Denne protokollen beskriver en enkel metode for å dyrke tredimensjonale rekonstituerte menneskelige epidermis på en reproduserbar og robust måte. I tillegg karakteriserer den strukturfunksjonsforholdet til den epidermale barrieremodellen. De biologiske responsene til den rekonstituerte menneskelige epidermis ved proinflammatoriske stimuli presenteres også.
En tredimensjonal human epidermis modell rekonstruert fra neonatal primære keratinocytter presenteres. Heri er en protokoll for dyrkingsprosessen og karakteriseringen av modellen beskrevet. Neonatal primære keratinocytter dyrkes nedsenket på gjennomtrengelige polykarbonatinnlegg og løftes til luftvæskegrensesnittet tre dager etter sådd. Etter fjorten dager med stimulering med definerte vekstfaktorer og askorbinsyre i høyt kalsiumkulturmedium, er modellen fullt differensiert. Histologisk analyse avslørte en helt stratifisert epidermis, som etterligner morfologien til innfødt menneskelig hud. For å karakterisere modellen og dens barrierefunksjoner, proteinnivåer og lokalisering spesifikke for tidlig keratinocyttdifferensiering (dvs. keratin 10), senfasedifferensiering (dvs. involucrin, loricrin og filaggrin) og vevsadhesjon (dvs. desmoglein 1), ble vurdert av immunofluorescence. Vevsbarrierens integritet ble videre evaluert ved å måle transepithelial elektrisk motstand. Rekonstruert menneskelig epidermis var responsiv til proinflammatoriske stimuli (dvs. lipopolysakkarid og tumornekrose faktor alfa), noe som førte til økt cytokinfrigjøring (dvs. interleukin 1 alfa og interleukin 8). Denne protokollen representerer en enkel og reproduserbar in vitro-metode for å dyrke rekonstruert menneskelig epidermis som et verktøy for å vurdere miljøeffekter og et bredt spekter av hudrelaterte studier.
Epidermis er det ytterste laget av huden, i direkte grensesnitt mellom menneskekroppen og det ytre miljø. Hovedfunksjonene er å gi beskyttelse og hydrering1. Epidermis fungerer som en effektiv fysisk barriere mot eksterne midler og forhindrer overdreven vanntap fra kroppen. Disse hudfunksjonene avhenger hovedsakelig av det cellulære arrangementet i de ytterste lagene av huden, sammensetningen og organiseringen av intercellulære lipider2. Epidermis består hovedsakelig av keratinocytter som migrerer oppover til ytre siden av vevet og gjennomgår differensiering. Det er 4-5 epidermale lag som er preget av deres differensieringsstadium. Fra innsiden til utsiden starter de epidermale lagene fra levedyktig epidermis, det vil si stratum basale (SB), stratum spinosum (SS) og stratum granulosum (SG), til det ikke-levedyktige øverste laget, det vil si stratum corneum (SC)3. Basallaget består hovedsakelig av prolifererende keratinberikede keratinocytter, som migrerer gjennom SS ved differensiering4. Under keratinocyttmodning oppstår ulike endringer i proteinuttrykk og struktur. Keratinocytter holder seg gjennom dannelsen av desmosomale veikryss5. I SG initieres genereringen av lamelllegemer. De består av lipidforløpere og enzymer som er avgjørende for dannelsen av hudbarrierefunksjonen6. SG er også preget av tilstedeværelsen av keratohyalingranuler i cytoplasma av keratinocyttene. Ved grensesnittet med SC ekstruderes innholdet i lamellarlegemene inn i de intercellulære områdene og de ikke-polare lipidene som ceramides, kolesterol og frie fettsyrer organiseres i stablede lamellar lipidbilayers for å danne den ekstracellulære lipidmatrisen7. I SC mister celler alle cellulære organeller, inkludert kjernen, på grunn av enzymatisk nedbrytningsprosesser og vedtar en flatt morfologi. De er omgitt av en cornified konvolutt laget av krysskoblede proteinlag, og kalles corneocytes8,9. Desmosomale komponenter er kryssbundet til den cornified konvolutten for å danne corneodesmosomes og binde corneocytes sammen. Det resulterende epitelet fornyes kontinuerlig fra stamceller, med en omsetningstid på ca. 5-6 uker10. Differensieringsprosessen til keratinocyttene, som resulterer i en fullt stratifisert epidermis, er avgjørende for dannelsen av barrierefunksjonen til huden11.
Under sår og betennelse induserer keratinocytter endringer i adhesjonsmolekyler og overflatereseptorer og utløser proinflammatoriske responser via sekresjon av cytokiner, kjemokiner og antimikrobielle peptider12. Huden er ikke bare en fysisk barriere mot eksogene stoffer; Det fungerer også som en immunsensor ved eksponering for patogener. I tillegg regulerer det diffusjonen av flere stoffer på tvers av lagene, for eksempel vanninnhold for å beskytte menneskekroppen mot dehydrering. Huden er også involvert i syntesen av vitamin D og har forskjellige andre metabolske funksjoner3,13,14.
For å vurdere bivirkningene av eksogene stoffer har toksikologer i flere tiår stolt på dyreforsøk, men i dag er det ikke den foretrukne tilnærmingen. Foruten å ha begrenset prediktiv kapasitet for menneskelig toksisitet, involverer dyremodeller mange etiske problemer. Forbudet mot dyreforsøk i kosmetikkindustrien og anbefalingen om å følge 3R-prinsippet (dvs. erstatning, reduksjon og raffinement) i forskning har ført til utvikling av alternative testmetoder basert på in vitro tilnærminger15. De første in vitro hudcellemodellene er allerede beskrevet på 90-tallet, og en imponerende utvikling fra enkle menneskelige keratinocyttmonokulturer til fullt differensierte epidermis- og fulltykkelsesmodeller er oppnådd16. I dag har hudvevsteknikk fått betydning i både farmasøytiske og dermato-kosmetiske felt. I løpet av de siste to tiårene har flere selskaper kommersialisert tredimensjonale (3D) rekonstruerte humane epidermis (RhE) som representerer standardiserte og reproduserbare verktøy for hudrelaterte studier. Flere kommersielle RhE-modeller aksepteres for in vitro hudtesting av kjemikalier i henhold til OECDs retningslinjer for testing av hudirritasjon17,18 (dvs. testretningslinje 43919) og hudkorrosjon20 (dvs. testretningslinje 43121). In vitro-testen for hudsensibilisering22 (dvs. SENS-IS-analyse) er for tiden i godkjenningssporet og under fagfellevurdering23. Det er også mange andre analyser utviklet som bruker kommersielle RhE-modeller, for å evaluere fototoksisitet24, for å teste legemiddelformuleringer25, kosmetiske formuleringer og aktive ingredienser26, for å studere hudbarrierefunksjonen27 og for å teste den biologiske responsen på miljøstressorer28,29,30,31.
I tillegg til kommersielt tilgjengelige 3D-hudmodeller har flere forskningsgrupper utviklet sine egne RhEs32,33,34,35,36,37. Interne RH-er gir fordelen for å kontrollere kulturforholdene i henhold til formålet med studien. Spesielt kan forskere velge typen og kilden til keratinocyttene som skal brukes til rekonstituering av deres 3D-epidermale modell (dvs. primær vs. udødeliggjort, neonatal vs. alderen, enkelt vs. samlet tilfeldige givere, kjønn, etnisitet, individuelle levevaner som røyking, etc.). De har muligheten til å variere sammensetningen av kulturmediet og innlemme vekstfaktorer, vitaminer eller andre forbindelser som kan modulere uttrykket av målproteiner eller lipider. Med interne RhEs kan forskere også undersøke biologiske responser og biomekaniske egenskaper som en funksjon av differensieringstilstanden til 3D-modellen. I tillegg til de intuitive parametrene, er det kontinuerlig innsats for å øke kompleksiteten til 3D-hudmodeller og gjøre dem mer fysiologisk relevante, for eksempel ved å legge til andre epidermale celletyper (f.eks. melanocytter og immunceller)38,39, ved å dyrke keratinocyttene oppå en fibroblastfylt kollagenmatrise40,41,42og ved å inkludere komponenter i det vaskulære nettverket43,44,45.
Selv om det er mulig å justere kulturforholdene etter spesifikke behov, er det parametere som må respekteres for å garantere både kvaliteten og relevansen til en RhE. For å dyrke RhE-vev, blir normale humane epidermale keratinocytter (NHEKs) sådd inn i spesifikke gjennomtrengelige kulturinnlegg hvis porøse syntetiske membran skiller brønnene i to rom, det vil si det apikale og basolaterale rommet. Porøsiteten til membranen (dvs. en porestørrelse på 0,4 μm) er slik at den tillater dannelsen av et cellemonolayer i det apikale rommet uten migrasjon av celler til basal innsatssiden, og fôring av keratinocytter med essensielle næringsstoffer fra kulturmediet som finnes i basolateralrommet. I begynnelsen av rekonstitueringsprosessen dyrkes NHEK-er under nedsenkede forhold i noen dager for å tillate vedheft på membranen. Kalsiumnivået i begge rom økes sammenlignet med kalsiumkonsentrasjonen som brukes til 2D-kulturen til NHEK-er for å bremse spredningen av celler og fremme i stedet differensiering46. En epidermal kalsiumgradient er viktig for å regulere barriereformasjonen og homeostase47,48. Høye kalsiumnivåer (dvs. opptil 1,5 mM) fremmer dannelsen av intercellulære veikryss og modulerer dannelsen av den cornified konvolutten under terminal differensiering49. Når keratinocytter danner en kontinuerlig og tett tilhenger monolayer på støttemembranen, fjernes mediet fra det apikale rommet og kulturprosessen fortsetter ved luftvæskegrensesnittet (ALI) for å stimulere stratifisering og etablere en epidermal barriere50,51. Spesifikke kulturforhold er avgjørende for å oppnå et fullt stratifisert epitel36. Under rekonstitueringsprosessen ved ALI suppleres mediet i basolateralrommet med keratinocyttvekstfaktor (KGF), insulin, kalsium og askorbinsyre. Askorbinsyre spiller en viktig rolle i dannelsen av en passende SC lipidbarriere, som ligner på den innfødte menneskelige huden52. Keratinocytter dyrket i askorbinsyre-supplert medium demonstrerer en differenotype, med et forbedret antall keratohyalingranulater, samt organisert intercellulær lipidlamell i interstices av corneocytes52. Slike tilskudd er avgjørende for å forbedre epidermal barrierefunksjon ved å øke cornified konvoluttinnhold og unngå uttømming av hydrofile antioksidantlagre53,54. KGF, en viktig paracrine mediator av epidermal spredning og differensiering, brukes til å stimulere NHEKs55.
De viktigste ulempene med interne RH-er inkluderer tap av standardisering mellom forskningsinstitusjoner og økt arbeidsintensitet og tidsforbruk (opptil 3 uker sammenlignet med de bruksklare kommersielle modellene). Målet med dagens papir er å adressere disse ulempene, og sette grunnlaget for produksjonen i større skala. I tillegg til de ovennevnte fordelene med interne RH-er, tar den nåværende protokollen sikte på å redusere intra- og intervariabiliteten blant vev, for å redusere forurensningsrisiko og for å effektivisere dyrkingsprosessen.
Den nåværende protokollen beskriver en reproduserbar og robust metode for å dyrke RhEs ved hjelp av neonatal NHEKs. Videre viser det representative resultater av karakteriseringen av RhEs morfologi, barriereintegritet og uttrykk for proteiner som er spesifikke for epidermal differensiering. RhEs morfologiske struktur ble undersøkt ved hjelp av hematoksylin og eosin (H&E) farging og overføringselektronmikroskopi (TEM). For å evaluere barriereintegriteten ble den transepidermale elektriske motstanden (TEER) og eksponeringstiden til Triton X-100 for å redusere 50% av vevs levedyktigheten (ET50) målt. Dannelsen av desmosomale veikryss (dvs. desmoglein 1) ble analysert av immunfluorescens (IF) for å evaluere keratinocyttadhesjon. Dannelsen av epidermale strukturelle proteiner (dvs. involucrin, loricrin og filaggrin) ble evaluert og påvist med IF. Disse proteinene er involvert i dannelsen av den svært krysskoblede proteinkonvolutten som omgir SC corneocytter og som et resultat er viktige markører for senfase epidermal differensiering56,57. I tillegg ble IF brukt til å analysere keratin 10, et protein indusert i tidlige differensierte celler i SS58 og funnet inne i alle differensierte lag. Til slutt ble RhEs respons på proinflammatoriske stimuli (dvs. lipopolysakkarid og tumornekrosefaktor alfa) undersøkt. Nivåene av interleukin 1 alfa (IL-1α) og interleukin 8 (IL-8) ble målt i cellekulturmediet ved hjelp av enzymbundne immunosorbente analyser (ELISA).
RhEs er mye brukt som screening verktøy i farmasøytiske og dermato-kosmetiske felt36,75,76,77,78. Selv om flere selskaper har gjort slike RH-er kommersielt tilgjengelige, forblir de kostbare og begrenser muligheten til å variere dyrkingsparametere etter behov for å ta opp nye forskningsspørsmål. Dette dokumentet beskriver produksjonsprosedyren til interne RH-er på en robust og pålitelig måte og gir en detaljert karakterisering av det oppnådde vevet for å bekrefte relevansen av modellen som en alternativ tilnærming til dyreforsøk.
Noen av trinnene i protokollen er avgjørende for å sikre riktig keratinocyttdifferensiering og RhE-reproduserbarhet. Dette kan utføres ved å bruke optimale celler, middels type(er) og dyrkingsforhold. I den foreslåtte RhE-modellen ble neonatal NHEKs valgt ut for mangel på antigen eksponering, sammenlignet med voksne NHEK-er. Videre var keratinocytter begrenset til kaukasisk etnisitet for å unngå variasjon mellom arter. Primære keratinocytter brukes vanligvis for deres evne til å differensiere og stratifisere79. De kan fås kommersielt eller ved intern isolasjon fra voksen hud80. Dyrking av en cellelinje (dvs. HaCaT) på en polykarbonatmembran, har vist seg å mislykkes differensiering og vist svekket kapasitet til å syntetisere lipider som er nødvendige for barrieredannelse.81. Imidlertid resulterte inkluderingen av forskjellige kulturmatriser, som hydrogeler, kollagen, fibrin og sfæroider kulturer, i vellykket utvikling av 3D-hudmodeller.78,82,83,84,85,86. De udødelige cellelinjene, N/TERT, har vist seg å være egnet for utvikling av RhEs35. Primære keratinocytter forblir proliferative på deres fjerde eller femte passasje61, derfor inkluderer den nåværende protokollen bruk av keratinocytter i sin tredje passasje. De Vuyst et al. har vist at cellefrøtettheten er av betydning og må være tilstrekkelig (dvs. ≥ 2,5×105 celler/cm2) for å sikre at mediet fra basolateralrommet ikke sprer seg til det apikale rommet. Utilstrekkelig såddtetthet (dvs. < 2.5×105 celler/cm2) kan resultere i manglende evne til å danne en riktig barriere, som indikeres av diffusjon av medium fra basolateral til det apikale rommet, noe som resulterer i nedsenket i stedet for ALI kulturforhold62. Serumfritt keratinocyttvekstmedium (se Tabell over materialer) ble foretrukket for reproduserbarhetsformål, siden det gir fordelen av å jobbe med et kjemisk definert medium og reduserer risikoen for forurensning. Dette mediet har en lavere kalsiumkonsentrasjon (dvs. 60 μM) og stimulerer derfor spredningen av keratinocytter87. Øke kalsiumkonsentrasjonen (dvs. 1,5 mM) fra det første trinnet i RhE-dyrkingen, favoriserer keratinocyttdifferensiering og hudbarrieredannelse og homeostase49. I tillegg er ALI-mediet supplert med askorbinsyre, som har vist seg å være avgjørende for dannelsen av SC-lipider og for å fremme differensiering.52,53,54. ALI-mediet inneholder også KGF, som er en vekstfaktor utskilt av fibroblaster som kan binde seg til keratinocytttransmembrane reseptorer og ved aktivering har en dobbel rolle i differensiering og sårreparasjon55,88. Det er viktig å oppdatere ALI-mediet ved bestemte tidsintervaller, for å gi en konstant tilførsel av friske næringsstoffer til RH-ene. Bruk av bæreplatesystem er avgjørende for RhE dyrking i større skala (dvs. 24 innsatser/plate). Det gir fordelen av å spare tid, redusere risikoen for forurensning, og gir mindre rom for innføring av menneskelige feil. Det gir også muligheten til å dyrke RhEs i et høyt volum av medier (dvs. 1,5 ml), noe som reduserer det nødvendige antallet ALI-middels oppdateringer. I tillegg gir det muligheten til å overføre en full plate med innsatser til en plate med friskt medium, unngå kontakt med innsatsene individuelt eller avdekke platelokket.
Det er flere begrensninger i RhE-modellen som bør noteres. I innfødt menneskelig hud er det en likevekt mellom spredning av keratinocytter i basallaget og løsrivelse av corneocytter i SC (dvs. desquamation)89. In vitro, desquamation finner imidlertid ikke sted. Derfor forblir hornhinnen festet til RhE og danner en tykk SC som er mindre fysiologisk relevant. Derfor er det en begrenset dyrkingstid av RhEs. Videre er denne RhE-modellen enkel og grei, siden den består av en entall celletype, det vil si keratinocytten, som er den mest tallrike celletypen av epidermis. Imidlertid er det andre celletyper bosatt i epidermis, for eksempel melanocytter, dendrittiske celler (dvs. Langerhans-celler), T-celler (f.eks.+ celler) og Merkel-celler13. For å forbedre hudmodellens fysiologiske relevans har forskere gjort hudmodeller mer komplekse ved å legge til melanocytter.38 , immunceller39eller pasientavledede celler90. Man bør huske på at barriereegenskapene til menneskelige hudmodeller er forskjellige sammenlignet med innfødt menneskelig hud, på grunn av spesielt en annen SC lipidsammensetning og en høyere barrieregjennomtrengelighet. 91,92,93,94,95. Imidlertid har flere studier rapportert endringer i barriereegenskaper til menneskelige hudmodeller ved dyrking under hypoksi.96 eller redusert relativ fuktighet97, modulering av dermal matrise med chitosan98, og endring i frie fettsyrer i kulturmediet99. Videre, i både enkle og mer komplekse RhEs, kan kulturforholdene og middels sammensetning moduleres for å etterligne patologiske egenskaper. Ved å utfordre modellen med cytokiner, en unormal morfologi100 og endringer i gen- og proteinuttrykksnivåer kan fastslås som vanligvis observeres ved vanlige hudsykdommer, som atopisk dermatitt og psoriasis35,101,102,103,104,105. Silencing spesifikke gener i keratinocytter før du starter rekonstitueringsprosessen av 3D-modellen er en annen tilnærming som brukes til å etterligne egenskaper av hudsykdommer og undersøke nye terapeutiske løsninger106,107. I tillegg til å modellere et epidermalt lag, kan et dermalt rom inkluderes i modellen (dvs. navngitte menneskelige hudekvivalenter eller modeller med full tykkelse) ved å legge inn fibroblaster i en kollagenmatrise før RhE-rekonstituering, noe som gjør den mer fysiologisk relevant og egnet for aldring og sårhelingsrelaterte studier.108,109,110. I tillegg har tumorsfæroider blitt tilsatt til tilsvarende menneskers hud for å studere melanomprogresjon111,112. De siste fremskrittene innen hudmodeller er biotrykk og hud-på-en-chip. Flere forskningsgrupper har nylig lyktes i utviklingen av (parfymerbare) biotrykte hudekvivalenter45,113,114. Den foreslåtte protokollen drar nytte av et 24-brønns format og en bæreplate, og unngår innsatser som skal håndteres individuelt. Studieskalaen er imidlertid fortsatt ganske begrenset og mangler automatisering. Ved å implementere bruk av biotrykk eller hud-på-en-chip, kan mindre hudmodeller brukes med mer automatiserte prosesser og i større skala.
RhE beskrevet i denne protokollen har flere likheter med de allerede utviklede og godt karakteriserte kommersielle epidermale modellene. Den morfologiske analysen har vist at selv om antall levedyktige lag i den foreslåtte RhE-modellen er lavere sammenlignet med for innfødt menneskelig hud (dvs. 6-7 sammenlignet med 7-14), er det sammenlignbart med EpiDerm RhE-modellen (dvs. 8-12)70. På samme måte som EpiDerm-, EpiSkin- og SkinEthic-modellene, viser det øvre RhE-laget et kurvvevd mønster av tettpakkede corneocyte lag28. Videre viste TEM-analyse at antall SC-lag i den foreslåtte RhE-modellen (dvs. 15-25) kan sammenlignes med EpiDerm (dvs. 16-25)70. Samlet sett viser den foreslåtte RhE-modellen en lignende struktur som for andre kommersialiserte epidermale modeller, som etterligner den innfødte menneskelige epidermis. Vevsintegriteten målt ved TEER er i området med kommersielle RhE-modeller (dvs. mellom 3000-5600 Ω,cm2)71,72,73 og andre interne RhEs (dvs. ca. 5000 Ω,cm2)74,115. Den foreslåtte RhE-modellen viser seg å være godt differensiert, som indikert ved tilstedeværelse og riktig lokalisering av differensierings- og vevsadhesjonsmarkører. Videre viser den foreslåtte RhE-modellen å være lydhør overfor proinflammatoriske stimuli (dvs. LPS og TNF-α).
For å konkludere viser dagens protokoll hvordan man produserer RH-er på en pålitelig måte og i relativt stor skala for å møte forskernes behov i både akademiske og private institusjoner. Den foreslåtte RhE-modellen viser at den har lignende morfologi, epidermal differensiering og biologisk respons på andre eksisterende kommersielle modeller. Det gir et alternativt verktøy for både farmasøytisk og dermato-kosmetisk felt når tilgang til en relevant hudmodell er nødvendig.
The authors have nothing to disclose.
EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie Grant med tilskuddsavtalen 765602 nr. Alle forfattere anerkjenner støtten fra Adolphe Merkle Foundation og University of Ferrara og anerkjenner takknemlig Dow Silicones Belgia. Dr. Miguel Spuch-Calvar er anerkjent for å forberede de grafiske bildene av RhE dyrkingsprosessen. Forfatterne takker Dr. Barbara Drasler, Dr. Franco Cervellati og Dr. Agnès Tessier for deres tekniske støtte og diskusjoner.
Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Antibiotic-antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15240062 | |
Aqueous Eosin Y solution | Sigma Aldrich | HT110280 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich or Merck | C8106 or 1.02378.0500 | Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 °C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. |
DAPI | Roche | 10236276001 | Prepare a stock at 100 μg/mL and store aliquots at -20 °C. Working conditon is 1 μg/mL. |
Entellan mounting medium | Merck | 1.07960.0500 | Mounting medium for H&E staining. |
EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | MEPI500CA | Contains 0.06 mM of Ca2+. |
Ethanol absolute | Any supplier | N/A | |
Formalin 10% | Leica Biosystems | 3800770 | |
Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | S0015 | To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 μg/mL hydrocortisone,5 μg/mL bovine transferrin, and 0.01 µg/mL human recombinant insulin-like growth factor-I. |
Isopropanol | Biosolve B.V. | 0016264102BS | |
Kaiser's glycerol gelatine, phenol-free | Merck | 1.08635.0100 | Mounting medium for IF staining. |
Keratinocyte growth factor (KGF) | R&D Systems | 251-KG-050 | Reconstitute KGF protein at 100 μg/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20°C. |
Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit | Roche | 4744926001 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20°C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark. |
Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5 | Sigma-Aldrich | L4524 | Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 °C. Working concentration is 100 μg/mL. |
Mayer’s Haematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS80 | |
Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) | Lonza | 00192906 | Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors. |
Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010056 or 10010-015 | Reference numbers can vary between countries. |
Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | ImmunoTools | 11344483 | Prepare a stock of 100 μg/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL |
Sterile ultrapure water | Any supplier | N/A | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93426 | |
Trypan blue (0.4% [v/v]) | Any supplier | N/A | |
Trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | R007100 | |
Trypsin/EDTA (0.05% [v/v]) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 25300054 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | Ab150113 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | Merck | 1.06448.0500 | For antigen retrieval buffer for IF staining. |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Dylight 488) | Agrisera | AS09 633 | |
Filaggrin Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-53243 | |
Involucrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-33742 | |
Keratin 10 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-32962 | |
Desmoglein-1 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | MAB944 | |
Loricrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP1-33610 |