Summary
We presenteren twee verschillende kleuringsprotocollen voor NKG2D ligand (NKG2DL) detectie in menselijke primaire acute myeloïde leukemie (AML) monsters. De eerste benadering is gebaseerd op een fusie-eiwit, in staat om alle bekende en potentieel nog onbekende liganden te herkennen, terwijl het tweede protocol afhankelijk is van de toevoeging van meerdere anti-NKG2DL-antilichamen.
Abstract
Bij dezelfde patiënt bleek de afwezigheid van NKG2D liganden (NKG2DL) oppervlakteexpressie leukemische subpopulaties met stamceleigenschappen (zogenaamde leukemische stamcellen, LSC's) te onderscheiden van meer gedifferentieerde tegenhanger leukemische cellen die geen ziekte-initiatiepotentieel hebben, hoewel ze vergelijkbare leukemiespecifieke genetische mutaties dragen. NKG2DL zijn biochemisch zeer diverse MHC klasse I-achtige zelfmoleculen. Gezonde cellen in homeostatische omstandigheden drukken over het algemeen geen NKG2DL uit op het celoppervlak. In plaats daarvan wordt de expressie van deze liganden geïnduceerd bij blootstelling aan cellulaire stress (bijv. oncogene transformatie of infectieuze stimuli) om eliminatie van beschadigde cellen via lysis te activeren via NKG2D-receptor-expresserende immuuncellen zoals nk-cellen (natural killer). Interessant is dat NKG2DL-oppervlakteexpressie selectief wordt onderdrukt in LSC-subpopulaties, waardoor deze cellen NKG2D-gemedieerde immuunbewaking kunnen ontwijken. Hier presenteren we een zij-aan-zij analyse van twee verschillende flowcytometriemethoden die het mogelijk maken om NKG2DL-oppervlakteexpressie op kankercellen te onderzoeken, d.w.z. een methode met pan-ligandherkenning en een methode waarbij meerdere antilichamen tegen enkelvoudige liganden worden gekleurd. Deze methoden kunnen worden gebruikt om levensvatbare NKG2DL-negatieve cellulaire subpopulaties te scheiden met putatieve kankerstamceleigenschappen van NKG2DL-positieve niet-LSC.
Introduction
NK-cellen zijn belangrijke effectoren van het aangeboren immuunsysteem die kwaadaardige cellen of gestreste gezonde cellen (bijv. door een virale infectie) kunnen herkennen en elimineren zonder voorafgaande antigeenstimulatie1. Dit proces wordt strak gereguleerd via een complex repertoire van activerende receptoren (zoals natuurlijke cytotoxiciteitsreceptoren (NVR's), NKG2D en CD16) en remmende receptoren die grotendeels worden vertegenwoordigd door killer immunoglobuline-achtige receptoren (KIR's)2. Binding van KIR's aan humane leukocytenantigeen (HLA) klasse I moleculen op somatische cellen zorgt voor zelfherkenning en brengt NK celtolerantie over. Aan de andere kant veroorzaken afwezigheid van zelfherkenning en verhoogde binding van activerende receptoren aan hun liganden op de doelcellen de afgifte van cytotoxische korrels die leiden tot NK-celgemedieerde cytotoxiciteit1. Ten slotte kunnen NK-cellen antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC) uitoefenen door de activerende receptor CD16 te binden aan doelen die het Fc-gedeelte van Ig (FcR)uitdrukken 2. Afgezien van directe cytotoxiciteit kunnen NK-cellen ook cytokine-afgifte activeren die de aangeboren stof overbrugt met het adaptieve immuunsysteem3.
NKG2D is een belangrijke activerende receptor uitgedrukt op NK, NKT, γδ T en naïeve CD8+ T-cellen4 die dergelijke cytotoxische immuuncellen in staat stelt om NKG2D ligand (NKG2DL) te herkennen en te lyseren en doelcellen uit te drukken. Gezonde cellen drukken NKG2DL vaak niet uit. In plaats daarvan wordt de NKG2DL-expressie geherreguleerd op kwaadaardige of met virussen geïnfecteerde cellen om deze vatbaar te maken voor immuunklaring5.
De menselijke NKG2DL-familie bestaat uit acht bekende moleculen waaronder de twee MHC I-ketengerelateerde moleculen A en B (MICA en MICB6) en het cytomegalovirus UL16-bindende eiwitten 1–6 (ULBP1-67). De expressie van NKG2DL is gereguleerd op de transcriptie, post-transcriptionele en de post-translationele niveaus8. Als zodanig, terwijl NKG2DL-expressie meestal niet detecteerbaar is op het oppervlak van gezonde cellen, werden NKG2DL mRNA9 en intracellulaire eiwitexpressie gerapporteerd in gezonde weefsels. De functionele relevantie van een dergelijke expressie en de mechanismen die aan dergelijke discrepante expressiepatronen ten grondslag liggen , moeten nog worden gedefinieerd10.
De mechanistische regulatie van NKG2DL expressie in de kankercellen is een fascinerend onderzoeksgebied. Trajecten waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij cellulaire stress, bijvoorbeeld de hitteschokstressroute9, of DNA-schadegerelateerde paden, zoals de ataxie telangiectasia gemuteerde (ATM) en Rad3-gerelateerde (ATR) route11, evenals virale of bacteriële infecties zijn direct gekoppeld aan de inductie van NKG2DL-expressie12. Echter, zelfs als oppervlakte expressie van NKG2DL effectief is geïnduceerd, kan deze expressie opnieuw verloren gaan door proteolytisch-gemedieerde afwerping, een mechanisme geassocieerd met immuunontsnapping en slechte klinische prognose bij sommige kankers13.
De afwezigheid van celoppervlak NKG2DL kan ook een belangrijke rol spelen bij patiënten met AML. Hier veroorzaakt behandeling met intensieve chemotherapie vaak remissie, maar terugval treedt vaak op door leukemische stamcellen (LSC), die selectief chemotherapieën overleven en immuunrespons ontwijken. Zoals we onlangs hebben laten zien, ontsnappen LSC's bijvoorbeeld aan NK-cellysis door NKG2DL-oppervlakteexpressie14 teonderdrukken.
Omgekeerd kan de afwezigheid van oppervlakte NKG2DL-expressie worden gebruikt als een methode om putatieve stamachtige subpopulaties van cellen te identificeren en viably te isoleren van bulk tegenhanger leukemische subpopulaties. Hier presenteren we twee flow cytometrische benaderingen die kunnen worden gebruikt om NKG2DL-oppervlakteexpressie te detecteren en daarmee NKG2DL-negatieve stamcellen bij leukemie en misschien ook bij andere kankers te identificeren: een methode voor pan-ligand oppervlakteherkenning en een methode waarbij kleuring met enkele of gepoolde antilichamen individuele bekende NKG2DL-eiwitten herkent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Patiëntenmonsters werden verzameld na goedkeuring door de Ethics Review Board van de universitaire ziekenhuizen van Basel en Tuebingen.
1. Biotinylering van het NKG2D fusie-eiwit
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd met een biotinyleringskit (zie materiaaltabel)volgens de instructies van de fabrikant. Deze stap van het protocol moet ten minste 24 uur vóór de kleuring worden uitgevoerd. Het biotinylated NKG2D fusie-eiwit moet worden opgeslagen bij -20 °C.
- Ontdooi zowel het biotine als de NKG2D fusie-eiwitbuizen bij kamertemperatuur (RT).
OPMERKING: Als de cellen steriel moeten zijn voor verder experimenteel gebruik (injectie bij muizen, kolonievormende eenheidstesten, enz.), reconstitueer dan het fusie-eiwit onder een laminaire stroomkap om besmetting te voorkomen. Anders kan elke stap op een bank worden uitgevoerd. - Draai snel de 50μg gevlyfiliseerd NKG2D-fusie-eiwit om. Voeg 500 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe om het poeder te reconstrueren en meng grondig met een P1000 micropipet.
