Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode, um dreidimensionale rekonstituierte menschliche Epidermis reproduzierbar und robust zu kultivieren. Zusätzlich charakterisiert es die Struktur-Funktions-Beziehung des epidermalen Barrieremodells. Die biologischen Reaktionen der rekonstituierten menschlichen Epidermis auf proinflammatorische Reize werden ebenfalls vorgestellt.
Ein dreidimensionales menschliches Epidermismodell, das aus neonatalen primären Keratinozyten rekonstruiert wurde, wird vorgestellt. Hierin wird ein Protokoll für den Kultivierungsprozess und die Charakterisierung des Modells beschrieben. Neonatale primäre Keratinozyten werden auf durchlässigen Polycarbonateinsätzen eingetaucht gezüchtet und drei Tage nach der Aussaat an die Luft-Flüssig-Grenzfläche gehoben. Nach vierzehn Tagen Stimulation mit definierten Wachstumsfaktoren und Ascorbinsäure in calciumreichem Kulturmedium ist das Modell vollständig differenziert. Die histologische Analyse ergab eine vollständig geschichtete Epidermis, die die Morphologie der einheimischen menschlichen Haut nachahmt. Zur Charakterisierung des Modells und seiner Barrierefunktionen wurden Proteinspiegel und Lokalisation, die spezifisch für die Keratinozytendifferenzierung im Frühstadium (d. h. Keratin 10), die Differenzierung im Spätstadium (d. H. Involucrin, Loricrin und Filaggrin) und die Gewebeadhäsion (d. H. Desmoglein 1) sind, durch Immunfluoreszenz untersucht. Die Integrität der Gewebebarriere wurde durch die Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands weiter bewertet. Reconstructed human epidermis reagierte auf proinflammatorische Reize (d. h. Lipopolysaccharid und Tumornekrosefaktor alpha), was zu einer erhöhten Zytokinfreisetzung führte (d. h. Interleukin 1 alpha und Interleukin 8). Dieses Protokoll stellt eine einfache und reproduzierbare In-vitro-Methode zur Kultivierung rekonstruierter menschlicher Epidermis als Instrument zur Bewertung von Umweltauswirkungen und einer breiten Palette von hautbezogenen Studien dar.
Die Epidermis ist die äußerste Schicht der Haut, an der direkten Schnittstelle zwischen dem menschlichen Körper und der äußeren Umgebung. Seine Hauptfunktionen sind Schutz und Hydratation1. Die Epidermis wirkt als wirksame physikalische Barriere gegen äußere Einflüsse und verhindert übermäßigen Wasserverlust aus dem Körper. Diese Hautfunktionen hängen hauptsächlich von der zellulären Anordnung in den äußersten Hautschichten, der Zusammensetzung und Organisation der interzellulären Lipideab 2. Die Epidermis besteht hauptsächlich aus Keratinozyten, die nach oben zur Außenseite des Gewebes wandern und eine Differenzierung durchlaufen. Es gibt 4-5 epidermale Schichten, die durch ihr Differenzierungsstadium gekennzeichnet sind. Von innen nach außen beginnen die epidermalen Schichten von der lebensfähigen Epidermis, d.h. dem Stratum basale (SB), dem Stratum spinosum (SS) und dem Stratum granulosum (SG), bis zur nicht lebensfähigen obersten Schicht, d.h. dem Stratum corneum (SC)3. Die Basalschicht besteht hauptsächlich aus proliferierenden keratinangereicherten Keratinozyten, die bei Differenzierung durch die SS wandern4. Während der Reifung der Keratinozyten treten verschiedene Veränderungen in der Proteinexpression und -struktur auf. Keratinozyten haften durch die Bildung von desmosomale Verbindungen5. Im SG wird die Erzeugung von Lamellenkörpern eingeleitet. Sie bestehen aus Lipidvorstufen und Enzymen, die für die Bildung der Hautbarrierefunktion entscheidend sind6. Das SG ist auch durch das Vorhandensein von Keratohyalin-Granula im Zytoplasma der Keratinozyten gekennzeichnet. An der Grenzfläche zum SC wird der Gehalt der Lamellenkörper in die Interzellularräume extrudiert und die unpolaren Lipide wie Ceramide, Cholesterin und freie Fettsäuren organisieren sich zu gestapelten lamellaren Lipiddoppelschichten, um die extrazelluläre Lipidmatrix zu bilden7. Im SC verlieren Zellen aufgrund enzymatischer Abbauprozesse alle Zellulären Organellen einschließlich des Kerns und nehmen eine abgeflachte Morphologie an. Sie sind von einer verhornten Hülle aus vernetzten Proteinschichten umgeben und werden als Korneozyten8,9bezeichnet. Desmosomale Komponenten sind mit der verhornten Hülle vernetzt, um Corneodesmosomen zu bilden und die Korneozyten miteinander zu verbinden. Das resultierende Epithel wird kontinuierlich aus Stammzellen erneuert, mit einer Umsatzzeit von ca. 5-6 Wochen10. Der Differenzierungsprozess der Keratinozyten, der zu einer vollständig geschichteten Epidermis führt, ist entscheidend für die Bildung der Barrierefunktion der Haut11.
Während der Verwundung und Entzündung induzieren Keratinozyten Veränderungen in Adhäsionsmolekülen und Oberflächenrezeptoren und lösen proinflammatorische Reaktionen durch sekretion von Zytokinen, Chemokinen und antimikrobiellen Peptidenaus 12. Die Haut ist nicht nur eine physische Barriere gegen exogene Substanzen; Es wirkt auch als Immunsensor bei Exposition gegenüber Krankheitserregern. Darüber hinaus reguliert es die Diffusion mehrerer Substanzen über seine Schichten, wie z.B. den Wassergehalt, um den menschlichen Körper vor Austrocknung zu schützen. Die Haut ist auch an der Synthese von Vitamin D beteiligt und hat verschiedene andere Stoffwechselfunktionen3,13,14.
Um die nachteiligen Auswirkungen exogener Substanzen zu beurteilen, verlassen sich Toxikologen seit Jahrzehnten auf Tierversuche, aber heutzutage ist dies nicht der bevorzugte Ansatz. Neben der begrenzten Vorhersagefähigkeit für die Toxizität beim Menschen beinhalten Tiermodelle zahlreiche ethische Fragen. Das Verbot von Tierversuchen in der Kosmetikindustrie und die Empfehlung, in der Forschung dem 3R-Prinzip (d.h. Replacement, Reduction und Refinement) zu folgen, haben zur Entwicklung alternativer Testmethoden auf der Grundlage von In-vitro-Ansätzen geführt15. Die ersten In-vitro-Hautzellmodelle wurden bereits in den 90er Jahren beschrieben, und eine beeindruckende Entwicklung von einfachen menschlichen Keratinozyten-Monokulturen zu vollständig differenzierten Epidermis- und Volldickenmodellen wurde erreicht16. Heutzutage hat das Skin Tissue Engineering sowohl im pharmazeutischen als auch im dermatokosmetischen Bereich an Bedeutung gewonnen. In den letzten zwei Jahrzehnten haben mehrere Unternehmen dreidimensionale (3D) rekonstruierte menschliche Epidermis (RhE) kommerzialisiert, die standardisierte und reproduzierbare Werkzeuge für hautbezogene Studien darstellen. Mehrere kommerzielle RhE-Modelle sind für die In-vitro-Hautprüfung von Chemikalien nach oecD-Richtlinien zur Prüfung von Hautreizungen17,18 (d.h. Testrichtlinie 43919) und Hautkorrosion20 (d.h. Testrichtlinie 43121)zugelassen. Der In-vitro-Test zur Hautsensibilisierung22 (d.h. SENS-IS-Assay) befindet sich derzeit in der Zulassungsspur und wird von Experten begutachtet23. Es gibt auch zahlreiche andere Assays, die kommerzielle RhE-Modelle verwenden, um die Phototoxizität24zu bewerten, Arzneimittelformulierungen25,kosmetische Formulierungen und Wirkstoffe26zu testen, die Hautbarrierefunktion27 zu untersuchen und die biologische Reaktion auf Umweltstressoren zu testen28,29,30,31.
Neben handelsüblichen 3D-Hautmodellen haben mehrere Forschungsgruppen eigene RhEs32 , 33,34,35,36,37entwickelt. Eigene RhEs bieten den Vorteil, die Kulturbedingungen entsprechend dem Zweck der Studie zu steuern. Insbesondere können Forscher den Typ und die Quelle der Keratinozyten auswählen, die für die Rekonstitution ihres 3D-Epidermismodells verwendet werden sollen (d. H. Primär vs. Immortalisiert, Neugeborene vs. Alter, Einzelne vs. Gepoolte Zufallsspender, Geschlecht, ethnische Zugehörigkeit, individuelle Lebensgewohnheiten wie Rauchen usw.). Sie haben die Möglichkeit, die Zusammensetzung des Kulturmediums zu variieren und Wachstumsfaktoren, Vitamine oder andere Verbindungen zu integrieren, die die Expression von Zielproteinen oder Lipiden modulieren können. Mit dem hauseigenen RhEs können Forscher auch biologische Reaktionen und biomechanische Eigenschaften in Abhängigkeit vom Differenzierungszustand des 3D-Modells untersuchen. Zusätzlich zu diesen intuitiven Parametern gibt es kontinuierliche Bemühungen, die Komplexität von 3D-Hautmodellen zu erhöhen und sie physiologisch relevanter zu machen, zum Beispiel durch Hinzufügen anderer epidermaler Zelltypen (z. B. Melanozyten und Immunzellen)38,39, durch Kultivierung der Keratinozyten auf einer fibroblastenbevölkerten Kollagenmatrix40,41,42und durch Einbeziehung von Komponenten des vaskulären Netzwerks43,44,45.
Obwohl es möglich ist, die Kulturbedingungen auf spezifische Bedürfnisse abzustimmen, gibt es Parameter, die eingehalten werden müssen, um sowohl die Qualität als auch die Relevanz einer RhE zu gewährleisten. Zur Kultivierung von RhE-Geweben werden normale humane epidermale Keratinozyten (NHEKs) in spezifische durchlässige Kultureinsätze eingesät, deren poröse synthetische Membran die Vertiefungen in zwei Kompartimente trennt, d.h. das apikale und das basolaterale Kompartiment. Die Porosität der Membran (d.h. eine Porengröße von 0,4 μm) ist so, dass sie die Bildung einer Zellmonoschicht im apikalen Kompartiment ohne Migration von Zellen zur Basaleinsatzseite und die Fütterung der Keratinozyten mit essentiellen Nährstoffen aus dem im basolateralen Kompartiment enthaltenen Kulturmedium ermöglicht. Zu Beginn des Rekonstitutionsprozesses werden NHEKs für einige Tage unter eingetauchten Bedingungen kultiviert, um ihre Haftung auf der Membran zu ermöglichen. Der Kalziumspiegel in beiden Kompartimenten ist im Vergleich zu der Kalziumkonzentration, die für die 2D-Kultur von NHEKs verwendet wird, erhöht, um die Proliferation von Zellen zu verlangsamen und stattdessen ihre Differenzierung zu fördern46. Ein epidermaler Calciumgradient ist essentiell, um die Barrierebildung und Homöostase zu regulieren47,48. Hohe Calciumgehalte (d.h. bis zu 1,5 mM) fördern die Bildung interzellulärer Verbindungen und modulieren die Bildung der verhornten Hülle während der terminalen Differenzierung49. Sobald Keratinozyten eine kontinuierliche und fest haftende Monoschicht auf der Stützmembran bilden, wird das Medium aus dem apikalen Kompartiment entfernt und der Kulturprozess an der Luft-Flüssig-Grenzfläche (ALI) fortgesetzt, um die Schichtung zu stimulieren und eine epidermale Barriere zu etablieren50,51. Spezifische Kulturbedingungen sind entscheidend, um ein vollständig geschichtetes Epithel zu erhalten36. Während des Rekonstitutionsprozesses bei ALI wird das Medium im basolateralen Kompartiment mit Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF), Insulin, Kalzium und Ascorbinsäure ergänzt. Ascorbinsäure spielt eine wichtige Rolle bei der Bildung einer geeigneten SC-Lipidbarriere, die der der einheimischen menschlichen Haut sehr ähnlichist 52. Keratinozyten, die in ascorbinsäureergänzungsmittelmittel gezüchtet werden, zeigen einen differenzierten Phänotyp mit einer erhöhten Anzahl von Keratohyalingranula sowie organisierte interzelluläre Lipidlamellen in den Zwischentischen der Korneozyten52. Eine solche Supplementierung ist unerlässlich, um die epidermale Barrierefunktion zu verbessern, indem der Gehalt an verhornten Hüllen erhöht und eine Erschöpfung der hydrophilen Antioxidantienspeicher vermieden wird53,54. KGF, ein wichtiger parakriner Mediator der epidermalen Proliferation und Differenzierung, wird verwendet, um die NHEKs55zu stimulieren.
Zu den Hauptnachteilen der internen RhEs gehören der Verlust der Standardisierung zwischen forschungseinrichtungen und eine erhöhte Arbeitsintensität und ein erhöhter Zeitaufwand (bis zu 3 Wochen im Vergleich zu den gebrauchsfertigen kommerziellen Modellen). Ziel des vorliegenden Papiers ist es, diese Nachteile anzugehen und die Grundlage für eine Produktion in größerem Maßstab zu legen. Zusätzlich zu den oben genannten Vorteilen von hauseigenen RhEs zielt das aktuelle Protokoll darauf ab, die Intra- und Intervariabilität zwischen Geweben zu reduzieren, Kontaminationsrisiken zu reduzieren und den Kultivierungsprozess zu rationalisieren.
Das aktuelle Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und robuste Methode zur Kultivierung von RhEs mit neonatalen NHEKs. Darüber hinaus zeigt es repräsentative Ergebnisse der Charakterisierung der RhEs-Morphologie, Barriereintegrität und Expression von Proteinen, die spezifisch für die epidermale Differenzierung sind. Die morphologische Struktur von RhEs wurde mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbe- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht. Zur Bewertung der Barriereintegrität wurden der transepidermale elektrische Widerstand (TEER) und die Expositionszeit gegenüber Triton X-100 gemessen, um 50% der Gewebelebensfähigkeit (ET50)zu reduzieren. Die Bildung von desmosomale Verbindungen (d.h. Desmoglein 1) wurde mittels Immunfluoreszenz (IF) analysiert, um die Keratinozytenadhäsion zu bewerten. Die Bildung von epidermalen Strukturproteinen (d.h. Involucrin, Loricrin und Filaggrin) wurde mit IF evaluiert und nachgewiesen. Diese Proteine sind an der Bildung der hochvernetzten Proteinhülle beteiligt, die SC-Korneozyten umgibt und sind daher wichtige Marker für die epidermale Differenzierung im Spätstadium56,57. Darüber hinaus wurde IF verwendet, um Keratin 10 zu analysieren, ein Protein, das in differenzierten Zellen im Frühstadium im SS58 induziert und in allen differenzierten Schichten gefunden wurde. Schließlich wurde die Reaktion der RhE auf proinflammatorische Reize (d.h. Lipopolysaccharid und Tumornekrosefaktor alpha) untersucht. Die Spiegel von Interleukin 1 alpha (IL-1α) und Interleukin 8 (IL-8) wurden in den Zellkulturmedien mit Enzym-Linked Immunosorbent Assays (ELISA) gemessen.
RhEs sind weit verbreitet als Screening-Werkzeuge in den pharmazeutischen und dermato-kosmetischen Bereichen36,75,76,77,78. Obwohl mehrere Unternehmen solche RhEs kommerziell verfügbar gemacht haben, bleiben sie kostspielig und schränken die Möglichkeit ein, Anbauparameter nach Bedarf zu variieren, um neue Forschungsfragen zu beantworten. Dieses Papier beschreibt den Herstellungsprozess von hauseigenen RhEs auf robuste und zuverlässige Weise und bietet eine detaillierte Charakterisierung der erhaltenen Gewebe, um die Relevanz des Modells als alternativen Ansatz für Tierversuche zu bestätigen.
Einige der Schritte im Protokoll sind entscheidend, um eine ordnungsgemäße Keratinozytendifferenzierung und RhE-Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Dies kann durch die Verwendung der optimalen Zellen, Mediumstypen und Kultivierungsbedingungen durchgeführt werden. Im vorgeschlagenen RhE-Modell wurden neonatale NHEKs aufgrund ihrer fehlenden antigenen Exposition im Vergleich zu erwachsenen NHEKs ausgewählt. Darüber hinaus waren Keratinozyten auf die kaukasische Ethnizität beschränkt, um Variabilität zwischen den Arten zu vermeiden. Primäre Keratinozyten werden typischerweise wegen ihrer Fähigkeit zur Differenzierung und Stratifizierung verwendet79. Sie können kommerziell oder durch interne Isolierung von der Haut eines Erwachsenen gewonnen werden80. Die Kultivierung einer Zelllinie (d.h. HaCaT) auf einer Polycarbonatmembran hat gezeigt, dass die Differenzierung fehlschlägt und eine beeinträchtigte Fähigkeit zur Synthese von Lipiden gezeigt wurde, die für die Barrierebildung notwendig sind.81. Die Einbeziehung verschiedener Kulturmatrizen wie Hydrogele, Kollagen-, Fibrin- und Sphärogusskulturen führte jedoch zur erfolgreichen Entwicklung von 3D-Hautmodellen.78,82,83,84,85,86. Die immortalisierten Zelllinien, N/TERT, haben sich als geeignet für die Entwicklung von RhEs erwiesen35. Primäre Keratinozyten bleiben bei ihrer vierten oder fünften Passage proliferativ61Daher beinhaltet das aktuelle Protokoll die Verwendung von Keratinozyten in ihrer dritten Passage. De Vuyst et al. haben gezeigt, dass die Zellaussaatdichte von Bedeutung ist und ausreichend sein muss (d.h. ≥ 2,5×105 Zellen/cm2), um sicherzustellen, dass das Medium aus dem basolateralen Kompartiment nicht in das apikale Kompartiment diffundiert. Eine unzureichende Aussaatdichte (z. B. < 2.5×105 Zellen/cm2) kann zu einer Unfähigkeit führen, eine geeignete Barriere zu bilden, was durch die Diffusion des Mediums vom basolateralen zum apikalen Kompartiment angezeigt wird, was zu untergetauchten anstelle von ALI-Kulturbedingungen führt.62. Serumfreies Keratinozyten-Wachstumsmedium (siehe Materialtabelle) wurde aus Gründen der Reproduzierbarkeit bevorzugt, da es den Vorteil bietet, mit einem chemisch definierten Medium zu arbeiten und das Risiko einer Kontamination zu verringern. Dieses Medium hat eine geringere Kalziumkonzentration (d.h. 60 μM) und stimuliert daher die Proliferation von Keratinozyten87. Die Erhöhung der Kalziumkonzentration (d.h. 1,5 mM) ab dem ersten Schritt der RhE-Kultivierung begünstigt die Keratinozytendifferenzierung und die Bildung von Hautbarrieren und die Homöostase49. Darüber hinaus wird das ALI-Medium mit Ascorbinsäure ergänzt, die sich als entscheidend für die Bildung von SC-Lipiden und zur Förderung der Differenzierung erwiesen hat.52,53,54. Das ALI-Medium enthält auch KGF, einen Wachstumsfaktor, der von Fibroblasten abgesondert wird, der an Keratinozyten-Transmembranrezeptoren binden kann und bei Aktivierung eine doppelte Rolle bei der Differenzierung und Wundreparatur spielt55,88. Es ist wichtig, das ALI-Medium in bestimmten Zeitintervallen aufzufrischen, um die RhEs konstant mit frischen Nährstoffen zu versorgen. Der Einsatz eines Trägerplattensystems ist entscheidend für den RhE-Anbau in größerem Maßstab (d.h. 24 Einsätze/Platte). Es bietet den Vorteil, Zeit zu sparen, das Risiko einer Kontamination zu reduzieren und weniger Raum für die Einführung menschlicher Fehler zu lassen. Es bietet auch die Möglichkeit, RhEs in einem hohen Medienvolumen (d. H. 1,5 ml) zu kulturieren, was die erforderliche Anzahl von ALI-Medium-Refreshes reduziert. Darüber hinaus bietet es die Möglichkeit, eine volle Platte von Einsätzen auf eine Platte mit frischem Medium zu übertragen, den Kontakt mit den Einsätzen einzeln zu vermeiden oder den Plattendeckel freizulegen.
Es gibt mehrere Einschränkungen des RhE-Modells, die beachtet werden sollten. In der nativen menschlichen Haut besteht ein Gleichgewicht zwischen der Proliferation von Keratinozyten in der Basalschicht und der Ablösung von Korneozyten im SC (d.h. Abschuppung).89. In vitro findet jedoch keine Abschämierung statt. Daher bleiben die Korneozyten an der RhE gebunden und bilden ein dickes SC, das physiologisch weniger relevant ist. Daher gibt es eine begrenzte Anbauzeitspanne von RhEs. Darüber hinaus ist dieses RhE-Modell einfach und unkompliziert, da es aus einem einzigen Zelltyp besteht, nämlich dem Keratinozyten, dem am häufigsten vorkommenden Zelltyp der Epidermis. Es gibt jedoch andere Zelltypen, die in der Epidermis ansässig sind, wie Melanozyten, dendritische Zellen (dh Langerhans-Zellen), T-Zellen (z. B. CD8).+ B. Zellen) und Merkelzellen13. Um die physiologische Relevanz des Hautmodells zu erhöhen, haben Forscher Hautmodelle durch Zugabe von Melanozyten komplexer gemacht38 , Immunzellen39oder vom Patienten abgeleitete Zellen90. Man sollte bedenken, dass die Barriereeigenschaften menschlicher Hautmodelle im Vergleich zur nativen menschlichen Haut unterschiedlich sind, insbesondere aufgrund einer anderen SC-Lipidzusammensetzung und einer höheren Barrierepermeabilität. 91,92,93,94,95. Mehrere Studien haben jedoch über Veränderungen der Barriereeigenschaften menschlicher Hautmodelle durch die Kultivierung unter Hypoxie berichtet.96 oder verminderte relative Luftfeuchtigkeit97, die Modulation der dermalen Matrix mit Chitosan98und Veränderung der freien Fettsäuren im Kulturmedium99. Darüber hinaus können sowohl in einfachen als auch in komplexeren RhEs die Kulturbedingungen und die Medienzusammensetzung moduliert werden, um pathologische Merkmale nachzuahmen. Durch die Herausforderung des Modells mit Zytokinen wird eine abnormale Morphologie100 und Es können Veränderungen der Gen- und Proteinexpressionsniveaus festgestellt werden, die typischerweise bei häufigen Hauterkrankungen wie atopischer Dermatitis und Psoriasis beobachtet werden35,101,102,103,104,105. Das Stummschalten spezifischer Gene in Keratinozyten vor beginnt der Rekonstitution des 3D-Modells ist ein weiterer Ansatz, um Merkmale von Hauterkrankungen nachzuahmen und neue therapeutische Lösungen zu untersuchen106,107. Neben der Modellierung nur einer epidermalen Schicht kann ein hautliches Kompartiment in das Modell einbezogen werden (d. h. benannte menschliche Hautäquivalente oder Modelle mit voller Dicke), indem Fibroblasten vor der RhE-Rekonstitution in eine Kollagenmatrix eingebettet werden, wodurch es physiologisch relevanter und für Alterungs- und Wundheilungsstudien geeignet ist108,109,110. Darüber hinaus wurden Tumorsphäroide zu menschlichen Hautäquivalenten hinzugefügt, um die Progression des Melanoms zu untersuchen111,112. Die neuesten Fortschritte auf dem Gebiet der Hautmodelle sind Bio-Printing und Skin-on-a-Chip. Mehreren Forschungsgruppen ist es in jüngster Zeit gelungen, (perfusierbare) biobedruckte Hautäquivalente zu entwickeln.45,113,114. Das vorgeschlagene Protokoll nutzt ein 24-Well-Format und eine Trägerplatte, wodurch eine individuelle Handhabung der Einsätze vermieden wird. Der Studienumfang ist jedoch noch recht begrenzt und es fehlt an Automatisierung. Durch die Implementierung von Bio-Printing oder Skin-on-a-Chip können kleinere Hautmodelle mit automatisierteren Prozessen und in größerem Maßstab verwendet werden.
Die in diesem Protokoll beschriebene RhE weist mehrere Ähnlichkeiten mit den bereits entwickelten und gut charakterisierten kommerziellen epidermalen Modellen auf. Die morphologische Analyse hat gezeigt, dass die Anzahl der lebensfähigen Schichten im vorgeschlagenen RhE-Modell zwar im Vergleich zu der einheimischer menschlicher Haut geringer ist (d. h. 6-7 im Vergleich zu 7-14), aber vergleichbar mit der des EpiDerm RhE-Modells (d. h. 8-12)70. Ähnlich wie die Modelle EpiDerm, EpiSkin und SkinEthic zeigt die obere RhE-Schicht ein Korbgewebemuster aus dicht gepackten Korneozytenschichten28. Darüber hinaus ergab die TEM-Analyse, dass die Anzahl der SC-Schichten im vorgeschlagenen RhE-Modell (d. h. 15-25) mit der von EpiDerm (d. h. 16-25)70vergleichbar ist. Insgesamt weist das vorgeschlagene RhE-Modell eine ähnliche Struktur wie andere kommerzialisierte epidermale Modelle auf und ahmt die native menschliche Epidermis nach. Die mit TEER gemessene Gewebeintegrität liegt im Bereich kommerzieller RhE-Modelle (d.h. zwischen 3000-5600 Ω,cm2)71,72,73 und anderen hauseigenen RhEs (d.h. ca. 5000 Ω,cm2)74,115. Das vorgeschlagene RhE-Modell erweist sich als gut differenziert, wie das Vorhandensein und die korrekte Lokalisierung von Differenzierungs- und Gewebeadhäsionsmarkern zeigt. Darüber hinaus zeigt das vorgeschlagene RhE-Modell, dass es auf proinflammatorische Reize (d.h. LPS und TNF-α) anspricht.
Abschließend zeigt das aktuelle Protokoll, wie RhEs zuverlässig und in relativ großem Maßstab hergestellt werden können, um die Bedürfnisse von Forschern sowohl in akademischen als auch in privaten Institutionen zu erfüllen. Das vorgeschlagene RhE-Modell zeigt eine ähnliche Morphologie, epidermale Differenzierung und biologische Reaktionsfähigkeit wie andere bestehende kommerzielle Modelle. Es bietet ein alternatives Werkzeug sowohl für den pharmazeutischen als auch für den dermatokosmetischen Bereich, wenn der Zugang zu einem relevanten Hautmodell erforderlich ist.
The authors have nothing to disclose.
Das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen des Marie-Skłodowska-Curie-Stipendiums mit der Finanzhilfevereinbarung Nr. 765602 diese Arbeit finanziert. Alle Autoren erkennen die Unterstützung der Adolphe Merkle Foundation und der Universität Ferrara an und danken Dow Silicones Belgium. Dr. Miguel Spuch-Calvar ist für die Erstellung der grafischen Bilder des RhE-Kultivierungsprozesses anerkannt. Die Autoren danken Dr. Barbara Drasler, Dr. Franco Cervellati und Dr. Agnès Tessier für ihre technische Unterstützung und Diskussionen.
Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Antibiotic-antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15240062 | |
Aqueous Eosin Y solution | Sigma Aldrich | HT110280 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich or Merck | C8106 or 1.02378.0500 | Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 °C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. |
DAPI | Roche | 10236276001 | Prepare a stock at 100 μg/mL and store aliquots at -20 °C. Working conditon is 1 μg/mL. |
Entellan mounting medium | Merck | 1.07960.0500 | Mounting medium for H&E staining. |
EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | MEPI500CA | Contains 0.06 mM of Ca2+. |
Ethanol absolute | Any supplier | N/A | |
Formalin 10% | Leica Biosystems | 3800770 | |
Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | S0015 | To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 μg/mL hydrocortisone,5 μg/mL bovine transferrin, and 0.01 µg/mL human recombinant insulin-like growth factor-I. |
Isopropanol | Biosolve B.V. | 0016264102BS | |
Kaiser's glycerol gelatine, phenol-free | Merck | 1.08635.0100 | Mounting medium for IF staining. |
Keratinocyte growth factor (KGF) | R&D Systems | 251-KG-050 | Reconstitute KGF protein at 100 μg/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20°C. |
Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit | Roche | 4744926001 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20°C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark. |
Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5 | Sigma-Aldrich | L4524 | Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 °C. Working concentration is 100 μg/mL. |
Mayer’s Haematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS80 | |
Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) | Lonza | 00192906 | Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors. |
Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010056 or 10010-015 | Reference numbers can vary between countries. |
Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | ImmunoTools | 11344483 | Prepare a stock of 100 μg/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL |
Sterile ultrapure water | Any supplier | N/A | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93426 | |
Trypan blue (0.4% [v/v]) | Any supplier | N/A | |
Trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | R007100 | |
Trypsin/EDTA (0.05% [v/v]) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 25300054 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | Ab150113 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | Merck | 1.06448.0500 | For antigen retrieval buffer for IF staining. |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Dylight 488) | Agrisera | AS09 633 | |
Filaggrin Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-53243 | |
Involucrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-33742 | |
Keratin 10 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-32962 | |
Desmoglein-1 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | MAB944 | |
Loricrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP1-33610 |