Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Polarisering av M1 og M2 Human Monocyte-Avledede celler og analyse med Flow Cytometry på Mycobacterium tuberkulose infeksjon

Published: September 18, 2020 doi: 10.3791/61807
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1, 1,4, 1
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet, 2Infectious Diseases Division, International Centre for Diarrhoeal Disease Research, Bangladesh, 3Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet, 4Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokollen gir en metode for å studere Mycobacterium tuberkuloseinfeksjon i humane M1- eller M2-polariserte makrofager basert på differensiering av perifere blod-monocytter til makrofaglignende celler som er infisert med den GFP-merkede virulente stammen H37Rv, og analysert med strømningscytometri ved hjelp av et 10-fargers panel inkludert uttrykk for utvalgte M1 / M2-markører.

Abstract

Menneskelige makrofager er primære vertsceller av intracellulær Mycobacterium tuberkulose (Mtb) infeksjon og har dermed en sentral rolle i immunkontroll av tuberkulose (TB). Vi har etablert en eksperimentell protokoll for å følge immunpolarisering av myeloid-avledede celler i M1 (klassisk aktivert) eller M2 (alternativt aktivert) makrofaglignende celler gjennom vurdering med et 10-fargers strømningscytometripanel som tillater visualisering og dyp karakterisering av grønn-fluorescerende protein (GFP) merket Mtb i forskjellige makrofager. Monocytter hentet fra friske blodgivere ble polarisert til M1- eller M2-celler ved hjelp av differensiering med granulocytt makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) eller makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) etterfulgt av polarisering med henholdsvis IFN-γ og lipopolysakkarid (LPS) eller IL-4. Fullt polariserte M1- og M2-celler ble smittet med Mtb-GFP i 4 timer før frittliggende Mtb-infiserte makrofager ble farget med strømningscytometri ved 4- eller 24-timers postinfeksjon. Prøveanskaffelse ble utført med flowcytometri og dataene ble analysert ved hjelp av en programvare for flytcytometrianalyse. Manuell gating samt dimensjonalitetsreduksjon med Uniform Manifold Tilnærming og projeksjon (UMAP) og fenografianalyse ble utført. Denne protokollen resulterte i effektiv M1/M2-polarisering preget av forhøyede nivåer av CD64-, CD86-, TLR2-, HLA-DR- og CCR7 på uinfiserte M1-celler, mens uinfiserte M2-celler viste en sterk oppregulering av M2-fenotypemarkørene CD163, CD200R, CD206 og CD80. M1-polariserte celler inneholdt vanligvis færre bakterier sammenlignet med M2-polariserte celler. Flere M1/M2-markører ble nedregulert etter Mtb-infeksjon, noe som tyder på at Mtb kan modulere makrofagpolarisering. I tillegg ble 24 forskjellige celleklynger av forskjellige størrelser funnet å være unikt fordelt mellom M1 og M2 uinfiserte og Mtb-infiserte celler ved 24-timers etterinfeksjon. Denne M1/M2 strømningscytometriprotokollen kan brukes som ryggrad i Mtb-makrofagforskning og vedtas for spesielle behov på ulike forskningsområder.

Introduction

Makrofager er immunceller som bidrar betydelig til regulering av vev homeostase, betennelse og sykdom patologier. Å være en viktig komponent i medfødt immunitet, uttrykker monocytt-makrofaglinjen av celler heterogene fenotyper som svar på endrede miljøsignaler, som gjenspeiler deres plastisitet og tilpasning til forskjellige anatomiske og immunologiske steder1. Avhengig av vekstfaktorene, cytokiner og andre mediatorer tilstede i mikromiljøet, har makrofager blitt kategorisert i to store reversible populasjoner, hver med en annen rolle i bakteriell kontroll og clearance2: de proinflammatoriske, klassisk aktiverte M1-polariserte makrofagene og de antiinflammatoriske, alternativt aktiverte M2-polariserte makrofagene som opprinnelig ble navngitt for å etterligne T-hjelper (Th) celle nomenklatur3. Denne grupperingen av immunpolariserte makrofager betraktes ofte som forenklet, da makrofagaktivering og differensiering ikke er lineær, men mer nøyaktig illustrert som et kontinuum der hver befolkning har forskjellige egenskaper og funksjonelle roller i utfallet av sykdomsutvikling og progresjon4,5,6,7. Likevel er det mange eksperimentelle fordeler med M1 / M2 makrofagmodellen som kan brukes på flere forskjellige forskningsfelt.

Mycobacterium tuberkulose (Mtb) er årsaksmiddelet til tuberkulose (TB) og har blitt estimert til å infisere en person hvert sekund og regnes som det mest dødelige enkelt smittsomme middelet i verden (Global TB rapport 2019). Siden luftveiene er hovedveien for Mtb-infeksjon, er alveolar makrofager de foretrukne vertscellene som skal smittes med Mtb og representerer både de primære barrierene og det smittsomme reservoaret for Mtb i lungene. Makrofag polarisering som svar på ulike stimuli har blitt grundig studert gjennom årene7 og i det meste av det publiserte arbeidet, M1 polarisering av monocyttkulturer in vitro er indusert av Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) sammen med IFN-γ og LPS8,9, mens M2 polarisering er indusert med Macrophage Colony Stimulating Factor (M-CSF) og IL-410,11. M1 makrofager er potente effektorceller som formidler antimikrobielle responser mot intracellulære patogener og har en viktig rolle i antitumorimmunitet12. M2 makrofager har derimot en antiinflammatorisk funksjon, høy fagocytisk kapasitet og er hovedsakelig involvert i sårheling og vevsreparasjon samt i parasittinfeksjoner12. Følgelig blir M1 makrofager sett på som mer effektive i intracellulær kontroll av Mtb sammenlignet med M2 makrofager13. Imidlertid har Mtb-bakterier også potensial til å modulere makrofagpolarisering for å undergrave medfødt immunitet14,15,16,17.

Selv om det er vanlig å generere makrofager fra differensiering av monocytter hentet fra perifert blod18, kan makrofager også genereres fra induserte pluripotente stamceller (iPSCer)19 eller fra benmargsavledede makrofager fra mus20,21. Dette er gjennomførbare teknikker for å studere primære makrofagceller hentet fra monocytt/ makrofag forfedre som vil spre seg og skille seg ut i en homogen populasjon av modne makrofaglignende celler. Imidlertid gir disse protokollene sjelden fordypet kunnskap om fenotypen og funksjonen til cellene som er oppnådd, og tar heller ikke hensyn til den naturlige heterogeniteten som observeres blant makrofager oppnådd in vivo. Siden Mtb er et strengt menneskelig patogen, er det også en fordel å studere Mtb i humaniserte modellsystemer. Flow cytometri er en kraftig teknologi som gir muligheten til å vurdere flere fenotypiske og funksjonelle egenskaper til enkeltceller i suspensjon22, noe som kan være ganske utfordrende med tilhengerceller som makrofager som også er kjent for å være autofluorescent23,24. I tillegg til kjemisk løsrivelse av fast tilhenger makrofager, kan Mtb-infeksjon utgjøre en betydelig stressfaktor for cellene som tilfører et annet nivå av kompleksitet i strømningscytometriske analyser av Mtb-infiserte makrofager.

I denne eksperimentelle protokollen har vi brukt en tidligere etablert human makrofaginfeksjonsmodell basert på immunpolarisering av primære perifere-blod-monocytt-avledede celler som er infisert med det virulente laboratoriet Mtb-stammen H37Rv, og analysert med strømningscytometri ved hjelp av et 10-fargers panel inkludert uttrykk for utvalgte M1- og M2-markører25. Denne protokollen gir en effektiv og reproduserbar metode for å studere respons på Mtb-infeksjon i M1 eller M2 polariserte monocyttavledede makrofager. I tillegg tillater bruk av strømningscytometri på tilhenger Mtb-infiserte makrofager oss å studere en rekke overflatemarkører forbundet med konvensjonelle M1- og M2-makrofager og deres langsgående respons på Mtb-infeksjon. Viktigst, denne protokollen kan lett vedtas for undersøkelser av infeksjoner med andre patogener, i anti-tumor studier eller i studier av inflammatoriske forhold, for narkotika screening etc. og kan også utnyttes til vurdering av M1 / M2 makrofag polarisering i menneskelige kliniske prøver.

Protocol

Humant perifert blod fra friske anonyme blodgivere ble hentet fra blodbanken ved Karolinska Universitetssykehus, Huddinge, Sverige (etisk godkjenning Dnr 2010/603-31/4). Alle eksperimentelle trinn som involverte levende virulente Mtb ble utført på Biosafety Level-3 (BSL-3) laboratoriet ved Public Health Agency of Sweden (FOHM), Solna, Sverige.

1. Utarbeidelse av medier, buffere og bakteriekulturer

MERK: Detaljer om alle reagenser og forbruksvarer er gitt i materialtabellen.

  1. RPMI komplett medium: Supplement RPMI 1640 med 1 mM natriumpyrominitt, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES og 10% varmeinaktivert foster bovint serum (FBS). Unngå antibiotika i cellekulturmediet når du arbeider med Mtb-infeksjon.
  2. Serumfritt RPMI-medium: Supplement RPMI 1640 med 1 mM natriumpyminitt, 2 mM L-glutamin og 10 mM HEPES.
  3. Vaskebuffer: Klargjør fosfatbuffer saltvann (PBS) som inneholder 0,05% (v/v) Tween-80.
  4. FACS-buffer: Klargjør PBS som inneholder 2,5 % (v/v) FBS og 0,5 mM EDTA.
  5. Fikseringsbuffer: Klargjør PBS som inneholder 4 % formaldehyd til PBS. Sørg for at den er nytilberedt før bruk, for eksempel blandet fra en lagerløsning på 37% formaldehyd.
  6. Permeabiliseringsbuffer: Tilsett 0,1% natriumsitrat og 0,1% Triton X-100 til deionisert vann.
  7. Vaskebuffer (for immunfluorescens): Klargjør PBS som inneholder 0,1% BSA og 0,1% Tween-20.
  8. Blokkeringsbuffer: Klargjør PBS som inneholder 0,1 % BSA og 10 % normalt geiteserum (NGS) til PBS.
  9. Fargebuffer (for immunfluorescens): Klargjør PBS som inneholder 0,1 % BSA til PBS.
  10. TB komplett medium: Supplement Middle Brook 7H9 buljong med 0,05% (v / v) Tween-80, 0,5% (v / v) glyserol, kanamycin (20 μg / ml), 10% (v / v) Middlebrook oljesyre, albumin, dextrose og catalase berikelse (Middlebrook OADC Enrichment).
  11. Bakteriekulturer: Bruk standard virulente Mtb laboratoriestamme, H37Rv, som vanligvis uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP), for infeksjon av monocytt-avledede celler. Denne Mtb-stammen bærer en pFPV2 plasmid som inneholder en genkoding GFP, samt et gen for kanamycinresistens. Antibiotikaresistensen muliggjør kontinuerlig utvelgelse av plasmid-uttrykkende bakterier i kulturer som inneholder kanamycin. Oppbevar bakterier i TB komplett medium og 70% glyserol (1:1 fortynning) ved -80 °C.

2. Perifer blodmonykleær celleisolasjon fra buffy strøk

MERK: Utfør alt arbeid med humant blod (potensielt smittsomt) inne i et biosikkerhetsskap i klasse II. Inaktiver gjenværende blodprodukter med desinfeksjonsmidler i 15 minutter før de kastes. Blod ble hentet fra friske frivillige i dette tilfellet. Denne in vitro-makrofagdifferensieringsprotokollen ble satt opp til å omfatte 10 x 106 isolerte PBMCer / donor / brønn. Fra hver donor inneholder en buffy frakk ca 50 ml konsentrert leukocyttfjæring som stammer fra fullblod, som normalt gir 500-800 x 106 PBMCer hvorav omtrent 10% eller 50-80 x 106 monocytter kan hentes fra.

  1. Last 15 ml buffy frakkblod på toppen av 15 ml tetthet gradient medium tilberedt i 50 ml rør. Legg blod langsomt over toppen av tetthetsgraderingslaget ved å lene pipettespissen til veggen av røret.
  2. Snurr rørene på 600 x g i 25 min ved romtemperatur (RT) med 0 akselerasjon og 0 retardasjon.
    MERK: Lukk lokkene forsiktig før sentrifugering, og kontroller alltid rørholderne for mulig søl over etter sentrifugering.
  3. Fjern det øverste plasmalaget med en steril Pasteur-pipette og samle deretter det mononukleære cellelaget forsiktig inn i et nytt 50 ml rør ved hjelp av en steril Pasteur pipette. Tilsett serumfritt RPMI-medium i PBMC-pelletsen for å oppnå et endelig volum på 50 ml. Bland forsiktig ved å snu røret et par ganger før sentrifugering ved 500 x g i 5 min ved RT.
  4. Kast supernatanten forsiktig og bruk cellepelleten på nytt ved å vippe bunnen av røret innenfor fingrene.
  5. For å fjerne tetthetsgradienten middels forurensning fra PBMCene, vask cellene 2-3 ganger med serumfri RPMI for å oppnå et endelig volum på 50 ml. Sentrifuge ved 500 x g i 5 min ved RT. Vask til celle supernatanten blir gjennomsiktig.
  6. Kast supernatanten og resuspend cellene i 20 ml serumfritt RPMI-medium.
  7. Tell cellene ved hjelp av trypan blå farging, manuelt ved hjelp av et hemocytometer eller ved hjelp av en automatisert celleteller. Fortynn cellefjæringen i trypanblå i 1:2 eller 1:10 fortynning ved å blande celle-trypan blå prøve i en 96 brønnplate f.eks. 50 μL + 50 μL (for hemocytometertelling) eller 10 μL + 10 μL (for automatisert celletelling) og telle cellene for å oppnå antall levende celler / ml.
    FORSIKTIG: Trypan blå er giftig og må kastes i et separat kjemisk avfall.

3. Differensiering og polarisering av monocytt-avledede celler

MERK: For differensiering og polarisering av monocyttavledede celler ble en protokoll som vi tidligere etablerte for M0-, M1-lignende og M2-lignende celler, samt fullstendigE M1- og M2-polariserte celler fulgt25. For enkelhets skyld er bare fullstendig polariserte M1- og M2-makrofager beskrevet her.

