Este protocolo descreve um método simples para cultivar epiderme humana reconstituída tridimensional de forma reprodutível e robusta. Além disso, caracteriza a relação estrutura-função do modelo de barreira epidérmica. Também são apresentadas as respostas biológicas da epiderme humana reconstituída sobre estímulos proinflamatórios.
Um modelo de epiderme humana tridimensional reconstruído a partir de queratinócitos primários neonatais é apresentado. Aqui, é descrito um protocolo para o processo de cultivo e a caracterização do modelo. Os queratinócitos primários neonatais são cultivados submersos em pastilhas de policarbonato permeáveis e elevados à interface ar-líquido três dias após a semeadura. Após quatorze dias de estimulação com fatores de crescimento definidos e ácido ascórbico em meio de cultura de cálcio elevado, o modelo é totalmente diferenciado. A análise histológica revelou uma epiderme completamente estratificada, imitando a morfologia da pele humana nativa. Para caracterizar o modelo e suas funções de barreira, foram avaliados os níveis de proteína e localização específicas para diferenciação de queratinócitos em estágio inicial (ou seja, queratina 10), diferenciação em estágio tardio (ou seja, involucrina, loricrina e filaggrina) e adesão tecidual (ou seja, desmoglein 1), por imunorreorescência. A integridade da barreira tecidual foi avaliada pela medição da resistência elétrica transepitelial. A epiderme humanaeconstruída r responsivo aos estímulos proinflamatórios (ou seja, lipopolisacarídeo e fator de necrose tumoral alfa), levando ao aumento da liberação de citocina (ou seja, interleucina 1 alfa e interleucina 8). Este protocolo representa um método in vitro simples e reprodutível para cultivar a epiderme humana reconstruída como uma ferramenta para avaliar os efeitos ambientais e uma ampla gama de estudos relacionados à pele.
A epiderme é a camada mais externa da pele, na interface direta entre o corpo humano e o ambiente externo. Suas principais funções são fornecer proteção e hidratação1. A epiderme atua como uma barreira física eficaz contra agentes externos e evita a perda excessiva de água do corpo. Essas funções de pele dependem principalmente do arranjo celular nas camadas mais externas da pele, da composição e organização dos lipídios intercelulares2. A epiderme é composta principalmente de queratinócitos que migram para cima para o lado externo do tecido e sofrem diferenciação. Existem 4-5 camadas epidérmicas que são caracterizadas pelo seu estágio de diferenciação. De dentro para fora, as camadas epidérmicas partem da epiderme viável, ou seja, do estrato basale (SB), do spinosum estrato (SS) e do estrato granuloso (SG), até a camada superior não viável, ou seja, o estrato corneum (SC)3. A camada basal é composta principalmente de queratinócitos enriquecidos com queratina, que migram através da SS após a diferenciação4. Durante a maturação do queratinócito, ocorrem várias mudanças na expressão e estrutura proteica. Os queratinócitos aderem através da formação de junções desmosômicas5. No SG, a geração de corpos lamelares é iniciada. Consistem em precursores lipídes e enzimas que são cruciais para a formação da função de barreira cutânea6. O SG também é caracterizado pela presença de grânulos de queatohyalina no citoplasma dos queratinócitos. Na interface com o SC, o conteúdo dos corpos lamelares é extrudado nos espaços intercelulares e os lipídios não polares, como ceramidas, colesterol e ácidos graxos livres se organizam em bicamadas lipídicas lamelares empilhadas para formar a matriz lipídica extracelular7. Na SC, as células perdem todas as organelas celulares, incluindo o núcleo, devido a processos de degradação enzimática e adotam uma morfologia achatada. Eles são cercados por um envelope cornificado feito de camadas proteicas cruzadas, e são chamados de corneócitos8,9. Os componentes desmosómicos estão ligados ao envelope cornificado para formar corneodesmosomosomos e unir os corneócitos. O epitélio resultante é continuamente renovado a partir de células-tronco, com um tempo de rotatividade de aproximadamente 5-6 semanas10. O processo de diferenciação dos queratinócitos, que resulta em epiderme totalmente estratificada, é crucial para a formação da função barreira da pele11.
