이 프로토콜은 재현 가능하고 견고한 방식으로 3차원 재구성된 인간 표피를 육성하는 간단한 방법을 설명합니다. 또한 표피 장벽 모델의 구조 기능 관계를 특성화합니다. 선동적인 자극에 재구성된 인간 표피의 생물학 반응은 또한 제시됩니다.
신생아 1차 각질 세포로부터 재구성된 3차원 인간 표피 모델이 제시된다. 본명, 모델의 재배 과정 및 특성화를 위한 프로토콜이 기재된다. 신생아 1차 각질세포는 투과성 폴리카보네이트 인서트에 침수되어 파종 후 3일 후에 공기-액체 인터페이스로 들어올수 있습니다. 높은 칼슘 배양 배지에서 정의된 성장 인자 및 아스코르브산을 가진 14일간의 자극 후, 이 모델은 완전히 분화된다. 조직학적 분석은 토착 인간의 피부의 형태를 모방한 완전히 계층화된 표피를 밝혀냈습니다. 모델및 장벽 기능, 단백질 수준 및 초기 단계 각질 분화(즉, 케라틴 10), 후기 분화(즉, 인볼루크린, 로리크린 및 필라그린) 및 조직 접착(즉, desmoglein)에 대한 특이적 특성화를 특징으로 하기 위해 면역제1을 평가하였다. 조직 장벽 무결성은 환피성 전기 저항을 측정하여 더욱 평가되었다. Re복합 인간 표피는 선동성 자극(즉, 리포폴다산차라이드 및 종양 괴사 인자 알파)에 반응하여 세포카인 방출(즉, 인터류킨 1 알파 및 인터류킨 8)을 증가시키는 것으로 나타났다. 이 프로토콜은 환경 효과와 광범위한 피부 관련 연구를 평가하는 도구로 재구성된 인간 표피를 육성하는 간단하고 재현 가능한 시험관 내 방법을 나타냅니다.
표피는 인체와 외부 환경 사이의 직접적인 인터페이스에서 피부의 가장 바깥쪽 층입니다. 주요 기능은 보호 및 수분1을제공하는 것입니다. 표피는 외부 에이전트에 대한 효과적인 물리적 장벽 역할을하고 몸에서 과도한 물 손실을 방지할 수 있습니다. 이러한 피부 기능은 주로 피부의 가장 바깥층의 세포 배열에 의존하며, 세포간 지질2의조성물 및 조직에 의존한다. 표피는 주로 조직의 바깥쪽으로 위로 이동하고 분화를 겪는 각질 세포로 구성됩니다. 분화의 그들의 단계를 특징으로 하는 4-5 표피 층이 있습니다. 내부에서 외부까지, 표피 층은 실행 가능한 표피, 즉, 층 배세 (SB), 지층 스모넘 (SS), 및 지층 과립 (SG), 비 실행 가능한 상부 층, 즉, 지층 각막 (SC)3에서시작한다. 기저층은 주로 각질이 풍부한 각질 세포로 구성되며, 이는 분화4시에SS를 통해 마이그레이션된다. 각질 세포 성숙 동안, 단백질 발현 및 구조의 다양한 변화가 발생합니다. 각질 세포는 탈모소말접합부 5의형성을 통해 부착한다. SG에서는 라멜라 바디의 생성이 시작됩니다. 그(것)들은 피부 장벽 기능 6의 대형에 중요한 지질 전구체 및 효소로 이루어져 있습니다6. SG는 또한 각질 세포의 세포질에 각질 화과립의 존재를 특징으로한다. SC와의 인터페이스에서, 라멜라 바디의 함량은 세포간 공간과 세라마이드, 콜레스테롤 및 자유 지방산과 같은 비극성 지질으로 압출되어 세포외 지질 매트릭스7을형성하기 위해 적층 된 라멜라 지질 양층으로 구성된다. SC에서 세포는 효소 저하 과정으로 인해 핵을 포함한 모든 세포 세포기관을 잃고 평평한 형태를 채택합니다. 그들은 교차 연결된 단백질 층으로 만든 옥수수 봉투에 둘러싸여 있으며, 코르네오사이클8,9라고합니다. Desmosomal 성분은 코르네오데스모좀을 형성하고 코네오사이클을 함께 묶기 위해 옥수수 봉투에 교차 연결됩니다. 결과 상피는 줄기 세포에서 지속적으로 갱신되며, 회전율은 약 5-6주10입니다. 완전히 계층화된 표피의 결과각질 세포의 분화 과정은피부(11)의장벽 기능 형성에 매우 중요합니다.