  1. Bruk plasttilslutning for isolering av monocytter. Kort sagt, frø nyisolerte PBMCer i en 6-brønns kulturplate med en passende konsentrasjon, for eksempel 10 x 106 PBMCer / brønn i 2 ml serumfritt RPMI-medium og inkuberer ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. Etter 2–3 timer fjerner du de ikke-tilhengercellene med en pipette og vasker brønnene 3 ganger med 1 ml serumfritt medium. De vedlagte cellene er monocytter og består av rundt 10% av de totale PBMCene som legges til brønnen, det vil si 106 monocytter hentet fra 10 x 106 PBMCer lagt til per brønn.
  3. For makrofagdifferensiering, lag en arbeidsløsning som inneholder henholdsvis 50 ng/ml GM-CSF eller M-CSF for M1 og M2 makrofagpolarisering, tilsatt i 2 ml RPMI komplett medium per brønn. Kultur cellene i en 5% CO2 inkubator i 37 °C i 3 dager.
  4. På dag 3 fjerner du 1 ml av cellekulturmediet forsiktig fra det øverste laget av hver brønn og supplerer cellekulturene med 1 ml fersk RPMI komplett medium som inneholder den doble konsentrasjonen av M-CSF eller GM-CSF for å oppnå 50 ng / ml sluttkonsentrasjon i brønnene. Tilsett vekstfaktorene i en ferdig arbeidsløsning på 100 ng/ml/brønn.
  5. På dag 6 legger du til forskjellige stimuli for de siste 18-20 h celledifferensiering for å oppnå fullt polarisert og moden M1 (interferon-γ; IFN-γ og lipopolysakkarid; LPS (E. coli O55:B5)) eller M2 (interleukin 4; IL-4) makrofager. For M1 polarisering, forberede IFN-γ og LPS i RPMI komplett medium og tilsett 50 μL per brønn for å oppnå en endelig konsentrasjon på 50 ng / ml IFN-γ og 10 ng / ml LPS i cellekulturene. For M2 polarisering, forberede IL-4 i RPMI komplett medium og tilsett 50 μL per brønn for å oppnå en endelig konsentrasjon på 20 ng / ml i cellekulturene.
  6. For differensiering av M0 polariserte makrofager, stimulere cellene med bare M-CSF, uten ytterligere cytokiner (gir en M2-lignende fenotype)25.
  7. Kontroller morfologien til monocytt-avledede cellekulturer regelmessig med lysmikroskopi for å sikre at mindre monocytter differensieres i større makrofaglignende celler. Overvåk også potensielle morfologiske forskjeller mellom polariseringen av M1 og M2, det vil si langstrakte og strakte M1-celler sammenlignet med M2-celler med en mer avrundet form25.
  8. På dag 7, overfør platene med monocytt-avledede celler til et BSL-3-laboratorium for infeksjon med virulente Mtb.

4. Utarbeidelse av Mtb-kulturer

MERK: Følgende trinn må utføres i en BSL-3-innretning. For alt arbeid med virulente Mtb, bruk verneklær, åndedrettsvern og etanolbestandige hansker.

  1. Tine et hetteglass med 1 ml bakteriell aliquot og bland med 9 ml TB komplett medium (1:10 fortynning) i et 50 ml filtrert hetterør. Kultur suspensjonen i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
  2. Etter 24 timer, spinn bakteriell suspensjon på 2300 x g i 10 minutter og hell forsiktig av mediet. Resuspend bakteriell pellet med 15-20 ml fersk TB komplett medium i en ny 50 ml filtrert cap kultur tube og inkubere ved 37 °C og 5% CO2. Bland de avgjorte bakteriene i røret hver 2-3 dager for å opprettholde en homogen næringsforsyning for alle bakterieceller.
  3. Etter 7–10 dager blander du bakteriell suspensjon riktig ved å pipettere opp og ned før du overfører til et 50 ml skruehettrør.
  4. Tilsett 35-40 ml steril vaskebuffer til 50 ml-røret og spinn bakteriell suspensjon ved 2300 x g i 10 minutter. Gjenta vasketrinnene én gang. Resuspend bakteriell pellet i 1 ml serumfritt RPMI medium ved pipettering med en mikropipette.
  5. Tilsett ytterligere 9 ml serumfritt RPMI-medium og soniker bakteriell suspensjon inne i et klasse II biosikkerhetsskap i 5 min ved 37 °C, for å forstyrre bakteriell klumper. Dypp røret gjentatte ganger (3-4 ganger) i vannbadets soniker for å sikre maksimal forstyrrelse av bakterielle klumper. Mål den optiske tettheten (OD) på 1 ml bakteriell suspensjon ved 600 nm bølgelengde ved hjelp av et spektrofotometer plassert inne i biosikkerhetsskapet. Bruk serumfritt RPMI-medium for å stille inn referansen.
  6. Beregn antall kolonidannende enheter (CFU) ved hjelp av formelen: (OD+0,155)/0,161 = Y, og Y x 107= Y x 106 CFU/ml, for eksempel gir en OD-verdi 0,32 en bakteriell konsentrasjon på (0,32 + 0,155)/0,161 = 2,95, 2,95 x 107= 29,5 x10 6 CFU/mL.

5. Mtb-infeksjon av monocyttavledede celler

MERK: Følgende trinn må utføres i en BSL-3-innretning.

  1. Resuspend bakteriell pellet i serumfritt RPMI medium i et nytt sterilt 50 ml rør og juster den endelige bakteriekonsentrasjonen til ca. 5 x 106 CFU / ml.
  2. Fjern cellekulturmediet fra de 6 brønnplatene som inneholder monocyttavledede celler. Tilsett 1 ml serumfritt RPMI-medium til hver brønn. Tilsett 1 ml bakteriell suspensjon per brønn for å oppnå et mangfold av infeksjon (MOI) 5:1, det vil si 5 x 106 CFU per 106 makrofager i 2 ml/brønn og inkuber platene i 4 timer i 37 °C og 5 % CO2.
  3. Etter infeksjon, vask cellene 3 ganger med 1 ml steril vaskebuffer for å fjerne ekstracellulære bakterier. Vipp platen og fjern forsiktig hele vaskebufferen fra hjørnene. Resuspend de Mtb-infiserte monocytt-avledede cellene i 2 ml RPMI komplett medium uten antibiotika og fortsett å strømme cytometrifarging eller inkubere cellene i ytterligere 24 timer (eller andre tidspunkter) før strømningscytometri.

6. Strømningscytometrifarging av Mtb-infiserte monocyttavledede celler

MERK: Følgende trinn må utføres i en BSL-3-innretning. Strømningscytometrifargingen kunne utføres i en 96-brønnsplate i stedet for rør.

  1. Løsne de Mtb-infiserte cellene (og uinfiserte kontroller) fra brønnene i de 6 brønnplatene ved inkubasjon med 1 ml FACS-buffer per brønn i minst 30 minutter ved 37 °C og 5 % CO2.
  2. Rør forsiktig opp og ned et par ganger for å sikre at cellene løsnes. Hvis det er mulig, bekreft celleavløsning med mikroskopi. Overfør cellefjæringen fra hver brønn til et skruekappet mikrosenterrør og snurr rørene på 200 x g i 5 minutter. Kast supernatanten forsiktig ved pipettering.
  3. Vask cellepellet i hvert rør to ganger med FACS buffer og spinn cellene på 200 x g i 5 min.
  4. Beflekk cellene (ca. 0,5 x 106 til 1 x 106 celler/rør) med ca. 50 μL cocktail av fluorokromkonjugede antimenneskelige antistoffer, inkludert TLR2 (AF647), CD206 (APC-Cy7), CD163 (BV605), CD80 (BV650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (PE), CD64 (PE-Dazzle 594), HLA-DR (PE-Cy5) (Tabell 1) i kombinasjon med levedyktighetsfarge Zombie-UV i 30 minutter ved 4 °C (kjøleskap) i mørket.
  5. Vask de fargede cellene to ganger med 400 μL FACS-buffer og spinn cellene på 200 x g i 5 minutter.
  6. Fest de fargede cellene med 200 μL fikseringsbuffer (nytilberedt) i 30 min ved RT i mørket for å sikre fullstendig inaktivering av mykobakterier.
  7. Vask cellene to ganger med 400 μL FACS-buffer og spinn ved 200 x g i 5 minutter for å fjerne overflødig løsningsbuffer.
  8. Resuspend de faste cellene i 400 μL AV FACS buffer og overføre prøvene til nye 1 ml mikrocentrifuge rør før du tar dem ut av BSL-3 laboratoriet for strømning cytometri i BSL-2. Oppbevar de fargede cellene i +4 °C til prøveanskaffelse.
    MERK: Spray rørene med 70 % etanol før du tar dem ut av BSL-3-laboratoriet. Formaldehyd er giftig (kreftfremkallende) og må håndteres i et biosikkerhetsskap i klasse II. Kast formaldehydavfall i et separat kjemisk avfall.

7. Flow cytometrisk datainnsamling og analyse av Mtb-infiserte monocytt-avledede celler

MERK: Trinn 7.1–7.2 skal utføres i forkant av strømningscytometrifargingen som er beskrevet ovenfor. For å unngå problemer med cellekumping og dissosiasjon av tandemfarger etter cellefiksering, utføres prøveanskaffelse av både Mtb-infiserte og uinfiserte celler innen 4-10 timer etter primær antistofffarging.

  1. Før strømningscytometrifarging beskrevet ovenfor, kompensere fluorescerende signal for hvert fluorokromkonjugert antistoff som er oppført i fargepanelet (tabell 1) ved hjelp av kompensasjonsperler (både positive og negative).
  2. Titrat antistofffortynning for farging av menneskelige makrofager for å oppnå det optimale signalet for hver fluorokrom.
  3. Bruk unstained celler for å bestemme nivået av bakgrunnsfluorescens som er nødvendig for å sette port for den negative cellepopulasjonen slik at de fargede cellene kan visualiseres (makrofager er svært auto fluorescerende).
  4. Skaff deg minst 50 000 celler/prøve i strømningscytometeret ved hjelp av den anbefalte programvaren for datainnsamling.
  5. Eksporter oppkjøpsfilene fra flow cytometeret i flow cytometry standard (FCS) format 3.1.
  6. Analyser FCS-filene i flyt cytometrianalyseprogramvare.
  7. Gate makrofager i henhold til deres fremover- og sidespredning (FSC og SSC) egenskaper og utelukke døde celler ved levende / død celle gating ved hjelp av Zombie-UV levedyktighet fargestoff.
  8. Visualiser H37Rv-GFP-infiserte makrofager i FITC-kanalen.
  9. Identifisere frekvensen av positivt fargede celler og geometrisk gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) for alle markører (Tabell 1).

8. Immunfluorescence farging av Mtb-infiserte monocytt-avledede celler

MERK: Mtb-infeksjon må utføres i et BSL-3-anlegg.

  1. For immunstaining, frø 2 x 105 PBMCs / brønn i 500 μL serumfritt RPMI medium i 8 brønnkammer lysbilder for å oppnå 2 x 104 monocytter / brønn. Etter differensiering og M1/M2 polarisering av monocytter, fortsett med Mtb-infeksjon som beskrevet ovenfor. Fest lysbildene etter 24 timers Mtb-infeksjon med fikseringsbuffer i 30 minutter. Faste skred lagres i fryseren ved -20 °C inntil videre analyser.
  2. Vask de monocyttavledede cellene to ganger med 200 μL PBS i 10 minutter hver.
  3. Permeabiliser cellene med 200 μL permeabiliseringsbuffer i 5 minutter ved RT.
  4. Vask cellene 3 ganger med 200 μL PBS i 5 min hver.
  5. Vask cellene to ganger med 200 μL vaskebuffer i 5 min hver.
  6. Blokker ikke-spesifikk binding med 200 μL blokkeringsbuffer i 30 minutter ved RT.
  7. Fortynn de primære antistoffene 1:100 i fargebuffer og inkuber M1-cellene med et ukonjugert CD64-antistoff (klone: 10,1) og M2-cellene med et ukonjugert CD163 antistoff (polyklonal) i 2 timer ved RT.
  8. Deretter vasker du cellene 3 ganger med 200 μL vaskebuffer i 10 minutter hver.
  9. Fortynn de fluorescerende merkede sekundære antistoffene 1:1000 i fargebuffer og inkuber M1-cellene med en antimus IgG-Alexa Fluor 594 og M2-cellene med en antikanin IgG-Alexa Fluor 594 i 1 time ved RT.
  10. Vask cellene 3 ganger med 200 μL vaskebuffer i 10 min hver.
  11. Fjern kammergitteret og tilsett ~20 μL DAPI-monteringsmedium i hver brønn og legg en 1,5 mm deksleslip på hvert lysbilde.
  12. Forsegle dekslene med et lag neglelakk.
  13. Skaff bilder ved hjelp av et konfokalt mikroskop med lasere som sender ut ved henholdsvis 486 nm for eksitasjon av GFP (grønn kanal), 402 nm for DAPI (blå) og 560 nm for sekundært antistoff (rødt).

Representative Results

En skjematisk illustrasjon av cytokinstimuleringene som brukes til polarisering av monocytt-avledede celler til M0 (M2-lignende celler), M1 (fullt polariserte M1-celler) og M2 (fullt polariserte M2-celler) presenteres i figur 1A, mens representative bilder av M0-, M1- og M2-cellekulturer samt M1-kulturer på dag 0, 3 og 7, vises i figur 1B. Uinferte M0-celler ble brukt til å demonstrere den grunnleggende gatingstrategien (Figur 2A). I utgangspunktet er myeloidcellene (~ 85%) ble inngjerdet i henhold til deres fremre spredningsegenskaper (FSC) og sidespredt (SSC), inkludert de større cellene med høy granularitet og unntatt små rester med en lav SSC og FSC som finnes nederst til venstre i prikkplottet. I det andre plottet ble doublets (dvs. celleklumper) definert som å ha et økt område, men lignende høyde sammenlignet med enkeltceller og ble utelukket fra videre analyse. Derfor ble bare celler som var proporsjonale mellom FSC-area og FSC-Height (enkeltceller), inkludert i den skråstilte figurporten. Deretter ble Zombie-UV levedyktighetsfargen som flekker de cytoplasmatiske proteinene inne i de døde cellene, brukt til å utelukke de døde cellene fra etterfølgende analyse. Som forventet var levedyktige uinfiserte M0-celler negative for Mtb-GFP-uttrykk visualisert i FITC-kanalen.

Deretter brukte vi den samme gatingstrategien på uinfiserte så vel som Mtb-infiserte M1- og M2-makrofager etter 4 timer etter infeksjon (Figur 2B, C). To underpopulasjoner ble påvist i FCS/SSC-porten til ikke-uoppdagede M1 polariserte makrofager; en populasjon med en mindre størrelse (FCS) og høyere granularitet (SSC) og den andre populasjonen med større størrelse og lavere granularitet (Figur 2B), mens hovedporten til uinferte M2-celler virket mer homogen (Figur 2C). Både M1 og M2 monocytt-avledede celler viste et vertikalt skifte til høyere granularitet og redusert cellestørrelse ved Mtb-infeksjon, noe som kan gjenspeile økt kompleksitet inne i cellene forårsaket av opptak av intracellulære Mtb-bakterier (Figur 2B,C). Videre viste levedyktighetsflekken en forbedret celledød (17-22%) blant de Mtb-infiserte M1- og M2-cellene ved en MOI på 5, sammenlignet med uinfiserte M0-celler (99 %) (Figur 2A-C) eller ikke-siterte M1- og M2-celler (data vises ikke). Representative data viste at Mtb-GFP-uttrykket (dvs. Mtb-infektivitet) var vesentlig høyere i M2 (77 % GFP-positive celler) sammenlignet med M1-celler (19 % GFP-positive celler) etter 4 timers infeksjon (figur 2B,C). Etter 24 timers infeksjon var Mtb-GFP-uttrykket henholdsvis 43 % og 85 % i M1- og M2-celler, noe som tyder på at M1-cellene hadde en relativt høyere økning i GFP-uttrykket fra 4–24 timer etter Mtb-infeksjon sammenlignet med M2-celler, henholdsvis 126 % versus 10,4 % økning i GFP-uttrykk i M1- og M2-celler fra henholdsvis 4–24 timer.

For å karakterisere effekten av M1/M2-polarisering i uinfiserte monocyttavledede celler ble prikkplott brukt til å identifisere M1-celler som var dobbeltpositive for CD64 og CD86 (CD64+CD86+) og M2-celler som var dobbeltpositive for CD163 og CD200R (CD163+CD200R+; Figur 3A;B). Utvalget av M1/M2 markører ble primært gjort basert på resultatene fra vårt tidligere arbeid25, men også fra andre studier26,27,28,29. Kvadrantene for de fargede cellene ble satt ved hjelp av tilsvarende porter for ikke-inngrodde M1/M2-celler (figur 3A). Ingen av disse markørene uttrykkes utelukkende av M1- eller M2-celler, men andelen positive celler samt intensiteten til overflateuttrykket er forskjellig. Dette var spesielt tydelig fra M1-flekken der rundt 95% av M1-cellene og 79% av M2-cellene var CD64+CD86+, men fargingsintensiteten var vesentlig høyere i M1-delsettet (Figur 3A). Mens 27% av M1-cellene var positive for M2-markøren CD200R, var bare 1% positive for CD163, noe som ga 0,5% CD163+CD200R+ M1 celler sammenlignet med 63% CD163+CD200R+ M2 celler (Figur 3A). Etter 4 timer med Mtb-infeksjon ble det observert en økning i frekvensen av CD200R+ celler i Mtb-GFP-positive M1 polariserte celler (16%), mens CD163-uttrykket ble redusert i M2-celler (Figur 3B). Varmekartet viser en høy intensitet av GFP-uttrykk i CD163+CD200R+ M2-celler, men også i DELSETTET CD64+CD86+ M2 sammenlignet med de tilsvarende M1-celledelsettene (Figur 3B). Totalt sett visualiseres også skiftet i uttrykk for de respektive M1- og M2-markørene i histogrammer i figur 3C. Videre ble Mtb-GFP-bakterier også visualisert i CD64+ M1-celler og i CD163+ M2-celler ved konfokal mikroskopi, som støttet et forbedret intracellulært opptak og / eller vekst av Mtb inne i M2 sammenlignet med M1-celler (Figur 3D).

For å verifisere resultatene av den manuelle gatingen brukte vi dimensjonalitetsreduksjon ved hjelp av Uniform Manifold-tilnærming og projeksjon (UMAP). UMAP-analyse viste at Mtb-infeksjon i 4 timer ikke var tilstrekkelig til å påvirke polariseringen av makrofager, i motsetning til 24 timers infeksjon, noe som resulterte i klart separerte klynger av M1 og M2 uinfiserte og infiserte celler (figur 4A). Uinferte M1-makrofager viste høyere uttrykk for CD64-, CD86-, TLR2-, HLA-DR- og CCR7 sammenlignet med M2-makrofager, mens uinferte M2-celler viste en sterk oppregulering av M2-fenotypemarkørene CD163, CD200R, CD206 og CD80 (Figur 4B, C). I samsvar med den manuelle gatingen forårsaket Mtb-infeksjon etter 24 timer en klar nedregulering av CD163, CD200R og CD206 på M2-celler og oppregulering av CD86 og HLA-DR på M1-celler (Figur 4B, C), som antyder at Mtb kan modulere makrofagpolarisering. Etterfølgende fenografianalyse (Figur 4D-F) identifiserte 24 forskjellige klynger av forskjellige størrelser som var unikt fordelt mellom de uinfiserte og Mtb-infiserte cellene som illustrert i UMAP-grafene (figur 4D), sektordiagrammer (figur 4E) og varmekart (figur 4F). Til sammen viser disse resultatene lovende effektivitet av denne protokollen for å generere fenotypisk og funksjonelt mangfoldige M1 og M2 polariserte celler in vitro som er ytterligere modulert av Mtb-infeksjon.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av in vitro-differensiering og polarisering av humane myeloid-avledede celler. Cellene (A) M0 (M2-lignende), M1 (klassisk aktivert) og M2 (alternativt aktivert) er avbildet. Monocytter hentet fra friske blodgivere ble polarisert med forskjellige cytokiner som beskrevet i protokollen og infisert med GFP-merket Mtb-stamme, H37Rv, i 4 timer før analyse med 10-fargers strømningcytometri. M1-polariserte celler inneholder vanligvis færre bakterier sammenlignet med M2-polariserte celler. (B) Mikroskopiske bilder av fullt polariserte, uinfiserte M0-, M1- og M2-celler i 6-brønnsplatene på dag 7, og representative bilder av M1-celledifferensiering fra monocytter på dag 0, 3 og 7. Forstørrelsen er 20x (øvre panel) og 10x (nedre panel). Legg merke til at M1-cellene er lengre og strukket sammenlignet med de mer avrundede M0- og M2-cellene (øvre panel). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Gating strategi for differensial polariserte myeloid-avledede celler. Representative punkttegninger som viser egenskapene (A) Forward scatter (FSC) og sidesprekt (SSC) for ikke-uoppdagede M0-makroer. FSC-A/FSC-H-plottet viser manuell gating av enkeltceller proporsjonalt for areal og høyde. Den levende celleporten ekskluderte celler som var positive for Zombie-UV (levedyktighetsfarge). Intracellulært Mtb ble påvist av GFP-uttrykk i levende celler observert i FITC-kanalen. (B) Gating av M1 og (C) M2 makrofager som viser FCS / SSC-prikkplott av både i uinfiserte celler og Mtb-infiserte celler 4 timer og 24 timer etter infeksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Effekt av polariseringsprotokollen in vitro M1/M2. Representative punktplott og kvadrant gating som viser delsettfrekvenser av M1- og M2-polariserte celler ved hjelp av CD64 og CD86 (M1) eller CD163 og CD200R (M2) i (A) ubeskyttede og fargede uinfiserte celler og (B) Mtb-infiserte fargede celler 4 t etter infeksjon. Prikkplottene i (B) illustrerer fluorescensintensiteten til GFP-uttrykket (varmekartet) i M1- og M2-polariserte makrofager hentet fra forskjellige underporter. (C) Geometrisk gjennomsnitt av fluorescensintensitet (MFI) er vist i histogrammer fra en representativ donor etter 4 timer Mtb-infeksjon. MFI-verdiene i uinfiserte M1-celler (lyseblå) og M2-celler (lys lilla) presenteres i det øvre panelet, og Mtb-infiserte M1-celler (dypblå) og M2-celler (dyp lilla) presenteres i det nedre panelet. (D) Representative konfiskeringsbilder av uinfiserte og Mtb-infiserte M1- og M2-polariserte celler vises. M1- og M2-celler ble farget for henholdsvis CD64- og CD163-uttrykk ved hjelp av immunfluorescens. Positiv overflatefarging er vist i rødt og GFP-uttrykkende intracellulære bakterier er vist i grønt. DAPI-farget kjerner vises i blå farge. Skala – 10 μm. Forstørrelsen av bilder til høyre er 350x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Dimensjonalitetsreduksjon med Uniform Manifold Tilnærming og projeksjon (UMAP) og fenografianalyse av uinfiserte og Mtb-infiserte M1- og M2-celler. (A) UMAP, opprettet ved å sette sammen 11000 levende celler fra uinfiserte og Mtb-infiserte M1- og M2-cellekulturer fra to representative blodgivere, 4 t (venstre grafer) eller 24 timer (høyre grafer) etter infeksjon. Varmekartet for GFP-uttrykk (nedre panel) indikerer uinfiserte og Mtb-infiserte celler. (B-C) MFI av markører uttrykt i uinfiserte og Mtb-infiserte M1- og M2-celler 24 timer etter infeksjon, vist som (B) varmekart eller (C) barplott. (D-F) Fenografianalyse identifiserte 24 klynger som er differensialt fordelt mellom de uinfiserte og Mtb-infiserte M1- og M2-kulturene. Klynger 8-13 er unike i uinfiserte M1-celler, klynger 1-7 er unike i M1-celler som er infisert av M1, klynger 20–24 er unike i uinfiserte M2-celler og klynger 14–19 er unike i M2-celler som er infisert av MB. MFI for hver markør i hver fenografiklynge er vist i (F). Dataene presenteres som uinfiserte M1-celler (lyseblå) og M2-celler (lys lilla) og Mtb-infiserte M1- (dypblå) og M2-celler (dyp lilla). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Liste over antistoffer som brukes til strømningscytometri.