- Voeg 100 μL van het NKG2DL-fusie-eiwit toe aan een biotinebuis om een uiteindelijke voorraadconcentratie van 100 μg/ml te verkrijgen.
- Meng de oplossing grondig door continu te resuspenderen met een P100 micropipet.
- Incubeer de fusie-eiwit/biotineoplossing gedurende 24 uur bij een gecontroleerde RT. Het fusie-eiwit is nu klaar voor gebruik.
2. Ontdooien van primaire AML-cellen
OPMERKING: Ongeveer 5.000.000 bevroren leukemische cellen per patiënt opgeslagen in vloeibare stikstof werden ontdooid en vervolgens meteen gebruikt voor de test. Leukemische cellen werden verkregen en ingevroren zoals eerder beschreven15. Kortom, perifere bloedmonsters verzameld van patiënten met AML en hoge blast cell percentages (>90% van de blasten onder mononucleaire cellen) werden verwerkt met een dichtheidsgradiëntscheiding om mononucleaire cellen te verkrijgen en vervolgens ingevroren in foetale kalfsserum (FCS) met 10% dimethylsulfoxideoplossing (DMSO). Celaantallen zeer gevarieerd tussen patiënten in afhankelijkheid van de leukocytenconcentratie bij de patiënt (bereik: 1.000.000 tot 30.000.000 leukemische cellen per ml bloed).
- Pre-warm RPMI-medium met 10% FCS bij 37 °C met behulp van een waterbad. Voeg voor elke flacon AML-cellen (tot 30.000.000 cellen in 1 ml FCS + 10% DMSO) 10 ml voorverwarmd medium toe aan een reactiebuis van 15 ml.
- Verwijder het cryoviale met primaire AML uit de opslag van vloeibare stikstof en ontdooi de cellen onmiddellijk met een waterbad van 37 °C. Beweeg de buis voorzichtig heen en weer in het water, zodat de inhoud van de flacon kan ontdooien totdat er nog maar een klein ijskristal over is.
- Breng de ontdooide cellen onmiddellijk over in de medium-bevattende buis en spoel de flacon af met 1 ml medium.
- Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 300 x g en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.
- Was de cellen met 5 ml RPMI-medium met 10% FCS en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 x g.
3. Celtelling
- Resuspendeer de celkorrel in een bekend volume RPMI-medium dat 10% FCS bevat.
- Breng een klein volume van de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml en verdun in een bekende verhouding met trypanblauw of een andere alternatieve kleurstof die live cel/dode celdiscriminatie mogelijk maakt.
- Gebruik elk apparaat om de cellen te tellen.
- Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 300 x g en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.
4. Kleuring van primaire AML-cellen met behulp van het biotinylated NKG2D-fusie-eiwit
- Bereid de kleuringsbuffer voor door 500 ml PBS aan te vullen met runderserumalbumine (BSA) en ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) tot een eindconcentratie van respectievelijk 0,07 mM en 2 mM. Stel indien nodig de pH (7,2–7,4) in.
- Resuspendeer de celkorrel met kleuringsbuffer tot een eindconcentratie van 0,5 x 107 cellen/ml.
OPMERKING: Optioneel kunnen de cellen vóór de kleuring worden geïncubeerd met een blokkeermiddel (bijv. hIgG (1μg/ml) gedurende 30 minuten bij RT of FcR-blocking agent).. - Breng 100 μL van de celsuspensie over naar een celkweek 96-put U-bodemplaat en centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten op 300 x g. Gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.
- Bereid een mastermix van biotinylated NKG2D fusion protein voor, zodat cellen worden geresuspendeerd in een eindvolume van 50 μL per put met een eindconcentratie van 10 μg/ml per put.
- Voeg de mastermix, bereid in stap 4.4, toe met behulp van een pipet van 100 μL en resuspend de celkorrels met een meerkanaalspipet van 300 μL.
OPMERKING: Verklein het uiteindelijke volume op basis van het aantal cellen om de hoeveelheid fusie-eiwit te verminderen die nodig is voor de kleuring. - Incubeer de celsuspensie gedurende 25 minuten bij RT of 50 min bij 4 °C.
- Was de cellen door 200 μL kleurbuffer per put toe te voegen met een 300 μL meerkanaals pipet.
- Centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten op 300 x g en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.
- Herhaal stap 4.7 en 4.8.
OPMERKING: De hier beschreven kleuring wordt uitgevoerd in een celkweek 96-put U-bodemplaat. Daarom worden wasstappen twee keer uitgevoerd vanwege de kleine volumecapaciteit van dergelijke platen. De kleuring kan ook in andere buizen worden uitgevoerd en wasstappen kunnen dan slechts één keer worden uitgevoerd met een groter volume. - Bereid een mastermix met Streptavidin-PE (zie tabel 1 voor verdunningen) zodat cellen worden geresuspendeerd in een eindvolume van 50 μL.
OPMERKING: Voeg selectieantistoffen toe voor uw celtype als bijv. CD33, CD34.... voor AML. - Voeg de mastermix, bereid in stap 4.10, toe met een pipet van 100 μL en resuspend de celkorrels met een meerkanaalspipet van 300 μL.
- Incubeer de celsuspensingen gedurende 15 minuten bij RT of 30 minuten bij 4 °C in het donker.
- Was de cellen door 200 μL kleurbuffer per put toe te voegen met een 300 μL meerkanaals pipet.
- Centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten op 300 x g en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.
- Herhaal stap 4.13 en 4.14.
- Bereid een oplossing van kleuringsbuffer met inbegrip van 7-AAD (7-Aminoactinomycine D, 1:1000) of een reagens om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen.
- Resuspend celkorrels in 200 μL kleurbuffer + 7-AAD bereid in stap 4.16 bij het gebruik van een 300 μL meerkanaals micropipet.
- Analyseer de cellen met behulp van een flow cytometrie apparaat.
5. Kleuring van enkelvoudige of gepoolde enkelvoudige anti-NKG2DL antilichamen
- Gebruik dezelfde celsuspensie als in stap 4.2.
- Breng 100 μL van de celsuspensie over naar een celkweekplaat met een 96-put U-bodemplaat met behulp van een meerkanaalspipet van 300 μL en centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten op 300 x g. Gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.
- Bereid voor elk primair antilichaam of gepoolde antilichamen een antilichaamstammix voor (zie tabel 2 voor verdunningen) zodat de cellen in een eindvolume van 50 μL worden geresuspendeerd.
- Voeg de mastermix, bereid in stap 5.3, toe met behulp van een pipet van 100 μL en resuspend de celkorrels met een meerkanaalspipet van 300 μL.
- Incubeer de cellen gedurende 25 minuten bij RT.
- Was de cellen door 200 μL kleurbuffer per put toe te voegen met behulp van een 300 μL meerkanaals pipet.
- Centrifugeer de celkweek 96-well U-bottom plaat op 300 x g gedurende 10 min en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.
- Herhaal stap 5.6 en 5.7.
- Bereid een antilichaam master mix voor door het secundaire antilichaam toe te voegen (zie tabel 2 voor verdunningen) zodat de cellen worden geresuspendeerd in een eindvolume van 50 μL per put.
- Voeg de mastermix, bereid in stap 5.9, toe met behulp van een pipet van 100 μL en resuspend de celkorrels met een meerkanaalspipet van 300 μL.
- Incubeer gedurende 15 minuten bij RT of 30 minuten bij 4 °C in het donker.
- Was door 200 μL kleurbuffer per put toe te voegen met behulp van een meerkanaalspipet van 300 μL.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten op 300 x g en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.
- Herhaal stap 5.12 en 5.13.
- Resuspend celkorrels in 200 μL kleurbuffer met 7-AAD bereid in stap 4.16.
- Analyseer de cellen met behulp van een flowcytometrieapparaat zoals beschreven in stap 6.
6. Gegevensverwerving
OPMERKING: Zorg ervoor dat de wekelijkse kwaliteitscontroles van de flowcytometer worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de lasers goed functioneren. Voor het hier gepresenteerde protocol wordt een wekelijks Cytometer en Tracking (CTS) proces uitgevoerd met relatieve kralen om laserprestaties op alle kanalen te controleren. Na het CTS worden 10.000 gebeurtenissen geregistreerd met behulp van de 8-piek kralen als interne controle. Alle pieken moeten zich in dezelfde positie binnen hun poorten bevinden en goed van elkaar gescheiden zijn.
- Maak de matrixcompensatie om spectrale overlapping tussen detectoren met kralen of met cellen16af te trekken.
- Neem 10.000 gebeurtenissen op voor de niet-bevlekte cellen en de enkele bevlekte kralen. Voor de fluorescentie minus één (FMO) controles, registreren 50.000 gebeurtenissen en voor de volledig bevlekte steekproeven registreren tot 100.000 gebeurtenissen.
OPMERKING: Als alternatief kunnen enkele bevlekte monsters op de cellen worden uitgevoerd. Zorg er dan voor dat de cellen een positief signaal hebben voor de gewenste marker. - Verkrijg een enkel gekleurd cel- of kraalmonster voor elke fluorofoor die in het experiment wordt gebruikt om de hoeveelheid spectrale overlapping te onthullen. Gebruik de compensatiemaker van het flowcytometrieapparaat om overloopwaarden te berekenen en de compensatiematrix toe te passen op alle gemeten monsters.
OPMERKING: Secundaire antilichamen kunnen niet worden gebruikt voor het maken van compensatie met kralen als de compensatie wordt berekend met kralen. Afhankelijk van het type compensatieparels kunnen secundaire antilichamen niet worden gebruikt voor de compensatie met kralen. - Voor de FMO-controles en de volledige bevlekte monsters met het fusie-eiwit selecteert u eerst de cellen op basis van hun voorwaartse spreiding (FSC) en zijstrooiing (SSC). Na de uitsluiting van doubletten, poort de cellen op basis van hun negativiteit voor 7-AAD (PercP-Cy5.5) signaal om de dode cellen uit te sluiten (zie stap 5.15). De laatste plot toont de expressie van CD34 (Y-as) en NKG2DL (X-as) op levende singlets.
- Voor de enkele anti-NKG2DL-antilichamen, pas dezelfde strategie toe op de monsters, maar merk op dat ligand positiviteit ligt in Alexa Fluor 488 en niet in het PE-kanaal.
- Pas poorten aan volgens de FMO-besturingselementen voor gatingstrategie uit stap 6.4 en 6.5 (zie tabel 3) voor geschikte FMO-besturingselementen om voor dit experiment uit te voeren: Teken in de analysesoftware een poort op de negatieve fractie. Tijdens het opnemen van het volledig bevlekte monster zijn de cellen boven de eerder gemaakte poort positief voor de geanalyseerde markering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beide hier gepresenteerde protocollen maken de verrijking van AML LSC door flow cytometrische analyses mogelijk met behulp van CD34, een bekende marker van LSC17, in combinatie met NKG2DL-oppervlakteexpressie door gebruik te maken van pan-ligandherkenning of kleuring met gepoolde antilichamen tegen individuele liganden. In figuur 1laten we zien dat de geanalyseerde AML-monsters positief zijn voor CD34 en NKG2DL, maar er bestaan ook negatieve subpopulaties, wat wordt aangetoond door de aanwezigheid van in totaal vier verschillende populaties. Onze gegevens tonen de typische gatingstrategie voor een dergelijke kleuring, te beginnen met de selectie van de belangrijkste populatie cellen via hun FSC en SSC. Doubletten en dode cellen zijn uitgesloten in de downstreamanalyse (figuur 1A). Poorten worden aangepast met behulp van FMO-controles om een goede identificatie van positieve cellen te garanderen (figuur 1B).
In figuur 1Cbenadrukken we de fluorescentieintensiteiten van cellen die positief zijn voor CD34 (APC, Y-as) versus NKG2DL (PE, X-as). AML-cellen die positief zijn voor CD34 vertonen een lagere oppervlakteexpressie van NKG2DL (figuur 1C), wat in overeenstemming is met eerdere bevindingen van ons laboratorium, waaruit blijkt dat NKG2DL-expressie geassocieerd is met een gebrek aan steelheid14.
Figuur 2 geeft de robuustheid aan van beide NKG2DL-kleurmethoden. In figuur 2Aonderzoeken we drie primaire AML-monsters naast elkaar met respectievelijk 19,8, 49,8 en 89,4% van positieve voorvallen voor de fusie-eiwitkleuring vs 20,4, 50,4 en 90,6% voor de gepoolde anti-NKG2DL-antilichaamkleuring (gepoolde antilichamen tegen respectievelijk MICA, MICB, ULBP1, ULBP2). Aan de andere kant vertoont enkelvoudig ligand (tegen MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 of ULBP3) kleuring een reeks positieve gebeurtenissen tot 92% (figuur 2B). Dit percentage varieert afhankelijk van de ligand zelf en de patiënt, bijvoorbeeld ULBP3 (figuur 2B). Een enkele cel kan meerdere NKG2DL uitdrukken.
Wanneer meerdere anti-NKG2DL-antilichamen worden samengevoegd en gecombineerd tot één enkele buis, is het percentage positieve cellen vergelijkbaar met het percentage van het fusie-eiwit (figuur 2A). Als zodanig werken beide protocollen goed en kunnen vergelijkbare resultaten opleveren met betrekking tot NKG2DL-expressie op primaire AML-cellen. In sommige AML kan de fusie-eiwitmethode een hogere gevoeligheid mogelijk maken, omdat het de herkenning van verdere NKG2DL-eiwitten mogelijk kan maken.
Figuur 1: Typische gatingstrategie van primaire AML-monsters. (A) Cellen worden eerst gated op basis van hun grootte (X-as) en complexiteit (bijv. granulariteit, Y-as). Doubletten worden dan uitgesloten door de hoogte of breedte tegen het gebied te plotten voor voorwaartse spreiding. Ten slotte worden levende cellen geselecteerd op basis van hun grootte (X-as) versus hun negativiteit voor 7AAD (PerCP-Cy5.5, Y-as). B) FMO-controles worden gebruikt om de poorten op te zetten die helpen onderscheid te maken tussen positieve en negatieve populaties voor aangegeven markers. De gatingstrategie blijft identiek zoals weergegeven in figuur 1A. (C) Flow cytometrie plot met positieve en negatieve gebeurtenissen voor CD34 (APC, Y-as) vs NKG2DL (PE of AlexaFluor488, X-as). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking van kleuringsprotocollen. (A) Staafgrafieken met het percentage positieve voorvallen voor het fusie-eiwit versus de gepoolde anti-NKGD2L-antilichamen (n = 3 AML-monsters) uit gated single levende cellen. (B) Staafgrafieken met het percentage positieve voorvallen voor enkelvoudige ligandkleuring voor alle bekende anti-NKG2DL-antilichamen en gepoolde enkelvoudige liganden (zie tabel met materialen voor gedetailleerde antilichaaminformatie). Gating werd opnieuw uitgevoerd op enkele levende cellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Tube naam | Antigeen | Fluorofoor | Verdunning/concentratie |
| Niet-aangetaste cellen | - | - | - |
| Enkele vlek PE |
NKG2D-Fusionproteïne | PE | 1:10 voor primaire stap 1:100 voor secundaire stap |
| Enkele vlek 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
Live/Dood | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| Enkele vlek APC |
CD34 | APC | 1:25 |
| Volledige bevlekte cellen | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2D-Fusionproteïne | PE | 1:10 voor primaire stap 1:100 voor secundaire stap | |
| Live/Dood | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tabel 1: Buizen die nodig zijn om monsters te beitsen met het NKG2D-fusie-eiwit. Deze tabel toont de buizen die nodig zijn om het experiment op te zetten.
| Tube naam | Antigeen | Fluorofoor | Verdunning/concentratie |
| Niet-aangetaste cellen | - | - | - |
| Enkele vlek Alexa Fluor 488 |
ULBP-1 | Alexa Fluor 488 | 10 μg/ml voor primaire stap 4 μg/ml voor secundaire stap |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| MICA | |||
| MICB | |||
| enkele vlek 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
Live/Dood | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| Enkele vlek APC |
CD34 | APC | 1:25 |
| Volledige bevlekte cellen | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2DL | Alexa Fluor 488 | 10 μg/ml voor primaire stap 4 μg/ml voor secundaire stap |
|
| Live/Dood | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tabel 2: Buizen die nodig zijn om monsters te bevlekken met de anti-NKG2DL-antilichamen. Deze tabel toont de buizen die nodig zijn om het experiment op te zetten.
| Tube naam | Antigeen | Fluorofoor | Verdunning/concentratie |
| Niet-aangetaste cellen | - | - | - |
| FMO_APC | ULBP-1 | Alexa Fluor 488 | 10 μg/ml voor primaire stap 4 μg/ml voor secundaire stap |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| MICA | |||
| MICB | |||
| NKG2D-Fusionproteïne | PE | 1:10 voor primaire stap 1:100 voor secundaire stap |
|
| Live/Dood | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_PE | CD34 | APC | 1:25 |
| ULBP-1 | Alexa Fluor 488 | 10 μg/ml voor primaire stap 4 μg/ml voor secundaire stap |
|
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| MICA | |||
| MICB | |||
| Live/Dood | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_Alexa Fluor 488 | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2D-Fusionproteïne | PE | 1:10 voor primaire stap 1:100 voor secundaire stap |
|
| Live/Dood | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tabel 3: Buizen die nodig zijn om de essentiële bedieningselementen in te stellen. Deze tabel toont de buizen die nodig zijn om de juiste FMO-, primaire en secundaire antilichaamcontroles in te stellen. Alle vereiste controles (FMO) moeten door de experimenteerder worden toegevoegd om geldige resultaten en interpreteerbare gegevens te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we twee flow cytometrische methoden die NKG2DL-oppervlakteexpressie op menselijke primaire AML-cellen kunnen detecteren. We laten zien dat beide detectiemethoden kunnen worden gebruikt in combinatie met andere antilichaamkleuringen (bijv. het detecteren van CD34-expressie). Vergelijkbare kleuringen kunnen ook worden uitgevoerd op andere primaire celtypen en cellijnen.
We hebben onlangs laten zien dat de afwezigheid van NKG2DL op het oppervlak van AML-patiëntstralen LSC14kan verrijken. In AML bezitten NKG2DL-negatieve maar niet NKG2DL-positieve leukemische subpopulaties clonogene en in vivo leukemie-initiërende capaciteiten. Toekomstig onderzoek zal uitwijzen of afwezigheid van NKG2DL-oppervlakteexpressie ook kan worden gebruikt als hulpmiddel om stamcellen bij andere kankertypen te verrijken.
Van CD34 is klassiek aangetoond dat het LSC's in AML markeert, maar AML is een zeer heterogene ziekte en niet alle AML-patiënten vertonen CD34-expressie (d.w.z. CD34-negatieve AML18). We hebben eerder aangetoond dat afwezigheid van NKG2DL-oppervlakteexpressie een nieuw hulpmiddel is om LSC te identificeren in deze subgroep van CD34-negatieve AML. Hier richten we ons daarentegen op de subgroep van CD34-positieve AMLs en laten we zien dat er verschillende subpopulaties kunnen optreden. Toekomstig onderzoek zal uitwijzen of co-staining voor NKG2DL in combinatie met dergelijke andere markers (bijv. CD34) LSC effectiever kan verrijken.
In flowcytometrie is het belangrijk om adequate controles zoals FMO op te nemen om de experimenteerder te helpen correct onderscheid te maken tussen positieve en negatieve gebeurtenissen. Bovendien zijn positieve controles voor elk gebruikt antilichaam nodig om ervoor te zorgen dat de afwezigheid van kleuring niet te wijten is aan een defect antilichaam. Het protocol dat we hier presenteren, gebruikt slechts een beperkt aantal oppervlaktemarkeringen, die kunnen worden uitgebreid volgens de behoefte van de experimenteerder, bijvoorbeeld door toevoeging van CD33- of potentiële LSC-markeringen19. Bovendien kunnen de fluoroforen die in dit protocol worden gebruikt, worden aangepast. Belangrijk is dat dergelijke veranderingen gepaard gaan met een antilichaamtitratie om de beste verdunning te bepalen.
Een cruciale stap voor de kleuring is het ontdooien van primaire AML-cellen. Naast hun kwetsbaarheid worden dergelijke monsters namelijk geconserveerd in dimethylsulfoxide (DMSO), dat op zich giftig is voor de cellen. Daarom moeten de monsters met zorg worden behandeld en grondig worden gespoeld om langdurige blootstelling aan DMSO te voorkomen. Hoewel onze monsters werden verwerkt en ingevroren volgens een eerder vastgesteld protocol15,is het belangrijk om de stappen die in het manuscript worden beschreven zorgvuldig te volgen om een hoog celherstel te garanderen. Het werken met verse monsters zorgt voor een betere levensvatbaarheid en wordt daarom aanbevolen. In de meeste gevallen is dit echter niet haalbaar.
Een andere factor die de beschreven methode beïnvloedt, is een monsterspecifieke afwijking die kan leiden tot verschillende celverstrooiingsprofielen die worden waargenomen via flowcytometrie. Vanwege ziekte heterogeniteit is dit onvermijdelijk, maar moet in de analyse worden overwogen. Extra variabiliteit kan worden geïntroduceerd door bevriezing/ontdooiing of andere mechanische stappen in de monsterverwerking. Over het algemeen is snelheid de sleutel om celdood te voorkomen. Stervende cellen en puin kunnen echter niet worden vermeden en moeten in de analyse in aanmerking worden genomen en uitgesloten. Gating op basis van FSC/SSC moet grondig en kritisch worden uitgevoerd, aangezien dit de eerste stap van monsteranalyse is.
Een groot voordeel van het fusie-eiwit is de potentie om alle bekende en potentieel onbekende NKG2DL's te detecteren, terwijl specifieke anti-NKG2DL-antilichamen (bijv. MICA, MICB) een selectiebias introduceren. Beide methoden zijn even haalbaar. Voor het geanalyseerde beperkte aantal monsters lieten ze ook zeer vergelijkbare resultaten zien. Het gebruik van het NKG2D-fusie-eiwit heeft een aantal belangrijke voordelen: minder tijdrovend, verminderd reagensaantal en aantal kleurmonsters, evenals een lagere kans op menselijke fouten (d.w.z. pipetteerfouten). Bovendien kan deze methode ook effectiever zijn bij het vastleggen van NKG2DL-expressie in sommige monsters, omdat het ook de expressie van onbekende eiwitten met de NKG2DL-functie moet vastleggen, wat in sommige AML-gevallen kan worden uitgedrukt. Hoewel deze methode inzicht geeft in de aanwezigheid van NKG2DL op het oppervlak, geeft deze methode geen informatie over de intracellulaire niveaus van NKG2DL, hun handel of regulering, en daarom moeten andere onderzoeken worden uitgevoerd om meer kennis over dergelijke vragen op te doen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Swiss National Science Foundation (179239), de Foundation for Fight Against Cancer (Zuerich), de Wilhelm Sander Foundation aan CL (2019.042.1) en de Novartis Foundation for medical-biological research aan C.L. Bovendien heeft dit project financiering ontvangen van het horizon 2020-onderzoek- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 765104. We danken de Flow Cytometry Facility in Basel voor de steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
- Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: "One for All, All for One". Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
- Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
- El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
- Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
- Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
- Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
- Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
- Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
- Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
- Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
- Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
- Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).