Durante a ferida e inflamação, os queratinócitos induzem alterações em moléculas de adesão e receptores de superfície e desencadeiam respostas proinflamatórias por meio da secreção de citocinas, quimiocinas e peptídeos antimicrobianos12. A pele não é apenas uma barreira física contra substâncias exógenas; também age como um sensor imunológico após a exposição a patógenos. Além disso, regula a difusão de várias substâncias em suas camadas, como o teor de água para proteger o corpo humano da desidratação. A pele também está envolvida na síntese da vitamina D e possui várias outras funções metabólicas3,13,14.
Para avaliar os efeitos adversos das substâncias exógenas, os toxicologistas se baseiam há décadas em testes em animais, mas hoje em dia não é a abordagem preferida. Além de ter capacidade preditiva limitada para a toxicidade humana, os modelos animais envolvem inúmeras questões éticas. A proibição de testes em animais na indústria cosmética e a recomendação de seguir o princípio 3R (ou seja, Substituição, Redução e Refinamento) em pesquisa levaram ao desenvolvimento de métodos alternativos de teste baseados em abordagens in vitro15. Os primeiros modelos de células da pele in vitro já foram descritos na década de 90, e um desenvolvimento impressionante de simples monoculturas de queratinócitos humanos a modelos de epiderme totalmente diferenciados e de espessura total foi alcançado16. Atualmente, a engenharia de tecidos de pele ganhou importância tanto nos campos farmacêutico quanto dermato-cosméticos. Nas últimas duas décadas, várias empresas comercializaram epiderme humana reconstruída tridimensional (3D) que representam ferramentas padronizadas e reprodutíveis para estudos relacionados à pele. Vários modelos comerciais de RhE são aceitos para testes in vitro de pele de produtos químicos de acordo com as diretrizes da OCDE para o teste de irritação da pele17,18 (ou seja, diretriz de teste 43919) e corrosão da pele20 (ou seja, diretriz de teste 43121). O teste in vitro para sensibilização da pele22 (ou seja, ensaio SENS-IS) está atualmente na faixa de aprovação e sob revisão por pares23. Há também inúmeros outros ensaios desenvolvidos que utilizam modelos comerciais de RhE, para avaliar a fototoxicidade24, testar formulações de medicamentos25,formulações cosméticas e ingredientes ativos26,estudar a função da barreira cutânea27 e testar a resposta biológica aos estressores ambientais28,29,30,31.
Além dos modelos de pele 3D disponíveis comercialmente, vários grupos de pesquisa desenvolveram seus próprios RhEs32,33,34,35,36,37. Os RhEs internos oferecem a vantagem de controlar as condições culturais de acordo com o propósito do estudo. Especificamente, os pesquisadores podem selecionar o tipo e a fonte dos queratinócitos a serem usados para a reconstituição de seu modelo epidérmico 3D (ou seja, primário vs. imortalizado, neonatal versus idoso, doadores aleatórios solteiros vs. agrupados, sexo, etnia, hábitos de vida individuais como fumar, etc.). Eles têm a possibilidade de variar a composição do meio cultural e incorporar fatores de crescimento, vitaminas ou outros compostos que possam modular a expressão de proteínas-alvo ou lipídios. Com rhes internos, os pesquisadores também podem investigar respostas biológicas e propriedades biomecânicas em função do estado de diferenciação do modelo 3D. Além desses parâmetros intuitivos, há esforços contínuos para aumentar a complexidade dos modelos de pele 3D e torná-los mais fisiologicamente relevantes, por exemplo, adicionando outros tipos de células epidérmicas (por exemplo, melanócitos e células imunes)38,39, culminando os queratinócitos em cima de uma matriz de colágeno povoada por fibroblastos40,41,42, e incluindo componentes da rede vascular43,44,45.
Embora seja possível ajustar as condições de cultura de acordo com necessidades específicas, existem parâmetros que devem ser respeitados para garantir tanto a qualidade quanto a relevância de um RhE. Para cultivar tecidos RhE, os queratinócitos epidérmicos normais (NHEKs) são semeados em inserções específicas de cultura permeável cuja membrana sintética porosa separa os poços em dois compartimentos, ou seja, o compartimento apical e basolateral. A porosidade da membrana (ou seja, um tamanho de poroso de 0,4 μm) é tal que permite a formação de uma monocamada celular no compartimento apical sem migração de células para o lado da inserção basal, e a alimentação dos queratinócitos com nutrientes essenciais do meio de cultura contido no compartimento basolateral. No início do processo de reconstituição, os NHEKs são cultivados em condições submersas por alguns dias para permitir sua adesão à membrana. O nível de cálcio em ambos os compartimentos é aumentado em comparação com a concentração de cálcio usada para a cultura 2D de NHEKs para retardar a proliferação de células e promover sua diferenciação46. Um gradiente epidérmico de cálcio é essencial para regular a formação de barreiras e a homeostase47,48. Altos níveis de cálcio (ou seja, até 1,5 mM) promovem a formação de junções intercelulares e modulam a formação do envelope cornificado durante a diferenciação terminal49. Uma vez que os queratinócitos formam uma monocamadas contínua e firmemente aderente na membrana de suporte, o meio do compartimento apical é removido e o processo de cultura continua na interface ar-líquido (ALI) para estimular a estratificação e estabelecer uma barreira epidérmica50,51. Condições de cultura específicas são cruciais para obter um epitélio totalmente estratificado36. Durante o processo de reconstituição na ALI, o meio no compartimento basolateral é suplementado com fator de crescimento de queratinócitos (KGF), insulina, cálcio e ácido ascórbico. O ácido ascórbico desempenha um papel importante na formação de uma barreira lipídica de SC apropriada, assemelhando-se intimamente à da pele humana nativa52. Os querotinócitos cultivados em meio ascórbico suplementado por ácido demonstram um fenótipo diferenciado, com um número aprimorado de grânulos de ceratohyalina, bem como lamellae lipídica intercelular organizada nos interstícios dos corneócitos52. Tal suplementação é essencial para melhorar a função da barreira epidérmica, aumentando o teor de envelopes cornificados e evitando o esgotamento dos estoques de antioxidantes hidrofílicos53,54. O KGF, importante mediador paracrino de proliferação e diferenciação epidérmica, é usado para estimular os NHEKs55.
As principais desvantagens das RMS internas incluem a perda de padronização entre as instituições de pesquisa e o aumento da intensidade do trabalho e do consumo de tempo (até 3 semanas em comparação com os modelos comerciais prontos para uso). O objetivo do presente artigo é abordar essas desvantagens, estabelecendo a base de produção em maior escala. Além das vantagens acima mencionadas das RMS internas, o protocolo atual visa reduzir a intra e intervariabilidade entre os tecidos, reduzir os riscos de contaminação e agilizar o processo de cultivo.
O protocolo atual descreve um método reprodutível e robusto para cultivar RhEs usando NHEKs neonatais. Além disso, mostra resultados representativos da caracterização da morfologia dos RhEs, integridade da barreira e expressão de proteínas específicas para diferenciação epidérmica. A estrutura morfológica dos Roses foi examinada utilizando-se a coloração de hematoxilina e eosina (H&E) de coloração e microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Para avaliar a integridade da barreira, foram medidas a resistência elétrica transepidérmica (TEER) e o tempo de exposição ao Tritão X-100 para reduzir 50% da viabilidade tecidual (ET50). A formação de junções desmosômicas (ou seja, desmogleina 1) foi analisada por imunofluorescência (IF) para avaliar a adesão da queratinócito. A formação de proteínas estruturais epidérmicas (ou seja, involucrina, loricrin e filaggrin) foi avaliada e detectada com IF. Essas proteínas estão envolvidas na formação do envelope proteico altamente interligado que envolve corneócitos de SC e, como resultado, são marcadores importantes para a diferenciação epidérmica em estágio tardio56,57. Além disso, o IF foi utilizado para analisar a queratina 10, proteína induzida em células diferenciadas em estágio inicial na SS58 e encontrada dentro de todas as camadas diferenciadas. Finalmente, foi investigada a resposta do RhE a estímulos proinflammatórios (ou seja, lipopolisacarídeo e fator de necrose tumoral alfa). Os níveis de interleucina 1 alfa (IL-1α) e interleucina 8 (IL-8) foram medidos nos meios de cultura celular, utilizando ensaios imunosorbentes ligados à enzima (ELISA).
Os RhEs são amplamente utilizados como ferramentas de triagem nos campos farmacêutico e dermato-cosmético36,75,76,77,78. Embora várias empresas tenham disponibilizado esses RhEs comercialmente, elas permanecem caras e limitam a possibilidade de variar parâmetros de cultivo conforme necessário para abordar novas questões de pesquisa. Este artigo descreve o procedimento de produção de RhEs internos de forma robusta e confiável e fornece uma caracterização detalhada dos tecidos obtidos para confirmar a relevância do modelo como uma abordagem alternativa aos testes em animais.
Algumas das etapas do protocolo são cruciais para garantir a diferenciação adequada da queratinócito e a reprodutibilidade do RhE. Isso pode ser realizado utilizando as células ideais, tipos médios e condições de cultivo. No modelo RhE proposto, os NHEKs neonatais foram selecionados por sua falta de exposição antigênica, em comparação com os NHEKs adultos. Além disso, os queratinócitos limitavam-se à etnia caucasiana para evitar a variabilidade entre espécies. Queratinócitos primários são tipicamente usados para sua capacidade de diferenciar e estratificar79. Eles podem ser obtidos comercialmente ou por isolamento interno da pele adulta80. O cultivo de uma linha celular (ou seja, HaCaT) em uma membrana de policarbonato, mostrou falta de diferenciação e demonstrou uma capacidade prejudicada de sintetizar lipídios necessários para a formação de barreiras81. No entanto, a inclusão de diferentes matrizes culturais, como hidrogéis, colágeno, fibrina e culturas esferoides, resultou no desenvolvimento bem-sucedido de modelos de pele 3D78,82,83,84,85,86. As linhas celulares imortalizadas, N/TERT, mostraram-se adequadas para o desenvolvimento de RhEs35. Queratinócitos primários permanecem proliferativos em sua quarta ou quinta passagem61, portanto, o protocolo atual inclui o uso de queratinócitos em sua terceira passagem. De Vuyst et al. demonstraram que a densidade de semeadura celular é importante e precisa ser suficiente (ou seja, ≥ 2,5×105 células/cm2) para garantir que o meio do compartimento basolateral não se difunda ao compartimento apical. Uma densidade de semeadura insuficiente (ou seja, < 2.5×105 células/cm2) pode resultar em uma incapacidade de formar uma barreira adequada, que é indicada pela difusão do meio do basolateral para o compartimento apical, resultando em condições submersas em vez de cultura ALI62. Meio de crescimento de queratinócitos sem soro (ver Tabela de Materiais) foi preferido para fins de reprodutibilidade, pois oferece a vantagem de trabalhar com um meio quimicamente definido e reduz o risco de contaminação. Este meio tem menor concentração de cálcio (ou seja, 60 μM) e, portanto, estimula a proliferação de queratinócitos87. O aumento da concentração de cálcio (ou seja, 1,5 mM) a partir da primeira etapa do cultivo de RhE favorece a diferenciação de queratinócitos e a formação de barreiras cutâneas e homeostase49. Além disso, o meio ALI é suplementado com ácido ascórbico, que tem se mostrado crucial para a formação de lipídios de SC e para promover a diferenciação52,53,54. O meio ALI também contém KGF, que é um fator de crescimento secretado por fibroblastos que podem se ligar aos receptores transmembranos queratinócitos e após a ativação tem um papel duplo na diferenciação e reparação de feridas55,88. É importante atualizar o meio ALI em intervalos de tempo específicos, para fornecer um fornecimento constante de nutrientes frescos para os RhEs. O uso de um sistema de placas portadoras é crucial para o cultivo de RhE em uma escala maior (ou seja, 24 inserções/placa). Oferece a vantagem de economizar tempo, reduzir o risco de contaminação, e deixa menos espaço para a introdução de erros humanos. Ele também oferece a possibilidade de cultivar RhEs em um alto volume de mídia (ou seja, 1,5 mL), o que reduz o número necessário de atualizações médias ali. Além disso, oferece a possibilidade de transferir uma placa completa de pastilhas para uma placa com meio fresco, evitando contato com as pastilhas individualmente ou descobrindo a tampa da placa.
Existem várias limitações do modelo RhE que devem ser notadas. Na pele humana nativa há um equilíbrio entre a proliferação de queratinócitos na camada basal e o desprendimento de corneócitos na SC (ou seja, desquamation)89. No entanto, in vitro, a dessaquamação não ocorre. Portanto, os corneócitos permanecem ligados ao RhE e formam uma SC grossa que é menos fisiologicamente relevante. Portanto, há um tempo limitado de cultivo de RhEs. Além disso, este modelo de RhE é simples e simples, uma vez que consiste em um tipo de célula singular, ou seja, o queratinócito, que é o tipo celular mais abundante da epiderme. No entanto, existem outros tipos de células residentes na epiderme, como melanócitos, células dendríticas (ou seja, células Langerhans), células T (por exemplo, CD8+ células), e células Merkel13. Para aumentar a relevância fisiológica do modelo de pele, pesquisadores tornaram os modelos de pele mais complexos adicionando melanócitos38 , células imunes39, ou células derivadas do paciente90. Deve-se ter em mente que as propriedades de barreira dos modelos de pele humana são diferentes em comparação com a pele humana nativa, devido a uma composição lipídica diferente de SC e uma maior permeabilidade de barreira 91,92,93,94,95. No entanto, vários estudos relataram mudanças nas propriedades de barreira de modelos de pele humana pelo cultivo sob hipóxia96 ou diminuição da umidade relativa97, a modulação da matriz dérmica com chitosan98, e alteração nos ácidos graxos livres no meio da cultura99. Além disso, tanto em RhEs simples quanto mais complexos, as condições de cultura e a composição média podem ser moduladas para imitar características patológicas. Desafiando o modelo com citocinas, uma morfologia anormal100 e alterações nos níveis de expressão genética e proteica podem ser estabelecidas que são tipicamente observadas em distúrbios comuns da pele, como dermatite atópica e psoríase35,101,102,103,104,105. Silenciar genes específicos em queratinócitos antes de iniciar o processo de reconstituição do modelo 3D é outra abordagem usada para imitar características de distúrbios da pele e investigar novas soluções terapêuticas106,107. Além de modelar apenas uma camada epidérmica, um compartimento dérmico pode ser incluído no modelo (ou seja, chamados de equivalentes de pele humana ou modelos de espessura total) incorporando fibroblastos em uma matriz de colágeno antes da reconstituição do RhE, tornando-o mais fisiologicamente relevante e adequado para estudos relacionados ao envelhecimento e cicatrização de feridas108,109,110. Além disso, os esferoides tumorais foram adicionados aos equivalentes da pele humana para estudar a progressão do melanoma111,112. Os últimos avanços no campo dos modelos de pele são a bioimprimem e a pele em um chip. Vários grupos de pesquisa tiveram sucesso recentemente no desenvolvimento de equivalentes de pele biofusable (perfusíveis)45,113,114. O protocolo proposto aproveita um formato de 24 poços e uma placa portadora, evitando que as pastilhas sejam manuseadas individualmente. No entanto, a escala de estudo ainda é bastante limitada e carece de automação. Ao implementar o uso de bioimprimem ou pele em um chip, modelos de pele menores podem ser usados com processos mais automatizados e em maior escala.
O RhE descrito neste protocolo tem múltiplas semelhanças com os modelos epidérmicos comerciais já desenvolvidos e bem caracterizados. A análise morfológica demonstrou que, embora o número de camadas viáveis no modelo RhE proposto seja menor se comparado ao da pele humana nativa (ou seja, 6-7 em comparação com 7-14), é comparável ao do modelo EpiDerm RhE (ou seja, 8-12)70. Da mesma forma que os modelos EpiDerm, EpiSkin e SkinEthic, a camada rhe superior mostra um padrão de cesto de camadas de corneócito densamente embaladas28. Além disso, a análise do TEM revelou que o número de camadas de SC no modelo RhE proposto (ou seja, 15-25) é comparável ao do EpiDerm (ou seja, 16-25)70. No geral, o modelo RhE proposto demonstra uma estrutura semelhante à de outros modelos epidérmicos comercializados, imitando a epiderme humana nativa. A integridade tecidual medida pelo TEER está em faixa com modelos comerciais de RhE (ou seja, entre 3000-5600 Ω,cm2)71,72,73 e outros RhEs internos (ou seja, aproximadamente 5000 Ω,cm2)74,115. O modelo RhE proposto mostra-se bem diferenciado, como indicado pela presença e correta localização de marcadores de diferenciação e adesão tecidual. Além disso, o modelo RhE proposto mostra ser responsivo a estímulos proinflamatórios (ou seja, LPS e TNF-α).
Para concluir, o protocolo atual mostra como produzir RhEs de forma confiável e em escala relativamente grande para atender às necessidades dos pesquisadores em instituições acadêmicas e privadas. O modelo RhE proposto mostra ter morfologia semelhante, diferenciação epidérmica e responsividade biológica a outros modelos comerciais existentes. Fornece uma ferramenta alternativa para o campo farmacêutico e dermato-cosmético quando o acesso a um modelo de pele relevante é necessário.
The authors have nothing to disclose.
O Programa de Pesquisa e Inovação Horizon 2020 da União Europeia no âmbito do Bolsa Marie Skłodowska-Curie com o acordo de subvenção nº 765602 financiado este trabalho. Todos os autores reconhecem o apoio da Fundação Adolphe Merkle e da Universidade de Ferrara e reconhecem com gratidão a Dow Silicones Bélgica. Dr. Miguel Spuch-Calvar é reconhecido por preparar as imagens gráficas do processo de cultivo de RhE. Os autores agradecem à Drasler, ao Dr. Franco Cervellati e ao Dr. Agnès Tessier pelo apoio técnico e às discussões.
Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Antibiotic-antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15240062 | |
Aqueous Eosin Y solution | Sigma Aldrich | HT110280 | Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL. |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich or Merck | C8106 or 1.02378.0500 | Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 °C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. |
DAPI | Roche | 10236276001 | Prepare a stock at 100 μg/mL and store aliquots at -20 °C. Working conditon is 1 μg/mL. |
Entellan mounting medium | Merck | 1.07960.0500 | Mounting medium for H&E staining. |
EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | MEPI500CA | Contains 0.06 mM of Ca2+. |
Ethanol absolute | Any supplier | N/A | |
Formalin 10% | Leica Biosystems | 3800770 | |
Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | S0015 | To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 μg/mL hydrocortisone,5 μg/mL bovine transferrin, and 0.01 µg/mL human recombinant insulin-like growth factor-I. |
Isopropanol | Biosolve B.V. | 0016264102BS | |
Kaiser's glycerol gelatine, phenol-free | Merck | 1.08635.0100 | Mounting medium for IF staining. |
Keratinocyte growth factor (KGF) | R&D Systems | 251-KG-050 | Reconstitute KGF protein at 100 μg/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20°C. |
Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit | Roche | 4744926001 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20°C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark. |
Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5 | Sigma-Aldrich | L4524 | Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 °C. Working concentration is 100 μg/mL. |
Mayer’s Haematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS80 | |
Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) | Lonza | 00192906 | Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors. |
Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010056 or 10010-015 | Reference numbers can vary between countries. |
Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | ImmunoTools | 11344483 | Prepare a stock of 100 μg/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL |
Sterile ultrapure water | Any supplier | N/A | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93426 | |
Trypan blue (0.4% [v/v]) | Any supplier | N/A | |
Trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | R007100 | |
Trypsin/EDTA (0.05% [v/v]) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 25300054 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | Ab150113 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | Merck | 1.06448.0500 | For antigen retrieval buffer for IF staining. |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Dylight 488) | Agrisera | AS09 633 | |
Filaggrin Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-53243 | |
Involucrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-33742 | |
Keratin 10 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP2-32962 | |
Desmoglein-1 Mouse antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | MAB944 | |
Loricrin Rabbit antibody | BioTechne (Novus Biologicals) | NBP1-33610 |