Laser Filter Fluorokrom Fenotype Funksjonen Klone Katalognr. Selskapet
639 670/30 AF647 TLR2 Patogengjenkjenningsreseptor TL2.1 309714 BioLegend
639 780/60 APC-Cy7 CD206 Mannose reseptor 15-2 321120 BioLegend
405 610/20 BV605 CD163 Scavenger reseptor GHI/61 333616 BioLegend
405 670/30 BV650 CD80 Kostimulatorisk molekyl 2D10 305227 BioLegend
405 710/50 BV711 CCR7 Kjemokin reseptor G043H7 353228 BioLegend
405 780/60 BV785 CD86 Kostimulatorisk molekyl IT2.2 305442 BioLegend
488 530/30 GFP Mtb Intracellulære bakterier
561 586/15 Pe CD200R Hemmende reseptor OKSE-108 329306 BioLegend
561 620/14 PE/DAZZLE 594 CD64 Fc gamma reseptor-I av IgG 10.1 305032 BioLegend
561 661/20 PE-Cy5 (PC5) HLA-DR MHC klasse II molekyl L243 307608 BioLegend
355 450/50 BUV395 Levedyktighet fargestoff Live/dead-celleindikator Zombie UV 423108 Invitrogen

Discussion

Denne eksperimentelle protokollen beskriver effektiv polarisering av myeloid-avledede celler i M1- eller M2-fenotyper, inkludert vurdering med et 10-fargers strømningscytometripanel som tillater visualisering og dypkarakterisering av GFP-merket Mtb i forskjellige makrofager. Selv om TB er en gammel menneskelig sykdom, er det for tiden ingen gylden standardmodell for å studere Mtb-makrofaginteraksjoner, og flerfarget strømningscytometri av makrofager kan være komplisert sammenlignet med analyser av lymfocyttresponser. Få tilgjengelige protokoller for in vitro differensiering av menneskelige monocytter til makrofager presenterer dyp kunnskap om hvilken type makrofager som genereres. En grunnleggende protokoll for makrofagpolarisering og strømningscytometrisk vurdering av makrofagaktivering ved hjelp av et solidt panel av markører kan sannsynligvis lette slik karakterisering og gi muligheter til å utforske flere funksjoner i polariserte celler behandlet under forskjellige forhold. Dette inkluderer analyser av celler dyrket in vitro samt analyser av celler in vivo i kliniske prøver, det vil si både PBMC og encellede suspensjoner fra kroppsvæsker (dvs. bronkoalveolar lavage) eller homogenisert vev. Følgelig kan differensierings- og/eller aktiveringsstatus for monocytter og makrofager oppnådd fra pasienter være relatert til sykdomsutfall. Utvidelse av CD16+CD163+ monocytter i perifert blod er rapportert hos lunge TB-pasienter30. En økt frekvens av CD163+ celler ble også påvist i betent hud av atopisk dermatitt pasienter31. På samme måte har CD206+ M2-lignende makrofager vist seg å hemme spredning og differensiering av celler i mikromiljøet av adipocyttvev32 og å bli beriket i benmargsprøver fra pasienter med akutt myeloid leukemi (AML)29. Et forhøyet forhold mellom CD64 (M1) og CD163 (M2) celler i fullblod av pasienter med slitasjegikt ble funnet å være forbundet med sykdomalvorlighetsgrad 33. En annen studie brukte CD86 (M1) og CD163 (M2) for å demonstrere at høyt M1-uttrykk i vev korrelert med verre utfall i en undergruppe av ondartede hjernesvulster34.

Det er flere betydelige fordeler med denne eksperimentelle M1/M2 flowcytometriprotokollen. Denne modellen gir mulighet til å studere medfødte immunresponser på virulente Mtb-infeksjon og kan utvikles for å inneholde studier av adaptive immunresponser ved å legge til autologe T-celler sammen med M1- eller M2-makrofager i blandede lymfocyttreaksjoner (MLR). Protokollen er også egnet for legemiddelscreening og testing av ulike immunmodulerende og antimikrobielle forbindelser. Her har vi tidligere studert effekten av vitamin D og histon deacetylasehemmer fenylbutyrate på myeloid-avledede celler etter Mtb-infeksjon25,35. M1/M2 strømningscytometri kan også brukes til å vurdere makrofagaktivering etter kondisjonering med cellekultur supernatanter eller pasientplasma. Mens in vivo studier av TB co-infeksjon med HIV eller helminter eller TB-diabetes co-morbidity kan være utfordrende, den mindre komplekse M1 / M2 modellen kan lette studier av co-morbidities in vitro. På samme måte kan protokollen utnyttes til overføringsstudier for å undersøke Mtb-infektiviteten til celler eller for å undersøke fagocytisk så vel som antigenpresentasjonskapasitet for individuelle M1/ M2-celler. M1/M2 strømningscytometri er også attraktivt for bruk i biomarkør- og vaksinestudier, for å følge sykdomsprognose under behandling og for å teste terapier rettet mot myeloid-avledede celler. Det er viktig at en rekke ulike metoder kan anvendes parallelt med strømningscytometri for samtidig vurdering av makrofag polariseringsfenotyper og funksjonelle responser ved hjelp av konfokal mikroskopi (figur 3D), sanntids PCR, western blot, multipleksanalyser og ELISA av løselige faktorer i kulturen supernatant samt vurdering av intracellulær bakteriell infektivitet og vekst ved hjelp av GFP-uttrykk (strømningscytometri og konfokal mikroskopi) og kolonidannende enheter (CFU). Infeksjon av M1- eller M2-celler med Mtb-GFP-bakterier gjør det også mulig å sortere de uinfiserte og Mtb-infiserte cellene fra samme prøve for enkeltcelle-RNA sekvenseringsanalyse.

Den beskrevne protokollen har også noen begrensninger, inkludert både tekniske og vitenskapelige ulemper. Ulempen ved å bruke monocytt-avledede makrofager fra menneskelige blodgivere er at donorvariabiliteten ofte er høy og det faktum at cellene ikke polariseres i det fysiologiske miljøet i menneskelig vev. Stor variasjon i polariseringseffekten M1/M2 eller Mtb-infectivity mellom donorer kan føre til problemer med både intra- og intereksperimentale variasjoner, lav statistisk kraft og et behov for å inkludere mange givere for å oppnå pålitelige resultater. I tillegg resulterer plasttilslutning av monocytter fra PBMCer i et donoravhengig antall monocytter/brønn som til slutt kan gi en vilkårlig MOI som kan påvirke makrofagpolariseringen og celle levedyktigheten etter Mtb-infeksjon. Kritiske trinn i protokollen innebærer riktig vasking for å forhindre at andre celletyper forurenser cellekulturene som også kan påvirke makrofagpolariseringen. Mens en for lav MOI kan etterligne latent TB-infeksjon, vil en for høy MOI drepe cellene, og fremheve viktigheten av å bruke en passende MOI. Videre kan det være vanskelig å hente fast tilhengerceller ved løsrivelse, noe som kan føre til en partisk representasjon av visse makrofager undergrupper som brukes til strømningscytometrianalyser. Et avgjørende skritt i flytcytometrianalyse innebærer riktig bruk av perler kompensasjon matrise og negative kontroller som unstained celler eller FMO (Fluorescence Minus One) kontroller for å sikre riktig manuell gating.

En annen begrensning innebærer polarisering av monocytter avledet fra blod og ikke fra det lokale vevsmiljøet. Kjennetegnet på menneskelig TB er dannelse av granulomer i Mtb-infisert vev, og dermed bør immunopaologi i TB fortrinnsvis studeres på det lokale vevsstedet. Monocytter rekrutteres imidlertid til lungen fra perifert blod ved betennelse/infeksjon, hvor celler kan skille seg ut i makrofager i nærvær av inflammatoriske cytokiner som GM-CSF12. Viktig, i det fysiologiske miljøet av vev in vivo, er det sannsynligvis en stor heterogenitet av makrofag polarisering inkludert en blanding og forskjellige forhold mellom forskjellige M1- og M2-lignende makrofagpopulasjoner som bidrar til skjebnen til TB-infeksjon36. Vi har tidligere utviklet en human organotypisk lungevevsmodell som muliggjør 3D-studier av makrofagmediert granulomdannelse i TB37. Det kan være interessant å utnytte den nåværende M1/M2 polariseringsprotokollen i kombinasjon med lungevevsmodellen for å studere TB granulomdannelse, effektorfunksjoner og M1/M2-forhold i eksperimentelt vev.

Denne M1/M2 flowcytometriprotokollen kan lett tilpasses for å inkludere et utvidet panel av myeloidmarkører som er nyttige for vurdering av funksjoner forbundet med hemmende så vel som inflammatoriske responser. Det er stor forskningsinteresse i hemmende immunkontrollpunktmolekyler som PD-1, SIRP-α, IDO og arginaser som kan modulere makrofagresponser38. I denne sammenhengen kan polarisering av myeloide celler også innebære andre stimuli som fremmer immunregulatoriske makrofager (Mreg) eller myeloid-avledede undertrykkerceller (MDSC) som har vist seg å være involvert i flere sykdommer, inkludert TB38. Mer avanserte strømningscytometripaneler av M1/M2/Mreg-makrofagundergrupper kan også omfatte intracellulær farging av cytokiner/kjemokiner IL-1β, TNF-α, IL-10 og MCP-1 eller andre løselige faktorer eller effektormolekyler som induserbart nitrogenoksid (iNOS) og antimikrobielle peptider. Dette kan forbedre mulighetene for å studere polyfunksjonelle makrofagresponser, på samme måte som det som er grundig beskrevet for T-celler39.

For tiden kan strømningscytometrifargingspaneler inkludere opptil 30-40 farger, noe som gir muligheten til å immunofenotype flere celleundergrupper og molekyler samtidig. Det grunnleggende eksperimentelle oppsettet av denne M1/M2 flowcytometriprotokollen kan brukes som en ryggrad som er kompatibel med de fleste gamle så vel som nye strømningscytometere og kan bygges på og skreddersys i henhold til individuelle behov, inkludert utfordringene ved arbeid med virulente Mtb i et BSL-3-miljø. I dag er dimensjonalitetsreduksjonsteknikker som UMAP tilgjengelige i de nye versjonene av flowcytometriprogramvare, som muliggjør analyse av et stort antall parametere generert i encellede studier som er avgjørende for forbedret visualisering og tolkning av høydimensjonale data40. De konstante teknologiske forbedringene i strømningscytometri vil sannsynligvis fortsette i de kommende årene, inkludert kombinasjonen av multiparametrisk fenotyping sammen med moderne cellesorteringsevner, der denne protokollen kan være nyttig i flere makrofagbaserte Mtb-infeksjonsanalyser.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker våre kolleger i Folkehelseinstituttet i Sverige, Matilda Svensson og Solomon Ghebremichael for hjelp i BSL-3-laboratoriet.

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Swedish Heart and Lung Foundation (HLF) (2019-0299 og 2019-0302 til SB), Det svenske forskningsrådet (VR) (2014-02592, 2019-01744 og 2019-04720 til SB), Stiftelsen for å forhindre antibiotikaresistens (Resist), Karolinska Institutet Foundations og KID til SB (delvis finansiering av doktorgradsutdanning for Marco Loreti) fra Karolinska Institutet. ML ble støttet fra Den svenske barnekreftstiftelsen (TJ2018-0128 og PR2019-0100).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-well chamber slides Lab-Tek 154534
BD Comp bead plus BD 560497
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
DAPI Mounting media Vector Laboratories H-1200-10
EDTA (0.5 M) Karolinska University hospital, Huddinge N/A
Falcon 6-well Flat Bottom plates Corning Life Sciences 353046
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Glycerol (70%) Karolinska University hospital, Huddinge N/A
GM-CSF Peprotech 300-03
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody Invitrogen R37121 Secondary antibody for CD64
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody Invitrogen A-11037 Secondary antibody for CD163
HEPES GE Healthcare Life Sciences SH30237.01
IFN-γ Peprotech 300-02
IL-4 Peprotech 200-04
L-Glutamine GE Healthcare Life Sciences SH30034.01
LPS (Escherichia coli O55:B5) Sigma-Aldrich L6529
Lymphoprep Alere Technologies AS 11508545
M-CSF Peprotech 300-25
Middle Brook 7H10 agar plates Karolinska University hospital, Huddinge N/A
Middle Brook 7H9 media Karolinska University hospital, Huddinge N/A
Mouse anti-human CD64 primary antibody Bio-Rad MCA756G Clone: 10.1
Na-pyruvate GE Healthcare Life Sciences SH300239.01
Normal goat serum Jackson ImmunoResearch 005-000-121
Rabbit anti-human CD163 primary antibody GeneTex GTX81526 Polyclonal
RPMI 1640 Life Technologies Corporation SH30096.01
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
TubeSpin bioreactor tubes TPP Techno Plastic Products AG 87050
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Tween-80 Sigma-Aldrich P4780

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  2. Cassetta, L., Cassol, E., Poli, G. Macrophage polarization in health and disease. Scientific World Journal. 11, 2391-2402 (2011).
  3. Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. Journal of Immunology. 164 (12), 6166-6173 (2000).
  4. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000 Prime Reports. 6, 13 (2014).
  5. Atri, C., Guerfali, F. Z., Laouini, D. Role of human macrophage polarization in inflammation during infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2018).
  6. Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
  7. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
  8. Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. Journal of Immunology. 178 (8), 5245-5252 (2007).
  9. Nathan, C. F., Murray, H. W., Wiebe, M. E., Rubin, B. Y. Identification of interferon-gamma as the lymphokine that activates human macrophage oxidative metabolism and antimicrobial activity. Journal of Experimental Medicine. 158 (3), 670-689 (1983).
  10. Leidi, M., et al. M2 macrophages phagocytose rituximab-opsonized leukemic targets more efficiently than m1 cells in vitro. Journal of Immunology. 182 (7), 4415-4422 (2009).
  11. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: a marker of alternative immunologic macrophage activation. Journal of Experimental Medicine. 176 (1), 287-292 (1992).
  12. Italiani, P., Boraschi, D. From Monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Frontiers in Immunology. 5, 514 (2014).
  13. Verreck, F. A., et al. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (13), 4560-4565 (2004).
  14. Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 88 (1), 159-168 (2010).
  15. Refai, A., Gritli, S., Barbouche, M. R., Essafi, M. Mycobacterium tuberculosis virulent factor ESAT-6 drives macrophage differentiation toward the pro-inflammatory M1 phenotype and subsequently switches it to the anti-inflammatory M2 phenotype. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 327 (2018).
  16. Kahnert, A., et al. Alternative activation deprives macrophages of a coordinated defense program to Mycobacterium tuberculosis. European Journal of Immunology. 36 (3), 631-647 (2006).
  17. Marino, S., et al. Macrophage polarization drives granuloma outcome during Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 83 (1), 324-338 (2015).
  18. Erbel, C., et al. An in vitro model to study heterogeneity of human macrophage differentiation and polarization. Journal of Visualized Experiments. (76), e50332 (2013).
  19. Lee, C. Z. W., Kozaki, T., Ginhoux, F. Publisher Correction: Studying tissue macrophages in vitro: are iPSC-derived cells the answer. Nature Reviews Immunology. 18 (11), 726 (2018).
  20. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (76), e50323 (2013).
  21. Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
  22. McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  23. Njoroge, J. M., et al. Characterization of viable autofluorescent macrophages among cultured peripheral blood mononuclear cells. Cytometry. 44 (1), 38-44 (2001).
  24. Li, F., et al. Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).
  25. Rao Muvva, J., Parasa, V. R., Lerm, M., Svensson, M., Brighenti, S. Polarization of human monocyte-derived cells with vitamin D promotes control of Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Immunology. 10, 3157 (2019).
  26. Tarique, A. A., et al. functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
  27. Hristodorov, D., et al. Targeting CD64 mediates elimination of M1 but not M2 macrophages in vitro and in cutaneous inflammation in mice and patient biopsies. MAbs. 7 (5), 853-862 (2015).
  28. Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
  29. Xu, Z. J., et al. The M2 macrophage marker CD206: a novel prognostic indicator for acute myeloid leukemia. Oncoimmunology. 9 (1), 1683347 (2020).
  30. Liu, Q., et al. Differential expression and predictive value of monocyte scavenger receptor CD163 in populations with different tuberculosis infection statuses. BMC Infectious Diseases. 19 (1), 1006 (2019).
  31. Sugaya, M., et al. Association of the numbers of CD163(+) cells in lesional skin and serum levels of soluble CD163 with disease progression of cutaneous T cell lymphoma. Journal of Dermatological Science. 68 (1), 45-51 (2012).
  32. Nawaz, A., et al. CD206(+) M2-like macrophages regulate systemic glucose metabolism by inhibiting proliferation of adipocyte progenitors. Nature Communications. 8 (1), 286 (2017).
  33. Liu, B., Zhang, M., Zhao, J., Zheng, M., Yang, H. Imbalance of M1/M2 macrophages is linked to severity level of knee osteoarthritis. Experimental and Therapeutic Medicine. 16 (6), 5009-5014 (2018).
  34. Lee, C., et al. M1 macrophage recruitment correlates with worse outcome in SHH Medulloblastomas. BMC Cancer. 18 (1), 535 (2018).
  35. Rekha, R. S., et al. Phenylbutyrate induces LL-37-dependent autophagy and intracellular killing of Mycobacterium tuberculosis in human macrophages. Autophagy. 11 (9), 1688-1699 (2015).
  36. Mattila, J. T., et al. Microenvironments in tuberculous granulomas are delineated by distinct populations of macrophage subsets and expression of nitric oxide synthase and arginase isoforms. Journal of Immunology. 191 (2), 773-784 (2013).
  37. Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection. Journal of Visualized Experiments. (104), e53084 (2015).
  38. Brighenti, S., Joosten, S. A. Friends and foes of tuberculosis: modulation of protective immunity. Journal of Internal Medicine. , 12778 (2018).
  39. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Good cell, bad cell: flow cytometry reveals T-cell subsets important in HIV disease. Cytometry Part A. 77 (7), 614-622 (2010).
  40. Becht, E., et al. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP. Nature Biotechnology. 37, 38-44 (2019).

Tags

Denne måneden i JoVE Utgave 163 makrofag human polarisering M1/M2 Mycobacterium tuberkulose infeksjon immunrespons strømningscytometri

Erratum

Formal Correction: Erratum: Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection
Posted by JoVE Editors on 10/14/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. Author and affiliation information was updated.

The author and affiliation information was updated from:

Akhirunnesa Mily1, Sadaf Kalsum1, Marco Giulio Loreti1, Rokeya Sultana Rekha2, Jagadeeswara Rao Muvva1, Magda Lourda1,3, Susanna Brighenti1
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet 
2Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet 
3Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

to:

Akhirunnesa Mily1,2, Sadaf Kalsum1, Marco Giulio Loreti1, Rokeya Sultana Rekha3, Jagadeeswara Rao Muvva1, Magda Lourda1,4, Susanna Brighenti1
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet 
2Infectious Diseases Division, International Centre for Diarrhoeal Disease Research, Bangladesh
3Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet 
4Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

Polarisering av M1 og M2 Human Monocyte-Avledede celler og analyse med Flow Cytometry på <em>Mycobacterium tuberkulose</em> infeksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mily, A., Kalsum, S., Loreti, M. G., … More

Mily, A., Kalsum, S., Loreti, M. G., Rekha, R. S., Muvva, J. R., Lourda, M., Brighenti, S. Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. J. Vis. Exp. (163), e61807, doi:10.3791/61807 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter