Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Polarisering af M1 og M2 Human Monocyte-afledte celler og analyse med Flow Cytometry på Mycobacterium tuberkulose Infektion

Published: September 18, 2020 doi: 10.3791/61807
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1, 1,4, 1
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet, 2Infectious Diseases Division, International Centre for Diarrhoeal Disease Research, Bangladesh, 3Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet, 4Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokol giver en metode til at studere Mycobacterium tuberkulose infektion i humane M1- eller M2-polariserede makrofager baseret på differentiering af perifere blod-monocytter til makrofaglignende celler, der er inficeret med GFP-mærket virulent stamme H37Rv, og analyseret med flow cytometry ved hjælp af en 10-farve panel, herunder udtryk for udvalgte M1/M2 markører.

Abstract

Humane makrofager er primære værtsceller for intracellulær Mycobacteriumtuberkulose (Mtb) infektion og har dermed en central rolle i immunforsvaret af tuberkulose (TB). Vi har etableret en eksperimentel protokol til at følge immun polarisering af myeloid-afledte celler i M1 (klassisk aktiveret) eller M2 (alternativt aktiveret) makrofag-lignende celler gennem vurdering med en 10-farve flow cytometry panel, der tillader visualisering og dyb karakterisering af grøn-fluorescerende-protein (GFP)-mærket Mtb i forskellige makrofager delmængder. Monocytter opnået fra raske bloddonorer blev polariseret i M1- eller M2-celler ved hjælp af differentiering med granulocyt makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) eller makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) efterfulgt af polarisering med henholdsvis IFN-γ og lipopolysaccharide (LPS) eller IL-4. Fuldt polariserede M1- og M2-celler blev inficeret med Mtb-GFP i 4 timer, før løsrevne Mtb-inficerede makrofager blev plettet med flowcytometri ved 4- eller 24-timers postinfektion. Prøveanskaffelse blev udført med flowcytometry, og dataene blev analyseret ved hjælp af en flowcytometrianalysesoftware. Manuel gating samt dimensionalitet reduktion med Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) og fænograf analyse blev udført. Denne protokol resulterede i effektiv M1/M2 polarisering karakteriseret ved forhøjede niveauer af CD64, CD86, TLR2, HLA-DR og CCR7 på uinficerede M1-celler, mens uinficerede M2-celler udviste en stærk opregulering af M2-fænotypemarkørerne CD163, CD200R, CD206 og CD80. M1-polariserede celler indeholdt typisk færre bakterier sammenlignet med M2-polariserede celler. Flere M1/M2 markører blev nedreguleret efter Mtb infektion, hvilket tyder på, at Mtb kan modulere makrofag polarisering. Derudover viste det sig, at 24 forskellige celleklynger af forskellig størrelse var entydigt fordelt mellem M1- og M2-uinficerede og Mtb-inficerede celler ved 24-timers post-infektion. Denne M1/M2-flowcytometriprotokol kan bruges som rygrad i Mtb-makrofagforskning og vedtages til særlige behov inden for forskellige forskningsområder.

Introduction

Makrofager er immunceller, der bidrager væsentligt til reguleringen af vævshomøostase, betændelse og sygdomspatologier. Som en væsentlig bestanddel af medfødt immunitet udtrykker cellernes monocyt-makrofagalage heterogene fænotyper som reaktion på ændrede miljømæssige signaler, som afspejler deres plasticitet og tilpasning til forskellige anatomiske og immunologiske placeringer1. Afhængigt af vækstfaktorerne, cytokiner og andre mæglere, der er til stede i mikromiljøet, er makrofager blevet kategoriseret i to store reversible populationer, hver med en anden rolle i bakteriekontrol og clearance2: de proinflammatoriske, klassisk aktiverede M1-polariserede makrofager og antiinflammatoriske, alternativt aktiverede M2-polariserede makrofager, der oprindeligt blev navngivet til at efterligne T-hjælper (Th) cellenomenklatur3. Denne gruppering af immunpolariserede makrofager betragtes ofte som forenklet, da makrofagaktivering og differentiering ikke er lineær, men mere præcist illustreret som et kontinuum, hvor hver befolkning har forskellige egenskaber og funktionelle roller i resultatet af sygdomsudvikling og progression4,5,6,7. Ikke desto mindre er der mange eksperimentelle fordele med M1/M2 makrofagmodellen, der kan bruges inden for flere forskellige forskningsområder.

Mycobacteriumtuberkulose (Mtb) er årsagsmidlet til tuberkulose (TB) og er blevet anslået til at inficere en person hvert sekund og betragtes som det mest dødelige enkelt infektiøse middel i verden (Global TB-rapport 2019). Da luftvejene er hovedvejen for Mtb-infektion, er alveolar makrofager de foretrukne værtsceller, der skal inficeres med Mtb og repræsenterer både de primære barrierer og det smitsomme reservoir for Mtb i lungerne. Makrofagpolarisering som reaktion på forskellige stimuli er blevet grundigt undersøgt gennem årene7 og i det meste af det offentliggjorte arbejde, M1 polarisering af monocytkulturer in vitro fremkaldes af Granulocyte-Macrophage Colony Stimuleringsfaktor (GM-CSF) sammen med IFN-γ og LPS8,9, mens M2 polarisering induceres med Macrophage Colony Stimuleringsfaktor (M-CSF) og IL-410,11. M1-makrofagerne er potente effektorceller, der formidler antimikrobielle reaktioner mod intracellulære patogener og har en væsentlig rolle i antitumorimmunitet12. M2 makrofager har på den anden side en antiinflammatorisk funktion, høj fagocytisk kapacitet og er hovedsageligt involveret i sårheling og vævsreparation samt i parasitinfektioner12. Derfor betragtes M1-makrofager som mere effektive i intracellulær kontrol af Mtb sammenlignet med M2-makrofager13. Men, Mtb bakterier har også potentiale til at modulere makrofag polarisering at undergrave medfødte immunitet14,15,16,17.

Selv om det er almindeligt at generere makrofager fra differentiering af monocytter opnået fra perifert blod18, makrofager kan også genereres fra inducerede pluripotente stamceller (iPSCs)19 eller fra knoglemarvs-afledte makrofager fra mus20,21. Disse er mulige teknikker til at studere primære makrofagceller opnået fra monocyt / makrofag stamfadere, der vil formere sig og differentiere sig til en homogen population af modne makrofag-lignende celler. Disse protokoller giver imidlertid sjældent uddybet viden om de opnåede cellers fænotype og funktion eller tager højde for den naturlige heterogenitet, der observeres blandt makrofager opnået in vivo. Da Mtb er et strengt menneskeligt patogen, er der også en fordel ved at studere Mtb i humaniserede modelsystemer. Flow cytometry er en kraftfuld teknologi, der giver mulighed for at vurdere flere fænotypiske og funktionelle egenskaber ved enkelte celler i suspension22, noget der kan være ret udfordrende med vedhængende celler som makrofager, der også er kendt for at være autofluorescerende23,24. Ud over kemisk løsrivelse af fast klæbende makrofager kan Mtb-infektion udgøre en betydelig stressfaktor for cellerne, der tilføjer et andet niveau af kompleksitet i flowcytometriske analyser af Mtb-inficerede makrofager.