상처와 염증 동안, 각질 세포는 접착 분자및 표면 수용체의 변화를 유도하고 사이토카인, 케모킨 및 항균 펩타이드12의분비를 통해 염증 반응을 유발한다. 피부는 외인성 물질에 대한 물리적 장벽뿐만 아니라; 그것은 또한 병원 체에 노출 시 면역 센서 역할을. 또한, 탈수로부터 인체를 보호하기 위해 수분 함량과 같은 여러 물질의 확산을 조절합니다. 피부는 또한 비타민 D의 합성에 관여하고 다양한다른 대사 기능을 갖는다3,13,14.
외인 성 물질의 부작용을 평가하기 위해 독성 학자는 동물 실험에 수십 년 동안 의존해 왔지만 요즘은 바람직한 접근 방식이 아닙니다. 인간의 독성에 대한 제한된 예측 능력을 갖는 것 외에도 동물 모델은 수많은 윤리적 문제를 수반합니다. 화장품 산업에서 동물 실험 금지 및 연구에서 3R 원칙 (즉, 교체, 감소 및 정제)을 따르도록 권고하면 체외 접근법15에기초한 대체 시험 방법의 개발로 이어졌습니다. 첫 번째 체외 피부 세포 모델은 이미 90 년대에 설명되었으며, 간단한 인간 각질 세포 모노 배양에서 완전히 차별화 된 표피 및 풀 두께 모델에 이르기까지 인상적인 개발이16을 달성했습니다. 요즘, 피부 조직 공학은 제약 및 피부 막장 분야에서 모두 중요성을 얻고있다. 지난 2년 동안 여러 회사에서 피부 관련 연구를 위한 표준화되고 재현 가능한 도구를 나타내는 3차원(3D) 재구성된 인간 표피(RhE)를 상용화했습니다. 여러 상용 RhE 모델은 피부 자극17,18 (즉, 테스트 지침 43919)및 피부 부식20 (즉, 테스트 가이드 라인 43121)의시험을 위한 OECD 지침에 따라 화학 물질의 체외 피부 테스트를 허용합니다. 피부감작(22)에 대한 체외 시험(예: SENS-IS 분석)은 현재 승인 트랙에 있으며 피어리뷰(23)에있다. 또한 상용 RhE 모델을 활용하여 광독성(24)을 평가하고,약물제형(25,화장품 제형 및 활성성분(26)을시험하고, 피부 장벽기능(27)을 연구하고 환경 스트레스에 대한 생물학적 반응을 시험하기 위해 개발된 수많은 다른 연구가있다.
시판되는 3D 스킨 모델 외에도 여러 연구 그룹은 자체 RHEs32,33,34,35,36,37을 개발했다. 사내 RhEs는 연구의 목적에 따라 문화 조건을 제어하는 이점을 제공합니다. 구체적으로, 연구원은 3D 표피 모델의 재구성에 사용되는 각질 세포의 유형과 소스를 선택할 수 있습니다 (즉, 기본 대 불멸, 신생아 대 숙성, 단일 대 풀랜덤 기증자, 성별, 민족, 흡연과 같은 개별 생활 습관 등). 그(것)들은 배양 매체의 조성을 변화시키고 표적 단백질 또는 지질의 발현을 조절할 수 있는 성장 인자, 비타민, 또는 그밖 화합물을 통합할 가능성이 있습니다. 사내 RhEs를 통해 연구자들은 3D 모델의 분화 상태의 기능으로 생물학적 반응및 생체 역학적 특성을 조사할 수 있습니다. 이러한 직관적인 매개 변수 외에도 3D 피부 모델의 복잡성을 증가시키고 생리적으로 더 관련성을 높이기 위한 지속적인 노력이 있으며, 예를 들어 다른 표피 세포 유형(예: 멜라닌세포 및 면역 세포)을첨가하여 38,39,섬유아세포 가포성 콜라겐 매트릭스40,41,42,및 혈관망의구성요소를 포함하였습니다.
특정 요구에 따라 문화 조건을 조정할 수 있지만 RhE의 품질과 관련성을 보장하기 위해 존중해야 하는 매개 변수가 있습니다. RhE 조직을 육성하기 위해 정상적인 인간 표피 각질 세포(NHEKs)는 다공성 합성 멤브레인이 우물을 두 개의 구획, 즉 정약 및 바식탈 구획으로 분리하는 특정 투과성 배양 인서트로 시드됩니다. 멤브레인의 다공성(즉, 0.4 μm의 공공 크기)은 세포가 기저 삽입 측으로 이동하지 않고 압정 구획에서 세포 단층의 형성을 허용하고, 배꼽 구획에 포함된 배양 배지로부터 필수 영양소를 가진 각질 세포의 공급이 허용된다. 재구성 과정의 시작 부분에서 NHEK는 멤브레인에 접착을 허용하기 위해 며칠 동안 침수 된 조건에서 배양됩니다. 두 구획의 칼슘 수준은 세포의 증식을 늦추고 대신분화(46)를촉진하기 위해 NHEKs의 2D 배양에 사용되는 칼슘 농도에 비해 증가한다. 표피 칼슘 그라데이션은 장벽 형성 및 항상성을 조절하는 데필수적이다(47,48). 높은 칼슘 수준(즉, 최대 1.5mMM)은 세포간 접합의 형성을 촉진하고 말단분화(49)동안 옥수수화된 봉투의 형성을 조절한다. 각질세포가 지지막상에 연속적이고 단단히 부착된 단층층을 형성하면, 어포형 구획으로부터의 배지가 제거되고 배양 공정이 공기-액체 인터페이스(ALI)에서 계속되어 계층화를 촉진하고 표피장벽(50,51)을확립한다. 특정 문화 조건은 완전히 계층화 된 상피(36)를얻기 위해 매우 중요합니다. ALI에서 의 재구성 과정에서, 바소포탈 구획의 배지는 각질 세포 성장 인자(KGF), 인슐린, 칼슘 및 아스코르브산으로 보충됩니다. 아스코르브산은 적절한 SC 지질 장벽의 형성에 중요한 역할을 하며, 이는 토착 인간피부(52)와밀접한 관련이 있다. 아스코르브 산 보충 배지에서 자란 각질 세포는코로세포(52)의중식에서 조직된 세포간 지질 라멜라엘라뿐만 아니라 케라토히알린 과립의 향상된 수와 함께 차별화된 표현형을 입증한다. 이러한 보충제는 옥수수 봉투 함량을 증가시키고 친수성 항산화 저장소53,54의고갈을 피함으로써 표피 장벽 기능을 개선하는 데 필수적이다. 표피 증식 및 분화의 중요한 파라크리인 KGF는NHEKs(55)를자극하는 데 사용된다.
사내 RhEs의 주요 단점은 연구 기관 간의 표준화 손실과 노동 강도 및 시간 소비 증가(즉시 사용 되는 상용 모델에 비해 최대 3 주)를 포함합니다. 본 논문의 목적은 이러한 단점을 해결하고 생산의 기초를 더 큰 규모로 설정하는 것입니다. 상기 사내 RhEs의 장점 외에도, 현재 의정서는 조직 간의 내및 간 가변성을 줄이고, 오염 위험을 줄이고, 재배 과정을 간소화하는 것을 목표로 합니다.
현재 프로토콜은 신생아 NHEKs를 사용하여 RH를 육성하는 재현 가능하고 강력한 방법을 설명합니다. 더욱이, 표피 분화를 위해 특정한 단백질의 RhEs 형태, 장벽 무결성 및 발현의 특성화의 대표적인 결과를 나타낸다. RhEs 형태학적 구조는 헤마톡시린 및 에오신(H&E) 염색 및 투과 전자 현미경 검사(TEM)를 사용하여 검사하였다. 장벽 무결성을 평가하기 위해, 트리톤 X-100에 대한 경피 전기 저항(TEER) 및 노출 시간을 측정하여 조직 생존가능성(ET50)의 50%를감소시키는 것으로 측정하였다. 탈모실 접합(즉, desmoglein 1)의 형성은 각질 세포 부착을 평가하기 위해 면역 형광(IF)에 의해 분석되었다. 표피 구조 단백질(즉, 인볼루크린, 로리크린 및 필래그린)의 형성은 IF로 평가및 검출되었다. 이러한 단백질은 SC 코르네오사이클을 둘러싸고 고도로 연결된 단백질 봉투의 형성에 관여하며 그 결과 후기 표피분화(56,57)에대한 중요한 마커가 된다. 또한, IF는 각질(10)을 분석하기 위해 사용되었고, SS58에서 초기 단계 분화 세포에서 유도된 단백질은 모든 분화층 내부에서 발견되었다. 마지막으로, 염증 자극에 대한 RhE의 반응(즉, 리포폴다산화물 및 종양 괴사 인자 알파)을 조사하였다. 인터류신 1알파(IL-1α) 및 인터류인 8(IL-8)의 수준은 효소-연결된 면역흡제 분석(ELISA)을 이용하여 세포 배양 배지에서 측정하였다.
RhEs는 제약 및 피부막 화장품분야(36,75,76,77, 77)및78에서스크리닝 도구로 널리 사용된다. 여러 회사가 이러한 RH를 시판적으로 사용할 수 있도록 했지만, 비용이 많이 들고 새로운 연구 문제를 해결하는 데 필요한 재배 매개 변수를 변경할 가능성을 제한합니다. 이 논문은 사내 RhEs의 생산 절차를 강력하고 신뢰할 수 있는 방식으로 설명하고 동물 실험에 대한 대체 접근법으로서 모델의 관련성을 확인하기 위해 획득한 조직의 상세한 특성을 제공합니다.
프로토콜의 일부 단계는 적절한 각질 세포 분화 및 RhE 재현성을 보장하는 데 중요합니다. 이는 최적의 세포, 중간 형( 들) 및 재배 조건을 활용하여 수행될 수 있다. 제안된 RhE 모형에서, 신생아 NHEKs는 성숙한 NHEKs에 비교된 항원성 노출의 그들의 부족을 위해 선택되었습니다. 더욱이, 각질 세포는 종 간 가변성을 피하기 위하여 백인 민족으로 제한되었습니다. 기본 각질 세포는 일반적으로 차별화하고 계층화하는 능력에 사용됩니다.79. 상업적으로 또는 성인 피부로부터 사내 격리를 통해 얻을 수 있습니다.80. 폴리카보네이트 멤브레인에 세포주(즉, HaCaT)의 재배는 분화를 실패하고 장벽 형성에 필요한 지질을 합성하는 장애인 능력을 입증했습니다.81. 그러나 하이드로겔, 콜라겐, 피브린 및 스페로이드 배양과 같은 다양한 배양 행렬이 포함되면서 3D 피부 모델이 성공적으로 발달했습니다.78,82,83,84,85,86. 불멸의 세포주, N/TERT는 RhEs의 발달에 적합한 것으로 나타났습니다.35. 기본 각질 세포는 그들의 네 번째 또는 다섯 번째 통로에 증식 남아61따라서 현재 프로토콜에는 제 3 통로에서 각질 세포의 사용이 포함됩니다. De Vuyst 외. 세포 종자 밀도가 중요하고 충분해야 한다는 것을 입증했습니다 (즉, ≥ 2.5×105 셀/cm2)바소포탈 구획에서 배지가 어포형 구획으로 확산되지 않도록 한다. 불충분한 시드 밀도(예: < 2.5×105 셀/cm2)은 바소포탈에서 어포메이션 구획으로 배지의 확산으로 표시되는 적절한 장벽을 형성할 수 없게 되어 ALI 배양 조건 대신 침수될 수 있습니다.62. 세럼이 없는 각질 세포 성장 매체(참조) 재료 테이블)는 화학적으로 정의된 매체로 작업하는 이점을 제공하고 오염 위험을 감소시키기 때문에 재현성 목적으로 선호되었다. 이 매체는 칼슘 농도(즉, 60 μM)를 가지므로 각질 세포의 증식을 자극합니다.87. RhE 재배의 첫 번째 단계에서 칼슘 농도(즉, 1.5 mM)를 증가시키고 각질 세포 분화 및 피부 장벽 형성 및 항상성을 선호합니다.49. 또한, ALI 배지는 SC 지질의 형성과 차별화를 촉진하는 데 중요한 것으로 나타난 아스코르빅 산으로 보충됩니다.52,53,54. ALI 배지는 또한 KGF를 포함, 이는 각질 세포 간 막 수용체에 결합 할 수있는 섬유 아세포에 의해 분비 성장 인자이며 활성화시 분화 및 상처 수리에 이중 역할을55,88. 특정 시간 간격으로 ALI 배지를 새로 고치고 RhEs에 신선한 영양소를 지속적으로 공급하는 것이 중요합니다. 캐리어 플레이트 시스템의 사용은 더 큰 규모(즉, 24인서식/플레이트)에서 RhE 재배에 매우 중요합니다. 그것은 시간을 절약, 오염의 위험을 감소의 장점을 제공하고, 인간의 오류의 도입을위한 적은 공간을 떠난다. 또한 많은 양의 미디어(즉, 1.5mL)에서 RH를 배양하여 필요한 ALI 중간 리프레시 수를 줄일 수 있는 가능성을 제공합니다. 또한, 삽입의 전체 플레이트를 신선한 매체로 플레이트에 전달하여 개별적으로 인서트와의 접촉을 피하거나 플레이트 뚜껑을 발견할 수 있습니다.
주목해야 하는 RhE 모델에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 네이티브 인간의 피부에는 기저 층에서 각질 세포의 증식과 SC의 코르네오사이클 분리 (즉, 탈화) 사이의 평형이 있습니다.89. 그러나, 시험관 내에서, 담수는 일어나지 않습니다. 따라서, 코르네오사이클은 RhE에 부착된 채로 남아 있으며 생리학적으로 관련성이 떨어지는 두꺼운 SC를 형성한다. 따라서, RhEs의 제한된 재배 기간이있다. 더욱이, 이 RhE 모델은 단수 세포 유형, 즉 표피의 가장 풍부한 세포 유형인 각질 세포세포로 구성되어 있기 때문에 간단하고 간단하다. 그러나 멜라닌세포, 수지상 세포(즉, 랑게란스 세포), T 세포(예를 들어, CD8)와 같은 표피에 상주하는 다른 세포 유형이 있습니다.+ 셀), 및 메르켈 세포13. 피부 모델의 생리적 관련성을 향상시키기 위해 연구자들은 멜라닌세포를 추가하여 피부 모델을 더욱 복잡하게 만들었습니다.38 , 면역 세포39또는 환자 유래 세포90. 특히 다른 SC 지질 조성및 더 높은 장벽 투과성으로 인해 인간의 피부 모델의 장벽 특성이 토착 인간의 피부에 비해 다르다는 것을 명심해야 합니다. 91,92,93,94,95. 그러나, 몇몇 연구 결과는 저산소증의 밑에 재배에 의하여 인간 피부 모형의 장벽 속성에 있는 변경을 보고했습니다96 상대 습도 감소97, 키토산과 진피 매트릭스의 변조98배양 배지에서 자유지방산의 변화99. 더욱이, 간단하고 복잡한 RH에서, 배양 조건 및 중간 조성은 병리학적 특징을 모방하도록 변조될 수 있다. 사이토카인으로 모델에 도전함으로써 비정상적인 형태100 및 유전자 및 단백질 발현 수준에 있는 변경은 아토피성 피부염 및 건선과 같은 일반적인 피부 무질서에서 전형적으로 관찰되는 설치될 수 있습니다35,101,102,103,104,105. 3D 모델의 재구성 과정을 시작하기 전에 각질 세포에 특정 유전자를 침묵시키는 것은 피부 질환의 특징을 모방하고 새로운 치료 솔루션을 조사하는 데 사용되는 또 다른 접근 방식입니다.106,107. 표피 층을 모델링하는 것 외에도, 진피 구획은 RhE 재구성 전에 콜라겐 매트릭스에 섬유아아를 포함시킴으로써 모델(즉, 인간 피부 등가물 또는 풀 두께 모델)에 포함될 수 있어 생리학적으로 관련성이 높으며 노화 및 상처 치유 관련 연구에 적합합니다.108,109,110. 추가적으로, 종양 스페로이드는 흑색종 진행을 공부하기 위하여 인간 적인 피부 등가에 추가되었습니다111,112. 피부 모델 분야의 최신 발전은 바이오 프린팅과 스킨 온 어 칩입니다. 여러 연구 그룹은 최근 (과두구) 바이오 인쇄 피부 등가물의 개발에 성공했다45,113,114. 제안된 프로토콜은 24웰 형식과 캐리어 플레이트를 활용하여 개별적으로 처리되는 인서트를 방지합니다. 그러나, 연구 규모는 여전히 매우 제한 하 고 자동화 부족. 바이오 프린팅 또는 스킨 온-어칩의 사용을 구현함으로써 더 작은 피부 모델을 보다 자동화된 공정과 더 큰 규모로 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜에 설명된 RhE는 이미 개발된 것과 잘 특징인 상용 표피 모델과 여러 가지 유사점이 있습니다. 형태학적 분석은 제안된 RhE 모델에서 실행 가능한 층의 수가 토착 인간 피부(즉, 7-14에 비해 6-7)에 비해 낮지만, EpiDerm RhE 모델(즉, 8-12)의 것과 비교할 수 있음을 입증하였다. EpiDerm, EpiSkin 및 SkinEthic 모델과 마찬가지로, 상부 RhE 층은 조밀하게 포장된 코르네오사이클층(28)의바구니 직조 패턴을 나타낸다. 더욱이, TEM 분석은 제안된 RhE 모델(즉, 15-25)에서 SC 층의 수가 EpiDerm(즉, 16-25)70의것과 비교된다는 것을 밝혔다. 전반적으로 제안된 RhE 모델은 네이티브 인간 표피를 모방한 다른 상용화된 표피 모델과 유사한 구조를 보여줍니다. TEER에 의해 측정된 조직 무결성은 상용 RhE 모델(즉, 3000-5600 Ω.cm2)71,72,73 및 기타 사내 RhEs(즉, 약 5000 Ω.cm2)74,115와범위에 있다. 제안된 RhE 모델은 분화 및 조직 접착 마커의 존재 및 올바른 국소화에 의해 표시된 바와 같이 잘 분화되는 것을 보여준다. 더욱이, 제안된 RhE 모델은 선동적인 자극(즉, LPS 및 TNF-α)에 반응할 것을 보여줍니다.
결론을 내리기 위해, 현재 의정서는 학술 및 민간 기관 모두에서 연구원의 요구를 충족시키기 위해 신뢰할 수있는 방식으로 상대적으로 큰 규모로 RhEs를 생산하는 방법을 보여줍니다. 제안된 RhE 모델은 다른 기존 상용 모델에 유사한 형태, 표피 분화 및 생물학적 반응성을 갖는 것을 보여줍니다. 관련 피부 모델에 대한 접근이 필요할 때 제약 및 피부 막장 전모두에 대한 대체 도구를 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
보조금 협정 제1호와 함께 마리 스크와도우스카-퀴리 그랜트(Marie Skłodowska-Curie Grant)의 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램은 765602 이 사업에 자금을 지원했습니다. 모든 저자는 아돌프 머클 재단과 페라라 대학의 지원을 인식하고 감사 다우 실리콘 벨기에 인정. 미겔 스푸흐 칼바르 박사는 RhE 재배 과정의 그래픽 이미지를 준비한 것으로 인정됩니다. 저자들은 바바라 드래슬러 박사, 프랑코 세르벨라티 박사, 아그네스 테시에 박사의 기술 적 지원과 토론에 감사드립니다.
Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Antibiotic-antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15240062 | |
Aqueous Eosin Y solution | Sigma Aldrich | HT110280 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich or Merck | C8106 or 1.02378.0500 | Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 °C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. |
DAPI | Roche | 10236276001 | Prepare a stock at 100 μg/mL and store aliquots at -20 °C. Working conditon is 1 μg/mL. |
Entellan mounting medium | Merck | 1.07960.0500 | Mounting medium for H&E staining. |
EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | MEPI500CA | Contains 0.06 mM of Ca2+. |
Ethanol absolute | Any supplier | N/A | |
Formalin 10% | Leica Biosystems | 3800770 | |
Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | S0015 | To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 μg/mL hydrocortisone,5 μg/mL bovine transferrin, and 0.01 µg/mL human recombinant insulin-like growth factor-I. |
Isopropanol | Biosolve B.V. | 0016264102BS | |
Kaiser's glycerol gelatine, phenol-free | Merck | 1.08635.0100 | Mounting medium for IF staining. |
Keratinocyte growth factor (KGF) | R&D Systems | 251-KG-050 | Reconstitute KGF protein at 100 μg/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20°C. |
Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit | Roche | 4744926001 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20°C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark. |
Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5 | Sigma-Aldrich | L4524 | Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 °C. Working concentration is 100 μg/mL. |
Mayer’s Haematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS80 | |
Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) | Lonza | 00192906 | Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors. |
Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010056 or 10010-015 | Reference numbers can vary between countries. |
Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | ImmunoTools | 11344483 | Prepare a stock of 100 μg/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL |
Sterile ultrapure water | Any supplier | N/A | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93426 | |
Trypan blue (0.4% [v/v]) | Any supplier | N/A | |
Trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | R007100 | |
Trypsin/EDTA (0.05% [v/v]) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 25300054 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | Ab150113 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | Merck | 1.06448.0500 | For antigen retrieval buffer for IF staining. |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Dylight 488) | Agrisera | AS09 633 | |
Filaggrin Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-53243 | |
Involucrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-33742 | |
Keratin 10 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-32962 | |
Desmoglein-1 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | MAB944 | |
Loricrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP1-33610 |