde voordelen van interne RhEs, is het huidige protocol gericht op het verminderen van de intra- en intervariabiliteit tussen weefsels, het verminderen van besmettingsrisico’s en het stroomlijnen van het teeltproces.
Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare en robuuste methode om RhEs te kweken met neonatale NHEKs. Bovendien toont het representatieve resultaten van de karakterisering van de RhEs-morfologie, barrière-integriteit en expressie van eiwitten die specifiek zijn voor epidermale differentiatie. RhEs morfologische structuur werd onderzocht met behulp van hematoxyline en eosine (H&E) kleuring en transmissie elektronenmicroscopie (TEM). Om de barrière-integriteit te evalueren, werden de transepidermaal elektrische weerstand (TEER) en de blootstellingstijd aan Triton X-100 gemeten om 50% van de levensvatbaarheid van het weefsel (ET50) te verminderen. De vorming van desmosomale verbindingen (d.w.z. desmogleine 1) werd geanalyseerd door immunofluorescentie (IF) om de hechting van keratinocyt te evalueren. De vorming van epidermale structurele eiwitten (d.w.z. involucrine, loricrine en filaggrin) werd geëvalueerd en gedetecteerd met IF. Deze eiwitten zijn betrokken bij de vorming van de sterk gekruiste eiwitschil die SC-corneocyten omringt en zijn als gevolg daarvan belangrijke markers voor epidermale differentiatie in een laat stadium56,57. Bovendien werd IF gebruikt om keratine 10 te analyseren, een eiwit dat werd geïnduceerd in gedifferentieerde cellen in het vroege stadium in SS58 en werd gevonden in alle gedifferentieerde lagen. Ten slotte werd de reactie van de RhE op pro-inflammatoire stimuli (d.w.z. lipopolysaccharide en tumornecrosefactor alfa) onderzocht. De niveaus van interleukine 1 alfa (IL-1α) en interleukine 8 (IL-8) werden gemeten in de celkweekmedia, met behulp van enzymgekoppelde immunosorbenttesten (ELISA).
RhEs worden wijd gebruikt als het onderzoeken hulpmiddelen op de farmaceutische en dermato-kosmetische gebieden36,75,76,77,78. Hoewel verschillende bedrijven dergelijke RhEs commercieel beschikbaar hebben gesteld, blijven ze duur en beperken ze de mogelijkheid om de teeltparameters te variëren als dat nodig is om nieuwe onderzoeksvragen aan te pakken. Dit document beschrijft de productieprocedure van interne RhEs op een robuuste en betrouwbare manier en biedt een gedetailleerde karakterisering van de verkregen weefsels om de relevantie van het model als alternatieve benadering van dierproeven te bevestigen.
Sommige stappen in het protocol zijn cruciaal om een goede keratinocytdifferentiatie en RhE-reproduceerbaarheid te garanderen. Dit kan worden uitgevoerd door gebruik te maken van de optimale cellen, medium type(s) en teeltomstandigheden. In het voorgestelde RhE-model werden neonatale NHEK’s geselecteerd op hun gebrek aan antigene blootstelling, vergeleken met volwassen NHEKs. Bovendien waren keratinocyten beperkt tot kaukasische etniciteit om variabiliteit tussen soorten te voorkomen. Primaire keratinocyten worden meestal gebruikt voor hun vermogen om te differentiëren en te stratificeren79. Ze kunnen commercieel of door interne isolatie van volwassen huid worden verkregen80. De teelt van een cellijn (d.w.z. HaCaT) op een polycarbonaatmembraan, heeft aangetoond dat differentiatie mislukt en een verminderd vermogen heeft aangetoond om lipiden te synthetiseren die nodig zijn voor barrièrevorming81. De opname van verschillende cultuurmatrices, zoals hydrogels, collageen-, fibrine- en sferoïdenculturen, resulteerde echter in de succesvolle ontwikkeling van 3D-huidmodellen78,82,83,84,85,86. De vereeuwigde cellijnen, N/TERT, zijn geschikt gebleken voor de ontwikkeling van RhEs35. Primaire keratinocyten blijven proliferatieve bij hun vierde of vijfde passage61, daarom omvat het huidige protocol het gebruik van keratinocyten in hun derde passage. De Vuyst et al. hebben aangetoond dat de celzaderijdichtheid van belang is en voldoende moet zijn (d.w.z. ≥ 2,5×105 cellen/cm2) ervoor te zorgen dat het medium uit het basolaterale compartiment niet naar het apicale compartiment verspreidt. Een onvoldoende zaaidichtheid (d.w.z. < 2.5×105 cellen/cm2) kan resulteren in een onvermogen om een goede barrière te vormen, wat wordt aangegeven door de verspreiding van medium van het basolaterale naar het apicale compartiment, wat resulteert in ondergedompelde in plaats van ALI-cultuuromstandigheden62. Serumvrij keratinocytgroeimedium (zie Tabel met materialen) de voorkeur kreeg voor reproduceerbaarheidsdoeleinden, omdat het het voordeel biedt van het werken met een chemisch gedefinieerd medium en het risico op besmetting vermindert. Dit medium heeft een lagere calciumconcentratie (d.w.z. 60 μM) en stimuleert daarom de proliferatie van keratinocyten87. Verhoging van de calciumconcentratie (d.w.z. 1,5 mM) vanaf de eerste stap van de RhE-teelt, bevordert keratinocytdifferentiatie en huidbarrièrevorming en homeostase49. Bovendien wordt het ALI-medium aangevuld met ascorbinezuur, dat cruciaal is gebleken voor de vorming van SC-lipiden en om differentiatie te bevorderen52,53,54. Het ALI-medium bevat ook KGF, een groeifactor die wordt afgescheiden door fibroblasten die zich kunnen binden aan keratinocyt transmembrane receptoren en bij activering een dubbele rol heeft bij differentiatie en wondherstel55,88. Het is belangrijk om het ALI-medium met specifieke tijdsintervallen te vernieuwen, om een constante toevoer van verse voedingsstoffen aan de RhEs te bieden. Het gebruik van een draagplaatsysteem is cruciaal voor rhe-teelt op grotere schaal (d.w.z. 24 wisselplaten/plaat). Het biedt het voordeel van tijdsbesparing, het verminderen van het risico op besmetting en laat minder ruimte over voor de introductie van menselijke fouten. Het biedt ook de mogelijkheid om RhEs te culteren in een hoog volume media (d.w.z. 1,5 ml), wat het vereiste aantal ALI-mediumvernieuwingen vermindert. Bovendien biedt het de mogelijkheid om een volledige plaat wisselplaten over te brengen naar een plaat met vers medium, contact met de inzetstukken afzonderlijk te vermijden of het deksel van de plaat bloot te leggen.
Er zijn verschillende beperkingen van het RhE-model die moeten worden opgemerkt. In de inheemse menselijke huid is er een evenwicht tussen de proliferatie van keratinocyten in de basale laag en de loslating van corneocyten in de SC (d.w.z. desquamatie)89. In vitro vindt desquamatie echter niet plaats. Daarom blijven de corneocyten gehecht aan de RhE en vormen ze een dikke SC die minder fysiologisch relevant is. Daarom is er een beperkte teelttijdspanne van RhEs. Bovendien is dit RhE-model eenvoudig en eenvoudig, omdat het bestaat uit een enkel celtype, d.w.z. de keratinocyt, het meest voorkomende celtype van de epidermis. Er zijn echter andere celtypen die in de epidermis voorkomen, zoals melanocyten, dendritische cellen (d.w.z. Langerhans-cellen), T-cellen (bijv. CD8+ cellen) en Merkel-cellen13. Om de fysiologische relevantie van het huidmodel te verbeteren, hebben onderzoekers huidmodellen complexer gemaakt door melanocyten toe te voegen38 , immuuncellen39, of van de patiënt afgeleide cellen90. Men moet in gedachten houden dat de barrière-eigenschappen van menselijke huidmodellen anders zijn in vergelijking met de inheemse menselijke huid, met name vanwege een andere SC-lipidesamenstelling en een hogere barrièredoorlaatbaarheid 91,92,93,94,95. Verschillende studies hebben echter veranderingen in barrière-eigenschappen van menselijke huidmodellen gemeld door de teelt onder hypoxie96 of verminderde relatieve vochtigheid97, de modulatie van de dermale matrix met chitosan98, en wijziging van de vrije vetzuren in het kweekmedium99. Bovendien kunnen in zowel eenvoudige als complexere RhEs de cultuuromstandigheden en de gemiddelde samenstelling worden gemoduleerd om pathologische kenmerken na te bootsen. Door het model uit te dagen met cytokinen, een abnormale morfologie100 en veranderingen in gen- en eiwitexpressieniveaus kunnen worden vastgesteld die meestal worden waargenomen bij veel voorkomende huidaandoeningen, zoals atopische dermatitis en psoriasis35,101,102,103,104,105. Het dempen van specifieke genen in keratinocyten voordat het reconstitutieproces van het 3D-model wordt gestart, is een andere benadering die wordt gebruikt om kenmerken van huidaandoeningen na te bootsen en nieuwe therapeutische oplossingen te onderzoeken106,107. Naast het modelleren van alleen een epidermale laag, kan een dermaal compartiment in het model worden opgenomen (d.w.z. benoemde menselijke huidequivalenten of modellen met volledige dikte) door fibroblasten in een collageenmatrix te verankeren voorafgaand aan RhE-reconstitutie, waardoor het fysiologisch relevanter en geschikter wordt voor verouderings- en wondgenezingsgerelateerde studies108,109,110. Bovendien zijn tumorsferoïden toegevoegd aan menselijke huidequivalenten om de progressie van melanoom te bestuderen111,112. De nieuwste ontwikkelingen op het gebied van huidmodellen zijn bioprinten en skin-on-a-chip. Meerdere onderzoeksgroepen zijn er onlangs in geslaagd om (perfusable) bio-geprinte huidequivalenten te ontwikkelen45,113,114. Het voorgestelde protocol maakt gebruik van een 24-well formaat en een draagplaat, waardoor wisselplaten niet afzonderlijk moeten worden behandeld. De studieschaal is echter nog steeds vrij beperkt en mist automatisering. Door het gebruik van bioprinten of skin-on-a-chip te implementeren, kunnen kleinere huidmodellen worden gebruikt met meer geautomatiseerde processen en op grotere schaal.
De RhE beschreven in dit protocol heeft meerdere overeenkomsten met de reeds ontwikkelde en goed gekarakteriseerde commerciële epidermale modellen. De morfologische analyse heeft aangetoond dat, hoewel het aantal levensvatbare lagen in het voorgestelde RhE-model lager is in vergelijking met dat van de inheemse menselijke huid (d.w.z. 6-7 in vergelijking met 7-14), het vergelijkbaar is met dat van het EpiDerm RhE-model (d.w.z. 8-12)70. Net als bij de Modellen EpiDerm, EpiSkin en SkinEthic toont de bovenste RhE-laag een mandweefselpatroon van dicht opeengepakte corneocytlagen28. Bovendien bleek uit tem-analyse dat het aantal SC-lagen in het voorgestelde RhE-model (d.w.z. 15-25) vergelijkbaar is met dat van EpiDerm (d.w.z. 16-25)70. Over het algemeen vertoont het voorgestelde RhE-model een vergelijkbare structuur als die van andere gecommercialiseerde epidermale modellen, die de inheemse menselijke epidermis nabootsen. De weefselintegriteit zoals gemeten door TEER ligt binnen het bereik van commerciële RhE-modellen (d.w.z. tussen 3000-5600 Ω,cm2)71,72,73 en andere interne RhE’s (d.w.z. ongeveer 5000 Ω,cm2)74,115. Het voorgestelde RhE-model blijkt goed gedifferentieerd te zijn, zoals blijkt uit de aanwezigheid en correcte lokalisatie van differentiatie- en weefseladhesiemarkers. Bovendien blijkt het voorgestelde RhE-model te reageren op pro-inflammatoire stimuli (d.w.z. LPS en TNF-α).
Tot slot laat het huidige protocol zien hoe rhEs op een betrouwbare manier en op relatief grote schaal kunnen worden produceren om te voldoen aan de behoeften van onderzoekers in zowel academische als particuliere instellingen. Het voorgestelde RhE-model vertoont vergelijkbare morfologie, epidermale differentiatie en biologische responsiviteit als andere bestaande commerciële modellen. Het biedt een alternatief hulpmiddel voor zowel het farmaceutische als dermato-cosmetische veld wanneer toegang tot een relevant huidmodel vereist is.
The authors have nothing to disclose.
Het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidie met de subsidieovereenkomst nr. 765602 dit werk gefinancierd. Alle auteurs erkennen de steun van de Adolphe Merkle Foundation en de Universiteit van Ferrara en erkennen dow silicones belgium dankbaar. Dr. Miguel Spuch-Calvar wordt erkend voor het voorbereiden van de grafische afbeeldingen van het RhE-teeltproces. De auteurs danken Dr. Barbara Drasler, Dr. Franco Cervellati en Dr. Agnès Tessier voor hun technische ondersteuning en discussies.
Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Antibiotic-antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15240062 | |
Aqueous Eosin Y solution | Sigma Aldrich | HT110280 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich or Merck | C8106 or 1.02378.0500 | Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 °C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. |
DAPI | Roche | 10236276001 | Prepare a stock at 100 μg/mL and store aliquots at -20 °C. Working conditon is 1 μg/mL. |
Entellan mounting medium | Merck | 1.07960.0500 | Mounting medium for H&E staining. |
EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | MEPI500CA | Contains 0.06 mM of Ca2+. |
Ethanol absolute | Any supplier | N/A | |
Formalin 10% | Leica Biosystems | 3800770 | |
Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | S0015 | To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 μg/mL hydrocortisone,5 μg/mL bovine transferrin, and 0.01 µg/mL human recombinant insulin-like growth factor-I. |
Isopropanol | Biosolve B.V. | 0016264102BS | |
Kaiser's glycerol gelatine, phenol-free | Merck | 1.08635.0100 | Mounting medium for IF staining. |
Keratinocyte growth factor (KGF) | R&D Systems | 251-KG-050 | Reconstitute KGF protein at 100 μg/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20°C. |
Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit | Roche | 4744926001 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20°C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark. |
Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5 | Sigma-Aldrich | L4524 | Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 °C. Working concentration is 100 μg/mL. |
Mayer’s Haematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS80 | |
Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) | Lonza | 00192906 | Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors. |
Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010056 or 10010-015 | Reference numbers can vary between countries. |
Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | ImmunoTools | 11344483 | Prepare a stock of 100 μg/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL |
Sterile ultrapure water | Any supplier | N/A | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93426 | |
Trypan blue (0.4% [v/v]) | Any supplier | N/A | |
Trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | R007100 | |
Trypsin/EDTA (0.05% [v/v]) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 25300054 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | Ab150113 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | Merck | 1.06448.0500 | For antigen retrieval buffer for IF staining. |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Dylight 488) | Agrisera | AS09 633 | |
Filaggrin Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-53243 | |
Involucrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-33742 | |
Keratin 10 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-32962 | |
Desmoglein-1 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | MAB944 | |
Loricrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP1-33610 |