I denne eksperimentelle protokol har vi brugt en tidligere etableret human makrofaginfektionsmodel baseret på immunpolarisering af primære perifere blod-monocyt-afledte celler, der er inficeret med det virulent laboratorium Mtb stamme H37Rv, og analyseret med flowcytometri ved hjælp af et 10-farvepanel, herunder udtryk for udvalgte M1- og M2-markører25. Denne protokol giver en effektiv og reproducerbar metode til at studere reaktioner på Mtb-infektion i M1 eller M2 polariserede monocyt-afledte makrofager. Derudover giver brugen af flowcytometri på vedhængende Mtb-inficerede makrofager os mulighed for at studere en række overflademarkører forbundet med konventionelle M1- og M2-makrofager og deres langsgående reaktion på Mtb-infektion. Det er vigtigt, at denne protokol let kan vedtages til undersøgelser af infektioner med andre patogener, i antisvulstundersøgelser eller i undersøgelser af inflammatoriske tilstande, til lægemiddelscreening osv. og kan også udnyttes til vurdering af M1/M2 makrofagpolarisering i kliniske humane prøver.

Protocol

Humant perifert blod fra raske anonyme bloddonorer blev fra blodbanken på Karolinska Universitetshospital, Huddinge, Sverige (etisk godkendelse Dnr 2010/603-31/4). Alle eksperimentelle trin, der involverede levende virulent Mtb, blev udført på Biosafety Level-3 (BSL-3) laboratoriet ved Det Svenske Sundhedsagentur (FOHM), Solna, Sverige.

1. Forberedelse af medier, buffere og bakteriekulturer

BEMÆRK: Nærmere oplysninger om alle reagenser og hjælpematerialer findes i materialeoversigten.

  1. RPMI komplet medium: Tillæg RPMI 1640 med 1 mM natrium pyruvat, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES og 10% varmeinaktiveret føtal kvægserum (FBS). Undgå antibiotika i cellekulturmediet, når du arbejder med Mtb-infektion.
  2. Serumfrit RPMI-medium: Tillæg RPMI 1640 med 1 mM natrium pyruvat, 2 mM L-glutamin og 10 mM HEPES.
  3. Vaskebuffer: Forbered fosfatbuffers saltvand (PBS), der indeholder 0,05% (v/v) Tween-80.
  4. FACS buffer: Forbered PBS indeholdende 2,5% (v/v) FBS og 0,5 mM EDTA.
  5. Fikseringsbuffer: Forbered PBS indeholdende 4% formaldehyd til PBS. Sørg for, at det er frisklavet før brug, f.eks. blandet fra en stamopløsning på 37% formaldehyd.
  6. Permeabiliseringsbuffer: Tilsæt 0,1% natriumcitrat og 0,1% Triton X-100 til deioniseret vand.
  7. Vaskebuffer (for immunfluorescens): Forbered PBS indeholdende 0,1% BSA og 0,1% Tween-20.
  8. Blokeringsbuffer: Forbered PBS indeholdende 0,1% BSA og 10% normalt gedeserum (NGS) til PBS.
  9. Farvningsbuffer (til immunfluorescens): Forbered PBS indeholdende 0,1% BSA til PBS.
  10. TB komplet medium: Tillægget Middle Brook 7H9 bouillon med 0,05% (v/v) Tween-80, 0,5% (v/v) glycerol, kanamycin (20 μg/mL), 10% (v/v) Middlebrook oliesyre, albumin, dextrose og catalase berigelse (Middlebrook OADC Enrichment).
  11. Bakteriekulturer: Brug standard virulent Mtb-laboratoriestammen, H37Rv, der konstituerende udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP), til infektion af monocyt-afledte celler. Denne Mtb stamme bærer en pFPV2 plasmid, der indeholder et gen kodning GFP, samt et gen for kanamycin resistens. Antibiotikaresistensen muliggør kontinuerlig udvælgelse af plasmid-udtrykkende bakterier i kulturer, der indeholder kanamycin. Bakterier opbevares i TB komplet medium og 70% glycerol (1:1 fortynding) ved -80 °C.

2. Perifer blod mononuklear celle isolation fra buffy frakker

BEMÆRK: Udfør alt arbejde med humant blod (potentielt smitsomt) i et biosikkerhedsskab i klasse II. Inaktivere restblodprodukter med desinfektionsmidler i 15 minutter, før de kasseres. Blod blev opnået fra raske frivillige i dette tilfælde. Denne in vitro-differentieringsprotokol for makrofag blev oprettet med henblik på at omfatte 10 x10 6 isolerede PBMCs/donor/well. Fra hver donor indeholder en buffy frakke ca. 50 mL af en koncentreret leukocyt suspension med oprindelse i fuldblod, som normalt giver 500-800 x 106 PBMCs, hvorfra ca. 10% eller 50-80 x 106 monocytter kan hentes.

  1. 15 mL buffy coatblod påføres oven på 15 mL tæthedsgradientmedium tilberedt i 50 mL rør. Overlejr langsomt blodet oven på massefyldegradientlaget ved at hælde pipettespidsen til rørets væg.
  2. Drej rørene ved 600 x g i 25 minutter ved rumtemperatur (RT) med 0 acceleration og 0 deceleration.
    BEMÆRK: Luk lågene forsigtigt før centrifugering, og kontroller altid rørholderne for potentielt spild efter centrifugering.
  3. Fjern det øverste plasmalag med en steril Pasteur-pipette, og opsaml derefter forsigtigt det mononukleare cellelag i et nyt 50 mL rør ved hjælp af en steril Pasteur-pipette. Der tilsættes serumfrit RPMI-medium til PBMC-pellet'en for at opnå et endeligt volumen på 50 mL. Bland forsigtigt ved at vende røret et par gange før centrifugering ved 500 x g i 5 minutter ved RT.
  4. Kassér supernatanten forsigtigt og genbrug cellepillen ved at vende bunden af røret i fingrene.
  5. For at fjerne den tæthedsgradientmedieforurening fra PBMCs vaskes celler 2-3 gange med serumfri RPMI for at opnå et endeligt volumen på 50 mL. Centrifuge ved 500 x g i 5 min ved RT. Vask, indtil cellen supernatant bliver gennemsigtig.
  6. Supernatanten kasseres, og cellerne genbruges i 20 mL serumfrit RPMI-medium.
  7. Tæl cellerne ved trypan blå farvning, manuelt ved hjælp af et hæmocytometer eller ved hjælp af en automatiseret celletæller. Celleaffjedringen fortyndes i trypanblå i 1:2 eller 1:10 fortynding ved at blande celle-trypanblå prøve i en 96 brøndplade, f.eks.
    ADVARSEL: Trypan blå er giftig og skal kasseres i et separat kemisk affald.

3. Differentiering og polarisering af monocyt-afledte celler

BEMÆRK: For differentiering og polarisering af monocyt-afledte celler, en protokol, som vi tidligere har etableret for M0, M1-lignende og M2-lignende celler samt fuldt M1 og M2 polariserede celler blev fulgt25. For nemheds skyld er kun fuldt polariserede M1- og M2-makrofager beskrevet her.

  1. Brug plastisk vedhæftenhed til isolering af monocytter. Kort sagt frø frisk isolerede PBMCs i en 6-brønds kultur plade i en passende koncentration, f.eks 10 x 106 PBMCs/well i 2 mL serum-fri RPMI medium og inkubere ved 37 °C og 5% CO2.
  2. Efter 2-3 timer fjernes de ikke-klæbende celler med en pipette, og brøndene vaskes 3 gange med 1 mL serumfrit medium. De vedhæftede celler er monocytter og omfatter omkring 10% af de samlede PBMCs føjet til brønden, dvs 106 monocytter hentet fra 10 x 106 PBMCs tilføjet per brønd.
  3. Til differentiering af makrofag skal du udarbejde en arbejdsløsning, der indeholder henholdsvis 50 ng/mL GM-CSF eller M-CSF til M1- og M2-makrofagpolarisering, tilføjet i 2 ml RPMI komplet medium pr. brønd. Cellerne dyrkes i en 5% CO 2-inkubator i 37 °C i 3 dage.
  4. På dag 3 fjernes 1 mL af cellekulturmediet forsigtigt fra det øverste lag af hver brønd og supplerer cellekulturerne med 1 mL frisk RPMI komplet medium, der indeholder den dobbelte koncentration af M-CSF eller GM-CSF for at opnå 50 ng / mL endelig koncentration i brøndene. Tilføj vækstfaktorerne i en færdig arbejdsløsning på 100 ng/mL/well.
  5. På dag 6 tilsættes forskellige stimuli for de sidste 18-20 timers celledifferentiering for at opnå fuldt polariseret og moden M1 (interferon-γ; IFN-γ og lipopolysaccharid; LPS (E. coli O55:B5)) eller M2 (interleukin 4; IL-4) makrofager. Til M1-polarisering forberedes IFN-γ og LPS i hele RPMI-mediet, og der tilsættes 50 μL pr. brønd for at opnå en endelig koncentration på 50 ng/mL IFN-γ og 10 ng/mL LPS i cellekulturerne. Til M2 polarisering forberedes IL-4 i RPMI komplet medium og tilsættes 50 μL pr. brønd for at opnå en endelig koncentration på 20 ng/mL i cellekulturerne.
  6. For differentiering af M0 polariserede makrofager, stimulere cellerne med M-CSF kun, uden yderligere cytokiner (giver en M2-lignende fænotype)25.
  7. Kontroller regelmæssigt morfologien af monocyt-afledte cellekulturer med let mikroskopi for at sikre, at mindre monocytter differentieres til større makrofaglignende celler. Overvåg også potentielle morfologiske forskelle mellem M1- og M2-polariseringen, dvs. aflange og strakte M1-celler sammenlignet med M2-celler med en mere afrundet form25.
  8. På dag 7 overføres pladerne med monocyt-afledte celler til et BSL-3 laboratorium for infektion med virulent Mtb.

4. Forberedelse af Mtb kulturer

BEMÆRK: Følgende trin skal udføres i en BSL-3-facilitet. Til alt arbejde med virulent Mtb skal du bruge beskyttelsesbeklædning, åndedrætsværn og ethanolresistente handsker.

  1. Tø et hætteglas med 1 mL bakterielt aliquot og bland med 9 mL TB komplet medium (1:10 fortynding) i et 50 mL filtreret hætterør. Suspensionen i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2dyrkes .
  2. Efter 24 timer drejes bakterieophænget ved 2.300 x g i 10 minutter og hældes forsigtigt af mediet. Den bakteriel pellet er blevet genbrugt med 15-20 mL frisk TB komplet medium i et nyt 50 mL filtreret hættekulturrør og inkuberes ved 37 °C og 5% CO2. Bland nedsatte bakterier i røret hver 2-3 dage for at opretholde en homogen næringsstofforsyning til alle bakterieceller.
  3. Efter 7-10 dage blandes bakterieaffjedringen korrekt ved at pipette op og ned, før den overføres til et 50 mL skruehætterør.
  4. Tilsæt 35-40 mL steril vaskebuffer til 50 mL røret, og drej bakterieophænget ved 2.300 x g i 10 min. Gentag vasketrinnene én gang. Den bakterielle pellet opsuspendes i 1 mL serumfrit RPMI-medium ved pipettering med en mikropipette.
  5. Der tilsættes yderligere 9 mL serumfrit RPMI-medium, og bakterieaffjedringen tilsættes i et biosikkerhedsskab i klasse II i 5 minutter ved 37 °C for at forstyrre bakterieklumperne. Dyp røret gentagne gange (3-4 gange) i vandbadets sonikator for at sikre maksimal forstyrrelse af bakterielle klumper. Den optiske massefylde (OD) på 1 mL bakteriel affjedring ved 600 nm bølgelængde måles ved hjælp af et spektrofotometer placeret inde i biosikkerhedsskabet. Brug serumfrit RPMI-medie til at angive referencen.
  6. Beregn antallet af kolonidannende enheder (CFU) ved hjælp af formlen: (OD+0,155)/0,161 = Y, og Y x 107= Y x 106 CFU/mL, f.eks.

5. Mtb-infektion i monocyt-afledte celler

BEMÆRK: Følgende trin skal udføres i en BSL-3-facilitet.

  1. Den bakterielle pellet i serumfrit RPMI-medium genbruges i et nyt sterilt 50 mL rør, og den endelige bakteriekoncentration justeres til ca. 5 x 106 CFU/mL.
  2. Fjern cellekulturmediet fra de 6 brøndplader, der indeholder monocytafledte celler. Tilsæt 1 mL serumfrit RPMI-medium til hver brønd. Der tilsættes 1 mL bakteriel suspension pr. brønd for at opnå en mangfoldighed af infektion (MOI) 5:1, dvs.
  3. Efter infektion vaskes cellerne 3 gange med 1 mL steril vaskebuffer for at fjerne ekstracellulære bakterier. Vip pladen og fjern forsigtigt hele vaskebufferen fra hjørnerne. Resuspend de Mtb-inficerede monocyt-afledte celler i 2 mL RPMI komplet medium uden antibiotika og fortsætte med at flyde cytometri farvning eller inkubere cellerne i yderligere 24 timer (eller andre tidspunkter) før flow cytometry.

6. Flow cytometri farvning af Mtb-inficerede monocyt-afledte celler

BEMÆRK: Følgende trin skal udføres i en BSL-3-facilitet. Flowcytometry farvning kunne udføres i en 96-godt plade i stedet for rør.

  1. De Mtb-inficerede celler (og ikke-inficerede kontroller) fjernes fra brøndene i 6-brøndspladen(erne) ved inkubation med 1 mL FACS-buffer pr. brønd i mindst 30 min ved 37 °C og 5% CO2.
  2. Rør forsigtigt op og ned et par gange for at sikre, at cellerne løsnes. Hvis det er muligt, skal du bekræfte celleløsning med mikroskopi. Overfør celleaffjedringen fra hver brønd til et skrueloftet mikrocentrifugerør, og drej rørene ved 200 x g i 5 min. Kassér supernatanten forsigtigt ved pipettering.
  3. Vask cellepillen i hvert rør to gange med FACS buffer og drej cellerne ved 200 x g i 5 min.
  4. Plette cellerne (ca. 0,5 x 106 til 1 x 106 celler/rør) med ca. 50 μL cocktail af fluorochrom-konjugerede anti-humane antistoffer, herunder TLR2 (AF647), CD206 (APC-Cy7), CD163 (BV605), CD80 (BV650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (PE), CD64 (PE-Dazzle 594), HLA-DR (PE-Cy5) (Tabel 1) i kombination med levedygtighedsfarvningsfarven Zombie-UV i 30 minutter ved 4 °C (køleskab) i mørke.
  5. Vask de farvede celler to gange med 400 μL FACS buffer og drej cellerne ved 200 x g i 5 min.
  6. De farvede celler fikseres med 200 μL fikseringsbuffer (frisklavet) i 30 minutter ved RT i mørke for at sikre fuldstændig inaktivering af mycobakterier.
  7. Cellerne vaskes to gange med 400 μL FACS-buffer, og der drejes ved 200 x g i 5 minutter for at fjerne overskydende fikseringsbuffer.
  8. Resuspend de faste celler i 400 μL FACS buffer og overføre prøverne til nye 1 mL mikrocentrifuge rør, før du tager dem ud af BSL-3 laboratorium for flow cytometry i BSL-2. De farvede celler opbevares i +4 °C, indtil der udtages prøver.
    BEMÆRK: Sprøjt rørene med 70% ethanol, før du tager dem ud af BSL-3 laboratoriet. Formaldehyd er giftigt (kræftfremkaldende) og skal håndteres i et biosikkerhedsskab i klasse II. Udsmid formaldehydaffald i et separat kemisk affald.

7. Flow cytometrisk dataindsamling og analyse af Mtb-inficerede monocyt-afledte celler

BEMÆRK: Trin 7.1-7.2 skal udføres forud for den ovenfor beskrevne pletning af flowcytometry. For at undgå problemer med celleklumpning og dissociation af tandemfarver efter cellefiksering udføres prøveopsamling af både Mtb-inficerede og uinficerede celler inden for 4-10 timer efter primær antistoffarvning.

  1. Før den ovenfor beskrevne cytometrifarvning kompenseres fluorescerende signal for hvert fluorokromkonjugeret antistof, der er anført i farvningspanelet (tabel 1), ved hjælp af kompensationsperler (både positive og negative).
  2. Titrere antistof fortynding til farvning af menneskelige makrofager for at opnå det optimale signal for hver fluorkrom.
  3. Brug ikke-indgroede celler til at bestemme det niveau af baggrundsfluorescens, der er nødvendigt for at indstille porten for den negative cellepopulation, så de farvede celler kan visualiseres (makrofager er meget automatisk fluorescerende).
  4. Anskaf mindst 50.000 celler/prøve i flowcytometeret ved hjælp af den anbefalede software til dataindsamling.
  5. Eksporter anskaffelsesfilerne fra flowcytometeret i FCS-format (Flow Cytometry Standard) 3.1.
  6. Analyser FCS-filerne i flowcytometrianalysesoftwaren.
  7. Gate makrofager i henhold til deres frem-og side scatter (FSC og SSC) egenskaber og udelukke døde celler ved levende / døde celle gating ved hjælp af Zombie-UV levedygtighed farvestof.
  8. Visualiser H37Rv-GFP-inficerede makrofager i FITC-kanalen.
  9. Identificer hyppigheden af positivt farvede celler og geometrisk gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) for alle markører (tabel 1).

8. Immunfluorescens farvning af Mtb-inficerede monocyt-afledte celler

BEMÆRK: Mtb-infektion skal udføres i et BSL-3-anlæg.

  1. Til immunfarvning, frø 2 x 105 PBMCs/ godt i 500 μL serum-fri RPMI medium i 8 godt kammer dias for at opnå 2 x 104 monocytter / godt. Efter differentiering og M1/M2 polarisering af monocytter, fortsæt med Mtb infektion som beskrevet ovenfor. Fastgør diasene efter 24 timers Mtb-infektion med fikseringsbuffer i 30 minutter. Faste lysbilleder opbevares i fryseren ved -20 °C indtil yderligere analyser.
  2. Monocyt-afledte celler vaskes to gange med 200 μL PBS i 10 min hver.
  3. Gennemtræng cellerne med 200 μL permeabiliseringsbuffer i 5 minutter ved RT.
  4. Cellerne vaskes 3 gange med 200 μL PBS i 5 min hver.
  5. Cellerne vaskes to gange med 200 μL vaskebuffer i 5 min hver.
  6. Bloker ikke-specifik binding med 200 μL blokeringsbuffer i 30 min ved RT.
  7. De primære antistoffer fortyndes 1:100 i farvningsbuffer, og M1-cellerne inkuberes med et ubestridt CD64-antistof (Klon: 10.1) og M2-cellerne med et ikke-konjugeret CD163-antistof (polyklonalt) i 2 timer ved RT.
  8. Derefter vaskes cellerne 3 gange med 200 μL vaskebuffer i 10 minutter hver.
  9. Fortynd fluorescerende mærket sekundære antistoffer 1:1,000 i farvning buffer og inkuber M1 celler med en anti-mus IgG-Alexa Fluor 594 og M2 celler med en anti-kanin IgG-Alexa Fluor 594 for 1 time på RT.
  10. Cellerne vaskes 3 gange med 200 μL vaskebuffer i 10 minutter hver.
  11. Kammergitteret fjernes, og der tilsættes ~20 μL DAPI-monteringsmedium i hver brønd, og der anbringes et 1,5 mm coverlip på hvert dias.
  12. Forsegl coverlip med et lag neglelak.
  13. Anskaf billeder ved hjælp af et konfokalt mikroskop med lasere, der udsender ved 486 nm til excitation af GFP (grøn kanal), 402 nm for henholdsvis DAPI (blå) og 560 nm for sekundært antistof (rødt).

Representative Results

En skematisk illustration af de cytokinstimuleringer, der bruges til polarisering af monocytafledte celler til M0 (M2-lignende celler), M1 (fuldt polariserede M1-celler) og M2 (fuldt polariserede M2-celler) er præsenteret i figur 1A, mens repræsentative billeder af M0-, M1- og M2-cellekulturer samt M1-kulturer på dag 0, 3 og 7 er vist i figur 1B. Uinficerede M0-celler blev brugt til at demonstrere den grundlæggende gating-strategi (Figur 2A). I første omgang myeloid celler (~ 85%) blev gated i henhold til deres fremad scatter (FSC) og side scatter (SSC) egenskaber, herunder de større celler med høj granularitet og eksklusive små mængder snavs med en lav SSC og FSC, der findes i nederste venstre hjørne af prik plot. I det andet område blev doublets (dvs. celleklumper) defineret som havende et øget areal, men lignende højde sammenlignet med enkelte celler og blev udelukket fra yderligere analyse. Derfor var det kun celler, der stod i forhold til FSC-området og FSC-højden (enkelte celler), der blev inkluderet i den skrå formport. Dernæst zombie-UV levedygtighed farvestof, der pletter cytoplasmiske proteiner inde i de døde celler, blev brugt til at udelukke de døde celler fra efterfølgende analyse. Som forventet var levedygtige ikke-inficerede M0-celler negative for Mtb-GFP-udtryk, der blev visualiseret i FITC-kanalen.

Dernæst anvendte vi den samme gating strategi til uinficerede samt Mtb-inficerede M1 og M2 makrofager på 4 timer efter infektion (Figur 2B, C). To underpopulationer blev påvist i FCS/SSC-porten til uinficerede M1 polariserede makrofager. en population med en mindre størrelse (FCS) og højere granularitet (SSC) og den anden befolkning med en større størrelse og lavere granularitet (figur 2B), mens hovedporten på uinficerede M2-celler syntes mere homogen (Figur 2C). Både M1- og M2 monocyt-afledte celler viste et lodret skift til højere granularitet og reduceret cellestørrelse ved Mtb-infektion, hvilket kan afspejle en øget kompleksitet inde i cellerne forårsaget af optagelse af intracellulære Mtb-bakterier (Figur 2B, C). Desuden afslørede levedygtighedspletten en forbedret celledød (17-22%) blandt de Mtb-inficerede M1- og M2-celler ved en MOI på 5 sammenlignet med uinficerede M0-celler (99 %) (Figur 2A-C) eller uinficerede M1- og M2-celler (data vises ikke). Repræsentative data viste, at Mtb-GFP-ekspressionen (dvs. Mtb-infektivitet) var væsentligt højere i M2 -celler (77 % GFP-positive celler) sammenlignet med M1-celler (19 % GFP-positive celler) efter 4 timers infektion (figur 2B,C). Efter 24 timers infektion Mtb-GFP-udtryk var henholdsvis 43% og 85% i M1- og M2-celler, hvilket tyder på, at M1-celler havde en relativt højere stigning i GFP-ekspression fra henholdsvis 4-24 timer efter Mtb-infektion sammenlignet med M2-celler, 126% mod 10,4% stigning i GFP-udtryk i M1- og M2-celler fra henholdsvis 4-24 timer.

For at karakterisere effekten af M1/M2 polarisering i uinficerede monocyt-afledte celler, dot plots blev brugt til at identificere M1 celler, der var dobbelt-positive for CD64 og CD86 (CD64+CD86+) og M2 celler, der var dobbelt-positive for CD163 og CD200R (CD163+CD200R+; Figur 3A,B). Udvælgelsen af M1/M2-markører blev primært foretaget på baggrund af resultaterne fra vores tidligere arbejde25 , men også fra andre undersøgelser26,27,28,29. Kvadranterne for de farvede celler blev indstillet ved hjælp af tilsvarende porte til ikke-indgroede M1/M2-celler (Figur 3A). Ingen af disse markører udtrykkes udelukkende af M1- eller M2-celler, men andelen af positive celler samt overfladeudtrykkets intensitet er forskellig. Dette fremgik især af M1-pletten, hvor ca. 95 % af M1-cellerne og 79 % af M2-cellerne var CD64+CD86+, men farvningsintensiteten var betydeligt højere i M1-delmængden (Figur 3A). Mens 27% af M1-cellerne var positive for M2-mærket CD200R, var kun 1% positive for CD163, hvilket gav 0,5% CD163+CD200R+ M1-celler sammenlignet med 63% CD163+CD200R+ M2-celler (Figur 3A). Efter 4 timers Mtb-infektion blev der observeret en stigning i hyppigheden af CD200R+ celler i Mtb-GFP-positive M1 polariserede celler (16%), mens CD163-ekspression blev reduceret i M2-celler (Figur 3B). Varmekortet viser en høj intensitet af GFP-ekspressionen i CD163+CD200R+ M2-celler, men også i cd64+CD86+ M2-delsættet sammenlignet med de tilsvarende M1-celleundersæt (Figur 3B). Samlet set visualiseres forskydningen i udtrykket af de respektive M1- og M2-markører også i histogrammerne i figur 3C. Desuden blev Mtb-GFP-bakterier også visualiseret i CD64+ M1-celler og i CD163+ M2-celler ved konfokal mikroskopi, som understøttede en forbedret intracellulær optagelse og / eller vækst af Mtb inde i M2 sammenlignet med M1-celler (Figur 3D).

For at verificere resultaterne af den manuelle gating anvendte vi dimensionalitetsreduktion ved hjælp af Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). UMAP-analyse viste, at Mtb-infektion i 4 timer ikke var tilstrækkelig til at påvirke polariseringen af makrofager, i modsætning til 24 timers infektion, hvilket resulterede i klart adskilte klynger af M1 og M2 uinficerede og inficerede celler (Figur 4A). Uinficerede M1-makrofager viste højere udtryk for CD64, CD86, TLR2, HLA-DR og CCR7 sammenlignet med M2-makrofager, mens uinficerede M2-celler udviste en stærk opregulering af M2-fænotypemarkørerne CD163, CD200R, CD206 og CD80 (Figur 4B,C). Efter aftale med den manuelle gating forårsagede Mtb-infektion efter 24 timer en klar nedregulering af CD163, CD200R og CD206 på M2-celler og opregulering af CD86 og HLA-DR på M1-celler (Figur 4B, C), hvilket tyder på, at Mtb kan modulere makrofag polarisering. Efterfølgende fænografanalyse (Figur 4D-F) identificerede 24 forskellige klynger af forskellig størrelse, som var entydigt fordelt mellem de Uinficerede celler M1 og M2, som illustreret i UMAP-graferne (Figur 4D), cirkeldiagrammer (Figur 4E) og varmekort (Figur 4F). Alt i alt viser disse resultater lovende effektivitet af denne protokol til at generere fænotypisk og funktionelt forskellige M1 og M2 polariserede celler in vitro, der er yderligere moduleret af Mtb infektion.

Figure 1
Figur 1: Skematisk illustration af in vitro differentiering og polarisering af humane myeloid-afledte celler. (A) M0 (M2-lignende), M1 (klassisk aktiveret) og M2 (alternativt aktiveret) celler er afbildet. Monocytter opnået fra raske bloddonorer blev polariseret med forskellige cytokiner som beskrevet i protokollen og inficeret med GFP-mærket Mtb stamme, H37Rv, i 4 timer før analyse med 10-farve flow cytometry. M1-polariserede celler indeholder typisk færre bakterier sammenlignet med M2-polariserede celler. (B) Mikroskopiske billeder af fuldt polariserede, uinficerede M0-, M1- og M2-celler i 6-brøndspladerne på dag 7 og repræsentative billeder af M1-celledifferentiering fra monocytter på dag 0, 3 og 7. Forstørrelse er 20x (øverste panel) og 10x (nederste panel). Bemærk, at M1-cellerne er mere aflange og strakte sammenlignet med de mere afrundede M0- og M2-celler (øverste panel). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Gating strategi differentieret polariseret myeloid-afledte celler. Repræsentative punktplotter, der viser egenskaberne (A) FSC (Forward Scatter) og SSC (Side Scatter) for ikke-inficerede M0-makrofager. FSC-A/FSC-H-plottet viser manuel gating af enkeltceller, der står i et rimeligt forhold til areal og højde. Den levende celle gate udelukket celler, der var positive for Zombie-UV (levedygtighed farvestof). Intracellulær Mtb blev opdaget af GFP-udtryk i levende celler observeret i FITC-kanalen. (B) Gating af M1 og (C) M2 makrofager viser FCS / SSC dot parceller af både i uinficerede celler og Mtb-inficerede celler 4 timer og 24 timer efter infektion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Effekt af in vitro M1/M2 polariseringsprotokollen. Repræsentative dot-plots og kvadrantgating, der viser undersætfrekvenser af M1- og M2-polariserede celler ved hjælp af CD64 og CD86 (M1) eller CD163 og CD200R (M2) i (A) ikke-inficerede og farvede uinficerede celler og (B) Mtb-inficerede farvede celler 4 timer efter infektion. Prikplotterne i (B) illustrerer fluorescensintensiteten af GFP-ekspression (varmekort) i M1- og M2-polariserede makrofager opnået fra forskellige underporte. (C) Geometrisk middelværdi af fluorescensintensitet (MFI) er vist i histogrammer fra en repræsentativ donor efter 4 h Mtb-infektion. MFI-værdierne i uinficerede M1-celler (lyseblå) og M2-celler (lys lilla) præsenteres i det øverste panel, og Mtb-inficerede M1-celler (dybblå) og M2-celler (dyb lilla) præsenteres i det nederste panel. (D) Repræsentative konfokale billeder af uinficerede og Mtb-inficerede M1- og M2-polariserede celler vises. M1- og M2-celler blev farves til henholdsvis CD64- og CD163-udtryk ved hjælp af immunfluorescens. Positiv overflade farvning er vist i rød og GFP-udtrykke intracellulære bakterier er vist med grønt. DAPI-farvede kerner vises i blå farve. Skaler – 10 μm. Forstørrelsen af billeder til højre er 350x. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Dimensionalitetsreduktion med ensartet manifold tilnærmelse og projektion (UMAP) og fænografanalyse af uinficerede og Mtb-inficerede M1- og M2-celler. (A) UMAP, skabt ved at sammenkæde 11000 levende celler fra uinficerede og Mtb-inficerede M1- og M2-cellekulturer fra to repræsentative bloddonorer, 4 timer (venstre grafer) eller 24 timer (højre grafer) efter infektion. Varmekortet for GFP-udtryk (nederste panel) angiver uinficerede og Mtb-inficerede celler. (B-C) MFI af markører udtrykt i uinficerede og Mtb-inficerede M1- og M2-celler 24 timer efter infektion, vist som (B) varmekort eller (C) barplot. (D-F) Fænografanalyse identificerede 24 klynger, der er forskelligt fordelt mellem de uinficerede og Mtb-inficerede M1- og M2-kulturer. Klynge 8-13 er unikke i ikke-inficerede M1-celler, klynge 1-7 er unikke i Mtb-inficerede M1-celler, klynger 20-24 er unikke i uinficerede M2-celler, og klynger 14-19 er unikke i Mtb-inficerede M2-celler. MFI'en for hver markør i hver fænografklynge er vist i (F). Dataene præsenteres som uinficerede M1 -celler (lyseblå) og M2-celler (lyselilla) og Mtb-inficerede M1-celler (dybblå) og M2-celler (dyb lilla). Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Liste over antistoffer, der anvendes til flowcytometri.

Laser Filter Fluorochrom Fænotype Funktion Klon Katalognr. Virksomhed
639 670/30 AF647 TLR2 Patogengenkendelsesreceptor TL2.1 309714 BioLegend
639 780/60 APC-Cy7 CD206 Mannose receptor 15-2 321120 BioLegend
405 610/20 BV605 CD163 Ådselæder receptor GHI/61 333616 BioLegend
405 670/30 BV650 CD80 Co-stimulerende molekyle 2D10 305227 BioLegend
405 710/50 BV711 CCR7 Kemokin receptor G043H7 353228 BioLegend
405 780/60 BV785 CD86 Co-stimulerende molekyle IT2.2 305442 BioLegend
488 530/30 GFP Mtb Intracellulære bakterier
561 586/15 Pe CD200R Hæmmende receptor OX-108 329306 BioLegend
561 620/14 PE/BLÆNDE 594 CD64 Fc gamma receptor-I af IgG 10.1 305032 BioLegend
561 661/20 PE-Cy5 (PC5) HLA-DR MHC klasse II molekyle L243 af 17. 307608 BioLegend
355 450/50 BUV395 Farvestof til levedygtighed Dynamisk/død cellemarkør Zombie UV 423108 Invitrogen

Discussion

Denne eksperimentelle protokol beskriver effektiv polarisering af myeloid-afledte celler i M1 eller M2 fænotyper, herunder vurdering med en 10-farve flow cytometry panel, der tillader visualisering og dyb karakterisering af GFP-mærket Mtb i forskellige makrofager delsæt. Selv om TB er en gammel menneskelig sygdom, er der i øjeblikket ingen gylden standard model til at studere Mtb-makrofag interaktioner, og multi-farve flow cytometri af makrofager kan være kompliceret i forhold til analyser af lymfocyt svar. Få tilgængelige protokoller for in vitro differentiering af menneskelige monocytter til makrofager præsentere dyb viden om den type makrofager genereret. En grundlæggende protokol for polarisering af makrofaget og cytometrisk vurdering af makrofagaktivering ved hjælp af et solidt panel af markører kan sandsynligvis lette en sådan karakterisering og give mulighed for at udforske yderligere funktioner i polariserede celler, der behandles under forskellige forhold. Dette omfatter analyser af celler, der er dyrket in vitro, samt analyser af celler in vivo i kliniske prøver, dvs. Derfor kan differentiering og/eller aktiveringsstatus for monocytter og makrofager fra patienter være relateret til sygdomsudfald. Udvidelse af CD16+CD163+ monocytter i perifert blod er blevet rapporteret hos lunge-TB-patienter30. En øget hyppighed af CD163+ celler blev også påvist i den betændte hud af atopisk dermatitis patienter31. På samme måde har CD206+ M2-lignende makrofager vist sig at hæmme spredning og differentiering af celler i mikromiljøet af adipocytvæv32 og at blive beriget med knoglemarvsprøver fra patienter med akut myeloid leukæmi (AML)29. Et forhøjet forhold mellem CD64 (M1) og CD163 (M2) celler i fuldblod hos patienter med slidgigt viste sig at være forbundet med sygdom sværhedsgrad33. En anden undersøgelse, der anvendes CD86 (M1) og CD163 (M2) til at påvise, at høj M1 udtryk i væv korreleret til dårligere resultat i en undergruppe af ondartede hjernetumorer34.

Der er flere væsentlige fordele ved denne eksperimentelle M1/M2 flow cytometry protokol. Denne model giver mulighed for at studere medfødte immunresponser på virulent Mtb-infektion og kan udvikles til at indeholde undersøgelser af adaptive immunresponser ved at tilføje autologe T-celler sammen med M1 eller M2 makrofager i blandede lymfocytreaktioner (MLR). Protokollen er også velegnet til lægemiddelscreening og testning af forskellige immunmodulerende og antimikrobielle forbindelser. Her har vi tidligere studeret virkningerne af D-vitamin og histone deacetylase inhibitor phenylbutyrat på myeloid-afledte celler efter Mtb-infektion25,35. M1/M2 flow cytometry kan også bruges til at vurdere makrofag aktivering efter konditionering med cellekultur supernatants eller patient plasma. Mens in vivo-undersøgelser af TB-co-infektion med HIV eller helminths eller TB-diabetes co-morbiditet kan være udfordrende, kan den mindre komplekse M1/M2-model lette undersøgelser af co-morbiditeter in vitro. På samme måde kan protokollen udnyttes til transmissionsundersøgelser til at undersøge cellers Mtb-infektiøsitet eller til at undersøge fagocytisk såvel som antigenpræsentationskapacitet for individuelle M1/M2-celler. M1/M2 flow cytometry er også attraktivt til brug i biomarkør- og vaccineundersøgelser, til at følge sygdomsprognoser under behandling og til at teste terapier rettet mod myeloid-afledte celler. Det er vigtigt, at der anvendes en række forskellige metoder parallelt med flowcytometry til samtidig vurdering af makrofagære polariseringsphoenotyper og funktionelle reaktioner ved hjælp af konfokal mikroskopi (Figur 3D), PCR i realtid, vestlige blot, multiplex assays og ELISA af opløselige faktorer i kulturen supernatant samt vurdering af intracellulær bakteriel infektivitet og vækst ved hjælp af GFP-udtryk (flow cytometry og konfokal mikroskopi) og koloni danner enheder (CFU). Infektion af M1- eller M2-celler med Mtb-GFP-bakterier gør det også muligt at sortere de uinficerede og Mtb-inficerede celler fra samme prøve til enkeltcelle-RNA-sekventeringsanalyse.

Den beskrevne protokol har også visse begrænsninger, herunder både tekniske og videnskabelige ulemper. Ulempen ved at bruge monocyt-afledte makrofager fra humane bloddonorer er, at donorvariationen ofte er høj, og det faktum, at cellerne ikke er polariseret i det fysiologiske miljø af humane væv. Stor variation i M1/M2 polarisering effekt eller Mtb-infektiøsitet mellem donorer kan resultere i problemer med både intra-og interexperimental variationer, lav statistisk effekt, og et behov for at omfatte mange donorer for at opnå pålidelige resultater. Derudover resulterer plastisk overholdelse af monocytter fra PBMCs i et donorafhængigt antal monocytter / godt, der i sidste ende kan give en vilkårlig MOI, der kan påvirke makrofaget polarisering og celle levedygtighed efter Mtb infektion. Kritiske trin i protokollen indebærer korrekt vask for at forhindre andre celletyper i at forurene cellekulturerne, som også kan påvirke polariseringen af makrofaget. Mens en for lav MOI kan efterligne latent TB-infektion, vil en for høj MOI dræbe cellerne og fremhæve vigtigheden af at bruge en passende MOI. Desuden kan det være vanskeligt at hente fast klæbende celler ved løsrivelse, hvilket kan resultere i en forudindtaget repræsentation af visse makrofager delsæt, der anvendes til flowcytometrianalyser. Et afgørende skridt i flow cytometry analyse indebærer korrekt brug af perler kompensation matrix og negative kontroller såsom unstained celler eller FMO (Fluorescens Minus One) kontrol for at sikre korrekt manuel gating.

En anden begrænsning indebærer polarisering af monocytter afledt af blod og ikke fra det lokale vævsmiljø. Kendetegnende for human TB er dannelsen af granulomer i Mtb-inficerede væv, og immunopatologi i TB bør derfor fortrinsvis undersøges på det lokale vævssted. Monocytter rekrutteres dog til lungerne fra perifert blod ved betændelse / infektion, hvor celler kan differentiere sig til makrofager i nærværelse af inflammatoriske cytokiner som GM-CSF12. Det er vigtigt, i det fysiologiske miljø af væv in vivo, er der sandsynligvis en stor heterogenitet af makrofag polarisering, herunder en blanding og forskellige forhold mellem forskellige M1- og M2-lignende makrofagpopulationer, der bidrager til skæbnen for TB-infektion36. Vi har tidligere udviklet en human organotypisk lungevævsmodel, der muliggør 3D-undersøgelser af makrofagimedieret granulomdannelse i TB37. Det kunne være interessant at udnytte den nuværende M1/M2 polariseringsprotokol i kombination med lungevævsmodellen til yderligere at studere TB granulomadannelse, effektorfunktioner og M1/M2-forhold i eksperimentelt væv.

Denne M1/M2 flowcytometry protokol kunne let tilpasses til at omfatte et udvidet panel af myeloid markører nyttige til vurdering af funktioner forbundet med hæmmende såvel som inflammatoriske reaktioner. Der er en stor forskningsinteresse i hæmmende immun checkpoint molekyler såsom PD-1, SIRP-α, IDO og arginaser, der kunne modulere makrofag svar38. I denne sammenhæng kan polarisering af myeloidceller også involvere andre stimuli, der fremmer immunorgulatoriske makrofager (Mreg) eller myeloid-afledte suppressorceller (MDSC), der har vist sig at være involveret i flere sygdomme, herunder TB38. Mere avancerede flow cytometry paneler af M1/M2/Mreg makrofag delmængder kan også omfatte intracellulær farvning af cytokiner / kemokiner IL-1β, TNF-α, IL-10 og MCP-1 eller andre opløselige faktorer eller effekteller molekyler såsom inducible nitrogenoxid (iNOS) og antimikrobielle peptider. Dette kunne forbedre mulighederne for at studere polyfunktionelle makrofagsresponser, svarende til hvad der er blevet udførligt beskrevet for T-celler39.

I øjeblikket kan flow cytometry farvning paneler omfatte op til 30-40 farver, som giver mulighed for at immunophenotype flere celle delsæt og molekyler samtidigt. Den grundlæggende eksperimentelle opsætning af denne M1/M2 flow cytometry-protokol kan bruges som en rygrad, der er kompatibel med de fleste gamle såvel som nye flowcytometre og kan bygges på og skræddersys efter individuelle behov, herunder udfordringerne ved arbejde med virulent Mtb i et BSL-3-miljø. I dag er dimensionalitetsreduktionsteknikker som UMAP tilgængelige i de nye versioner af flowcytometry-software, som muliggør analyse af et stort antal parametre, der genereres i enkeltcelleundersøgelser, der er afgørende for forbedret visualisering og fortolkning af højdimensionelle data40. De konstante teknologiske forbedringer i flowcytometry vil sandsynligvis fortsætte i de kommende år, herunder kombinationen af multi-parametrisk fænotyping sammen med moderne cellesorteringskapaciteter, hvor denne protokol kan vise sig nyttig i flere makrofagbaserede Mtb-infektionsanalyser.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker vores kolleger i Sveriges Sundhedsagentur, Matilda Svensson og Solomon Ghebremichael for hjælp i BSL-3 laboratoriet.

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Den Svenske Hjerte- og Lungefond (HLF) (2019-0299 og 2019-0302 til SB), det svenske forskningsråd (VR) (2014-02592, 2019-01744 og 2019-04720 til SB), Stiftelsen for Forebyggelse af Antibiotikaresistens (Resist), Karolinska Institutet Foundations og KID til SB (delvis finansiering af ph.d.-uddannelse for Marco Loreti) fra Karolinska Institutet. ML blev støttet af Den Svenske Børnecancerfond (TJ2018-0128 og PR2019-0100).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-well chamber slides Lab-Tek 154534
BD Comp bead plus BD 560497
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
DAPI Mounting media Vector Laboratories H-1200-10
EDTA (0.5 M) Karolinska University hospital, Huddinge N/A
Falcon 6-well Flat Bottom plates Corning Life Sciences 353046
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Glycerol (70%) Karolinska University hospital, Huddinge N/A
GM-CSF Peprotech 300-03
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody Invitrogen R37121 Secondary antibody for CD64
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody Invitrogen A-11037 Secondary antibody for CD163
HEPES GE Healthcare Life Sciences SH30237.01
IFN-γ Peprotech 300-02
IL-4 Peprotech 200-04
L-Glutamine GE Healthcare Life Sciences SH30034.01
LPS (Escherichia coli O55:B5) Sigma-Aldrich L6529
Lymphoprep Alere Technologies AS 11508545
M-CSF Peprotech 300-25
Middle Brook 7H10 agar plates Karolinska University hospital, Huddinge N/A
Middle Brook 7H9 media Karolinska University hospital, Huddinge N/A
Mouse anti-human CD64 primary antibody Bio-Rad MCA756G Clone: 10.1
Na-pyruvate GE Healthcare Life Sciences SH300239.01
Normal goat serum Jackson ImmunoResearch 005-000-121
Rabbit anti-human CD163 primary antibody GeneTex GTX81526 Polyclonal
RPMI 1640 Life Technologies Corporation SH30096.01
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
TubeSpin bioreactor tubes TPP Techno Plastic Products AG 87050
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Tween-80 Sigma-Aldrich P4780

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  2. Cassetta, L., Cassol, E., Poli, G. Macrophage polarization in health and disease. Scientific World Journal. 11, 2391-2402 (2011).
  3. Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. Journal of Immunology. 164 (12), 6166-6173 (2000).
  4. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000 Prime Reports. 6, 13 (2014).
  5. Atri, C., Guerfali, F. Z., Laouini, D. Role of human macrophage polarization in inflammation during infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2018).
  6. Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
  7. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
  8. Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. Journal of Immunology. 178 (8), 5245-5252 (2007).
  9. Nathan, C. F., Murray, H. W., Wiebe, M. E., Rubin, B. Y. Identification of interferon-gamma as the lymphokine that activates human macrophage oxidative metabolism and antimicrobial activity. Journal of Experimental Medicine. 158 (3), 670-689 (1983).
  10. Leidi, M., et al. M2 macrophages phagocytose rituximab-opsonized leukemic targets more efficiently than m1 cells in vitro. Journal of Immunology. 182 (7), 4415-4422 (2009).
  11. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: a marker of alternative immunologic macrophage activation. Journal of Experimental Medicine. 176 (1), 287-292 (1992).
  12. Italiani, P., Boraschi, D. From Monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Frontiers in Immunology. 5, 514 (2014).
  13. Verreck, F. A., et al. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (13), 4560-4565 (2004).
  14. Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 88 (1), 159-168 (2010).
  15. Refai, A., Gritli, S., Barbouche, M. R., Essafi, M. Mycobacterium tuberculosis virulent factor ESAT-6 drives macrophage differentiation toward the pro-inflammatory M1 phenotype and subsequently switches it to the anti-inflammatory M2 phenotype. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 327 (2018).
  16. Kahnert, A., et al. Alternative activation deprives macrophages of a coordinated defense program to Mycobacterium tuberculosis. European Journal of Immunology. 36 (3), 631-647 (2006).
  17. Marino, S., et al. Macrophage polarization drives granuloma outcome during Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 83 (1), 324-338 (2015).
  18. Erbel, C., et al. An in vitro model to study heterogeneity of human macrophage differentiation and polarization. Journal of Visualized Experiments. (76), e50332 (2013).
  19. Lee, C. Z. W., Kozaki, T., Ginhoux, F. Publisher Correction: Studying tissue macrophages in vitro: are iPSC-derived cells the answer. Nature Reviews Immunology. 18 (11), 726 (2018).
  20. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (76), e50323 (2013).
  21. Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
  22. McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  23. Njoroge, J. M., et al. Characterization of viable autofluorescent macrophages among cultured peripheral blood mononuclear cells. Cytometry. 44 (1), 38-44 (2001).
  24. Li, F., et al. Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).
  25. Rao Muvva, J., Parasa, V. R., Lerm, M., Svensson, M., Brighenti, S. Polarization of human monocyte-derived cells with vitamin D promotes control of Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Immunology. 10, 3157 (2019).
  26. Tarique, A. A., et al. functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
  27. Hristodorov, D., et al. Targeting CD64 mediates elimination of M1 but not M2 macrophages in vitro and in cutaneous inflammation in mice and patient biopsies. MAbs. 7 (5), 853-862 (2015).
  28. Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
  29. Xu, Z. J., et al. The M2 macrophage marker CD206: a novel prognostic indicator for acute myeloid leukemia. Oncoimmunology. 9 (1), 1683347 (2020).
  30. Liu, Q., et al. Differential expression and predictive value of monocyte scavenger receptor CD163 in populations with different tuberculosis infection statuses. BMC Infectious Diseases. 19 (1), 1006 (2019).
  31. Sugaya, M., et al. Association of the numbers of CD163(+) cells in lesional skin and serum levels of soluble CD163 with disease progression of cutaneous T cell lymphoma. Journal of Dermatological Science. 68 (1), 45-51 (2012).
  32. Nawaz, A., et al. CD206(+) M2-like macrophages regulate systemic glucose metabolism by inhibiting proliferation of adipocyte progenitors. Nature Communications. 8 (1), 286 (2017).
  33. Liu, B., Zhang, M., Zhao, J., Zheng, M., Yang, H. Imbalance of M1/M2 macrophages is linked to severity level of knee osteoarthritis. Experimental and Therapeutic Medicine. 16 (6), 5009-5014 (2018).
  34. Lee, C., et al. M1 macrophage recruitment correlates with worse outcome in SHH Medulloblastomas. BMC Cancer. 18 (1), 535 (2018).
  35. Rekha, R. S., et al. Phenylbutyrate induces LL-37-dependent autophagy and intracellular killing of Mycobacterium tuberculosis in human macrophages. Autophagy. 11 (9), 1688-1699 (2015).
  36. Mattila, J. T., et al. Microenvironments in tuberculous granulomas are delineated by distinct populations of macrophage subsets and expression of nitric oxide synthase and arginase isoforms. Journal of Immunology. 191 (2), 773-784 (2013).
  37. Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection. Journal of Visualized Experiments. (104), e53084 (2015).
  38. Brighenti, S., Joosten, S. A. Friends and foes of tuberculosis: modulation of protective immunity. Journal of Internal Medicine. , 12778 (2018).
  39. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Good cell, bad cell: flow cytometry reveals T-cell subsets important in HIV disease. Cytometry Part A. 77 (7), 614-622 (2010).
  40. Becht, E., et al. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP. Nature Biotechnology. 37, 38-44 (2019).

Tags

Denne måned i JoVE makrofag human polarisering M1/M2 Mycobacterium tuberkulose infektion immunrespons flow cytometry

Erratum

Formal Correction: Erratum: Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection
Posted by JoVE Editors on 10/14/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. Author and affiliation information was updated.

The author and affiliation information was updated from:

Akhirunnesa Mily1, Sadaf Kalsum1, Marco Giulio Loreti1, Rokeya Sultana Rekha2, Jagadeeswara Rao Muvva1, Magda Lourda1,3, Susanna Brighenti1
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet 
2Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet 
3Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

to:

Akhirunnesa Mily1,2, Sadaf Kalsum1, Marco Giulio Loreti1, Rokeya Sultana Rekha3, Jagadeeswara Rao Muvva1, Magda Lourda1,4, Susanna Brighenti1
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet 
2Infectious Diseases Division, International Centre for Diarrhoeal Disease Research, Bangladesh
3Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet 
4Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

Polarisering af M1 og M2 Human Monocyte-afledte celler og analyse med Flow Cytometry på <em>Mycobacterium tuberkulose</em> Infektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mily, A., Kalsum, S., Loreti, M. G., … More

Mily, A., Kalsum, S., Loreti, M. G., Rekha, R. S., Muvva, J. R., Lourda, M., Brighenti, S. Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. J. Vis. Exp. (163), e61807, doi:10.3791/61807 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter